EMBRAPA - Manual de Procedimentos Do Laboratorio

61
ISSN 1517-3135
Dezembro, 2008
Manual de Procedimentos do
Laboratrio de Cultura de
Tecidos da Embrapa Amaznia
Ocidental
Ocidental
61
Embrapa Amaznia Ocidental
Manaus, AM
2008
ISSN 1517-3135
Dezembro, 2008
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria
Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento
Regina Caetano Quisen
Paula Cristina da Silva Angelo
Exemplares desta publicao podem ser adquiridos na:
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Cintia Rodrigues de Souza
Marcos Vincius Bastos Garcia
Maria Augusta Abtibol Brito
Paula Cristina da Silva ngelo
Sglia Regina dos Santos Souza
Revisor de texto: Sglia Regina dos Santos Souza
Normalizao bibliogrfica: Maria Augusta Abtibol Brito
Diagramao: Gleise Maria Teles de Oliveira
Capa: Gleise Maria Teles de Oliveira
Fotos da capa: Regina Caetano Quisen
1 edio
1 impresso (2008): 300
Todos os direitos reservados.
A reproduo no autorizada desta publicao, no todo ou em parte,
constitui violao dos direitos autorais (Lei n 9.610).
CIP-Brasil. Catalogao-na-publicao.
Embrapa Amaznia Ocidental.
Cheila de Lima Boijink
Jos Ricardo Pupo Gonalves
Luis Antonio Kioshi Inoue
Paulo Csar Teixeira
Embrapa 2008
Quisen, Regina Caetano.
Manual de procedimentos do Laboratrio de Cultura de Tecidos da Embrapa
Amaznia Ocidental / Regina Caetano Quisen, Paula Cristina da Silva ngelo.
Manaus: Embrapa Amaznia Ocidental, 2008.
44 p. - (Embrapa Amaznia Ocidental. Documentos; 61).
ISBN 1517-3135
1. Cultura de tecidos. 2. Manual. I. Quisen, Regina Caetano. II. ngela, Paula
Cristina da Silva. III. Ttulo. IV. Srie.
CDD 581.0724
Autores
Engenheira florestal, D.Sc. em Biotecnologia
Vegetal, pesquisadora da Embrapa Amaznia
Ocidental, Manaus, AM,
regina.quisen@cpaa.embrapa.br
Biloga, D.Sc. em Cincias Biolgicas/Gentica,
pesquisadora da Embrapa Amaznia Ocidental,
Manaus, AM, paula.angelo@cpaa.embrapa.br
Apresentao
No decorrer do aprofundamento da gentica de plantas como cincia,
novas metodologias foram sendo utilizadas na seleo eficiente de
gentipos, visando introduo de novas caractersticas, como aumento
de produtividade de importantes culturas agrcolas, resistncia a doenas e
pragas e a condies ambientais adversas, que resultaram em melhor
qualidade tecnolgica e nutricional do produto final.
Esses ganhos foram obtidos por meio do melhoramento gentico de
plantas e de suas ferramentas mais modernas, tais como a biotecnologia
vegetal, que tem exercido grande reflexo sobre agricultores, indstria
alimentar, consumidores e, sobretudo, no meio ambiente.
O domnio de muitas tcnicas, como a da cultura de tecidos de plantas,
assume importncia crucial no avano desse conhecimento. A cultura de
tecidos constitui excelente ferramenta para clonagem de plantas em escala
comercial, alm de colaborar na realizao de estudos de transformao
gentica e na conservao de espcies vegetais e permitir a interao
entre fatores abiticos e biticos, resultando em plantas sadias, vigorosas
e geneticamente superiores, que podem ser multiplicadas massivamente.
Considerando a importncia dessa tcnica, a compreenso e o domnio de
conceitos bsicos para a aplicao da cultura in vitro, esperamos, com a
publicao deste documento, mostrar sociedade, de forma simples e
prtica, as rotinas determinantes para o bom desempenho e
funcionamento de um laboratrio de cultura de tecidos de plantas.
Maria do Rosrio Lobato Rodrigues
Chefe-Geral
Sumrio
Manual de Procedimentos do Laboratrio de Cultura de Tecidos
da Embrapa Amaznia Ocidental.......................................9
Introduo....................................................................9
Abreviaturas e definies teis.......................................10
Cultura de tecidos vegetais - conceito e aplicaes............13
Padres morfognicos in vitro.........................................14
O ambiente e a organizao do laboratrio........................16
Equipamentos e procedimentos de segurana...................18
Autoclave...................................................................19
Equipamentos de tratamento da gua..............................19
Segurana em laboratrio..............................................23
O meio de cultura.........................................................25
Preparo do meio de cultura.............................................31
Lembretes gerais..........................................................36
Clculos.....................................................................37
Referncias.................................................................39
Anexos......................................................................42
Tabela 4. Caractersticas e armazenamento de sais minerais e
vitaminas utilizados nos meios de cultura.........................42
Tabela 5. Determinao do volume a ser aliquotado (em mL) a
partir de soluo-estoque de regulador de crescimento de
1 mg/1 mL..................................................................43
Tabela 6. Valores de concentraes e equivalncias
matemticas...............................................................44
Tabela 7. Grau de perda de compostos freqentemente
utilizados para a cultura de tecidos vegetais por meio de
aquecimento do meio de cultura.....................................44
Ocidental
Introduo
A possibilidade de manipulao de clulas, tecidos e rgos in vitro est
fundamentada na capacidade de as clulas vegetais, mesmo separadas da
planta-me, continuarem a crescer quando cultivadas em condies
apropriadas. A tcnica da cultura de tecidos vegetais parte da premissa de
que todas as clulas da planta apresentam capacidade de gerar um
indivduo, conhecida como hiptese da totipotencialidade das plantas,
formulada por Schleiden & Schivann em 1838 (VASIL et al., 1979).
Com a evoluo da tcnica na segunda metade do sculo passado, muitos
avanos relacionados ao cultivo celular tm sido obtidos, desde a
descoberta dos reguladores de crescimento, dos trabalhos pioneiros em
melhoramento at a aplicao na engenharia gentica e na transformao
gentica de plantas. Nos ltimos anos, esses estudos tm maior enfoque na
organognese, embriognese, conservao e intercmbio de germoplasma,
diferenciao, mutagnese, hibridao, produo de metablitos
secundrios, fuso de protoplastos, entre outros, demonstrando o potencial
da tcnica de cultivo in vitro para inmeras espcies e reas de pesquisa,
generalizando sua aplicao.
Nesse contexto, o presente manual foi elaborado com o intuito de
apresentar, de forma sucinta, aspectos tericos da cultura in vitro e orientar
usurios de laboratrios de cultura de tecidos vegetais, com relao
padronizao de normas, procedimentos e orientaes metodolgicas.
Abreviaturas e definies teis
ABA
BAP
2,4-D
DMSO
EDTA
GA3
AIA
AIB
2iP
MS
ANA
PEG
PVP
V/V
cido abscsico
benzilaminopurina
cido 2,4-diclorofenoxiactico
dimetilsulfxido
etilenodiaminotetracetato
cido giberlico
cido indol-3-actico
cido indolbutrico
6- (g,g-dimetilaliminol) purina
Murashige e Skoog
cido naftalenoactico
polietilenoglicol
polivinilpirrolidona
Volume/Volume
A tcnica da cultura de tecidos vegetais envolve o uso de uma srie de
termos, os quais precisam ser bem definidos para melhor entendimento
do trabalho que est sendo realizado, dentre os quais destacam-se:
!
condies ambientais, aps sua remoo da condio in vitro, antes
do transplante para local definitivo.
! Alongamento: crescimento do eixo da planta ou da clula,
principalmente na direo longitudinal.
! pice meristemtico: estrutura constituda do meristema apical e de
um ou dois primrdios foliares.
! Assepsia: na cultura in vitro, significa ausncia de qualquer
microrganismo.
! Autotrficas: clulas, plantas ou outros organismos capazes de
sintetizar carboidratos a partir de componentes inorgnicos.
! Biofbrica: mtodo de propagao massal que utiliza a
micropropagao para reproduzir plantas de interesse econmico de
forma mais rpida e homognea, conservando ou aprimorando as
caractersticas genticas iniciais e desejadas da planta que lhe deu
origem.
Aclimatao ou aclimatizao: processo de adaptao da planta s
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Manual de Procedimentos do Laboratrio de Cultura de Tecidos da Embrapa
Amaznia Ocidental
! Calo: proliferao desorganizada de clulas a partir de segmentos de
rgos das plantas, irregularmente diferenciadas, normalmente em
resposta a injrias qumicas ou fsicas.
! Clula diferenciada: qualquer clula no meristemtica.
! Clula no diferenciada: clula meristemtica ou que foi
artificialmente induzida perda da identidade tissular.
! Clone: grupo de clulas geneticamente idnticas produzidas
assexuadamente (por divises mitticas) de uma clula isolada, ou de
plantas oriundas de um nico indivduo por propagao vegetativa.
! Competncia: a capacidade de uma clula particular ou grupo de
clulas responder de maneira esperada, quando fornecido o sinal de
desenvolvimento apropriado.
! Cultura de anteras: cultivo in vitro de anteras isoladas do boto floral,
com o objetivo de obter plantas haplides.
! Desdiferenciao celular: retorno de clulas diferenciadas ao estado
meristemtico no diferenciado.
