Usted tiene acceso gratuito a estos materiales Implantacin Regeneracin Periodontal Despus de cemento y ligamento periodontal clulas derivadas

de J. Nuez 1,2; S. Sanz-Blasco 1, Revista de Investigacin F. Vignoletti2, Periodontal F. Muoz 3, Volumen 47, Nmero H. Arzate 4, 1,pginas 33-44, febrero 2012 C. Villalobos 1, L.Nez 1, Caffesse RG 2, M. Sanz 2 Artculo publicado por primera vez en lnea: 12 SEP 2011 Doi: 10.1111/j.1600-0765.2011.01402.x 2011 John Wiley & Sons A / S Cuestin

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Palabras clave: cementoblastos; cemento dental; defectos periodontales intraseos; clulas madre mesenquimatosas; regeneracin periodontal Abstracto Nez J, S-Sanz Blasco, Vignoletti F, F Muoz, H Arzate, C Villalobos, L Nunez, RG Caffesse, Sanz M. La regeneracin periodontal tras la implantacin del cemento y el ligamento periodontal clulas derivadas. Periodont J Res. 2012, 47: 33 -44. 2011 John Wiley & Sons A / S

Fundamento y objetivo: . La regeneracin periodontal de los defectos seos y es insatisfactorio A menudo se puede mejorar en gran medida por la terapia celular tanto, el propsito de este estudio fue evaluar el potencial regenerativo de la implantacin de cemento caninos derivados de clulas (CDC) y el ligamento periodontal canina derivado de las clulas (PDLDCs) en defectos periodontales creados experimentalmente intraseos en perros beagle. Material y Mtodos: Se obtuvieron clulas de premolares extrados de cuatro perros beagle. tres paredes defectos intraseos periodontales, 3 mm de ancho y 4 mm de profundidad, creados quirrgicamente estaban en sus segundos premolares y cuarto y la placa se le permiti acumular. Once Were desbridar quirrgicamente los defectos, la regeneracin periodontal se intent mediante la implantacin aleatoria de esponjas de colgeno embebidas con CDC 750,000, 750,000 PDLDCs o medio de cultivo. Despus de 3 meses de curacin, las muestras fueron obtenidas y los resultados periodontales regenerativos fueron evaluados histolgicamente y histomtricamente. Resultados: En el anlisis histolgico mostr que una cantidad mnima de cemento nuevo se form en el grupo control (1,56 0,39 mm), que, en ambos grupos de prueba, cantidades significativamente mayores de nuevo cemento Fuiste formado (3,98 0,59 mm en el grupo de los CDC y 7,4 0,97 mm en el grupo de PDLDC). Los grupos de ensayo tambin se demuestre que mayor dimensin de nuevo tejido conectivo, lo que resulta en un nivel significativamente ms coronal de fijacin histolgica. Conclusin: Este estudio de prueba de principio sugiere que la terapia celular, en combinacin con una esponja de colgeno, regeneracin periodontal experimentales se promociona en defectos periodontales intraseos. El periodonto es un rgano complejo que comprende cuatro componentes de tejidos mesenquimales (cemento, hueso, ligamento periodontal y la enca) que actan como una unidad funcional, siempre que el diente con un aparato de insercin capaz de soportar las fuerzas masticatorias ( 1 ). Entre estos componentes, el periodontales ligamento (PDL) tiene la importante funcin de soporte del diente y mantenimiento de la homeostasis del periodonto. Este tejido es altamente vascularizado y contiene muchos tipos de clulas endoteliales, fibroblastos y que incluyen, clulas epiteliales,

progenitoras mesenquimales y nerviosas. Estas clulas son multipotentes ltimos maduro Las clulas madre mesenquimales (MSC-PDL) ( 2 ) que son capaces de diferenciarse en mltiples linajes celulares, as como a la auto-renovacin y mantener su capacidad multipotentes ( 3-5 ). MSC-PDL tienen el potencial de diferenciarse demostrada en osteognico , las clulas progenitoras adipogenic ( 6 ) y precursores de los nervios, como la cresta clulas ( 7 ). No es fcil identificar MSC-PDL Porque no hay un solo marcador antignico especfico para estas clulas ( 5 ), por lo tanto, Porque MSC-PDL tienen muchas molculas de superficie celular en comn con clulas hematopoyticas maduras, una combinacin de marcadores se utilizan para su identificacin, tales como CD13, CD29, CD44, CD59, CD90, CD10 ( 8 ) y STRO-1 ( 9 ). de acuerdo con la Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISCT), tres criterios deben ser brillantes mnimo para la in vitro identificacin de MSC: la adherencia al plstico, un patrn de expresin del antgeno de superficie especfica (CD73 +, CD90 +, CD44 +, CD105 +, CD34 -, CD45 -, CD11b -, CD14 , CD19-, CD79a - y HLA-DR -) y potencial de diferenciacin (linajes osteognicos, condrognicos y adipognica) ( 10 ). Canine MSC derivadas de PDL tienen nica expresin de CD146 y demostr STRO-1 ( 11 ). MSC no slo se han aislado a partir de la PDL, sino tambin de la pulpa dental ( 12,13 ), en dientes deciduos exfoliados ( 14 ) y en la papila apical dental ( 15 ). MSC rara vez se han utilizado teraputicamente y MOST terapia celular intentos de manera oral y maxilofacial aplicaciones han empleado estromales de mdula sea las clulas madre mesenquimales (BMSMCs) Estas clulas Favorecer Debido a la diferenciacin osteognica frente a otros linajes celulares ( 16 ). En los modelos caninos, vehiculado en BMSMCs hidroxiapatita cermica / triclcico andamios de fosfato ( 17.18 ) Promovido regeneracin de defectos seos alveolares y el contacto huesoimplante mejorado en comparacin con los injertos de hueso autgeno Cuando adems de plasma rico en plaquetas ( 19 ). En los BMSMCs sea regenerativa aplicaciones han sido probados en combinacin con diversos andamios en los procedimientos de elevacin sinusal ( 20 ) o para el tratamiento de defectos de paladar hendido ( 21,22 ). Estos estudios sugieren que la terapia con clulas que pueden promover la capacidad de

