PRCTICA 5 AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

Introduccin
En la naturaleza, la mayora de los microorganismos no se encuentran aislados, sino integrados en poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el estudio de estos microorganismos y de sus propiedades, es necesario separar unos de otros y trabajar con especies aisladas, obteniendo cultivos axnicos o puros. Un cultivo axnico o puro es aquel que contiene un slo tipo de microorganismo y que procede generalmente de una sola clula; el crecimiento de sta origina, en medio slido, una masa de clulas fcilmente visible que recibe el nombre de colonia. Para obtener cultivos axnicos o puros a partir de una poblacin microbiana mixta, se utilizan las denominadas tcnicas de aislamiento, que fueron desarrolladas durante el siglo XIX. En un principio, Lister utiliz diluciones seriadas en medio lquido con esta finalidad, pero la presencia de contaminacin, es decir, de microorganismos no deseados, dificult el aislamiento. La escuela de Robert Koch introdujo los medios slidos, complementados con agar, y las placas de Petri en Bacteriologa, permitiendo as la separacin fsica de las colonias sobre la superficie del medio de cultivo o en el interior del mismo. El aspecto de las colonias sirve para diferenciar distintas especies microbianas. ms mtodos. - Estudiar la morfologa de cada colonia.

Material
Asa de siembra, cayado, pipeta graduada, placas de Petri con medio de cultivo slido y cultivo de microorganismos.

Tcnicas
Existen distintas tcnicas que pueden utilizarse: a) Extensin en superficie con cayado

Serie de diluciones conocidas de la muestra

Cayado

Figura 5.1. Siembra por extensin en superficie para recuento.

Depositar sobre la superficie de una placa con agar nutritivo una gota 0,1 ml de una determinada dilucin del cultivo de microorganismos problema y extenderlo con ayuda del cayado, previamente esterilizado, en todas las direcciones hasta

Objetivos
- Familiarizarse con el manejo de microorganismos y con las tcnicas de aislamiento en placa de Petri. - Obtener colonias separadas, utilizando uno o

Carga (1 estra)

Primera diseminacin

Segunda diseminacin

(2 estra)

(3 estra)

ltima diseminacin

(4 estra)

Figura 5.2. Tcnica de aislamiento por estra en superficie.

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que est completamente seco. Incubar la placa, en posicin invertida, a la temperatura deseada (durante 24, 48 72 horas) segn el tipo de microorganismo. La posicin invertida evitar que el agua de condensacin se deposite sobre la superficie del medio, dificultando la obtencin de colonias aisladas. Es una tcnica usada para el aislamiento de colonias, que permite igualmente el recuento de bacterias viables en la muestra, si conocemos exactamente el volumen de muestra sembrado. b) Estra mltiple en superficie Con un asa de siembra, previamente esterilizada, se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se extiende sobre un rea pequea de la superficie de la placa con agar nutritivo, en forma de estras muy juntas, pero sin hacer presin para no daar el agar. Se flamea el asa, se enfra y despus de rozar la siembra realizada previamente, se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estras. Este proceso se repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas siembras en estra. Se lleva la placa a incubar, a la temperatura adecuada, siempre en posicin invertida. Mediante esta tcnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un elevado nmero de bacterias. c) Dilucin en masa En una placa de Petri vaca se deposita un pequeo volumen conocido de muestra y a continuacin se aade el medio de cultivo (agar nutritivo) fundido y atemperado aproximadamente a 45C. Se mezclan ambos por rotacin suave de la placa. De esta forma los microorganismos se distribuirn de forma homognea en el medio de cultivo, permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar. Otra variacin de esta tcnica consiste en inocular Medio fundido Medio atemperado fundido Inculo Inculo atempera calibrado calibrado

el medio de cultivo, fundido y atemperado, contenido en un tubo, con un determinado volumen de la muestra. La homogeneizacin de la muestra y el medio de cultivo se realiza por rotacin del tubo entre las manos, antes de verterlo sobre la placa. En ambos casos, trs homogeneizacin, se dejan enfriar las placas hasta que se solidifique el medio y posteriormente se incuban a la temperatura adecuada (siempre en posicin invertida). Aunque con esta tcnica se obtienen colonias aisladas, generalmente slo se utiliza para determinar el nmero de microorganismos viables en una muestra, cuando stos son anaerobios facultativos o microaerfilos.

Resultados
a) Extensin en superficie: Tras el perodo de incubacin se examinarn las placas. Las colonias aparecen sobre la superficie, distribuidas uniformemente si la siembra se ha realizado de forma correcta. Podrn diferenciarse las colonias de acuerdo a su tamao, forma, color, textura, etc. Esta tcnica de siembra, adems de permitir que se distingan las colonias por su morfologa, permite el recuento de microorganismos viables. La expresin de este recuento se hace en "unidades formadoras de colonias" (UFC) ya que cada una procede de un slo microorganismo (o de un grupo de microorganismos, pues en algunos casos stos tienden a formar agregados). A partir de las colonias aisladas, los microorganismos pueden transferirse a otros medios de cultivo para su estudio. b) Por estra mltiple en superficie: Tras la incubacin, se observarn las colonias aisladas en alguna regin de la placa inoculada. Con esta tcnica se logra la separacin de los microorganismos que se encuentran en un cultivo mixto, o bien que proceden de m u e s t r a s homogneas, pero en las que existe un elevado nmero. En las zonas donde existen colonias aisladas se puede estudiar Figura 5.4. Aislamiento la morfologa colo- por estra en superficie. nial. c) Dilucin en masa: Aparecen las colonias distribuidas por toda la masa del agar. Aquellas que estn en la superficie tendrn distintas caracters-

Homogeneizar Homogeneiz

Figura 5.3. Siembra por dilucin en masa o inclusin en agar.