! Determinao celular: processo pelo qual o potencial de
desenvolvimento de uma clula torna-se limitado a uma rota
especfica.
! Diferenciao: processo de diversificao das caractersticas
bioqumicas, anatmicas, morfolgicas e fisiolgicas, ocorrido nas
clulas, que as distingue daquelas que lhes deram origem.
! Dominncia apical: inibio hormonal das gemas laterais (axilares)
pelas gemas apicais.
! Embrio somtico: embrio formado a partir de clulas somticas
seguindo os mesmos padres de desenvolvimento do embrio
zigtico.
! Embriognese somtica: formao de embries somticos, que daro
origem a plantas inteiras.
! Explante: material utilizado para o incio da cultura in vitro. Pode ser
um pice meristemtico, um segmento de folha ou raiz, ou qualquer
rgo da planta que melhor se adaptar para o incio da cultura. O tipo
do explante varia de uma cultura para outra.
! Fluxo laminar: padro de fluxo de ar que se movimenta no sentido
unidirecional, com velocidade constante.
11
Amaznia Ocidental
! Habituao: habilidade adquirida por uma populao de clulas de
crescer e se dividir independentemente do suprimento exgeno de
substncias reguladoras de crescimento.
! Hbrido somtico: produto da fuso de duas clulas somticas,
geneticamente diferentes. A fuso feita utilizando-se protoplastos.
! Induo: o desencadeamento de um processo morfogentico pela
exposio do explante a estmulos fsico, qumico ou biolgico.
! In vitro: termo aplicado para designar crescimento de clulas, tecidos
ou rgos vegetais em meio de cultura, em condies asspticas.
! Meio (nutritivo): combinao de sais minerais (macro e
micronutrientes), carboidrato(s), vitaminas e reguladores de
crescimento.
! Meristema: tecido composto de clulas no diferenciadas, envolvido
com sntese protoplsmica e formao de novas clulas por diviso
mittica.
! Micropropagao: propagao de plantas in vitro a partir de pices
meristemticos ou segmento nodal, com objetivo de produo de
mudas em grande escala.
! Morfognese: surgimento de qualquer rgo (parte area, flor, raiz) a
partir de clulas ou tecidos que originalmente no possuem essa
forma ou estrutura.
! Organognese: formao de brotos e/ou razes in vitro. A
organognese pode ser direta, quando a regenerao ocorre a partir
de rgos ou segmentos de material vegetal, sem passar pela fase de
calo, ou indireta, quando a regenerao ocorre a partir de calos.
! Protoplastos: so clulas desprovidas de parede celular.
! Regenerao: em cultura de tecidos de plantas, significa uma
resposta morfogentica de um explante a um estmulo que resulta na
formao de partes areas, embries ou planta.
! Repicagem: transferncia do calo ou material vegetativo em cultivo
para um novo meio nutritivo.
! Subcultura: cultura de subdivises de tecido, j estabelecido in vitro,
em novo meio.
! Suspenso celular: cultura de clulas ou agregados celulares em meio
lquido, sob agitao.
12
Amaznia Ocidental
! Tecido diferenciado: qualquer tecido no meristemtico.
! Tecido no diferenciado: tecido meristemtico, organizado, mas no
diferenciado.
! Tecido no organizado: calo somente.
! Tecido organizado: qualquer outro tecido, exceto calo.
! Totipotncia: capacidade de clulas individuais expressarem o fentipo
da planta completa da qual foram derivadas.
! Variao somaclonal: modificaes genticas ou epigenticas que
ocorrem nos tecidos cultivados in vitro. Essas variaes acontecem
com maior freqncia quando ocorre passagem pela fase de calo ou
quando h manuteno por tempo muito longo in vitro e, algumas
vezes, quando ocorrem repicagens muito freqentes.
! Vitrificao ou hiperidricidade: manifestao fisiolgica provavelmente
devida ao excesso de absoro de gua em cultura de tecidos, em
funo de diversos fatores, tomando os brotos vitrificados e
quebradios.
Cultura de tecidos vegetais - conceito e aplicaes
Entende-se por cultura de tecidos vegetais o conjunto de tcnicas de
cultivo in vitro de clulas e tecidos vegetais (explantes) em meio nutritivo
sinttico, de composio definida, sob condies adequadas de assepsia,
nutrio e fatores ambientais como luz, temperatura, O e Co para gerar
2 2
uma planta.
A cultura in vitro de plantas uma tcnica que apresenta importncia
prtica para as reas agrcola e florestal e tambm para a rea cientfica
bsica, como a biologia de plantas, onde aparece como uma das tcnicas
mais polivalentes. Um dos principais objetivos da cultura de tecidos
prover uma alternativa de manipular plantas em nvel molecular.
As principais aplicaes das tcnicas de cultura de tecidos vegetais
podem ser sumarizadas como segue:
! Micropropagao: a multiplicao rpida de indivduos vegetais. Essa
rapidez deve-se, entre outros fatores, possibilidade de obter elevado
nmero de explantes a partir de uma planta matriz, e a velocidade da
multiplicao devida ao controle, tanto do meio como das condies
ambientais nas quais se conduz a multiplicao.
,
13
Amaznia Ocidental
! Obteno de plantas livres de viroses por meio de tcnicas variadas,
tais como: cultura de meristemas, microenxertia e termoterapia, as
quais devem ser testadas por indexao.
! Melhoramento gentico vegetal: por meio da cultura in vitro
possvel: a) obteno de indivduos haplides e duplicao posterior
do genoma para dar origem a linhagens haplo-diploidizadas, diplides,
homozigticos; b) induo de mutantes visando a determinadas
caractersticas para melhoramento; c) intercmbio e conservao de
germoplasma; d) regenerao de clulas ou de tecidos transgnicos;
e) polinizao in vitro visando a romper a incompatibilidade pr-
zigtica, assim como ps-zigtica pelo resgate de embries; f)
transposio de barreiras de incompatibilidade, por meio da fuso de
protoplastos e engenharia gentica, e seleo por resistncia a
determinado agente.
! Produo de metablitos secundrios: a cultura de tecidos permite
estudar a produo de metablitos e maximizar a produo e a
extrao dessas substncias.
! No campo da aplicao bsica, a cultura de tecidos d suporte
tcnico tambm bioqumica, fisiologia vegetal, fitopatologia e
citogentica. Na bioqumica, para estudo e elucidao de rotas
metablicas. Na fisiologia, para estudos de crescimento e
desenvolvimento, efeito de metais pesados, etc. Na fitopatologia,
para estudos de toxinas. Na citogentica, para estudos de
cromossomos ou aberraes cromossmicas (quebras
cromossmicas).
Padres morfognicos in vitro
As variaes na forma e nas funes das clulas, resultantes de
mudanas quantitativas e alteraes qualitativas dos componentes
celulares, conduzem a um processo morfogentico que depende,
sobretudo, da intensidade de determinao e da competncia das
clulas (GEORGE, 1996).
Dessa forma, tecidos, rgos ou clulas com intensidades de
determinao variadas podem adquirir novas competncias por meio da
ao de certos sinais qumicos que ativam seletivamente determinados
genes.
14
Amaznia Ocidental
O controle da morfognese, segundo Thorpe (1980), exercido por
fatores internos inerentes ao explante, como gentipo, condies
fisiolgicas e correlaes entre clulas e tecidos, e tambm por fatores
externos, como meio de cultura, reguladores de crescimento e
condies ambientais.
A resposta final, nos mais variados tecidos, a expresso
morfogentica a partir de diferentes rotas: organognese e
embriognese somtica.
! Organognese: caracterizada pela produo de uma estrutura
unipolar em conexo vascular com o tecido vascular pr-existente e
ocorre com o subseqente desenvolvimento de um primrdio de gema
vegetativa ou raiz (BROWN; THORPE, 1986). Essa expresso pode
acontecer de forma direta ou indireta. No primeiro caso, a partir do
explante primrio, d-se a formao de um rgo ou meristemide. A
forma indireta, por sua vez, ocorre a partir da desdiferenciao do
explante, resultando na formao de calos, que podem ser definidos
como a proliferao de massas de clulas no diferenciadas,
conduzindo formao de meristemas morfogenticos que originam
razes ou brotos. Existem basicamente trs tcnicas de manipulao
da organognese em sistemas in vitro: a) cultura de meristemas
apicais; b) proliferao de gemas axilares; e c) induo e proliferao
de gemas adventcias.
! Embriognese somtica: uma via de expresso morfogentica, na
qual o novo indivduo, o embrio somtico, origina-se a partir de
clulas simples, no resultantes da fuso de gametas, apresentando
broto e raiz conectados por um sistema vascular fechado. A
embriognese tambm pode ocorrer de forma direta ou indireta. H
hipteses de que a embriognese direta ocorre in vitro somente a
partir de clulas do explante que so predispostas (predeterminadas)
a se transformar em embries, produzidas antes de sua transferncia
para a cultura, onde o meio e outras condies servem apenas para
incentivar o processo. A embriognese somtica indireta requer que
as clulas diferenciadas de um explante sejam induzidas a produzir
calos no diferenciados e, ento, que algumas clulas se tornem
comprometidas ou predeterminadas a entrar em uma rota
embriognica.