regeneracin de los huesos injertos seos diferentes y por lo tanto reduce la morbilidad del sitio donante hueso autgeno de injerto asociado. La regeneracin periodontal en el enfoque de la terapia celular ha sido poco explotado. El periodonto destruido durante la periodontitis crnica ha limitado la capacidad de auto-regeneracin. De hecho, once se han eliminado la infeccin de las races afectadas, las clulas de la repoblacin de la herida determinar la naturaleza de la interfaz de tejido, a travs del establecimiento de Principalmente largo de la unin a epitelio. Este proceso reparador puede evitarse cuando las clulas epiteliales conectivo y tejido gingival estn excluidos del proceso de cicatrizacin de heridas y clulas de la PDL se permite a colonizar la herida, AS El logro de la regeneracin periodontal ( 23 ).Este potencial regenerativo periodontal-Atribuido a haber sido desde el MSC PDL indiferenciadas que, junto con un adecuado crecimiento y factores de diferenciacin, puede promover la formacin de nuevo cemento, hueso y tejido conectivo ( 1,24 ). Aunque la presencia de MSC en el PDL y la pulpa est bien establecido ( 9 ), no se sabe bien cmo se comportan estas clulas in vivo o los factores que influyen en su diferenciacin en los linajes celulares diferentes. algunas investigaciones han intentado aislar y la cultura Estas clulas, as como para estudiar su potencial para formar tejido periodontal ( 25-28 ). Preisig y Schroeder ( 29 ) PDL clulas cultivadas en rodajas de raz y desarrollado una in vitro PDL-como el tejido. En otro experimento, unido con races desmineralizadas re-PDL se implantaron las clulas in vivo en monos. Healing result en la formacin de nuevas fibras de colgeno orientadas perpendicularmente entre el hueso y la raz. Sin embargo, resorcin radicular y anquilosis tambin fueron observados ( 30 ). Estos primeros intentos de regeneracin demostrada la necesidad de aislar las clulas progenitoras y de utilizar andamiajes adecuados para entregar las clulas y factores de crecimiento para orientar la diferenciacin celular apropiadamente. Seo et al. ( 2 ) MSC humanas aisladas de la hidroxilapatita PDL y utilizados / fosfato triclcico andamios para implantar estas clulas creadas artificialmente en defectos periodontales en el molar mandibular de seis inmunodeficientes ratas. Ocho semanas despus, los autores encontraron una fina capa de cemento-como el tejido con fibras de colgeno unidas condensada, se asemejan a las fibras de Sharpey. Del mismo modo, Zhao et al. ( 31 ) tambin est implantado MSC Dentro de una esponja de

polmero en un modelo de defecto fenestracin en ratas, y ratones Reportado diferenciacin de cementoblastos con la capacidad de formar tejido mineralizado despus de 6 semanas. Nuestro grupo de investigacin ha informado anteriormente ( 32,33 ) un mtodo para el aislamiento de las MSC derivados de PDL humano y su diferenciacin en cementoblastos y los fibroblastos mediante inmunocitoqumica y RT-PCR. Estas clulas humanas derivadas del cemento (CDC humanos) fueron positivos para ameloblastina, amelogenina , cemento protena 1 (CEMP-1), protena de unin cemento (CAP) y la osteocalcina. Una vez que la metodologa para el aislamiento y caracterizacin de los CDC se estableci que el objetivo de evaluar su capacidad para promover la regeneracin periodontal en un modelo experimental preclnico. Por consiguiente, el objetivo de la presente investigacin fue evaluar el potencial regenerativo de los CDC caninos implantados ligamento periodontal canina y derivados de clulas (PDLDCs) Dentro de una esponja de colgeno (CS) que se utiliza como andamio en forma experimental creado, defectos periodontales intraseos crticos. Material y mtodos Celda de aislamiento y cultura Este estudio fue aprobado por el animal experimental Comit de tica en Investigacin del Hospital Central Militar "Gmez Ulla" (Madrid, Espaa). Cuatro varones, de 1 ao de edad, los perros que pesan 10 kg Beagle Acerca fueron seleccionados y sometidos a la cuarentena prescrita. Aunque los animales presentaron saludables los tejidos periodontales, de toda la boca profilaxis con escarificador ultrasnico y curetas manuales se llev a cabo antes de la fase experimental. CDC y caninos PDLDCs caninos fueron aislados y caracterizados por el mtodo previamente por nuestro grupo de investigacin ( 32 ). En premolares mandibulares breves, primera y tercera generalmente se extrajeron cuidadosamente bajo anestesia (anestesia inhalatoria - isofluorano Induccin con propofol intravenoso) y se colocaron inmediatamente en suero libre, medio alfa de Eagle modificado por (-MEM/F12) mezcla nutriente suplementado con 100 U / ml de penicilina y 100 ug / ml de estreptomicina. PDL fue raspado de las races con un 7/8 cureta Gracey

