Plant Physiol. octubre 2012; 160 (2) : 1023-1036. . Publicado en Internet el 09 de agosto 2012 doi: 10.1104/pp.112.

202945 PMCID: PMC3461527

El efecto de TESTA2 TRANSPARENTE en la biosntesis de cidos grasos de semilla y tolerancia al estrs ambiental durante el establecimiento de las plntulas jvenes en Arabidopsis
1, [W] [OA]

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ABSTRACTO
En las plantas, los cidos grasos ( AG ) y FA derivados de lpidos complejos son de carbono principal y reservas de energa en las semillas. Son componentes esenciales de las membranas celulares y las molculas de seales celulares o la hormona. Aunque TESTA2 TRANSPARENTES ( TT2 ) est bien estudiado por su funcin en la regulacin de la biosntesis de proantocianidina en la testa, se ha prestado poca atencin a su papel en la semilla que afecta FA acumulacin y tolerancia al estrs ambiental. Se demuestra que la tt2 mutacin aumenta notablemente la semilla FA contenido, disminucin de peso de la semilla, y alter la FA composicin. El aumento de la FA contenido en los TT2 semillas era debido a la disminucin relativa de la proporcin cubierta de la semilla, as como el ms eficiente FA sntesis en el tt2embrin. Microarray anlisis revel que tt2 mutacin regulados hasta un grupo de genes crticos para laFA biosntesis y el desarrollo embrionario. La mutacin tambin alter la expresin de genes que responden al estrs. El anlisis de microarrays descubierto que el aumento de la FA acumulacin de losTT2 semillas fueron acompaados por el significativo sobre regulacin de FUSCA3 , un factor de transcripcin para el desarrollo embrionario y ELONGASE1 CIDOS GRASOS , que cataliza la elongacin de FA cadenas. Por otra parte, una menor acumulacin de protena de la semilla durante la maduracin de la semilla tambin contribuy a la semilla aument FA acumulacin en TT2 mutantes.Este estudio avanza la comprensin de la TT2 gnica en semilla FA acumulacin y estreses abiticos durante la germinacin y establecimiento de plntulas. En Arabidopsis ( Arabidopsis thaliana ), semillas maduras constan de tres componentes principales, a saber, el embrin, endospermo y cubierta de la semilla. Los cidos grasos ( AG ) y FA derivados de lpidos complejos se encuentran entre las principales reservas de energa predominantemente almacenados en el embrin de la semilla, que se desarrolla en la planta vegetativa. las AF y FA lpidos derivados de facilitar la germinacin de las semillas y las plntulas establecimiento exitoso ( Li et al., 2006 ). Desarrollo de la semilla puede ser dividido en dos etapas principales, morfognesis embrionaria ( EM ) y la maduracin (Baud y Lepiniec, 2009 ). EM se inicia con la fertilizacin del doble en antropos vulos

bitegumentado. A travs de una serie de divisiones celulares programados, el embrin adquiere la arquitectura bsica de la planta ( Mayer y Jrgens, 1998 ; . Jenik et al, 2007 ). A los 6 das despus de la polinizacin ( DAP ), el embrin de Arabidopsis se convierte en forma de torpedo, y EM se logra. La fase de maduracin 7 a 20DAP se caracteriza por la acumulacin de compuestos de almacenamiento, tales como semilla de FA y protenas, y la adquisicin de la tolerancia a la latencia y de la desecacin ( Goldberg et al, 1994. ; Baud et al, 2002. ; Fait et al ., 2006 ). Finalmente, durante los ltimos das de maduracin de la semilla, la sntesis de almacenamiento compuesto termina y el embrin se convierte metablicamente inactivo. La acumulacin de las semillas de FA aumenta bruscamente entre el 7 y el 17 de DAP con un nivel mximo de 18 DAP . Una ligera disminucin en el contenido de semillas de lpidos se ha observado en varias especies de semillas oleaginosas, incluyendo Arabidopsis, al final del proceso de maduracin ( Turnham y Northcote, 1983 ; Eastmond y Rawsthorne, 2000 ; Baud et al, 2002. ). Durante la fase de maduracin de embriones de Arabidopsis, el endospermo es casi degradado y reducido a la capa de clulas que rodea al embrin ( Baud y Lepiniec, 2009 ). Como un sistema de tejido, el endospermo sirve como nutricin para el embrin en desarrollo y / o plntulas de germinacin ( Stone et al., 2008 ). Alrededor de 10% de la AFpresente en las semillas enteras se acumulan en el endospermo ( Penfield et al., 2004 ). En contraste, la cubierta de la semilla que rodea el embrin y el endospermo se deriva de tejido ovular y por lo tanto es estrictamente de origen materno. La cubierta de la semilla madura de Arabidopsis se compone de cuatro capas de clulas (del exterior al interior de la semilla): una epidermis y una capa de empalizada compone el tegumento exterior, mientras que una capa de triturado y una forma de la capa endotelial tegumento interno ( Debeaujon et al,. 2000 ). La cubierta de la semilla juega un papel importante en la nutricin embrionaria durante el desarrollo de semillas y en la proteccin del embrin contra agentes perjudiciales del ambiente ( Mohamedyasseen et al, 1994. ; . Weber et al, 1996 ; Debeaujon et al, 2000. ). Cubiertas de las semillas son consista de algunos compuestos importantes como los flavonoides, que son nicas para las plantas superiores como metabolitos secundarios implicados en las funciones fisiolgicas, como la latencia o viabilidad. Los flavonoides tambin sirven como micronutrientes beneficiosos en la dieta humana y animal. Tres clases principales de flavonoides, antocianinas, a saber, rojo (para pigmentos prpura), flavonoles (incolora o de color pigmentos amarillos) y proantocianidinas (pigmentos incoloros que se vuelven caf), tambin conocidos como taninos condensados, estn presentes en Arabidopsis. Ellos dan la pigmentacin roja, prpura y marrn para flores, frutas y semillas ( Koes et al, 1994. ; Shirley, 1996 ; Mol et al, 1998. ; Nesi y col, 2001. ; . Lepiniec et al, 2006 ) . Las proantocianidinas especficamente se acumulan en la capa de clulas ms interna de la cubierta de la semilla, denominada endotelio ( Devic et al, 1999. ; . Nesi y col, 2001 ). El defecto en la pigmentacin de flavonoides en mutantes tales como el transparente testa ( tt ) y la glabra tt ( Shirley et al., 1995 ), diferentes de otro tipo de mutaciones testa con estructura anormal testa, tales como la glabra2 mutante ( Rerie et al., 1994 ).Coordinado crecimiento y el desarrollo de la cubierta de la semilla, endospermo y embrin es esencial para la acumulacin de reservas de AF y proantocianidinas en las semillas maduras. Aunque los mecanismos de FA biosntesis y proantocianidinas han sido ampliamente estudiados, se ha prestado poca atencin a su relacin en la determinacin de los compuestos finales de semillas de almacenamiento. Para entender esta relacin, la semilla FA contenido y composicin de TT2 plantas mutantes fueron investigados. TT2 caractersticas de una protena R2R3 MYB dominio localizado principalmente en el ncleo, lo cual es consistente con su