15
Amaznia Ocidental
Os estgios de desenvolvimento, no processo de propagao in vitro,
ocorrem em uma seqncia de passos, assim resumidos:
! Estabelecimento da cultura assptica.
! Desenvolvimento do explante, seguindo a rota escolhida para os
experimentos, o qual sofre interferncias da interao entre gentipo,
ambiente e explante.
! Transferncia das plantas para o ambiente externo.
Cada um desses estgios apresenta diferentes objetivos e exigncias,
em relao composio do meio de cultura, concentrao e tipo de
regulador de crescimento, e a condies ambientais como luz,
temperatura e fotoperodo.
O ambiente e a organizao do laboratrio
O ambiente ideal para instalao do laboratrio de cultura de tecidos
deve assegurar o mximo de isolamento do ambiente externo, a fim de
evitar contaminantes que possam inviabilizar as culturas in vitro. Surge,
portanto, a necessidade de uma instalao com caractersticas
apropriadas e com equipamentos e normas de trabalho que possibilitem
a criao de um ambiente com elevado nvel de limpeza e assepsia.
Reforando a idia de que o laboratrio deve prezar pela limpeza e
limitar a circulao de pessoas, visando ao controle de contaminao no
ambiente, algumas recomendaes so necessrias:
! As paredes e pisos devem facilitar a limpeza.
! Os acessos devem ser limitados, minimizando a entrada de sujeira,
poeira e contaminantes.
! As janelas no so necessrias, pois dificultam o controle da luz e da
temperatura, mas quando existirem devem ser duplas, para evitar a
entrada de poeira, animais e contaminantes.
! As paredes devem ser brancas, para refletir a luz e a iluminao
abundante.
! A temperatura ambiente deve ser agradvel, preferencialmente com
ar condicionado, com exceo da sala de cultura, que deve ter
temperatura, umidade e luminosidade controladas.
Amaznia Ocidental 16
De maneira geral, um laboratrio de cultura de tecidos deve ter as
seguintes dependncias:
!
ambiente externo, o qual deve conter tapetes para limpeza dos calados,
armrios para armazenamento de bolsas e sacolas dos usurios do
laboratrio, banheiros e copa-cozinha, quando necessrio.
! rea de lavagem e esterilizao: local destinado ao descarte de meios
de cultura utilizados e outros resduos, lavagem de vidrarias,
autoclavagem de gua, aos meios de cultura e a utenslios diversos.
Nesse ambiente, so obrigatoriamente colocados os equipamentos:
autoclave, destilador(es), deionizador(es), geladeira e lavador de
pipeta. Essa sala deve estar localizada distante da sala de inoculao
e, de preferncia, deve dispor de um exaustor para a eliminao de
vapores desprendidos pela autoclave. Tambm deve ser dotada de
pias com cubas grandes, bancadas, prateleiras, armrios para
armazenamento temporrio de vidrarias, estufas para secagem e
esterilizao de pinas e bisturis.
! rea de meios de cultura: local destinado ao preparo de meios de
cultura e de solues diversas. Esse ambiente deve ser de tamanho
suficiente para circulao de pessoas e para conter bancada com
gavetas e pia, armrios, prateleiras, geladeiras e freezers. Os
equipamentos necessrios para as rotinas de preparo de meios so:
pHmetro, agitador magntico, microondas, aparelho de vcuo e
balanas de preciso e analtica. As balanas devem ficar
preferencialmente em local isolado e protegido da circulao de ar.
! rea para manipulao assptica: local onde exclusivamente so
realizadas inoculaes e transferncias de material vegetal. Alm da(s)
cmara(s) de fluxo laminar, onde so manipuladas as culturas, o local
deve conter estantes para estocagem temporria de meios de cultura
j autoclavados, alm de outros materiais estreis. Deve ser localizada
prxima sala de incubao de culturas, mantida sempre fechada e
de circulao restrita ao pessoal do laboratrio.
! rea para incubao das culturas: local dotado de sistema de controle
de temperatura, luz e umidade, no qual as culturas so mantidas at o
momento de ser retiradas dos frascos. Deve conter estantes metlicas
com lmpadas fluorescentes branca-fria e/ou grow-luz fixadas na parte
inferior da prateleira, distanciadas 40 cm 50 cm entre si. Alm das
estantes, pode conter cmaras de BOD (Byosistem Organized
Ante-sala: ambiente de recepo que protege o laboratrio das aes do
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Amaznia Ocidental
Development) e mesas de agitao orbital para culturas de clulas em
suspenso. Esse ambiente deve ser mantido sempre fechado e com
entrada restrita.
! rea para observao e avaliao das culturas: ambiente pequeno
contendo bancada de trabalho para avaliaes parciais ou finais de
experimentos in vitro. Essas observaes so realizadas com auxlio de
microscpios estereoscpicos e lupas e registradas com cmaras
fotogrficas acopladas a esses equipamentos. Esse ambiente pode ser
conjugado rea de balanas.
! Almoxarifado: nesse compartimento que devem ser colocadas estantes
ou prateleiras para guardar reagentes qumicos e materiais diversos em
estoque a ser utilizados na rotina laboratorial. Deve ser ambiente de
acesso restrito, devendo-se respeitar as normas de segurana quanto ao
armazenamento dos produtos qumicos, tais como temperatura e luz.
! Casa de vegetao, cmara de nebulizao e telado: ambientes anexos
ao laboratrio, destinados aclimatao de plantas produzidas in vitro.
Dependendo da condio climtica da regio, esses abrigos podem variar
desde um simples telado at ambientes mais modernos, equipados com
sistema de nebulizao com atomizadores, mais eficientes na
manuteno permanente da umidade elevada em todo o ar na
instalao.
O laboratrio de pesquisa deve possuir no mnimo salas de preparao de
meios de cultura, de inoculao, de crescimento e de observao e uma
casa de vegetao ou telado. As biofbricas, por sua vez, devero possuir
salas de escritrio, de preparo de meio de cultura, de inoculao e/ou
crescimento, almoxarifado e casa de vegetao ou telado.
Equipamentos e procedimentos de segurana
Para o adequado manuseio dos equipamentos, imprescindvel, antes do
uso, a leitura do manual de instrues, pois, ao seguir as orientaes do
fabricante, garante-se a segurana do usurio e a boa conservao de cada
equipamento.
A seguir, algumas caractersticas comuns dos principais equipamentos so
descritas, assim como os cuidados especficos quando do manuseio desses
equipamentos.
Autoclave
Equipamento horizontal ou vertical utilizado para a esterilizao de
meios de cultura, vidrarias, gua e outros materiais utilizados no

ambiente assptico da cmara de fluxo laminar. Atravs da produo de
calor seco ou mido, a autoclave vem regulada de fbrica para trabalhar
2 o
a uma presso de 1,05 kg/cm que resulta na temperatura de 121 C. O
tamanho ideal da autoclave depende basicamente da rotina de trabalho
de cada laboratrio. Para laboratrios de pesquisa pequenos, modelos
menores so mais indicados, enquanto em laboratrios com maior fluxo
de trabalho, os equipamentos de maiores dimenses so mais indicados.
A instalao da autoclave na sala de lavagem e esterilizao deve prever
a sada de gua quente e de vapor.
Independentemente do modelo utilizado, sempre, antes de iniciar o
funcionamento desses equipamentos, obrigatria a verificao do nvel
d'gua. Caso esteja baixo, completar com gua destilada, at cobrir as
resistncias eltricas.
O tempo de autoclavagem deve ser respeitado de acordo com o material
a ser esterilizado, nunca ultrapassando os limites estipulados. O uso da
autoclave deve ser otimizado e planejado de acordo com sua
capacidade, pois um equipamento que consome muita energia. A
abertura do equipamento deve ser feita logo aps finalizao do ciclo da
autoclavagem e assim que a presso chegue a zero, comeando pela
vlvula. A tampa deve ser aberta somente quando todo o vapor estiver
sido liberado, devendo-se tomar muito cuidado, pois o vapor
extremamente quente e, em contato com a pele, pode causar srias
queimaduras. O uso de luvas de amianto recomendado.
Equipamentos de tratamento da gua
A gua de laboratrio no apenas tem uma elevada pureza em termos
inicos, como tambm livre de compostos orgnicos e
microrganismos. Uma gua muito boa tem condutividade < 1,0 S/cm
(resistividade > 1,0 MW/cm) e teor de carbono orgnico total inferior a
50 ppb. gua com essa qualidade pode ser usada para uma
multiplicidade de aplicaes que vo desde a preparao de reagentes e
solues at preparao de meios nutrientes para cultura de clulas e
estudos microbiolgicos. A gua com grau para laboratrio pode ser
produzida por destilao dupla ou por sistemas de purificao de gua
que incorporem tecnologias de purificao mltiplas a seguir:
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Amaznia Ocidental
! Destilador (aquecer, ferver, evaporar, condensar e coletar): o processo
de destilao remove partculas inicas, material voltil e
microrganismos. A destilao baseia-se na mudana da fase lquida
para a gasosa, e posteriormente para a condensada. As impurezas
volteis como gases (CO ) so difceis de ser removidas. Recomenda-
2
se que tenha reservatrio de vidro especial, pois reservatrio metlico
libera o metal correspondente na gua. No caso de esse equipamento
estar conectado entre o deionizador e a fonte de gua, esse tipo de
contaminao deixa de ser problema. O processo de destilao tem
alto consumo de energia (~1 kW/litro) e de gua (~30 L/litro), baixa
condutividade e resistividade (1 M/cm), no elimina CO e amnia
2
volteis, e um processo lento (~ 5 L/h).