(Hu-Friedy, Chicago, IL, EE.UU.) y el tejido fue digerido por incubacin obtenido, a 37 C, en medio que contena 3 mg / ml de colagenasa tipo I y 4 mg / ml de Dispasa. Despus de 40 min, tejido digerido se centrifug durante 7 min a 200 g y se lavaron cuatro veces con medio fresco. clulas se pas despus por un 70-um filtro en placas de Petri que contena -MEM suplementado con 15% de suero fetal bovino, 100 M de cido ascrbico 2fosfato, 2 m M glutamina, 100 U ug / ml de penicilina y 100 / ml de estreptomicina, y las placas se colocaron en el interior una incubadora de aire a 37 C con una atmsfera de 5% CO 2/95%. En estas condiciones, un grupo de clulas mesenquimales aument despus de 4 d in vitro, la formacin de la denominada unidad formadora de colonias. Cada d 2 o menos , Cuando los cultivos convirti en semiconfluencia, y clulas separadas se colocaron en un medio de tripsina-EDTA que contiene. El nmero de PDLDCs duplicado en un 2 - a perodo de 3-d y estas clulas se utiliza para experimentos estaban dentro de los pasajes cuarto y quinto. El restante raz se dej en el mismo medio, que contena 3 mg / ml de colagenasa tipo I y 4 mg / ml de dispasa, durante 40 min a 37 C. La raz se lav cuatro veces con medio fresco y las capas delgadas fueron raz raspada en direccin apical-coronal utilizando una cuchilla 15c. Estas capas se lavan y se cortan en piezas ms pequeas utilizando tijeras de microciruga y despus se digiri de nuevo por la incubacin, durante 40 min a 37 C, en un medio que contena 3 mg / ml de colagenasa tipo I y 4 mg / ml de Dispasa. Pequeos trozos de tejido en placas fueron entonces en una placa Petri que contena -MEM suplementado con 15% de suero fetal bovino, 100 M de cido ascrbico 2-fosfato, 2 m M glutamina, 100 U / ml de penicilina y 100 ug / ml de estreptomicina, y se coloca en un 5% de CO 2/95% aire de la incubadora a 37 C. Despus de 10 das de cultura, un conjunto de CDC caninos creci, formando colonias discretas de clulas. Cada d 4 o as, cuando . la semiconfluencia convirti en cultivos, las clulas se separaron usando tripsina-EDTA que contenan medio El nmero de CDCs duplicado en un 3 - a 4-d perodo, y estas clulas usadas para los experimentos estuvieron dentro de los pasajes cuarto y quinto. La inmunocitoqumica CDC canina y PDLDCs (en pasos cuatro a cinco) se fijaron con formaldehdo al 4% y Analizado mediante inmunocitoqumica. En resumen, los CDC incubadas con anticuerpos primarios fueron en contra de la

osteocalcina (1: 100 dilucin, Alexis bioqumicos, Lausanne, Suiza), CEMP1 (1: 100 dilucin) y STRO-1 (1: 100 dilucin, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemania). en suero de cabra al 10% durante 90 min se incubaron con anticuerpos contra PDLDCs osteocalcina (1: 100 dilucin), STRO-1 (1: 100 dilucin), CEMP-1 (1: 100 dilucin) y CD44 (1: 100 dilucin, Abcam, Cambridge, UK). bajo las mismas condiciones experimentales , las muestras se incubaron a continuacin, durante 60 min, con isotiocianato de fluorescena ( FITC)-etiquetados anticuerpos secundarios (Invitrogen, Barcelona, Espaa). Las clulas teidas fueron identificados por microscopa de fluorescencia. Anlisis de citometra de flujo PDLDCs (en pasos de cuatro a cinco) se cultivaron en -MEM suplementado con 15% de suero fetal bovino, 2 m M glutamina, 100 U / ml de penicilina y 100 ug / ml de estreptomicina. Luego, las clulas fueron incubadas con el ratn anti .-suero humano a CD73, CD90, CD44, CD105, CD34, CD45, CD11b, CD80, CD19 y HLA-DR A continuacin, las clulas se incubaron con un 1: 100 dilucin de FITC-conjugado de cabra anti-IgG de ratn y se analizaron utilizando un EPICS XL citmetro de flujo y la Expo 32 ACS software (Coulter Electronics, Brookvale, Australia). Tincin de Von Kossa y la mineralizacin CDCs canina y PDLDCs (en pasajes cuatro a cinco) se sembraron a una densidad de 10 4 clulas / pocillo en estril placas de seis pocillos y se cultivaron en un medio mineralizante [medio esencial mnimo de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) / F12] que contiene 15% suero fetal bovino y 1% de penicilina / estreptomicina (diluido 100 veces a partir de una solucin madre a 5000 U / ml de penicilina, 5000 U / mL de estreptomicina, 50 mg / ml de cido ascrbico, 10 m M -glicerofosfato de sodio y 5 M dexametasona). El medio se cambi cada 2 d y la mineralizacin se ensay despus de 3 semanas utilizando tincin de Von Kossa y la microscopa de campo brillante. Para tincin de Von Kossa, las clulas se lavaron con fosfato, solucin salina tamponada y se fijaron con 4% de paraformaldehdo durante 10 min. Despus de lavar con agua destilada, se incubaron las clulas en nitrato de plata 5% a 4 C durante 40 min. Posteriormente, las clulas se lavaron con agua y 5% de solucin de tiosulfato de sodio se aadi a temperatura ambiente durante 5

min. Despus eliminacin de la solucin de tiosulfato de sodio y el lavado, las clulas sometidas a microscopa de luz para su anlisis. Estudio experimental Los mismos animales que proporcionaron los dientes extrados para el aislamiento de los CDC y PDLDCs se utilizaron en el estudio experimental. Se crearon defectos periodontales intraseos generalmente bajo anestesia inhalatoria [anestesia con isoflurano y luego inducida por va intravenosa (iv) propofol]. mucoperistico vestibular y lingual flaps se plantearon en los cuadrantes contralaterales intrasulcular mandbula a travs de incisiones de la cara mesial del segundo premolar a primer molar. Usando una pieza de mano y fresas de fisura bajo riego abundante, de tres paredes defectos intraseos periodontales, de 3-4 mm en bucolingual, direcciones mesiodistales y apicocoronal, fueron creados quirrgicamente en las caras mesial y distal de los segundos premolares y en la cara mesial de los premolares cuarto, generando seis defectos de cada animal. ligaduras de alambre de ortodoncia se colocaron y se fija alrededor de los dientes afectados y se inserta en los defectos antes de las solapas recolocado y suturado se interrumpieron con suturas reabsorbibles (Ethicon, Summerville, NJ, EE.UU.). Los perros fueron alimentados con una dieta blanda para permitir la acumulacin de placa y Malthus imitar periodontitis crnica. Despus de 1 mes de la acumulacin de placa, la los perros fueron sedados con 80 mg / kg de medetomidina, 20 mg / kg de butorfanol y 100 mg / kg de sulfato de atropina y eliminado las ligaduras se cargaron junto con la placa acumulada y el clculo utilizando raspadores ultrasnicos. Siete das ms tarde (5 semanas despus de la creacin de los defectos), la ciruga regenerativa se llev a cabo utilizando el mismo protocolo anestsico descrito anteriormente.Despus bucal y lingual colgajo mucoperistico sensibilizacin, los defectos periodontales intraseos con cuidado eran eran las races desbridadas y cepillada con curetas. Las mediciones intraseos siguientes se registraron utilizando un periodontal sonda de Carolina del Norte (Hu-Friedy, Chicago, IL, EE.UU.): La distancia entre la cresta sea alveolar y la unin cemento-esmalte (CEJ-ABC), la distancia de la ABC a la base del defecto (ABC-BD) y la dimensin bucolingual del defecto. Todas las mediciones se redondea hacia abajo al milmetro ms cercano. Con el uso de una fresa redonda, una muesca se hizo referencia en la base del defecto. Las tres modalidades de tratamiento