funcin reguladora. Es un regulador importante de limitacin en la red de regulacin de proantocianidina y expresa predominantemente durante el desarrollo temprano de semillas. La prdida de TT2 funcin especficamente afecta a la pigmentacin de semillas y reduce dramticamente la expresin de varios genes estructurales implicados en el metabolismo de tanino.Ganancia de funcin de los experimentos han demostrado que TT2 induce ectpico BAN expresin, que se considera como la primera enzima comprometida de la biosntesis de proantocianidina ( Nesi et al., 2001 ). A pesar del conocimiento acerca de la funcin de TT2 en la biosntesis de proantocianidina, el papel de TT2 en que afecta a las semillas FA almacenamiento ha sido mal entendido. En esta investigacin, previamente uncharacterized funciones de TT2 , es decir, el efecto negativo sobre la semillaFA acumulacin y el efecto positivo sobre la tolerancia al estrs durante la germinacin y establecimiento de plntulas fueron identificados.
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RESULTADOS
Aumento de la FA Contenido mayores TT2 Semillas y alteracin de la FA Composicin en

Dos lneas mutantes de la TT2 gen, CS83 ( TT2 - 1 ; . Nesi y col, 2001 ) y SALK_005260 ( TT2 - 5 ), un alelo recin nomenclatured en este artculo, fueron proporcionados por el Centro de Recursos Biolgicos Arabidopsis en los Estados Unidos. Otra lnea mutante, FLAG_106F02 ( TT2 - 3 ; . Nesi y col, 2001 )., se obtuvo del Instituto Nacional de Investigacin Agrcola, Francia Figura 1A muestra la estructura de laTT2 genes y los sitios de insercin respectivos de los dos mutantes allicos. Para investigar los efectos de los TT2 mutaciones en semillas FA acumulacin, las lneas mutantes ( TT2 - 3 y TT2 - 5 ) se retrocruzaron con sus respectivos padres de tipo salvaje en el caso de otras mutaciones estaban presentes en las lneas mutantes. La genotipificacin por PCR ( . Fig. 1B ) indic la presencia de los homocigotos tt2- 3 y TT2 - 5 mutantes, que carecen por completo de la transcripcin de TT2 gen, como se detect por la transcriptasa inversa ( RT )PCR ( Fig. 1C. ). Por otra parte, el mutante tt2 - 1 fue creado por irradiacin con rayos X y era difcil de genotipo por PCR. Por lo tanto, el rasgo de la testa de color amarillo ( Fig. 2 ) se us como un indicador para la determinacin del genotipo y las plantas mutantes se confirm por RT -PCR para nulos TT2 transcripciones ( fig. 1C ). Los TT2 semillas mutantes son ms pequeas en tamao que sus respectivos controles de tipo salvaje ( Fig. 2 ). En trminos de peso seco ( DW ), las semillas mutantes sobre la maduracin fueron aproximadamente 12% ms ligeros que sus correspondientes de tipo salvaje semillas ( Fig. 3A ). En contraste, los embriones mutantes fueron de aproximadamente 11% a 13% ms pesado que los de los respectivos tipos silvestres ( figura. 3, A y C ).

Figura 1. Identificacin de TT2 lneas mutantes utilizando los cebadores indicados en las Tablas suplementarios S1 y S2 . Una caracterizacin, Molecular de la tt2 mutacin. Estructura de la TT2 gen que muestra la posicin de la insercin de ADN-T en FLAG_106F02 ( TT2 - 3 ) y SALK_005260 ...

Figura 2. La observacin microscpica de TT2 semillas maduras. Las comparaciones cuantitativas de la longitud y anchura de una semilla entre TT2 lneas mutantes y sus respectivos controles de tipo salvaje se muestran en un grfico vecina cada par de el tipo salvaje y mutante.

Figura 3. Comparacin entre los TT2 lneas mutantes y sus respectivos tipos silvestres. Una semilla, DW . B, FA contenido. C, testa DW(incluyendo endospermo). D, FA del embrin. Los datos presentados son valores medios de tres experimentos independientes (tres repeticiones biolgicos) ... La semilla FA contenido y FA composicin en maduros TT2 semillas se analizaron mediante cromatografa de gases. Como se muestra en la Tabla I y la Figura 3B , los TT2 semillas demostr 86% a 95% ms alto FA contenido de las semillas de tipo salvaje. El grado de incremento dependa de las variaciones allicas en la TT2 locus ( Fig. 3B ). Independientemente del alelo mutado, el aumento de laFA contenido de las semillas mutantes se atribuy a la mayor proporcin del embrin y el aumento de laAF en los embriones ( Fig. 3, C y D ). Por otra parte, el aumento de la FA contenido fue acompaado por la alteracin de la FA composicin. En las semillas mutantes maduros, las proporciones de 16-C y 18-CAF , con una excepcin de 18:1, disminuy significativamente, mientras que las proporciones de 20-C, 22-C y 24-C AF (muy larga la cadena de AF [ VLCFAs ]; C 20) se increment significativamente ( Tabla I). Estructura subcelular de las TT2 lneas mutantes ( TT2 - 3 , TT2 - 5 , y TT2 - 1 ) se presentan en comparacin con la de sus respectivos controles de tipo salvaje ( Fig. 4. ). El nmero medio de cuerpos oleosos que estaban contenidos en una clula, as como las longitudes medias de eje largo y corto de un cuerpo de aceite tambin se muestra. Es obvio que los TT2 clulas tenan nmero mucho mayor y mayores tamaos de cuerpos oleosos contenidos.