! Deionizador: o processo contnuo remove impurezas dissolvidas
ionizadas, atravs da passagem da gua por resinas sintticas de troca
inica, sem ocorrer remoo da matria orgnica ou de
microrganismos. Deve ser instalado de forma que permita conexo
alternativa com o destilador ou com a fonte de gua. Quando instalado
aps o destilador, o deionizador recebe a gua com baixssimo teor de
sais, o que resulta em aumento da vida til de suas colunas. A gua
deionizada tem geralmente resistividade de 18 MW/cm.
! Osmose reversa: a purificao feita pela combinao de um cartucho
de osmose reversa com um de adsoro por carvo ativado, um de
troca inica e uma filtrao por microporo (0,22 m) produzindo gua
ultrapura, onde so removidos 100% de bactrias e matria orgnica,
90% das partculas inicas dissolvidas. Entretanto, esse processo no
promove a remoo de gases. Os equipamentos utilizados so de
maior custo; no entanto, a gua produzida tem condutividade eltrica
menor que 1 mS, baixo consumo de energia eltrica, no consome
gua de refrigerao, e apenas a gua impura expelida atravs do
dreno.
! gua ultrapura: a gua que se aproxima de graus teorticos de
pureza em termos de resistividade, teor orgnico, contagens de
partculas e de bactrias. Esse nvel de pureza obtido fazendo o
polimento da gua que foi pr-purificada por permuta inica, osmose
inversa ou destilao. A gua de grau ultrapuro necessria para
diversas tcnicas analticas sensveis e tambm em aplicaes como a
cultura de tecidos e a fertilizao in vitro (IVF).
! Peagmetro (pHmetro): aparelho necessrio para determinao e ajuste
do pH de meios de cultura e deve ter preciso de 0,1 unidade. Existem
vrios modelos que apresentam diferentes formas de funcionamento,
nos quais basicamente devem ser respeitados alguns procedimentos.
Os equipamentos devem ser ligados alguns minutos antes de sua
utilizao. Para o ajuste do aparelho, devem ser utilizados os padres
de pH, seguindo as instrues do fabricante (manual), quanto
seqncia de procedimentos para ajuste. As solues padres, quando
armazenadas em geladeira, devem ser somente utilizadas
temperatura ambiente. O meio de cultura deve ser mantido em
agitao contnua para o ajuste do pH, e o ajuste para o valor desejado
deve utilizar NaOH 0,1mol/L a 1,0 mol/L ou HCl 0,1 mol/L a 1,0 mol/L.
! Cmara de fluxo laminar: equipamento que fora a passagem de ar por
meio de um filtro bacteriolgico, de modo que seja criado um ambiente
estril com presso positiva, que evita a entrada do ar externo
contaminado. essencial no laboratrio, pois nele realizada a
manipulao assptica das culturas in vitro. Deve ser mantida em local
com bom nvel de assepsia, para preservar a vida til do filtro. Os
fluxos devem ser limpos com lcool 70% 90% ou lisoforme 5%
(com exceo do visor acrlico) antes do incio das atividades e ao final
de cada dia de trabalho. importante que a cmara no seja colocada
de frente para porta, ventilador ou aparelho de ar condicionado, os
quais podem criar correntes de ar capazes de vencer a presso positiva
gerada na cmara, mesmo distando dela. O trnsito atrs do operador
deve ser minimizado. O operador no deve atrapalhar o fluxo de ar
gerado com movimentos repetidos de retirada e introduo das mos
dentro do fluxo. Ligar o fluxo 10 minutos antes do uso e mant-lo
funcionando por pelo menos mais 5 minutos aps o trmino do
procedimento, antes de deslig-lo. Limpar novamente o fluxo aps o
uso. As lmpadas de luz ultravioleta devem ser ligadas pelo menos 20
minutos antes de iniciar o trabalho, visando a esterilizar o ambiente
interno da cmara de fluxo. Nesse caso, ningum deve permanecer no
ambiente, e as portas de acesso sala de incubao devem ser
mantidas fechadas ou a passagem da luz ultravioleta deve ser
bloqueada. importante reforar os cuidados necessrios durante a
utilizao de lmpadas UV, uma vez que elas podem causar
queimaduras, so altamente mutagnicas e devem ser mantidas
desligadas durante o trabalho na cmara. As datas de manuteno da
cmara de fluxo laminar e troca de filtro devem ser
21
Amaznia Ocidental
rigorosamente registradas e seguidas. O tempo de uso das lmpadas
de UV tambm deve ser registrado, j que elas possuem vida til
limitada. Deve-se trabalhar sempre perto de um bico de gs ou de
lamparina acesa e usar uma mscara, para evitar aspirao de
aerossol ou contaminar o ambiente com expirao, bem como lavar
as mos antes e depois da operao.
! Balanas: a balana de preciso um dos equipamentos mais caros
do laboratrio, juntamente com a autoclave e a capela de fluxo
laminar, e pouco acessvel a pequenos laboratrios, apesar de
imprescindvel para pesagem de quantidades mnimas de
fitorreguladores. Tem capacidade para pesar at 200 g e preciso de
0,1 mg. A balana analtica utilizada para a pesagem de reagentes
usados em maior quantidade. Em geral, tem capacidade para pesar
at cerca de 4 kg e preciso de 0,1 g. O manuseio de uma balana
requer muito cuidado, pois so instrumentos delicados, caros e que
podem se desregular. Quando de sua utilizao, devem ser
observados os seguintes cuidados gerais:
- Manter a balana limpa.
- No colocar os reagentes diretamente sobre o prato da balana.
- Os objetos a serem pesados devem estar limpos, secos e
temperatura ambiente.
- A balana deve ser mantida travada quando no estiver sendo
utilizada.
- As balanas analticas devem estar travadas quando da retirada e
colocao dos objetos a serem pesados.
- Nas balanas analticas, os objetos devem ser colocados e retirados
com a pina, e no com as mos.
- A balana deve ser recalibrada (informe o tcnico do laboratrio)
sempre que mudada de local ou aps longo perodo de uso.
- O operador no deve se apoiar na mesa em que a balana est
colocada.
! Micropipetas: devem ser usadas para medir quantidades muito
pequenas de lquidos que funcionam pelo deslocamento de ar,
mediante um mbolo com deslocamento determinado, que, ao
regressar ao ponto de origem, arrasta por suco um volume
conhecido de lquido. Esse volume pode ser constante, em micropipetas
de volume fixo, ou varivel, nos modelos com volumes dentro de uma
faixa determinada. As ponteiras para os mais diferentes modelos e
marcas so, geralmente, transparentes (inferior a 2 L a 10 L), amarelas
(20 L a 200 L) ou azuis (mais de 200 L). As micropipetas so
equipamentos sensveis e dispendiosos, por isso recomenda-se o mximo
de cuidado no seu manuseio e a realizao de todas as operaes
lentamente. Quando de sua utilizao, devem ser observados os
seguintes cuidados gerais:
- Observar se a pipeta tem trava que evita alterao do volume marcado
durante o uso. A pipeta deve estar destravada para que o volume
desejado seja determinado.
- Nunca forar os volumes das micropipetas para alm ou aqum dos
limites determinados pelo fabricante.
- Encaixar a ponteira com perfeio na pipeta antes do uso.
- A ponteira da micropipeta deve ser mergulhada no lquido com altura
mnima que garanta o enchimento de forma constante, contnua e sem
entrada de bolhas de ar. Observar o enchimento e, se necessrio,
pipetar novamente.
- As micropipetas devem ser manuseadas na vertical.
- Deve-se sempre mudar de ponteira quando pipetar um lquido diferente.
- No pipetar lquidos a temperaturas superiores a 70 C.
- O lquido nunca deve entrar no corpo da pipeta.
- Nunca virar a micropipeta ao contrrio.
- Nunca colocar a pipeta de lado quando tiver lquido na ponteira.
- Nunca pipetar cidos e bases fortes com as micropipetas.
- Para adicionar reagente a meios de cultura esterilizados, na cmara de
fluxo, utilizar ponteiras autoclavadas que no tenham sido expostas ao
ambiente fora da cmara de fluxo.
Segurana em laboratrio
A prtica em laboratrio, seja em nvel profissional, seja em nvel de
aprendizado, exige que regras de segurana sejam rigorosamente
23
Amaznia Ocidental
seguidas, para evitar acidentes e prejuzos de ordem humana ou
material. Os acidentes podem, se tomadas as devidas precaues, ser
evitados, ou ao menos ter suas conseqncias minimizadas.
A seguir, esto relacionadas algumas regras de segurana que devem
ser colocadas em prtica para a prpria segurana e a de toda a equipe:
! Lavar as mos com detergente antes do trabalho.
! O laboratrio deve ser mantido sempre muito limpo - manter a porta
do laboratrio sempre fechada e evitar a formao de correntes de ar.
! A equipe deve usar sempre o guarda-p (vestimenta) de algodo, de
mangas compridas, na altura dos joelhos e fechado. Importante: ter
cuidado com as mangas durante a manipulao de lamparinas.
! Usar calados fechados de couro ou similar.