siempre se aplicaron en la misma secuencia con el fin de evitar la repeticin del tratamiento en los defectos. La aleatorizacin de los tratamientos se realiz mediante el lanzamiento de una moneda, Seleccin del tratamiento para empezar en la mesial defecto periodontal intraseo del segundo premolar ( Tabla 1 ). Los tratamientos regeneradores probado consisti en la implantacin de un CS (Xemax Surgical Products Inc., Napa, CA, EE.UU.) que contiene (a)> 750,000 CDC (ensayo), (b)> 750,000 PDLDCs (prueba) o (c) 50 ul de medio de cultivo ( control) en el defecto periodontal. Las solapas entonces reposicionado y se sutura Fueron interrumpidos con sutura reabsorbible (Ethicon). Asegurar la presencia de clulas viables en el andamio (CS) es evaluado previamente el mantenimiento de las clulas vivas mediante la incubacin de los CDC caninos durante 24 h a 37 C en 5% de CO 2/95%de aire ambiente y, a continuacin despus de 5 h en un refrigerador (4 C) para imitar las condiciones en que las clulas estn expuestas durante el trnsito desde el laboratorio a la sala de operaciones. La viabilidad celular fue evalu por microscopa de fluorescencia despus de la tincin con diacetato de fluorescena el andamio (50 mg / ml, 3 min) y yoduro de propidio (20 mg / ml, 30 s) (Fig. 1 ). rea Controle Prueba 1 Prueba 2 1. Representar los valores proporcionados por el nmero de tratamientos. 2. Control, medio de cultivo, Test 1, caninos cemento derivados de las clulas (CDC), la Prueba 2, caninos derivados del ligamento periodontal-clulas (PDLDCs). Mesial PII Distal PII Mesial PIV 4 2 2 2 3 3 2 3 3

Tabla 1. Distribucin de los tratamientos utilizados para el tratamiento de defectos periodontales intraseos

Figura 1. La viabilidad celular en el soporte [esponja de colgeno (CS)]. El CS se impregn con caninos cemento derivadas de las clulas (CDC) en 50 ul de medio de cultivo y se incubaron durante 24 horas a 37 C en 5% de CO 2 / 95% incubadora de aire y para 5 h en un refrigerador (4 C). La imagen izquierda muestra la luz de transmisin de las clulas en el CS. La imagen central muestra las clulas muertas teidas con yoduro de

propidio.La imagen de la derecha muestra las clulas teidas con fluorescena diacetato vivo. Bar = 5 um, el aumento fue la misma en todos los paneles.Se muestran los resultados representativos de tres experimentos. Despus de la ciruga experimental, todos los animales recibieron antibiticos (amoxicilina, 15 mg / kg por va intramuscular, cada 48 horas durante 7 das) y anti-inflamatorios (meloxicam, 0,2 mg / kg por va subcutnea, cada 24 horas durante 3 das) y fueron alimentados con una dieta blanda durante 2 semanas para reducir el trauma mecnico potencial para el rea de la ciruga. A gluconato de clorhexidina (0,12%) fue rociado Aplicada tpicamente cada tercer da durante un perodo de 3 meses. El estudio histolgico Tres meses despus de la ciruga, los perros fueron sacrificados mediante una sobredosis de pentobarbital sdico y los tejidos fijados por perfusin vascular fueron a travs de las arterias cartidas con solucin Karnovsky fijador ( 34 ). La mandbula inferior se separ y se sumerge en una solucin de Karnovsky durante 1 semana. Los dientes experimentales y los bloques de tejido fueron hemiseccionaron tratada que contiene la raz y sus alrededores tejidos blandos y duros disecados y se procesaron para la seccin de tierra de acuerdo con el mtodo descrito por Donath y Breuner ( 35 ). Los bloques de tejido seccionado en el aspecto central de la mayora fueron . el defecto con una radiografa dental para asegurar la orientacin correcta Una seccin mesiodistal se prepar a partir de cada bloque de tejido y se reduce a un espesor de aproximadamente 20 micras usando un microtomo (Exakt ; Apparatebau, Norderstedt, Alemania).Las secciones fueron teidas utilizando el Levai -Laczk tcnica ( 36 ). Todas las muestras histolgicamente y histomtricamente se analizaron bajo un microscopio de luz (Eclipse E800, Nikon Inc., Tokio, Japn) equipado con un sistema informatizado de anlisis de imagen del sistema (NIS Elementos BR, DSRi1 Nikon, Amstelveen, los Pases Bajos). Un examinador bien entrenado (JN), cegados a los grupos, llevado a cabo todos evaluacin histolgica y anlisis histomtrico. Para asegurar la reproducibilidad y calibracin antes del anlisis histomtrico, un subgrupo de 10 muestras se midi por duplicado despus de 1 semana. Este anlisis dio como resultado 100% de acuerdo entre las mediciones duplicadas, dentro de un rango de 0,3