Tabla I. Comparacin de la FA composicin y total FA contenido en la fase semilla madura entre TT2 lneas mutantes y sus respectivos tipos silvestres

Figura 4. Comparacin del nmero y tamao de los cuerpos oleosos en clulas de semillas maduras entre el tipo salvaje y TT2 lneas mutantes en pares. Las flechas en la TEM imgenes apuntan a los cuerpos oleosos (O), granos de aleurona (A), y globoides (G). Barra = 1 m. Los datos cuantitativos son ... Estos resultados demuestran que la tt2 mutacin dio lugar a la biosntesis de proantocianidina defectuoso en la cubierta de la semilla, aumentos significativos en el peso del embrin y FA contenido, y de la alternancia de la FA composicin, y cambios en la cantidad de aceite y tamao del cuerpo dentro de una clula de la semilla madura.
Los genes expresados diferencialmente entre las tt2 - 5 y la de tipo salvaje en el desarrollo de semillas a las 6 y 16 de DAP

Hemos seleccionado minuciosamente dos etapas crticas de desarrollo para la comparacin de los perfiles expresivos entre un tt2 mutante ( tt2 - 5 ) y su tipo salvaje de control (Columbia-0 [ Col-0 ]). A las 6 deDAP , EM se ha completado y la semilla FA acumulacin comienza ( en baudios y Lepiniec, 2009 ), mientras que, a los 16 DAP , las grandes diferencias en las semillas FA contenido y FA composicin entre el mutante y de tipo salvaje fueron identificados. Como se muestra en la Tabla II , el total FA contenido en la TT2 - 5 semillas fue 420,99 g / mg, significativamente superior a 252,45 g / mg en las semillas de tipo salvaje. El FA contenido de las semillas en desarrollo en 16 DAP represent ms de 75% de la final FAcontenido en las semillas maduras en ambos genotipos ( Tablas I y Andii).II ). La acumulacin de las semillas de las AF aumentado bruscamente durante las etapas finales de la maduracin de embriones 16 a 18 DAPy lleg a la semilla final FA contenido al final de EM maduracin, lo que indica una participacin activa de los genes que contribuyen a las semillas de FA acumulacin. Por lo tanto, el anlisis molecular de las semillas en desarrollo a las 6 y 16 de DAP podra proporcionar pistas para averiguar los objetivos de abajoTT2 involucrados en FA biosntesis y comprender el mecanismo molecular subyacente TT2 -regulado semilla FA acumulacin.

Tabla II. Comparacin de la FA composicin y total FA contenido a los 16 DAP entre tt2 - 5 y Col 0Microarray anlisis revel que 503 genes expresados diferencialmente ( DEGs ) fueron identificados, entre los cuales 447 fueron hasta reguladas ( Cuadro S3 suplementarios ) y 56 eran las reguladas en el tt2mutante ( Supplemental Cuadro S4 ) en la etapa de desarrollo de semillas 6 DAP . El anlisis funcional de estos 503 DEGs descubri que 51 (11,4%) y 59 (13,2%) de los genes regulados estn relacionadas con el metabolismo de carbohidratos y la sntesis de protenas en general, respectivamente. Sin embargo, slo 13 (2,9%) de los genes regulados estn involucrados en el metabolismo lipdico y la embriognesis. Muchos de los DEGs estn relacionados con la respuesta al estrs / defensa ( Tabla II ; Suplementaria S3 Tablas yS4 ). Por lo tanto, la mutacin puede promover almidn de la semilla y la sntesis de protenas y altera las respuestas al estrs ambiental durante EM .

A los 16 DAP , 746 DEGs fueron identificados. De stos, 289 fueron hasta reguladas ( Supplemental Cuadro S5 ) y 457 se redujeron-regulado ( Supplemental Cuadro S6 ) en las semillas en desarrollo mutantes. El anlisis funcional revel que la expresin de genes implicados en el metabolismo lipdico y la embriognesis se modific significativamente en la tt2 - 5 semillas. Relativa a la 6 DAP etapa, un mayor nmero de DEGs estaban implicados en el metabolismo lipdico y la embriognesis en 16 DAP . Ms del 17% de los genes regulados a la baja, en particular los genes de la protena ribosomal, estuvieron involucrados en la sntesis de protenas en general ( Supplemental Cuadro S6 ). Hasta 48 genes regulados (10,5%) y 24 de los genes regulados (8,4%) estaban relacionados con el metabolismo de carbohidratos.Un mayor nmero de DEGs implicados en el metabolismo de hidratos de carbono se identificaron en el tt2 - 5 semillas en 16 DAP que en 6 DAP . La clase ms grande de DEGs a las 6 de DAP y al 16 de DAPentre el mutante y de tipo salvaje se relacion con la respuesta al estrs / defensa ( Tablas III y andIV;IV ; S3 Tablas Suplementarias - S6 ). Por lo tanto, la tt2 - 5 mutacin puede disminuir la tasa de sntesis de protenas y el almidn durante la maduracin embrionaria, y dio lugar a una respuesta diferente a las tensiones ambientales.

Tabla III. Clasificacin funcional de los DEGs en el desarrollo de semillas de plantas tt2-5 a las 6 de DAP

Tabla IV. Clasificacin funcional de los DEGs en el desarrollo de semillas de plantas tt2-5 a los 16 aos DAP Segn Beisson et al. (2003) y en baudios y Lepiniec (2009) , 33 genes codifican enzimas clave o subunidades de enzimas que catalizan FA sntesis ( FAS ) en los plstidos y retculo endoplsmico durante el desarrollo de la semilla. La mayora de estos genes fueron ligeramente hasta reguladas en el tt2 - 5mutante a las 6 y 16 de DAP , con log2 ratios inferiores a 1,00 ( Supplemental cuadros S7 y S8 ). Cabe destacar que ELONGASE1 CIDOS GRASOS ( FAE1 , o KCS1 ; At4g34520), que codifica para las enzimas de condensacin VLCFA sntesis ( . James et al, 1995 ; Millar y Kunst, 1997 ) fue significativamente hasta reguladas en el tt2 - 5 semillas en desarrollo a los 16 DAP ( S3 Tablas Suplementarias y S5 ). Slo el 2,9% de todos los genes hasta reguladas (log2 ratios 1,00, P valores 0,5) en el tt2 - 5 semillas estn relacionados con el metabolismo lipdico y el desarrollo embrionario a las 6 deDAP ( Tabla II ). En contraste, la proporcin de los genes regulados implicados en el metabolismo de lpidos y el desarrollo embrionario en