! No usar relgios, pulseiras, anis ou qualquer ornamento durante o
trabalho no laboratrio.
! No beber e no comer no laboratrio.
! Nunca usar material de laboratrio para beber ou para comer.
! Nunca fumar no laboratrio ou em qualquer outro lugar que possa pr
em risco a segurana ou a sade das pessoas.
! Caminhar com ateno e nunca correr no laboratrio.
! No levar as mos boca ou aos olhos quando estiver manuseando
produtos qumicos.
! Aventais de laboratrio, luvas, culos de proteo ou outras
vestimentas no devem ser usados fora do laboratrio.
! Em caso de acidentes, manter a calma e chamar o tcnico
responsvel.
! Objetos pessoais, como bolsas, blusas, etc., devem ser guardados em
armrios, de preferncia em reas externas aos laboratrios.
! Brincadeiras so absolutamente proibidas nos laboratrios.
! Usar a capela de exausto sempre que trabalhar com solventes
volteis, txicos e reaes perigosas, explosivas ou txicas.
! Substncias inflamveis devem ser manipuladas em locais distantes
de fontes de aquecimento.
! O uso de pipetadores requerido em qualquer circunstncia ao utilizar
pipetas.
! Nunca jogar reagentes ou resduos de reaes na pia; procurar o frasco de
descarte.
! Ao final de cada utilizao, as vidrarias usadas durante o trabalho de
laboratrio devem ser esvaziadas nos frascos de descarte e enxaguadas
com gua antes de ser enviadas para limpeza.
! O tcnico responsvel deve ser avisado sobre a ocorrncia de vidrarias
trincadas, lascadas ou quebradas, antes do descarte.
! Antes de manipular qualquer reagente, deve-se ter conhecimento de suas
caractersticas com relao toxicidade, inflamabilidade e explosividade.
! Deve-se tomar cuidados especiais quando manipular substncias com
potencial carcinognico.
! Os reagentes e solues devem ser claramente identificados; solues
devem apresentar data de preparo, validade e o nome do analista que as
preparou.
! Em caso de acidente com reagentes, todo resduo deve ser limpo assim que
possvel. No caso de cidos e bases, estes devem ser neutralizados antes da
limpeza. Se no tiver certeza de qual procedimento adotar para
descontaminar o local do acidente, contatar o tcnico ou o pesquisador
responsvel pelo laboratrio.
! Seguir corretamente o procedimento padro do laboratrio, e no
improvisar, pois improvisaes podem causar acidentes; usar sempre
materiais e equipamentos adequados.
! Todas as substncias so txicas, dependendo de sua concentrao. Nunca
confiar no aspecto de uma droga, necessrio conhecer suas propriedades
antes de manipul-la.
! Receber visitas apenas fora do laboratrio, pois elas no conhecem as
normas de segurana e no esto adequadamente vestidas.
O meio de cultura
O meio de cultura deve suprir tecidos e rgos cultivados in vitro com
nutrientes, visando a atender s condies do explante no seu crescimento.
De acordo com Bown e Thorpe (1986), as composies qumica e fsica do
meio so fatores determinantes para a iniciao e o desenvolvimento das
culturas.
25
Amaznia Ocidental
Basicamente, os meios consistem de uma mistura balanceada de
macronutrientes e micronutrientes, carboidratos, fontes orgnicas de
nitrognio, vitaminas e reguladores de crescimento. Esses componentes
so, muitas vezes, agrupados e preparados como solues-estoque,
vrias vezes concentradas, das quais pores menores so tomadas
quando da preparao do meio de cultura.
Os macronutrientes so fornecidos ao meio de cultura na forma de
sais, contendo nitrognio, potssio, fsforo, clcio, enxofre e
magnsio, que so requeridos em quantidades milimolares. So
+2 +2 +
absorvidos pelas clulas vegetais como ctions (Ca , Mg e K );
+ -
nitrognio na forma de amnio (NH ) ou nitrato (NO ); fsforo como
4 3
-2 - -2
ons fosfato (HPO ) e (H PO ) e enxofre como on sulfato (SO ) . A
4 2 4 4
concentrao tima de cada nutriente, para alcanar taxas de
crescimento mximas, varia consideravelmente dependendo da espcie,
do tipo de cultura, etc.
Os elementos que so requeridos em concentraes micromolares so:
ferro (Fe), mangans (Mn), zinco (Zn), boro (B), cobre (Cu), molibdnio
(Mo), pelo que so denominados micronutrientes. Tambm
importante a incorporao de Cobalto (Co) e de Iodo (I) ao meio.
Alguns meios de cultura usam os microelementos do meio B5
(GAMBORG et al., 1968) ou misturas mais concentradas nos meios MS
(MURASHIGE; SKOOG, 1962) e H (BOURGIN; NISCH, 1967).
Algumas clulas, tecidos e plntulas cultivados in vitro no encontram
condies adequadas de iluminao e concentrao de CO e, s vezes,
2
no apresentam teores de clorofila suficientes para realizar fotossntese
que sustente o crescimento. Essas clulas e tecidos so heterotrficos
e dependem de uma fonte externa de energia que deve ser incorporada
ao meio de cultura: os carboidratos.
A fonte mais comum de carbono a sacarose, que pode ser total ou
parcialmente hidrolisada em glucose e frutose, com possibilidade de ser
igualmente utilizadas em meios especficos. Outros carboidratos que
tm sido igualmente testados incluem a lactose, a maltose, a
galactose, e o amido, no entanto esses compostos so geralmente
muito inferiores sacarose ou glucose como fonte de energia. A
sacarose normalmente usada em concentraes entre 2% 3%.
As plantas, no seu ambiente natural, sintetizam as vitaminas que so
necessrias para seu crescimento e para seu desenvolvimento. No
entanto, quando clulas ou tecidos de plantas so colocados em cultura,
algumas vitaminas podem ser limitantes para o crescimento in vitro. Esse
crescimento e a sobrevivncia podem ser aumentados pela adio, ao
meio, de fatores em que clulas e tecidos vegetais se tornaram
deficientes. As vitaminas mais freqentemente usadas so: tiamina
(vitamina B ), cido nicotnico (niacina), piridoxina e vitamina B , as quais
1 6
fazem parte do meio MS e so adicionadas em diferentes concentraes.
Alguns meios tambm contm pantotenato de clcio e biotina, mas essas
e outras vitaminas (riboflavina, cido ascrbico, cido flico), que podem
ser adicionadas, no so consideradas fatores que limitam o crescimento.
O mio-inositol, um hexitol ou composto cclico com grupos OH em todos
os seus seis carbonos, considerado estimulador de processos de
crescimento in vitro e pode servir como fonte de carboidrato.
Os aminocidos podem ser adicionados ao meio para satisfazer a
necessidade das culturas quando o nitrognio reduzido, e a
suplementao pode ser realizada pela incluso de uma protena
hidrolisada ao meio. Os aminocidos e amidas tm importncia na
amplificao das respostas morfogenticas, os quais proporcionam maior
crescimento e facilitam a diferenciao no sentido da regenerao. A
tirosina apresenta influncia na iniciao de parte area em cultura de
calos, L-arginina no enraizamento e L-serina na obteno de embries
haplides mediante o cultivo de micrsporo. As amidas L-glutamina e L-
aspagarina so benficas na obteno de embries somticos, e a
cistena includa, s vezes, como agente redutor.
Substncias complexas so preparaes obtidas de produtos naturais, de
composies indefinidas, que servem para enriquecer o meio de cultivo.
A composio desses produtos de difcil determinao e de uso restrito
a algumas culturas e de complicada repetio experimental. Uma grande
variedade de extratos foi bastante utilizada, entre eles hidrolisados de
protenas, extratos de leveduras, assim como preparados vegetais, tais
como polpa de banana, suco de laranja e de tomate. De todos, a gua de
coco o aditivo mais utilizado para um grande nmero de espcies in
vitro, freqentemente a 2% 15% (v/v). As substncias obtidas de
tecidos vegetais podem conter componentes que so reguladores de
crescimento.
27
Amaznia Ocidental
Os meios nutritivos podem ser utilizados na forma semi-slida ou lquida.
Nos meios semi-slidos, a substncia com ao geleificante freqentemente
utilizada o gar, um polissacardeo extrado de algas marinhas que d
consistncia ao meio e serve de suporte s plantas. Outros produtos tm
sido testados e/ou utilizados, tais como fitagel, agarose, amido, entre
outros.
Os reguladores de crescimento so fatores determinantes, no crescimento e
no padro de desenvolvimento, na maioria dos sistemas de cultura de
tecidos. As auxinas, as citocininas e as giberelinas so os grupos de
reguladores de crescimento mais freqentemente utilizados. A ao das
auxinas verificada na induo do alongamento celular e na diferenciao de
razes em culturas in vitro, entre muitas outras aes como: induo de
embriognese, aumento da friabilidade de calos, alongamento de entrens,
etc. As citocininas constituem o grupo de reguladores indispensveis
diviso celular, quebra de dominncia apical, induo e proliferao de
gemas axilares e diferenciao de gemas adventcias, induo de parte
area em calos. Dentre as diversas giberelinas, o GA o mais
3
freqentemente utilizado, e tem efeito relacionado estimulao do
crescimento de rgos, como o alongamento de caule e de razes, assim
como ao desenvolvimento de embries somticos e ao florescimento. De
outros grupos de reguladores, tambm se aplicam o cido abcsico, como
inibidor de crescimento e indutor da maturao de embries, e o etileno,
regulador produzido pela prpria planta, na forma gasosa. Para leitura um
pouco mais completa das aes dos reguladores de crescimento, deve-se
consultar a literatura especializada e lembrar que, na maioria das situaes,
necessrio que ocorra um equilbrio entre os reguladores fornecidos no meio
de cultura e, ainda, entre estes e os reguladores endgenos dos explantes,
para que a rota de desenvolvimento pretendida para os experimentos seja
alcanada.