mm. Las siguientes mediciones se registran en cada seccin: la distancia desde la CEJ a la muesca (CEJ-Notch) la distancia entre el margen gingival (GM ) y el extremo apical del epitelio de unin (JE) (GM-JE), la distancia de la CEJ para el GM (CEJ-GM), la distancia entre el TJCE y el extremo apical de la JE (CEJ-JE) La Distancia entre la extensin apical de la JE y la ms coronal del cemento (JE-CC), la distancia entre la extensin cemento ms coronal de la recientemente formada a la muesca (CC-Notch), y la distancia entre la cresta sea y la mayor parte coronal muesca (OC-Notch). El anlisis estadstico Las medias y las desviaciones estndar para cada uno se calcularon los parmetros en los grupos experimentales y de control clnico e histolgico, con el perro beagle que sirve como unidad de anlisis (n = 4). Cuando slo dos medias se compararon, de Student t-test fue utilizado. Durante ms de dos grupos, la significacin estadstica de los datos se evalu mediante anlisis de varianza y comparacin de Bonferroni utilizando comparaciones mltiples de prueba. Las diferencias se consideraron significativas a p <0,05. Resultados Cultura y caracterizacin de los CDC caninos y PDLDCs Aislamiento y cultivo de clulas caninas experimental obtenido de la razrenderizados distintas clulas con la capacidad de formar colonias de clulas y demostrar el CDC y los fenotipos caractersticos PDLDC, se llev a cabo. PDLDCs comenz a extenderse fuera de los explantes despus de 4 das in vitro ( Fig. . 2A ), Considerando CDCs hizo lo mismo despus de 10 d en vitro ( Fig. 2B ). Despus de 60 das in vitro, Ambos tipos de clulas con clara deposicin formaron colonias de tejido mineralizado ( fig. 2C ) y amorfo despus de marrn / negro precipitados Von tincin de Kossa ( Fig. 2D ). Inmuno anlisis se llev a cabo en el cuarto paso (60 d in vitro) CDCs utilizando anti ()-CEMP-1, -STRO-1 y -osteocalcina y en PDLDCs cuarto paso utilizando -STRO-1, -CD44, -1-CEMP y -osteocalcina. Figura 3A muestra la tincin de inmunofluorescencia positiva para -CDCs en PEMF-1 (78% de la poblacin CDC) osteocalcina y -(66%), pero no para la -STRO-1. Figura 3B muestra la tincin de inmunofluorescencia positiva para -PDLDCs en CD44 (6%) y -STRO-1 (12%) pero no para la -CEMP-

1 y -osteocalcina. Se intent Para caracterizar adicionalmente estas clulas por citometra de flujo. Hemos encontrado CD105 expresado que PDLDCs caninos contra el antgeno de superficie especfica de las MSC (Fig. 3 ). Las clulas negativas canino-obtenidos para un nmero Fueron de marcadores caractersticos de anticuerpos contra antgenos humanos MSCs Cuando Se utilizaron (datos no presentados), lo que implica que o bien las clulas expresan estos marcadores no hacer o, ms probablemente, que los anticuerpos para marcadores humanos no se identifican los antgenos en clulas caninas.Desafortunadamente, canino anticuerpos especficos no estn disponibles en la actualidad. Figura 2. Canine cemento derivadas de las clulas (CDC) y caninos periodontales derivados de ligamento-clulas (PDLDCs) forman colonias celulares y minerales. dientes de perros beagle jvenes se utilizaron como una fuente de PDL. (A) del ligamento periodontal fue raspado de los dientes y se digiri con colagenasa y dispasa. Despus de 4 d in vitro, las clulas comenzaron a formar colonias, denominados unidades formadoras de colonias de fibroblastos-(CFU-F). En 60 d in vitro, el cultivo haba completado cuatro pasajes. (B) La externa capas retirados de superficies de la raz y se digiri estaban usando colagenasa y dispasa. clulas cultivadas a partir de los explantes de tejido empez a extenderse despus de 10 d en vitro y de formar colonias y de tejido mineralizado. Un ejemplo representativo en 60 d in vitro se muestra. CDCs y PDLDCs cultivados durante 3 semanas con cido ascrbico dexametasona, y -glicerofosfato fueron capaces de formar tejido mineralizado, como se muestra por microscopa de luz (C) y tincin de Von Kossa (D). Bar = 10 micras en todos los paneles. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.

Figura 3. Caracterizacin de marcadores de clulas caninas en cemento derivadas de las clulas (CDC) y caninos periodontales derivados de ligamento-clulas (PDLDCs). (A) CDCs fueron sometidos a inmunocitoqumica, utilizando, como sondas, anti-cemento protena 1 (CEMP -1), las clulas -STRO-1 y -osteocalcina y positivas se dieron a

conocer con fluorescena conjugada con anticuerpo secundario. imgenes izquierda, inmunofluorescencia. derecha, las imgenes de campo brillante.(B) fueron sometidos a PDLDCs inmunocitoqumica, utilizando como sondas, -CD44, -STRO-1, la osteocalcina y la --1-CEMP. se revelaron clulas positivas con fluorescena marcado con -CD44 y STRO-1 como anticuerpos secundarios. imgenes izquierda, inmunofluorescencia.Derecha, brillante imgenes de campo. La barra representa 10 micras, los paneles de la izquierda tiene la misma ampliacin que los paneles de la derecha correspondientes. (C) Anlisis de citometra de flujo de la expresin de CD105 en PDLDCs. clulas se trataron con anticuerpos humanos contra CD105 clulas positivas y probado por citometra de flujo Were. Estudio regenerativa experimental mediante la aplicacin de un CS embebido en CDCs, o cultivo PDLDCs medianas Un paso crtico en la terapia celular experimental es probar la eficiencia del operador celular. Decidimos probar en CS como un operador celular. POR LO TANTO, hemos probado la viabilidad de los CDC o PDLDCs (en pasos cuatro a cinco) y se cultivaron embebido dentro del CS. La CS fue capaz de mantener la viabilidad celular de 24 h de incubacin y para 5 h en un ambiente fro ( Fig. 1 ), dos condiciones necesarias para rellenar las celdas con CS y para transportarlos desde las instalaciones de cultivo celular para la ciruga habitacin. CS-que contiene las clulas se aplicaron a los defectos, como se describe en los materiales y mtodos, y los efectos sobre diferentes parmetros utilizando histometry fueron probados. Tabla 2 muestra las mediciones intraoperatorias registradas en los sitios donde el CS que contienen CDC, o medio de cultivo PDLDCs se aplica. cicatrizacin postoperatoria se produjo sin incidentes en todos los animales y a las 4 semanas Fueron los tejidos periodontales sanos sin ningn signo de infeccin. Las muestras fueron obtenidas para el anlisis histolgico de todos los defectos de los cuatro animales de experimentacin. Sus tejidos gingivales similar tenan caractersticas histolgicas en el tres grupos de estudio, representando un epitelio que cubre paraqueratinizado el margen gingival con un tejido conectivo subyacente rico en fibras de colgeno y fibroblastos, con excepcin de una banda de infiltrado inflamatorio confinado al epitelio del surco gingival y la unin ( Fig. 4 ). El aparato de insercin