los TT2 semillas aument a 10,1% en 16 DAP (log2 ratios 1,00, Pvalores 0,5; Tabla IV ). FA biosntesis est regulado por varios factores de transcripcin ( TFS ), incluyendo WRINKLED1 ( WRI1; At3g54320), FRONDOSO COTYLEDON1 ( LEC1 ; At1g21970), LEC2 (At1g28300), cido abscsico INSENSITIVE3 ( ABI3 ; At3g24650), y FUSCA3 ( FUS3 ; At3g26790) . No hay diferencias significativas en TF expresin entre el tt2 - 5 mutantes y el tipo salvaje ( Col-0 ) a las 6 y 16 DAP fueron observados, excepto para FUS3 expresin, que se aument significativamente en 16 DAP en tt2 - 5 en relacin con el tipo silvestre ( Col0 , Tablas Suplementarias S3 - S8 ).
La confirmacin de los genes regulados por FA Sntesis y desarrollo embrionario en las distintas fases en las TT2 Semillas

Para confirmar la sobre regulacin de los genes de AF biosntesis y el desarrollo embrionario en la tt2 - 5mutante, cuantitativa ( q ) RT -PCR se realiz. Como se muestra en la Figura 5 , la relacin FUS3expresin se mantuvo en 6 DAP , despus se increment drsticamente 6 a 16 DAP , y alcanz su pico a las 10 DAP en el tt2 - 5 mutante en comparacin con el tipo salvaje. La expresin de los genes que codifican los crticos FA enzimas biosintticas, tales y FAE1 ( At4g34520 ), que catalizan pasos diferentes en la FA ruta biosinttica, tambin se investig. Como se detalla en la figura 5 , a excepcin de CDS2 yFAE1 , la expresin de los 11 genes en el tt2 - 5 mutante fueron reguladas hasta ligeramente a 16 DAP y alcanz su mximo a 10 DAP etapa por unos 2-veces la del tipo salvaje ( Col-0 ). El pariente CDS2expresin alcanz su punto mximo a las 6 de DAP y disminuy en 10 y 16 DAP . Sin embargo, fue siempre mayor que la de la de tipo salvaje. La relativa FAE1 expresin en la tt2 - 5 mutante fue menor que el 2-veces la del tipo salvaje a 6 DAP , pero aument drsticamente 6 a 16 DAP y alcanz un mximo de 16 DAP .

Figura 5. Time-curso de anlisis de los genes regulados por el FAS y el desarrollo del embrin en diferentes etapas de desarrollo en TT2semillas. Las muestras de ARN fueron extrados de las semillas en desarrollo en tres etapas diferentes del desarrollo, incluyendo 6, 10, y 16 DAP , y el gen ... En conjunto, la tt2 - 5 mutacin promueve la expresin de FUS3 , un TF para el desarrollo embrionario, y los genes que codifican enzimas que catalizan crticos FA biosntesis.
Comparacin dinmica de fcula, las semillas y la acumulacin de protenas entre tt2 - 5 y el tipo salvaje ( Col-0 )

Indicado por el anlisis de microarrays, la prdida de TT2 funcin altera la expresin de genes relacionados con la biosntesis de protenas y carbohidratos ( Tablas II y III ; Tablas de consulta S4 - S7). El tt2 - 5 y Col 0- eran, por lo tanto, frente a 6 DAP , 16 DAP , y la etapa de madurez para el almidn y el contenido de protena. Como se muestra en la Figura 6A , el contenido de almidn del tipo silvestre (Col-0 , 205,86 g / mg DW ) y TT2 - 5 (234,75 g / mg DW ) mostraron los niveles ms altos en las semillas en desarrollo a 6 DAP . Las semillas mutantes contenan almidn significativamente mayores que las semillas de tipo salvaje. El contenido de almidn disminuy notablemente despus durante EM en ambos genotipos. En las semillas a 16 DAP y la etapa de madurez, slo trazas de almidn puede ser detectada tanto en el tipo silvestre y el mutante. Figura 6B muestra el incremento de protena total de la semilla y el contenido de protenas de

almacenamiento de 6 DAP a la etapa de madurez en el tipo silvestre y TT2 - 5 mutante. Los contenidos de protena de semilla en la tt2 - 5 semillas fueron significativamente mayores que la del tipo salvaje a 6 DAP ( Fig. 6B. ), lo cual es consistente con el hallazgo de que los genes regulados superaban en nmero a los genes regulados a la baja de carbohidratos y protenas metabolismo en el tt2 - 5 mutante ( Tablas III y andIV;IV ; Suplementario Tablas S3 y S4 ). La expresin de los genes implicados en el metabolismo de las protenas cambiado significativamente en 16 DAP y el nmero de genes regulados hasta fue mucho menor que los de los genes regulados ( Tablas III y andIV;IV ; Tablas Suplementarios S5 y S6 ). Esto puede dar lugar a la menor contenido total de protenas de almacenamiento de semillas y en el tt2 - 5 semillas en 16 DAP , as como en la etapa de madurez. Esto era til para la FA acumulacin en tt2 - 5 lnea mutante por otro lado.