Alm dos componentes bsicos, outras substncias podem ser incorporadas
aos meios de cultura com fins especficos, conforme relacionados abaixo:
! Fungicidas e antibiticos para o controle da contaminao.
! A adenina, utilizada na forma de sulfato de adenina, pode ter o efeito de
uma citocinina fraca ou interagir com as citocininas do meio.
! Carvo ativado, utilizado para a adsoro de impurezas e substncias
txicas, como os fenis, e para a reduo dos efeitos residuais das
citocininas, alm de utilizado para estimular o enraizamento e a maturao
de embries somticos.
! Outros antioxidantes como PVP e cido ascrbico.
Vrios meios de cultura tm sido testados e identificados pela
composio em sais minerais. As vitaminas, reguladores e outros
suplementos orgnicos variam amplamente, com respeito a sua
composio e concentrao. A escolha do meio de cultura depende da
espcie em questo e do propsito da cultura.
! O meio White (1951) foi utilizado durante anos como meio bsico
para a cultura de grande variedade de tecidos de diferentes espcies.
A mudana de padro, ao longo de anos aps seu estabelecimento,
seguiu as tentativas de otimizar o crescimento de calos in vitro.
! O meio MS (Murashige e Skoog, 1962) universalmente usado,
especialmente para morfognese, cultura de meristemas e
regenerao de plantas, e caracteriza-se pela elevada concentrao de
sais minerais.
! O meio B5 foi desenvolvido por Gamborg et al. (1968) e contm
quantidades mais baixas de sais minerais, o que parece ser preferido
pelas clulas de determinadas espcies.
! O meio SH (Schenk e Hildebrant, 1972) tem concentraes inicas
finais semelhantes s de Gamborg et al. (1968), porm com nveis
+2 +2
mais altos de Ca , Mg e H PO , e mais comumente utilizado na
2 4
cultura de leguminosas.
! O meio Anderson (1978, 1980) tem sido recomendado para lenhosas
e apresenta 1/4 das concentraes de on de nitrato, amnia e
-3
potssio do meio MS e o dobro de nveis de PO .
! O meio WPM - Wood Plant Medium (Lloyd e Mc Cown, 1981)
amplamente utilizado para propagao de arbustos e rvores, em
-
laboratrios comerciais. Apresenta as mesmas concentraes de NO
3
+
e NH que o meio Anderson, alm de mais potssio e alto nvel de
4
ons sulfato.
As composies dos meios citados acima, utilizados em cultura de
tecidos, esto relacionadas na Tabela 1.
29
Amaznia Ocidental
Tabela 1. Composio bsica dos principais meios de cultura.
b
*White (1963), White (1937).
**Originalmente 28 mg/L de FeDTPA.
-1 a #
***Gamborg (1977) incluiu 1,3 mg L de nicotinamida; Gamborg (1968); Murashige e
-1
Skoog (1962) suplementado tambm incluiu 1g L de hidrolisado protico.
Macronutrientes
CaCl
2
CaCll . 2 Hl O
2 2
Ca(NO )l . 4 Hl O
3 2 2
KCl
KHl PO
2 4
KNO
3
K2SO
4
MgSO .7Hl O
4 2
NaHl PO .Hl O
2 4 2
Nal SO
2 4
NH NO
4 3
NH Hl PO
4 2 4
(Nh )l SO
4 2 4
Micronutrientes
CoCll . 6 Hl O
2 2
CuSO
4
CuSO . 5 Hl O
4 2
Fe(SO )
4 3
H BO
3 3
KI
MnSO . 4 H O
4 2
Hl MoO .Hl O
2 4 2
Nal MoO .2 Hl O
2 4 2
ZnSO .7 Hl O
4 2
Fe(SO ) . 7 Hl O
4 2
Nal EDTA . 2 Hl O
2 2
Orgnicos
cido flico
cido indol actico
cido nicotnico
Biotina
Glicina
Mio-inositol
Piridoxina.hcl
Tiamina.hcl
-
150,0
-
-
-
2.500,0
-
250,0
150,0
-
-
-
134,0
0,025
-
0,025
-
3,0
0,75
13,2
-
0,25
2,0
27,8**
37,2**
-
-
1,0
-
-
100***
1,0***
10,0***
166,0
-
-
-
68,0
950,0
-
185,0
-
-
720,0
-
-
-
-
0,025
-
10,0
-
-
-
0,25
10,0
27,8
37,2
0,5
0,1
5,0
0,05
2,0
100
0,5
0,5
-
440,0
-
-
170,0
1900,0
-
370,0
-
-
1650,0
-
-
0,025
-
0,025
-
6,2
0,83
-
-
0,25
8,6
27,8
37,2
-
-
-
-
-
100
-
0,4
-
440,0
-
-
170,0
1900,0
-
370,0
-
-
1650,0
-
-
0,025
-
0,025
-
6,2
0,83
22,3
-
0,25
8,6
27,8
37,2
-
-
0,5
-
#
2,0
100
0,5
0,1
-
-
300,0
65,0
-
80,0
-
720,0
19,0
200,0
-
-
-
-
-
0,001
2,5
1,5
0,75
5,0
1,25
-
3,0
-
-
-
-
96,0
556,0
-
170,0
-
990,0
370,0
-
-
400,0
-
-
-
-
0,25
-
6,2
-
22,3
-
0,25
8,6
27,8
37,2
-
-
b
1,0
-
200,0
-
-
-
2.500,0
-
400,0
-
-
-
300,0
-
0,1
0,2
-
5,0
1,0
13,2
-
0,1
1,0
15,0
20,0
-
-
5,0
-
-
1000
0,5
5,0
a
B5 SH H LS MS White* WPM Componente
-1
mg L
Preparo do meio de cultura
Para cada fase de desenvolvimento da cultura in vitro, as formulaes ou
dosagens dos meios variam conforme as necessidades da espcie
cultivada. Esses meios se baseiam nas exigncias nutricionais das
plantas, com algumas modificaes, para atender s necessidades
especficas in vitro.
O preparo do meio de cultura uma das etapas que mais demandam
tempo, portanto, com o propsito de otimizar a rotina no laboratrio,
conveniente e prtico armazenar os componentes do meio em solues-
estoque concentradas. Tendo-se as solues-estoque de sais, vitaminas
e reguladores de crescimento prontas, o preparo de meios de cultura
torna-se bastante rpido.
Cada laboratrio pode adotar diferentes procedimentos para preparo dos
meios nutritivos; entretanto, deve-se tomar cuidado quando do preparo,
pois determinados sais no podem ser misturados em uma mesma
soluo.
Todas as solues devem ser preparadas com gua destilada e
deionizada, sempre observando as exigncias de solubilidade e
armazenamento da substncia qumica. A gua da torneira no
adequada para o preparo de solues-estoque e meios de cultura, dada a
possiblidade de impurezas nela contidas, como ctions (amnio, clcio,
ferro, magnsio, sdio, potssio), nions (bicarbonato, nitrato, sulfato e
fosfato), matria orgnica, slica, metais, microrganismos e gases
(amnia).
Deve-se prestar ateno frmula qumica exata dos reagentes que
esto sendo utilizados para fazer as solues, verificando sempre se est
pesando exatamente o mesmo reagente descrito nas tabelas, alm de
conferir os pesos moleculares (MW ou FW em rtulos na lngua inglesa).
A Tabela 2 apresenta as quantidades de sais minerais utilizadas para o
preparo das solues-estoque do meio MS aplicado no Laboratrio de
Cultura de Tecidos da Embrapa Amaznia Ocidental, no qual a
-1
concentrao das solues-estoque expressa em g L , e preparado
numa concentrao 100 vezes maior que a concentrao final. As
solues devem ser armazenadas em frascos escuros e em geladeira.
Tabela 2. Relao e concentrao das solues-estoque do meio de
cultura MS.
Os estoques de macronutrientes (A, B, C, D e E) devem ser dissolvidos
em 500 mL de gua destilada e deionizada cada. Em seguida, completar
os respectivos volumes para 1.000 mL e agitar bem. Armazenar em
frascos na geladeira.
O estoque de micronutrientes (F) preparado dissolvendo-se cada um
dos micronutrientes, um aps o outro, em 300 mL de gua destilada e
deionizada, completando o volume para 1.000 mL, seguido de agitao.
O preparado deve ser colocado em frasco e armazenado em geladeira.