periodontal, sin embargo , distinto histolgico mostraron caractersticas eran cuando los grupos comparados. La curacin de los defectos en los grupos de prueba demostrada tanto las caractersticas histolgicas de la regeneracin periodontal, incluyendo la formacin de nuevo cemento celular y una insercin de tejido conectivo relativo significativamente mayor en el grupo de control ( Fig. 5. ) . Por el contrario, en el grupo de control, la curacin se produjo principalmente por la reparacin, con formacin limitada del nuevo celular coronal a la muesca de referencia cemento. No hay signos de reabsorcin radicular o anquilosis se observaron en ambos grupos. En el PDL recin formada entre el hueso y el cemento , ricas en vasos capilares se observ ( Fig. 5 ). Aunque la nueva formacin sea en el grupo era mayor PDLDC que en el CDC y el grupo control, no alcanz la significacin estadstica de las diferencias. Parmetro Control (mm) CDC (mm) PDLDCs (mm)

1. Los datos son la media desviacin estndar como se muestra, n = 4. 2. Los parmetros incluyen la distancia entre la cresta sea alveolar y la unin cemento-esmalte (CEJ-ABC), la distancia entre la cresta sea alveolar y la base del defecto (ABC-BD) y el ancho bucolingual del defecto (BOC-LOC ). 3. CDC, cemento, derivados de las clulas del ligamento periodontal, PDLDCs derivados de clulas. ABC-CEJ ABC-BD BOC-LOC 3,25 0,32 7,00 0,70 3,12 0,12 2,62 0,31 6,12 0,47 2,75 0,14 3,50 0,50 6,50 0,64 2,75 0,25

Tabla 2. clnicos mediciones de defectos periodontales

Figura 4. promueve la unin de terapia celular del tejido conectivo. Despus de 3 meses de curacin en el grupo de control, muestra una micrografa Un epitelio paraqueratinizado cubriendo la enca (a), la muesca raz (b) y el hueso alveolar (c). (B) Mayor ampliacin del rea enmarcada muestra el epitelio largo de unin (a), tejido conectivo (b), cemento (C) y la dentina (d) [aumento original 40; eran muestras teidas con azul de toluidina (TB)]. En el cemento- celular derivada (CDC) de grupo, C tambin representa micrografa epitelio paraqueratinizado cubriendo la enca (a), la muesca raz (b) y el hueso alveolar (c). (D) a mayor aumento de la zona

enmarcada muestra la presencia de nueva insercin de tejido conectivo . en el grupo CDC Las fibras de tejido conectivo (a) coronal a la cresta sea (b) se insertan perpendicularmente a la recin formada cemento (C) y epitelio de unin (d) (aumento original 40; TB). En la micrografa E, el ligamento periodontal de clulas derivadas (PDLDC) muestra epitelio paraqueratinizado grupo que cubre la enca (a), la muesca raz (b) y el hueso alveolar (c). (F) Un mayor aumento de la zona enmarcada muestra la presencia de nueva insercin de tejido conectivo . Las fibras del tejido conectivo (a) coronal a la cresta sea (b) se insertan perpendicularmente a la recin formada cemento (c) (aumento original 40; TB).

. Figura 5 Terapia celular con cemento caninos derivados de las clulas (CDC) y los caninos derivados del ligamento periodontal-clulas (PDLDCs) Promueve la formacin de hueso nuevo, PDL y el nuevo cemento celular. (A) Grupo control: las fibras del tejido conectivo (a) coronal a la cresta sea (b), la muesca raz (c), cemento (d) y el epitelio largo de unin (e) [aumento original x 100; azul de toluidina (TB) mancha]. (B) CDC grupo: formacin de nuevo hueso alveolar ( a), alveolar hueso viejo (b), la muesca de raz (c), nueva formacin de cemento (d) y el antiguo cemento (e) (aumento original x 100; TB). (C) PDLDC grupo: formacin de nuevo hueso alveolar (a) , alveolar hueso viejo (b), la muesca de raz (c), nueva formacin de cemento (d) y el antiguo cemento (e) (aumento original x 100; TB). Los resultados del anlisis experimental en la histomtrico (CDC y PDLDCs) y los grupos de control se muestra en la figura 6 . Las dimensiones del epitelio (GM-JE) no fue significativamente diferente (p> 0,05) entre el grupo control (2,45 0,20 mm) y los grupos experimentales (2,18 0,26 mm para los CDC y 1,83 0,64 mm para los MSCDCs), representando el 44, 39 y 33% del defecto, respectivamente. La dimensin de la fijacin histolgica (CEJ-JE), sin embargo , fue significativamente diferente (p <0,05) entre el grupo control (3,14 0,57 mm) y los grupos experimentales (1,64 0,28 mm para los CDC y 1,68 0,50 mm para los PDLDCs), que representan el 56, 31 y 33% de la defecto, respectivamente. La dimensin de la adhesin de tejido conjuntivo gingival a la superficie de la raz entre el cemento nuevo