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ticas, dependiendo del tipo microbiano, mientras que las colonias que se desarrollan en el interior, bajo la superficie del agar, tienen forma lenticular, aunque los microorganismos que formen las distintas colonias sean de distinto tipo. Por tanto, las colonias que aparecen en la profundidad del agar son siempre biconvexas y no se diferencian unas de otras por su morfologa.

Figura 5.5. Aislamiento por dilucin en masa.

Forma
Puntiforme

Borde
Entero

Elevacin
Plana Plana Elevada Elevad Convexa Convex Crateriforme Crateriform Acuminada Acumina

Superficie o LisaLisa o rugosa Mate o Mate o brillante

Seca o cremosa Seca o Invasiva o Invasiva o superficial

Puntifor me Circular Circular

Rizoide

Entero

Ondulado

Ondulad o
Lobulado

Rizoide
Irregular

Irregular
Filamentosa

Lobulad o
Filamentoso Filamentoso

Filamentos a

Figura 5.6. Aspectos ms comunes de las diversas colonias microbianas aisladas sobre medio slido.

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PRCTICA 6 SIEMBRAS
Objetivos
- Aprender a inocular distintos medios de cultivo contenidos en tubo: Caldo, agar inclinado y medio semislido sembrado en profundidad. - Observar el crecimiento bacteriano en los distintos medios de cultivo. - Comprobar la movilidad de determinados microorganismos. c) En medio slido (agar inclinado): Con el asa de siembra estril tomar los microorganismos de la muestra e inocular el tubo realizando un movimiento de zig-zag en la superficie. El proceso se inicia en el fondo y se va avanzando hacia arriba por el rea inclinada. Incubar en estufa durante 28-48 horas a la temperatura ms adecuada.
Siembra en Siembra en zig-zag en zig-zag la Asa de siembra

Material
Asa de siembra, hilo de siembra, pipetas Pasteur o pipetas graduadas, suspensin de microorganismos y tubos con medio de cultivo lquido, slido inclinado y semislido.

Tcnica
a) En medio lquido con asa: Transferir aspticamente, con el asa de siembra, una pequea muestra de los microorganismos, desde el tubo que contiene el material problema al tubo con medio de cultivo estril. Sumergir el asa en el lquido y agitar para desprender y diluir la muestra. Incubar el tubo recin sembrado en estufa, durante 24-48 horas a la temperatura ptima de crecimiento.
Flameado Flameado

Muestra Medio(agar (agar inclinado) Muestra Medio

Figura 6.2. Siembra en un tubo de agar inclinado.

d) En medio semislido: La siembra en este tipo de medio, que contiene una proporcin menor de agar que los medios slidos y que se envasa en tubos, se lleva a cabo con un hilo de siembra esterilizado, con el cual se toma la muestra. El medio queda inoculado al introducir el hilo en profundidad hasta el fondo del tubo, retirndolo posteriormente por la misma trayectoria utilizada al realizar
Puncin

Muestra

Muestra

Inoculacin

Inoculaci

Incubacin Incubaci

Puncin limpia limpia

Figura 6.1. Inoculacin de un caldo de cultivo

(ver tambin figura III, pg. 4).
Filamento Filamento

b) En medio lquido con pipeta: Introducir aspticamente la pipeta Pasteur o la pipeta graduada en el medio lquido que contiene los microorganismos y, aspirando de forma adecuada, sacar una cantidad establecida de material que se transfiere al tubo con medio de cultivo estril. Incubar en estufa durante 24-48 horas a la temperatura ms adecuada.

Muestra

Muestra

Medio (agar semislido)

Medio (agar

Figura 6.3. Inoculacin de un medio semislido por picadura con hilo de siembra.
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la picadura. Una siembra con asa o con un cierto movimiento de vaivn podra originar un patrn de crecimiento que se interpretara errneamente como movilidad bacteriana. Incubar durante 24-48 horas a la temperatura ptima de crecimiento.

Resultados
a y b) En los cultivos lquidos no tiene lugar la formacin de colonias, por lo tanto se examinar la existencia de enturbiamiento ms o menos intenso, la formacin de una pelcula o velo sobre la superficie, la aparicin de sedimento en el fondo del tubo, etc. La utilizacin de medios de cultivo lquidos permite la obtencin de una poblacin microbiana grande, con un elevado nmero de microorganismos, para ser utilizados posteriormente. A B

temperaturas de 4C. d) En medio semislido se podr comprobar si el microorganismo es o no mvil, ya que en el primer caso se observar que el crecimiento difunde alrededor de la zona donde se hizo la picadura, detectndose turbidez. Por eso es tan importante que, cuando se inocula el medio de cultivo, no se distorsione el agar y se vuelva a sacar el hilo por el mismo sitio de inoculacin. Los microorganismos inmviles crecern nicamente a lo largo de la picadura. Este tipo de siembra en picadura sirve, tambin, como otro de mtodo de conservacin de microorganismos anaerobios facultativos.

Figura 6.4. Aspecto de cultivos en agar inclinado (A) y semislido (B) c) En medio slido (agar tras la inclinado) se observar el incubacin.

aspecto general del medio y la aparicin de crecimiento sobre su superficie. Este tipo de siembra permite el cultivo de microorganismos aerobios o anaerobios facultativos. Adems, se utiliza para almacenar cultivos durante cortos perodos de tiempo, a

Figura 6.5. Prueba de movilidad en agar semislido.

1. Microorganismo mvil. 2. Microorganismo inmvil. 3. Tubo control sin inocular.

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