Figura 6. Evaluacin de almidn y el contenido de protenas en el desarrollo de semillas de Arabidopsis entre Col-0 y TT2 - 5 . Un almidn,. B, el contenido de protenas se analizaron en tres diferentes etapas de desarrollo, incluyendo 6, 16 DAP , y la etapa de madurez, en el DWbase. El guin subraya ...
Alteracin de las respuestas al estrs en el TT2 lneas mutantes

Para determinar el efecto de la tt2 mutacin en las respuestas de estrs, germinacin y el establecimiento de plntulas se investigaron en un medio que contena 3% (w / v) Glc, 100 m M NaCl, o 1 M cido abscsico ( ABA ). Tasa de germinacin de semillas y crecimiento de plntulas en el medio sin ningn tipo de tratamiento de estrs fueron similares entre los TT2 lneas mutantes y sus respectivos controles de tipo salvaje. En el medio que contiene 3% (w / v) Glc, la tasa de germinacin de la semilla y el vigor de las TT2 lneas mutantes fueron significativamente ms bajos que el de sus respectivos controles de tipo salvaje. Siete das despus de la siembra, slo alrededor de tres cuartas partes de las TT2 semillas germinadas mutantes. En contraste, ms del 97% de las semillas de tipo salvaje germinado ( Fig. 7 ).Todas las plantas de tipo salvaje alcanzaron la etapa de dos hojas 10 d despus de la siembra ( DAS ) a diferencia de los TT2 plantas que no desarrollaron cotiledones normales y hojas verdes en el medio ( Fig. 8). Adems, la comparacin de la expresin de genes relacionados con el estrs osmtico y ABA entre el tipo silvestre ( Col-0 ) y la tt2 - 5 plantas a travs de semicuantitativo RT -PCR revel que el estrs Glc claramente reprime NCED3 e induce la expresin de ABA3 y CBL9 en el tt2 - 5 plantas mutantes. En contraste, la expresin de aba2 , abi1 , ABI2 , CBL1 , y RD29A en la tt2 - 5 plntulas fue similar a la de las plantas de tipo salvaje ( Fig. 9B. ). En el marco del 100 m M tratamiento de NaCl, el vigor de la germinacin de la semilla tt2 - 5 plantas 7 DAS era menor que la de la de tipo salvaje ( Fig. 7. ). Los cotiledones y hojas verdes poco desarrollado en los TT2 lneas mutantes, lo que indica que la prdida de TT2 funcin induce sensibilidad al estrs por salinidad ( Fig. 8 ). Semicuantitativo RT -PCR anlisis muestra que NCED3 es significativamente baja regulado, mientras que ABA3 y Rab18 fueron hasta reguladas en el tt2 - 5 semillas 10 DAS ( Fig. 9C. ).

Figura 7. Comparacin de la tasa de germinacin de semillas en ambientes estresados entre TT2 mutantes y sus respectivos controles de tipo salvaje. Germinacin de las semillas se anot al da despus de las puntas radicales haban surgido plenamente de las cubiertas de las semillas. Los datos son la media ...

Figura 8. Comparacin de establecimiento de plntulas en ambientes estresados entre TT2 lneas mutantes y sus respectivos controles de tipo salvaje. Las fotos fueron tomadas 10 DAS , que muestra las situaciones en el medio de control (sin estrs), 1 MS medio agar ...

La Figura 9. Comparacin de estrs osmtico y ABA expresin de los genes relacionados con el entre el tipo salvaje ( Col-0 ) y tt2 - 5 en ambientes estresados. ARN total fue aislado de la planta de semillero conjunto 10 DAS . RT -PCR se realiz con el estrs osmtico y ABAcebadores de genes relacionados. ... El tt2 - 5 mutantes tambin fueron sensibles a exgena de ABA (1 M ) durante la germinacin y establecimiento de plntulas. En comparacin con el tipo silvestre, las tt mutantes exhiben bajas tasas de germinacin de semillas ( Fig. 7 ) y plntulas mal desarrollados en el medio de Murashige y Skoog ( MS ) medio que contiene 1 M ABA ( Fig. 8 ). La expresin de abi1 , ABI2 , y NCED3 fue reprimida distintamente. Sin embargo, la expresin de CBL9 , ADH , y Rab18 se indujo obviamente en el tt2 - 5plantas mutantes ( Fig. 9D. ). Los experimentos con el tt2 - 3 y TT2 - 1 lneas mutantes obtuvieron resultados similares (datos no mostrados), que indican que TT2 puede directa o indirectamente confiere tolerancia a Glc, salinidad, y ABA tensiones durante la germinacin de semillas y el establecimiento de las plntulas.
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DISCUSIN
Los factores que controlan la cantidad total de FA almacenada en las semillas siguen siendo en gran parte desconocido. En este artculo, la funcin novedosa de la TT2 en que afecta a las semillas FA acumulacin y tolerancia al estrs abitico se demostr. TT2 , que codifica una protena de dominio R2R3 MYB, es un regulador clave de la biosntesis de proantocianidina en la cubierta de la semilla de Arabidopsis ( Nesi et al., 2001 ). Se encontr que la tt2 mutacin dio como resultado aumentado considerablemente semilla FAcontenido (86% -95% dependiendo del alelo mutado; Tabla I ; . Fig. 3B ), disminucin del tamao de la semilla ( Fig. 2. ), y peso de la semilla ( Figura 3A. ,) y una alteracin de FA composicin ( Tabla I ). El aumento de la FA contenido en los TT2 semillas acompaados por la disminucin relativa de la proporcin de la testa ( fig. 3C ), ms suficiente FAS , y la acumulacin de la protena reducida en el tt2embrin ( Figs. 3D y y 6).6 ). Por otro lado, los TT2 lneas mutantes demostr mala tolerancia a ambientes estresantes ( Fig. 7 -9). Microarray anlisis revel que TT2 regula los genes esenciales para el metabolismo de los lpidos, el desarrollo

embrionario y el estrs / respuestas de defensa ( Tablas III y andIV;IV ;S3 Tablas Suplementarias - S8 ).
La prdida de la TT2 funcin da como resultado ms suficiente FA Sntesis