y el epitelio de unin (JE-CC) fue de 0,80 0,30 mm en el control, 0,30 0,10 mm en los CDCs y 0,15 0,08 mm en los PDLDCs, estas diferencias no fueron estadsticamente significativas (p> 0,05). Figura 6. histomtricos resultados 3 meses despus de la ciruga. (A) Categora histomtricos utilizados: el margen gingival (GM), cementoesmalte (CEJ), Extensin apical del epitelio de unin (JE), el nivel coronal de la recin formada cemento (CC) y el nivel coronal de hueso alveolar recin formado (OC). (B) histomtricos distancias (mm) entre la ranura y el CEJ, entre el MM y el extremo apical del epitelio de unin (JE-GM) y de la CEJ al gingival . margen (CEJ-GM) Longitud del nivel coronal de fijacin histolgica: La distancia entre el CEJ y el epitelio de unin (CEJJE). Longitud de la adherencia del tejido conectivo: Distancia entre la extensin ms apical del epitelio de unin del cemento coronal y el MOST (JE-CC), la duracin de la recin formada cemento coronal a la muesca (CC-notch) y la longitud del hueso recin formado coronal a la muesca (hueso nuevo). La duracin del nivel de insercin histolgico y la cantidad formacin de nuevo cemento-mostraron diferencias significativas 3 meses despus del tratamiento. La unidad de anlisis es el nmero de perros (n = 4), * p <0,05. (C) Las barras muestran la distribucin porcentual de los valores experimentales de los diferentes parmetros mostrados anteriormente (datos son la media Dada como error estndar de la media). * P <0,05. La dimensin de la recientemente formada cemento (CC-Notch) tambin fue significativamente diferente (p <0,05) entre el grupo control (1,56 0,39 mm) y los grupos experimentales (3,98 0,59 mm en los CDC y 04,07 0,97 mm en el PDLDCs), representando el 28, el 77 y el 74% del defecto, respectivamente. New-formacin sea fue similar en todos los grupos, siendo 2,63 0,67 mm en el control, 2,63 0,44 mm en los CDC y 03,08 1,06 mm en las PDLDCs , que representa el 48, el 54 y el 57% del defecto, respectivamente ( Fig. 6 ). En general, no hubo diferencias en ningn parmetro evaluado entre los CDI y los PDLDCs, con resultados similares obtenidos para ambos grupos. Discusin

El objetivo de este estudio fue evaluar si una terapia celular basada en la implantacin de la CS Durante la ciruga periodontal impregnado con CDC Cualquiera canino caninos o PDLDCs periodontal en defectos periodontales intraseos experimentales dara lugar a la regeneracin en el perro beagle. Los hallazgos histolgicos obtenidos mostraron que este enfoque utilizando la terapia celular regenerativa fue capaz de promover la unin significativamente nuevo con la formacin de nuevo cemento y el hueso nuevo, y adhesin del tejido conectivo a la superficie expuesta de la raz a Previamente, en comparacin con el grupo de control en el mismo soporte, pero que carecen de las clulas era, implanta en los defectos. La primera fase de esta investigacin fue aislar CDC PDLDCs canino y canino Debido a que hay pocos informes en la literatura cuando se han aislado clulas en perros. En una investigacin anterior de nuestro grupo de investigacin ( 32 ), se inform de un protocolo para el aislamiento de CDC humanos y PDLDCs, la modificacin de la tcnica se inform anteriormente por Seo et al. ( 2 ). Hemos seguido este protocolo en la presente investigacin. Una vez aisladas, las clulas obtenidas fueron capaces de crecer y proliferar, formando colonias diferentes con la capacidad de secretar mineralizado matriz, como se muestra por microscopa de campo brillante y la tincin de Von Kossa. Con el fin de caracterizar las clulas Adems, hemos utilizado anticuerpos contra CEMP-1, una protena presente en humanos especificamente cementoblastos ( 37 ). Las colonias de explantes despus de 60 d de crecimiento en vitro demostrada inmunotincin positiva de una manera similar a las investigaciones anteriores que caracterizan cementoblastos humanos ( 33,37 ). En contraste, negativo a PDLDCs Fueron CEMP--1, pero positivo para CD44 y los antgenos -STRO-1 ya se ha informado que se expresa en MSCs de humano PDL ( 2,38 ). Como existe controversia sobre el uso de STRO-1 como marcador nico para las clulas madre ( 7 ), la combinacin de varios marcadores adicionales se utilizan para identificar positivamente PDLDCs identidad. STRO-1 es uno de los primeros marcador de tambin pre-clulas osteognicas, la expresin de STRO-1 Progresivamente se pierde despus de la proliferacin celular y la diferenciacin en osteoblastos maduros ( 39 ). Esta poblacin era pre-osteognico diferenciarse adicionalmente en una poblacin de clulas osteognica por crecimiento en medio osteognico que contiene un ascrbico cido 2-fosfato ( 39 ). Hemos

tratado de caracterizar PDLDCs adicionales usando citometra de flujo. Uso de una gran serie de anticuerpos contra un nmero de marcadores de clulas madre humanas, se encontr PDLDCs que se tieron positivas para CD105 canino, pero negativos para los marcadores restantes. Desafortunadamente, la falta de caninos anticuerpos especficos no permite concluir si o MSC son PDLDCs si simplemente no se pueden teir por el ser humano de anticuerpos especficos. Adems de la caracterizacin fenotpica Una de las caractersticas de estas clulas utilizando canino marcadores especficos se justifica . Uno de los factores clave en la terapia de clulas es el uso de un vehculo apropiado para asegurar la entrega Durante la viabilidad celular, como las clulas deben mantenerse en un estado viable y liberado durante el proceso de curacin. En el presente estudio se utiliz un CS con una resorcin tiempo de 72 h. Un vehculo similar se ha usado para aplicar recombinante humana protena morfogentica sea-2 en el tratamiento regenerativo de tres paredes defectos intraseos en perros ( 40 ) y en el tratamiento de intraseos periodontales una pared defectos con la aplicacin de crecimiento / factor de diferenciacin-5 ( 41 ). hidroxiapatita / -fosfato triclcico se ha utilizado como un vehculo tambin para terapia celular en defectos periodontales creadas artificialmente en los molares mandibulares en ratas ( 2 ) y en los defectos periimplantarios en los perros ( 11 ) pero la viabilidad de clulas en este andamio es incierto. Hemos demostrado que CDCs caninas o PDLDCs Applied promovido dentro de una regeneracin periodontal CS en un experimental de tres paredes defecto intraseo periodontal. Significativamente ms alto nuevocemento y nueva insercin de tejido periodontal formacin se observ en comparacin con la aplicacin de CS sin las clulas. La grupo PDLDC regenerada tambin nuevo cemento se asemeja a un periodoncio sano, lo que sugiere regeneracin ad integrum Malthus de los tejidos periodontales. Asimismo, ambos CDCs y PDLDCs similares dado resultados relativos a la regeneracin periodontal. En otras palabras, CDCs fomentar tanto como regeneracin periodontal PDLDCs. Este resultado Debido a que no es inesperado CDC son capaces de producir factores de crecimiento especficos y formar nuevo cemento, que se consideran factores crticos en la regeneracin de tejido periodontal. Nuestros resultados proporcionan una prueba de principio sobre el uso potencial de este modo de terapia celular