32
Amaznia Ocidental
Soluo-estoque Componente
g L-1
165,0
190,0
44,0
37,0
17,0
1,690
0,620
0,860
0,083
0,025
0,0025
0,0025
3,73
2,78
0,01
0,05
0,05
0,2
10,0
Concentrao
Macronutrientes
A
B
C
D
E
Micronutrientes
F
Fe.EDTA
G
Misturas orgnicas
H
I
J
NH NO
4 3
KNO
3
CaCl . 2H O
2 2
MgSO . 7H 0
4 2
KH PO
2 4
MnSO . H O
4 2
H BO
3 3
ZnSO 7H 0
4 2
KI
Na MoO . 2H O
2 4 2
CuSO . 5H O
4 2
CoCl . 6H O
2 2
Fe.EDTA
Na EDTA . 2 H O
2 2
FeSO . 7H O
4 2
tiamina . HCl
cido nicotnico
piridoxina . HCl
glicina
mio-inositol
O estoque (G) (Fe.EDTA) preparado com a diluio de Na EDTA . 2H O
2 2
em 800 mL de gua destilada e deionizada morna. Aps dissoluo,
manter a agitao e adicionar lentamente o FeSO . 7H O. Aps
4 2
dissoluo, completar o volume para 1.000 mL e agitar novamente.
Colocar em frasco escuro, coberto com papel alumnio, e armazenar em
geladeira.
Dessa forma, para o preparo de 1.000 mL de meio MS, deve-se usar 10
mL de cada soluo-estoque.
Para as vitaminas, tambm so preparadas solues-estoque e, nesses
casos, por tratar-se de solues orgnicas, recomenda-se preparo em
frascos menores ou estocagem em freezer, a fim de dificultar o
desenvolvimento de microrganismos. O estoque (H) preparado
dissolvendo-se os trs componentes em 300 mL de gua destilada e
deionizada e, em seguida, completando o volume para 1.000 mL,
agitando bem e armazenando em frasco na geladeira. Da mesma
maneira so preparadas as solues I e J.
No caso de reguladores de crescimento, deve-se ficar atento
solubilidade do produto. As solues so preparadas pesando-se a
quantidade devida, que dissolvida com posterior adio de gua. Os
reguladores de crescimento so mais exigentes que as vitaminas, com
relao solubilidade. As solues devem ser armazenadas em freezer,
em frascos pequenos, para evitar congelar e descongelar a mesma
soluo vrias vezes.
Quase todos os reguladores so relativamente solveis em gua.
Recomenda-se dissolver as auxinas (cidos orgnicos) em base na
proporo de 3 gotas da base para cada 10 mg da auxina e gua. As
citocininas (bases orgnicas) devem ser dissolvidas em cido na mesma
proporo usada para as auxinas. No entanto, as citocininas se
dissolvem em base com certa facilidade. Gamborg (1984) recomenda o
uso do lcool etlico para a dissoluo dos reguladores de crescimento.
Cuidados devem ser observados no uso de lcool, pois este inibidor da
embriognese in vitro. Os reguladores podem ser preparados em
solues concentradas, para que pequenas quantidades sejam
adicionadas ao meio sem alterar as outras caractersticas.
33
Amaznia Ocidental
Na Tabela 3 so detalhadas as caractersticas de vrios reguladores de
crescimento.
Tabela 3. Caractersticas, fatores de converso e solventes de alguns reguladores de
crescimento.
Os reguladores de crescimento que so termolbeis devem ser
esterilizados por ultrafiltrao. Esse processo mais lento e mais caro
que a autoclavagem, mas garante a integridade dos reguladores no meio
de cultura. As solues a ser esterilizadas so passadas por um filtro
com tamanho de poro de 0,22 m de dimetro em um recipiente
esterilizado. Pequenos volumes de solues (10 mL ou 20 mL) devem
ser passados atravs de uma unidade de filtro com adaptador para
seringa preso a uma desta e estocados. Depois de calculada a
quantidade necessria para o preparo do meio, a soluo-estoque
filtrada pode ser adicionada ao meio autoclavado que foi deixado
resfriar, at atingir aproximadamente 45 C, utilizando-se micropipeta
com ponteiras autoclavadas dentro da cmara de fluxo.
Grandes volumes de soluo, como a esterilizao de acares,
necessitam ser passados por um filtro de dimetro maior, sob presso
ou vcuo em vidrarias autoclavadas.
2,4-D = diclofenoxiactico; AIA = cido indolil-3-actico; AIB = cido indloil-3-butrico; ANA = cido
alfa-naftaleno actico. Citocinina = BAP (BA) = benzilamino purina; KIN = cinetina; TDZ =
6
thidiazuron; 2-iP = N 2-isopenteniladenina; Z = zeatina. (Outros: GA = cido giberelico; ABA =
3
cido abcsico. * Armazenamento do reagente slido. Verifique sempre no rtulo dos frascos qual a
temperatura de armazenamento de tudo que estiver utilizando.
175,2
203,2
186,2
221,0
241,5
215,2
225,3
203,2
219,2
220,2
346,4
264,3
Peso
molecular
gotas de NaOH 1M
ou etanol ou KOH 1M
gotas de NaOH 1M
gotas de NaOH 1M
gotas de NaOH 1M ou etanol
gua
gotas de HCl 1M
gotas de HCl 1M
gotas de HCl 1M
gotas de HCl 1M
lcool 70% ou DMSO
etanol 50% ou NaOH
gua + gotas de HCl 1
Solvente
filtragem
autoclave
autoclave
autoclave
autoclave
autoclave
autoclave
filtragem
autoclave
filtragem
filtragem
Esterilizao
Auxinas
AIA
AIB
ANA
2,4-D
Picloram
Citocininas
KIN
BAP
2-ip
Z
TDZ
Outros
GA
3
ABA
Regulador Converso
5,71
4,92
5,37
4,53
4,65
4,44
4,92
4,56
4,54
2,89
3,78
mg/L em
mmol/L
mmol/L
em mg/L
0,175
0,203
0,186
0,221
0,215
0,225
0,203
0,219
0,220
0,346
0,264
0
5
ambiente
ambiente
0
ambiente
0
0
0
ambiente
-20
Armazenamento
em C*
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Amaznia Ocidental
35
Amaznia Ocidental
Tendo-se as solues-estoque de sais, vitaminas e reguladores de
crescimento prontas, o preparo de meios de cultura torna-se bastante
rpido. Antes de preparar o meio, deve-se calcular a quantidade
necessria de cada soluo para o preparo do volume de meio de cultura
desejado, anotar os valores em formulrio prprio, o qual serve como
roteiro de trabalho. Tambm devem ser anotadas, nesse roteiro, as
quantidades a ser adicionadas de sacarose, vitaminas, reguladores de
crescimento e o agente solidificante. O volume de cada soluo deve ser
retirado com pipeta, para maior preciso, utilizando-se sempre uma pipeta
para cada frasco, a fim de evitar contaminao das solues.
Esse preparo pode ser realizado adotando-se diferentes formas de
procedimentos. A seguir so descritos dois mtodos.
Passos para o preparo do meio - Mtodo 1
! Primeiramente ligar o peagmetro (pHmetro) meia hora antes do uso, e
somente depois desse perodo calibr-lo com solues padres.
! Definida a quantidade de meio a ser preparada, preencher o formulrio
de meio de cultura. Exemplo: para fazer 1.000 mL de meio (1 L),
inicialmente aferir o volume a ser preparado, marcando-se, no Becker, o
volume final, no caso 1 L de gua estril.
! Transferir aproximadamente 700 mL (seguindo o exemplo) para outro
recipiente, para utilizar ao final.
! Nos aproximados 300 mL de gua destilada deionizada que restarem
no Becker, adicionar as solues-estoque, considerando a concentrao
adotada no laboratrio; no caso do Laboratrio da Embrapa Amaznia
Ocidental, tomar 10 mL por litro de meio a ser preparado.
! Adicionar a sacarose j pesada e levar a soluo ao pHmetro.
! No pHmetro j calibrado, ajustar o pH com auxlio de micropipeta e
solues prprias, sempre sob agitao. O pH final deve ser entre 5,6-
5,8 ou conforme solicitado.
! Pesar o gar e acrescent-lo soluo, assim como a maior poro da
gua reservada inicialmente.
! Levar a soluo ao microondas em potncia alta por aproximadamente
7 minutos, agitando no tempo intermedirio. Esse meio ficar pronto
quando estiver transparente, comeando a ferver. Cuidar para no
formar grumos. Ao final do tempo no microondas, retirar e completar
o volume pr-estabelecido (no exemplo, 1.000 mL) com gua morna.
Distribuir nos frascos, vedar muito bem com papel alumnio e levar
para a autoclave a 120 C, por 1520 minutos.
Passos para o preparo do meio Mtodo 2
! Primeiramente ligar o pHmetro meia hora antes do uso, e somente
depois desse perodo calibr-lo com solues padres.
! Definida a quantidade de meio a ser preparado, preencher o
formulrio de meio de cultura.
! Pesar a quantidade necessria de gar e sacarose.
! Colocar 40% do volume de gua deionizada em recipiente apropriado
ao volume final a ser preparado. Pipetar as solues-estoques e
dissolver a sacarose. Completar com gua a metade do volume final.
! Ajustar o pH com auxlio de micropipeta e solues prprias, sempre
sob agitao. O pH final deve ser de 5,8.
! Em outro recipiente, colocar o gar e a outra metade do volume final
(gua) e dissolver em microondas em potncia alta, agitando de vez
em quando. Esse meio ficar pronto quando estiver transparente,
comeando a ferver.
! Misturar as partes, distribuir nos tubos ou frascos e vedar bem com
papel alumnio ou tampa plstica e levar para a autoclave a 121 C,
por 20 minutos.