En Arabidopsis, TT2 , junto con TT GLABRA1 y TT8 , sinrgicamente controlar la expresin de genes biosintticos de la ruta biosinttica de proantocianidina, incluyendo TT12 , DFR , LDOX , y BAN (Pelletier et al, 1997. ; . Nesi y col, 2000 , 2001 ; Debeaujon et al, 2003. ; Lepiniec et al, 2006. ). De acuerdo con estudios anteriores, la tt2 mutacin significativamente baja regulado la expresin de DFR ,LDOX y BAN en las semillas en desarrollo a los 6 DAP ( Supplemental Cuadro S5 ) y ligeramente hacia abajo-regulado TT12 (datos no presentados). La prdida de TT2 funcin de los genes regulados hasta la TT10 y la RNS1 en las semillas en desarrollo en los 16 DAP etapa ( Supplemental Cuadro S6 ). La reduccin de las proantocianidinas en la cubierta de la semilla causado las TT2 semillas a aparecer amarillo ( Debeaujon et al., 2000 ) y tienen tamaos menores y pesos reducidos ( Figs. 2 y and3A).3A ). Sus embriones fueron, sin embargo, mucho ms pesado que los de tipo salvaje ( Fig. 3, A y C ). AF , una clase de metabolitos importantes en las semillas, son predominantemente almacenado en embrin y desempean papeles esenciales durante el crecimiento y desarrollo de todos los organismos vivos. A pesar de la bioqumica de la FA biosntesis y el mecanismo de regulacin de la FA metabolismo han sido bien estudiado en Arabidopsis, se ha prestado poca atencin a la regulacin de la TT2 en el metabolismo de las semillas de FA y otros metabolitos de semillas. Malonil-CoA formado a partir de acetil-CoA catalizada por ACCasa es el precursor de las semillas FA biosntesis ( Lepiniec et al, 2006. ;baudios y Lepiniec, 2009 ). ACCasa es el interruptor de llave que controla FA flujo, que debe ser altamente dinmica en respuesta a seales variables y se mantiene a un bajo umbral para permitir un control estricto. Por lo tanto, acta como un sensor de ACCasa o un sistema de llenado para controlar el flujo general de FA biosntesis ( Mu et al., 2008 ). Como subunidades ACCasa, BCCP2 y CAC2 fueron hasta reguladas durante tt2 - 5 semillas de EM ( Fig. 5. ). ACCasa ms activa debera conducir a un aumento de FA acumulacin en los TT2 semillas. Adems, la protena total y el contenido de almacenamiento de protenas en las semillas en desarrollo en el 16 DAP y las semillas maduras de tt2 - 5eran mucho ms baja que la del tipo silvestre ( Col-0 ; Fig. 6. ), que puede ser til para las semillas de FAacumulacin en el mutante. Por lo tanto, TT2 podra ser una opcin razonable para la ingeniera gentica hacia un mayor contenido de aceite de semilla de cultivos oleaginosos, como Brassica spp. las semillas oleaginosas. La expresin de los genes crticos para la FAS est regulada coordinadamente ( Ruuska et al, 2002. ; . Baud et al, 2003 ). La prdida de funcin de los TT2 genes regulados hasta muchos FA genes de biosntesis en el retculo endoplsmico y plstido. De estas enzimas, la BCCP2 y CAC2, subunidades de ACCasa, catalizan la etapa de sntesis inicial, la formacin de malonil-CoA a partir de acetil-CoA. Una reaccin clave es la transferencia de acetil-CoA y malonil-ACP a 3-cetoacil-ACP, que es catalizada por la 3-cetoacil-ACP sintasa. Las enzimas MOD1 funciona como un enoil-ACP reductasa, mientras que FAB2 (SSI2 ) codifica una desaturasa estearoilACP como los SSI2 mutantes aumentar 18:0 y 18:01 reducir FA .En el retculo endoplsmico, CDP-diacilglicerol se forma a partir catalizada 1,2-diacilglicerol-3fosfato por CDS2 y se transfiri a fosfatidilinositol por PIS2. FAD2 es esencial para la sntesis de lpidos poliinsaturados ( Okuley et al., 1994 ), y FAD3 es responsable de la sntesis de 18:3 FA a partir de fosfolpidos, que utiliza citocromo b5 como donante de electrones ( Shah et al., 1997 ). FAE1 es esencial para la sntesis de VLCFAs en las semillas, que se extiende la longitud de la cadena de conjuntos combustibles de C18 a C20 y C22. En este estudio, la mayora de FA genes

sintticos fueron slo moderadamente hasta reguladas, incluyendo los genes de la ACCasa. En contraste, FAE1 fue hasta reguladas notablemente ( Fig. 5. ; Tabla Suplementaria S6 ). Como consecuencia de este aumento de la expresin, la biosntesis de VLCFAs , tales como C20: 0, C20: 1, C22: 1 y era mucho ms eficaz que otrosconjuntos combustibles , tales como C16: 0, C18: 0, C18: 2, y C18: 3 en las TT2 semillas en 16 DAP ( Tabla I ; Suplementarios Tabla S3 ). La sntesis de C18: 1 en los TT2 semillas fue ms que suficiente que en las semillas de tipo salvaje ( Tabla I ). Esto podra ser causado por la expresin notablemente aumentado de KASII y FAB2 , que son esenciales en la transferencia de 16:0-ACP en el 18:1ACP en los plstidos ( Fig. 5 ). FA biosntesis est regulada en mltiples niveles, de los cuales el control transcripcional es importante para la regulacin de la FA ruta de biosntesis ( Ohlrogge y Jaworski, 1997 ; . Millar et al, 2000 ). Las claves TFS que regulan FA biosntesis puede incluir WRI1 , LEC1 , LEC2 , FUS3 , y ABI3 . WRI1 codifica un regulador transcripcional de la familia AP2/EREB que se dirige a las enzimas de la gluclisis tarde y en la plastidial FA red biosinttica ( Focks y Benning, 1998 ; Cernac y Benning, 2004 .) LEC1 codifica la subunidad HAP3 de la unin del factor de CCAAT y desempea funciones esenciales en la FA biosntesis (Lee et al, 2003. ; . Mu et al, 2008 .) LEC2 , FUS3 , y ABI3 codificar dominio B3 TFS de importancia funcional para la regulacin de la maduracin de la semilla ( Luerssen et al, 1998. ; Stone et al, 2001. ; . Para et al, 2006 ). Estos cinco TFS tienen funciones nicas y superpuestas en la regulacin del desarrollo embrionario y la FA ruta biosinttica en Arabidopsis ( A et al, 2006. , Wang et al, 2007. ; Santos-Mendoza et al, 2008. ; baudios y Lepiniec, 2009 ). En este estudio, la tt2 mutacin no causa cambios significativos en los niveles de expresin de WRI1 , LEC1 , LEC2 , y ABI3 ( Supplemental Tablas S8 y S9 ). Sin embargo, la FUS3 nivel de expresin aument notablemente ( Fig. 5. ; Tabla Suplementaria S6 ). FUS3 se expresa en las semillas en su mayora durante llenado de las semillas, y promueve la deposicin de aceite mediante la sincronizacin de los genes en la FA ruta biosinttica para aumentar los niveles de transcripcin de CAC2 , KASI , FAB2 , FAD3 , BCCP2 , ACP1 , y ACP5 , etc ( Wang et al, 2007. ; . Yamamoto et al, 2010 ). Por otra parte, tambin juega un papel activo en la regulacin positiva de la expresin de genes fotosintticos durante el desarrollo temprano de semillas ( Yamamoto et al., 2010 ).Por lo tanto, era posible que el aumento de expresin de FUS3 en la tt2 mutante podra haber resultado en ms fotosintatos, que podran ser ms particionados en semillas FA depsitos. Segn Debeaujon et al. (2003) , TT2 expresin se limita a la testa de las primeras semillas en desarrollo.Sin embargo, FA se sintetiza principalmente en los embriones. No es probable que TT2 regula directamente la FAS en los embriones. Posiblemente, la deficiencia de los flavonoides, los precursores de las proantocianidinas, en tt2 mutante provoca ms suficiente FA biosntesis en el embrin, porque los flavonoides, permeables de testa a embrin, son inhibidores potenciales de la FA biosntesis. Estos suprimen la expresin de FabG y FabI , que codifican reductasas importantes implicados en la elongacin de la cadena ( Zhang y Rock, 2004 ). El tt2 mutacin, por lo tanto, indirectamente promovi la FAacumulacin debido a la eliminacin de la represin de flavonoides. En la naturaleza, hay dos tipos bsicos de FAS arquitecturas. El prototipo de FAS tipo I se encuentra en los mamferos y se compone de un solo gen que produce un polipptido, que contiene todos los centros de la reaccin necesaria para producir un FA ( Smith et al., 2003 ). En contraste, la disociada FAS tipo II sistema, en el que cada paso individual en la FAS es catalizada va con una nica protena codificada por un gen distinto, se encuentra en las bacterias, plantas, y parsitos ( White et al., 2005 ).