para el tratamiento de la periodontales intraseos lesiones. En un estudio previo con terapia de clulas con una siembra de clulas similares a fibroblastos en defectos de fenestracin artificiales en los perros, la cantidad de cemento nuevo era slo 9-12% Formado en mayora de las muestras ( 42 ). Mejores resultados en forma similar Fueron inform de defectos con el uso de cido hialurnico como un vehculo para las clulas similares a fibroblastos, alcanzando 54% de cemento nuevo en el grupo experimental frente a 40% en el grupo de control ( 43 ). En este estudio, la cantidad de cemento nuevo era Alcanzado el 77% (3,98 mm) para el grupo CDC y el 74% (4,07 mm) para el grupo PDLDC, siendo ambos significativamente mayor (p <0,05) que el grupo de control, que alcanz el 28% (1,56 mm) de nuevo cemento. Estos valores de la nueva formacin de cemento son similares a otros estudios que lo importado en EMDs Cundo se utiliza para tratar los defectos de dehiscencia vestibular en monos, ( 44 ) o dos paredes defectos intraseos en perros ( 45 ). A diferencia de los resultados obtenidos sobre nuevo cemento, niveles similares de nueva formacin sea se produjo en los grupos experimentales y de control, que representan el 54% del grupo de los CDC, el 57% en el grupo PDLDC y el 48% en el grupo de control. Estos resultados sobre la nueva formacin de hueso se puede explicar por el modelo experimental utilizado en este estudio, como el defecto de tres paredes periodontal tiene una anatoma sea autnomo rodeado por paredes que permite una buena estabilizacin del cogulo de sangre y la promocin de la nueva formacin sea. A pesar de esto, el grupo PDLDC mostr una mayor cantidad de hueso de nueva formacin, aunque las diferencias entre los grupos no fueron estadsticamente diferentes. Un aspecto difcil de evitar durante los procedimientos quirrgicos despus de la curacin periodontal apical es la ubicacin del margen gingival en relacin a la UAC (recesin gingival). Para evitar este resultado, los abordajes quirrgicos mnimamente invasivos han descrito recientemente para el tratamiento de los defectos periodontales con el uso de recesin biolgicos (EMD), y una mnima gingival ha sido reportada ( 46,47 ). En este estudio, dos grupos de pruebas no muestran ninguna recesin gingival, en contraste con el grupo control en el que la medicin de la recesin gingival de 0,72 mm se obtuvo. Estas Los resultados representan un aumento del nivel coronal histolgico de fijacin de 3,50 mm en el grupo de los CDC,

3,73 mm en el grupo PLCDC y 2,39 mm en el grupo de control, los resultados en ambos grupos de prueba es significativamente diferente (p <0,05) a partir del resultado en el grupo de control. Uno de los inconvenientes de esta investigacin fue la falta de prueba de que se mantuvo activo durante las celdas de curacin, las clulas trasplantadas Porque el no eran etiquetadas. Era imposible saber cmo TANTO Estas clulas pueden haber contribuido a la regeneracin de los tejidos logrado. demostrada Nosotros, sin embargo , que las clulas estaban vivas cuando fueron implantados en los defectos caninos, y ambos grupos mediante la terapia celular regenerativa Conseguido significativamente mayores resultados histolgicos comparacin con el control cuando se utiliza la misma compaa pero que carecen de las clulas. Podemos especular que incluso si las clulas muri poco despus del trasplante, pueden haber contribuido positivamente al proceso de curacin. Adems, si las clulas permanecieron viables, adems se pudo diferenciarse en clulas de los responsables de los procesos de regeneracin periodontal. Aunque el nmero de perros utilizados relatively en esta investigacin era pequeo, principalmente por razones ticas, los resultados sugieren que la obtenida evidente que la implantacin de estas clulas tienen el potencial de promover la regeneracin, allanando el camino para futuras terapias celulares Malthus-estudios en el tratamiento de la la enfermedad periodontal. En conclusin, la terapia celular Desarrollado y probado en el presente estudio experimental sugiere que la implantacin de los CDC y PDLDCs en un CS en defectos periodontales creados experimentalmente en un modelo canino Promueve la regeneracin de los tejidos periodontales a travs de la formacin de nuevo cemento celular , nuevo PDL y el hueso nuevo. Los resultados experimentales de esta investigacin no puede, sin embargo, son extrapolables al tratamiento de pacientes humanos. Para ello, en primer lugar, una tcnica no invasiva confiable y predecible para la extraccin de los CDC y PDLDC debe ser desarrollado y probado. Segunda , estas clulas deben ser probados en el laboratorio para el crecimiento consistente y diferenciacin. Tercero, su viabilidad y la liberacin debe ser evaluada en contacto con los diferentes operadores. Finalmente, los estudios mediante los adecuados protocolos de seguridad estndar de terapia celular en los seres humanos debe llevarse a cabo antes de esta teraputica enfoque puede Mil en pacientes humanos. necesita ms

investigacin para el esclarecimiento de la actividad biolgica especfica en el proceso de regeneracin de los tejidos y las clulas madre cementoblastos de PDL. Agradecimientos Estamos muy agradecidos con el Dr. Songtao Shi (Facultad de Odontologa de la Universidad del Sur de California, Los Angeles, CA) para permitir que el Dr. Nez como investigador visitante en su laboratorio para aprender las tcnicas para aislar MSC humana desde el PDL. Tambin agradecemos a la Sra. Carmen Romn ( Instituto de Biologa y Gentica Molecular IBGM, Valladolid, Espaa), para la asistencia tcnica. El apoyo financiero se obtuvo para estas investigaciones a travs de becas de la Federacin de Cajas de Ahorros de Castilla y Len, Castilla y Len, Espaa (VA022A05), Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Espaa, y el Ministerio espaol de Ciencia e Innovacin, Madrid, Espaa. Este estudio fue apoyado por becas de la Federacin de Cajas de Ahorros de Castilla y Len y el Instituto Espaol de Salud Carlos III (PI07/0766). Los autores declaran que ellos no tienen ningn conflicto de intereses.