Lembretes gerais
! Os qumicos so dissolvidos em gua destilada. Os sais devem ser
sempre dissolvidos pela adio, um por vez. A precipitao
normalmente evitada pela dissoluo de fontes de nitrognio
inorgnico primeiro. A precipitao pode ocorrer entre as fontes de
fosfato ou de clcio, quando o pH for aproximado a 6,0. Depois da
dissoluo dos sais e de outros ingredientes, o pH ajustado.
! As solues-estoque dos reguladores de crescimento podem ser
preparadas nas concentraes de 1 mg/L. Observe a quantidade (g)
do reagente que vai pesar, antes de iniciar o preparo de meio. Alguns
reguladores so adquiridos em pequenssimas quantidades. Em caso
de dvidas, procure o responsvel pelo Laboratrio.
-
36
Amaznia Ocidental
! Observar, com freqncia, o funcionamento do pHmetro, o timer da sala
de crescimento e a condutividade eltrica da gua utilizada no laboratrio.
! A limpeza do laboratrio deve ser realizada diariamente, e semanalmente,
com gua sanitria e desinfetante, principalmente na sala de crescimento.
Clculos
A seguir so colocados alguns conceitos qumicos, transformaes e
principais clculos matemticos aplicados nas rotinas do laboratrio, os
quais so necessrios antes do preparo de solues e meios de cultura.
! Soluo molar (M) = 1 mol (corresponde ao peso molecular em gramas)
de uma substncia em 1 litro de soluo.
! Soluo milimolar (mM) = 1/1.000 = 0,001 de um mol (mmol) de uma
substncia em 1 litro de soluo = 0,001 M.
! Soluo micromolar (M) = 1/1.000.000 = 0,000001 de um mol (mol)
de uma substncia em 1 litro de soluo = 0,000 001 M.
! Normal (N) = 1 equivalente grama de uma substncia em 1 litro de
soluo.
-1 -1
! ppm = mg L ; g mL .
! Molaridade (M): indica o nmero de molculas da substncia em um
volume da soluo. Uma soluo molar preparada pesando-se um mol
(peso molecular) da substncia, o qual dissolvido num solvente, de
modo a se obter 1 litro da soluo.
Ex. Preparo de uma soluo 1 M ou mol/L de KNO
3
PM = 101,10 g
KNO3
Pesar 101,10 g e completar o volume com gua destilada e
deionizada, para 1000 mL.
! Porcentagem (%): indica qual a porcentagem do volume total que
corresponde ao soluto.
Ex. Preparo de 100 mL de uma soluo 2% de sacarose.
Pesar 2 g de sacarose.
Completar o volume, com gua destilada e deionizada, para 100
mL.
! Peso por volume (p/v): indica qual o peso do soluto presente no volume
de soluo.
37
Amaznia Ocidental
Ex 1. Preparo de 1.000 mL de uma soluo com 101,10 g de
KNO .
3
Pesar 101,10 g de KNO .
3
Completar o volume com gua destilada e deionizada, para
1.000 mL.
Ex. 2. Preparo de 1.000 mL de KNO 10% p/v ou 10:1.000 p/v
3 .
Pesar 10 g de nitrato de potssio e fazer soluo em 1 litro
! Volume por volume (v/v).
Ex. 1. Preparo de Tween 2% (v/v).
Pipetar 2 mL de Tween e completar a soluo para 100 mL.
! Parte por milho (ppm): indica uma soluo com a presena de 1 mg
de soluto em 1.000 mL da soluo, ou 1 g em 1 mL, e assim por
diante.
! Adio de reguladores de crescimento: a aplicao pode ser feita
diretamente ao meio de cultura pela pesagem e diluio em solvente
apropriado ou utilizando-se volume de soluo-estoque previamente
preparada. Nesse ltimo caso, basta calcular a quantidade de volume
a ser retirado na soluo e acrescentar ao meio. Esse volume deve ser
determinado por meio da seguinte frmula:
V x C = V x C
A A B B
Onde: V o volume da soluo-estoque a ser tomado.
A
C a concentrao da soluo-estoque.
A
V o volume de meio a ser preparado.
B
C a concentrao desejada no meio a ser preparado.
B
Exemplo: Uma soluo-estoque de BAP tem concentrao de 10 mg/100
mL e deseja-se preparar 1.000 mL de meio de cultura contendo 0,5 mg/L de
BAP. Para tal, deve-se determinar o V aplicando V x C = V x C , onde
A A A B B
tem-se:
V x 100 mg/L = 0,5 mg/L x 1.000 mL.
A
V = 0,5 x 1.000 / 100.
A
V = 5 mL da soluo-estoque, para preparar 1 litro do
A
meio de cultura
Sempre observar se as unidades aplicadas na frmula so as mesmas, caso
contrrio estas devem ser uniformizadas.
38
Amaznia Ocidental
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41
Amaznia Ocidental
Tabela 4. Caractersticas e armazenamento de sais minerais e vitaminas utilizados nos
meios de cultura.
Compostos inorgnicos
Compostos orgnicos
cido brico
Cloreto de clcio anidro
Cloreto de clcio dihidratado
Cloreto de cobalto
Cloreto de nquel
Cloreto de sdio
EDTA dissdico
Fosfato de K monobsico
Iodeto de potssio
Molibdato de sdio
Nitrato de amnio
Nitrato de clcio
Nitrato de potssio
Sulfato de amnio
Sulfato de cobre
Sulfato de magnsio
Sulfato de mangans monohid.
Sulfato de mangans tetrahidr.
Sulfato de potssio
Sulfato de zinco
Sulfato frrico
Sulfato ferroso
cido ascrbico
cido ctrico
cido flico
cido nicotnico
Adenina
Biotina
Glicina
Inositol
Pantotenato de clcio
Piridoxina.HCl
Riboflavina
Sacarose
Tiamina.HCl
61,8
110,9
147,0
237,9
237,7
58,4
372,2
136,1
166,0
241,9
80,0
236,2
101,1
132,1
249,7
246,5
169,0
223,0
174,3
287,5
372,3
278,0
Solvente
Solvente
gua
gua
gua
gua
gua
gua
gua
gua
gua
gua
gua
gua
gua
gua
gua
gua
gua
gua
gua
gua
gua
gua
gua
gua
NaOH 1mol/L
gua
gua
NaOH 1mol/L
gua
gua
gua
gua
NaOH
gua
gua
Esterilizao
Esterilizao
autoclave
autoclave
autoclave
autoclave
autoclave
autoclave
autoclave
autoclave
autoclave
autoclave
autoclave
autoclave
autoclave
autoclave
autoclave
autoclave
autoclave
autoclave
autoclave
autoclave
autoclave
autoclave
filtragem
autoclave
filtragem
autoclave
autoclave
autoclave
autoclave
autoclave
autoclave
autoclave
autoclave
autoclave
Armazenagem*
Armazenagem
ambiente
ambiente
ambiente
ambiente
ambiente
ambiente
ambiente
ambiente
ambiente
ambiente
ambiente
ambiente
ambiente
ambiente
ambiente
ambiente
ambiente
ambiente
ambiente
ambiente
ambiente
ambiente
- 0 C
- 0 C
- 0 C
- 0 C
- 0 C
- 0 C
- 0 C
- 0C
ambiente
- 0 C
PM
176,1
192,1
441,4
123,1
135,10
244,3
75,07
180,16
476,5
205,6
376,4
342,30
337,3
PM
*Armazenamento do reagente slido. Verifique sempre, no rtulo dos frascos, qual a
temperatura de armazenamento de tudo que estiver utilizando.
Anexos
42
Amaznia Ocidental
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Tabela 6. Valores de concentraes e equivalncias matemticas.
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1:200
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1:1000
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1:10000
1:20000
1:50000
1:100000
1:200000
1:500000
1:1 milho
1:2 milhes
1:5 milhes
1:10 milhes
1:20 milhes
1:50 milhes
1:100 milhes
1:200 milhes
1:500 milhes
1:1 bilho
1
0.5
0.2
0.1
0.05
0.02
0.01
0.005
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0.001
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0.0002
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0.00005
0.00002
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0.000005
0.000002
0.000001
0.0000005
0.0000002
0.0000001
%
ppb
10
5
2
1
0.5
0.2
0.1
0.05
0.02
0.01
0.005
0.002
0.001
0.0005
0.0002
0.0001
0.00005
0.00002
0.00001
0.000005
0.000002
0.000001
g/L (p/v)
10000
50000
2000
1000
500
200
100
50
20
10
5
2
1
0.5
0.2
0.1
0.05
0.02
0.01
0.005
0.002
0.001
10000
5000
2000
1000
500
200
100
50
20
10
5
2
1
ppm
Tabela 7. Grau de perda de compostos freqentemente utilizados para cultura
de tecidos vegetais por meio de aquecimento do meio de cultura.
Composto
ABA
frutose
cido giberlico
L-glutamina
AIA
AIB
cinetina
extrato de malte
PBA
piridoxina
2-iP
tiamina
Zeatina
Grau de degradao
algum
substncia inibitria
leve
alto
40% perda em 20autoclave
20% perda em 20autoclave
leve
substncia inibitria
leve
leve
leve
alto em pH<5,5
leve
44
Amaznia Ocidental

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