La prdida de la TT2 funcin conduce a disminucin de la tolerancia al estrs ambiental durante el establecimiento de plntulas

FAS es una va metablica primaria esencial para el funcionamiento de las clulas vegetales. AF o FAderivados actan como molculas seal u hormonas, almacenamiento de carbono y de energa, y la capa de superficie de proteccin de la planta del estrs medioambiental ( Ohlrogge y Jaworski, 1997 ; Hong et al. , 2008 ; Mu et al, 2008. ). La cubierta de la semilla juega un papel importante en la proteccin contra los microorganismos nocivos y condiciones ambientales desfavorables ( Mohamedyasseen et al, 1994. ; . Debeaujon et al, 2000 ). Este estudio muestra que la tt2 lnea mutante eran mucho ms sensibles a las tensiones abiticas causadas por concentraciones altas de Glc, NaCl, o ABA en el medio de crecimiento ( Fig. 7 -9). Los niveles de transcripcin de los genes relacionados con el estrs osmtico y ABA fueron diferentes entre el tt2 y el tipo salvaje bajo entornos estresantes. El NCED3 expresin en la tt2 disminuy significativamente en un entorno estresante. NCED3 codifica dioxigenasa 9-cis-epoxycarotenoid, que funciona como una enzima clave en ABA biosntesis ( Fig. 7 -9). El anlisis de microarrays revel que la clase ms grande de DEGs entre el tt2 mutante y el tipo salvaje estaba relacionada con la respuesta de estrs / defensa ( Tablas II y III ; Tablas Suplementarios S4 - S7 ). Tambin es posible que la deficiencia de flavonoides dio lugar a la alternancia del patrn de expresin de gen de respuesta a estrs durante el establecimiento de las plntulas jvenes. Por otra parte, los fenotipos sensibles al estrs de TT2 lneas mutantes son por aumento de la permeabilidad de los elementos estresantes a travs de los TT2 cubiertas de las semillas. Este trabajo avanza la comprensin de TT2 funciones de semilla FA acumulacin y estreses abiticos durante la germinacin de semillas y el establecimiento de plntulas. Sin embargo, los mecanismos por los que se regulan TT2 FA acumulacin en las semillas y las respuestas de estrs durante el establecimiento de las plntulas jvenes no son del todo claras.
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MATERIALES Y MTODOS
Materiales vegetales y condiciones de crecimiento

Arabidopsis ( Arabidopsis thaliana ) adhesiones Col-0 , Landsberg erecta ( L er ), y 2-Wassilewskija ( Ws-2 ) se utilizaron como los controles de tipo salvaje de acuerdo con el fondo de la mutante. Las semillas de estas lneas fueron preenfriar a 4 C durante 2 a 4 das y, a continuacin la superficie esterilizada con 6% (w / v) de solucin de NaClO durante 6 a 8 min. Posteriormente, las semillas se lavaron cinco a siete veces con agua destilada, desionizada y despus se sembraron en slido MS medio stock. Despus de aproximadamente 2 semanas, las plntulas sanas se transfirieron a suelo tratado en autoclave en una maceta 7 cm de dimetro. Las plantas se fertilizaron tres veces en dos etapas de hoja verdadera, la etapa de roseta de hojas y la etapa de floracin. El fertilizante (Shanghai Wintong Chemicals Company) contiene 20% de nitrgeno total (5,97% nitrgeno ntrico, 3,92% de nitrgeno amoniacal y nitrgeno de urea en 10,11%), 20% soluble en agua, fsforo (P 2 O 5 ), 20% de potasio soluble en agua (K 2 O), 0,07% de magnesio soluble en agua, 0,009% de boro, y 0,02% de cobre, 0,1% de hierro, 0,05% de manganeso, 0,002% de molibdeno, 0,02% de zinc, y 0,0005% de cobalto (todos quelado). Las plantas fueron cultivadas bajo condiciones de da largo (16 h) en una sala de crecimiento de aire acondicionado, a 24 C y 18 C da y noche las

temperaturas, respectivamente. La intensidad de luz para el da fue de 100 mmol m -2 s -1 , medida sobre la base de una planta.
Anlisis de AF , almidn de las semillas, y Protena

La extraccin y el anlisis de los conjuntos combustibles se llevaron a cabo de la siguiente manera (Poirier et al, 1999. ; . Mu et al, 2008 ). Acerca de 10 mg de semillas intactas se calentaron a 80 C en solucin de metanol que contiene 1 M de HCl durante 2 h. Las FA steres metlicos se extrajeron con 2 ml de hexano y 2 ml de 0,9% (w / v) de NaCl, y la fase orgnica se utiliza para el anlisis por cromatografa de gases, usando heptadecanoato de metilo como patrn interno. La mquina (Shimadzu, GC-2014) estaba equipado con un detector de ionizacin de llama y un m 30 (longitud) x 0,25 mm (ID) x 0,5 m (espesor de la membrana lquida) columna (Supelco cera-10, Supelco, cat. No. 24079). La temperatura inicial de la columna se mantuvo a 160 C durante 1 min, luego se increment por 4 C min -1 a 240 C, y se mantuvo durante 16 min a la temperatura final. Despus de la ejecucin, los picos correspondientes a cada FA especies se identificaron por sus tiempos de retencin caractersticos. Las concentraciones de cada muestra se normalizaron frente a la del control interno. Para analizar la FA contenido y FA composicin en el embrin, los sobres de semillas que se componen de los tegumentos ms la capa endospermo se dejaron en la MS medio cuando las semillas germinaron y, a continuacin se recogieron cuidadosamente. Hasta 100 sobres de semillas para cada una de las tres repeticiones se recogieron, se secaron a la condicin similar como las semillas maduras, y posteriormente se pesa hasta que el peso se mantuvo sin cambios. El peso de los sobres de semillas se resta del de la semilla entera, dejando el peso del embrin. El FA contenido del embrin de la semilla se calcul utilizando la FA contenido de la semilla entera dividida por el peso neto del embrin de la semilla. El contenido de almidn de la semilla se determin como sigue ( Mccleary et al, 1994. ; . Baud et al, 2002). Hasta 20 semillas se molieron dos veces en 2 x 500 l de 80% (v / v) de etanol a 4 C. Despus de la centrifugacin (15.000 g , 10 min, 4 C), el sedimento resultante se sec a 50 C durante 30 min y despus se homogeneizan en 150 l de 50 m M tampn MOPS (pH 7,0) que contena 15,4 unidades de calor estable -amilasa. La suspensin se incub a 100 C durante 6 min. Entonces, 200 l de 0,2 M de tampn de acetato de sodio (pH 4,8) que contena 26,1 unidades de amiloglucosidasa se aadieron y la suspensin se incub a 50 C durante 30 min con agitacin regular. Despus de la centrifugacin, el Glc en el lquido sobrenadante se utiliz para la cuantificacin de almidn. La cuantificacin de almacenamiento de la semilla y la protena total fue adaptado de Baud et al. (2002) .Veinte semillas se homogeneizaron en 200 l de tampn de extraccin que contiene 50 m M HEPES, 5 m MMgCl 2 , 5 m M ditiotreitol, 1 m M fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 1 m M EDTA, y% 10 (v / v) de etilenglicol (pH 7,5) en presencia de Polyclar. Despus de la centrifugacin (17530 g , 10 min, 4 C), el sobrenadante se utiliza para las mediciones de protenas de almacenamiento de acuerdo con Bradford (1976) . Las protenas insolubles restantes en el tampn de extraccin se recuperaron por tratamiento con 1 M de hidrxido de sodio y se midi como se ha descrito anteriormente. En ambos ensayos, gammaglobulina (Bio-Rad) se utiliz para la calibracin.
Observaciones morfolgicas de semillas maduras

Las semillas de la observacin fueron seleccionados de las silicuas cosechadas a partir de la parte basal de una inflorescencia importante en este estudio. Las semillas maduras de la de tipo salvaje y las TT2 lneas mutantes se seleccionaron al azar y se fotografiaron usando un estereomicroscopio Olympus SZ 61. Seis semillas

de cada genotipo fueron seleccionados al azar para seccionar. Transections perpendiculares fueron producidos y las secciones con mayor rea de superficie de forma ovalada fueron seleccionados al azar para la observacin del cuerpo oleoso. Los cuerpos oleosos se observaron bajo microscopio electrnico de transmisin ( TEM ). Un nmero de 20 clulas de una semilla se observaron para los cuerpos oleosos contenidos. El nmero medio de cuerpos de aceite dentro de una clula se calcul sobre la base de seis semillas. TEM observacin se realiz como sigue. Los pasos principales, la fijacin doble, deshidratacin, infiltracin y la incrustacin, y la seccin ultrafinas se describen en detalle como sigue.Fijacin doble: Las semillas de Arabidopsis se fija primero con 2,5% de glutaraldehdo en tampn fosfato (0,1 M , pH 7,0) durante aproximadamente 16 horas y despus se lavaron tres veces en el tampn fosfato (0,1 M , pH 7,0) durante 25 min. Las semillas se fijaron posteriormente a continuacin, con 1% OSO 4 en tampn de fosfato (0,1 M , pH 7,0) durante 2 h y se lavaron tres veces en tampn de fosfato (0,1 M , pH 7,0) durante 25 min, respectivamente. Deshidratacin: La muestra se deshidrat mediante una serie graduada de etanol (50%, 70%, 80%, 90%, 95%, y% 100) durante aproximadamente 20 min, respectivamente, y luego se transfiere a la acetona absoluta durante 20 min. Infiltracin: la muestra se coloc en una mezcla 1:1 de acetona absoluta y la mezcla de resina Spurr final de 2 h a temperatura ambiente y despus se transfiri a una mezcla 1:3 de acetona absoluta y la mezcla de resina Spurr final de 5 h y a Spurr final de mezcla de resina durante la noche. Seccionamiento incrustacin y ultradelgadas: la muestra se coloc en tubos eppendorf que contenan medio de inclusin y se calent a 70 C durante aproximadamente 9 h. Las secciones de muestras se tieron con acetato de uranilo y citrato de plomo alcalina durante 15 min, respectivamente, y se observaron bajo un TEM (JEM-1230).
Microarray hibridacin y anlisis de datos

Las flores de la de tipo salvaje ( Col-0 ) y tt2 - 5 fueron marcados con hilos de diferentes colores para indicar el DAP . Slo las semillas de las silicuas en los brotes primarios se utilizaron en este estudio. Tres independientes repeticiones biolgica se llevaron a cabo para el tipo salvaje ( Col-0 ) y tt2 - 5 en el experimento de microarrays. Probe el etiquetado y la hibridacin de chips se llevaron a cabo a travs del servicio Affymetrix personalizado (CapitalBio) siguiendo el protocolo estndar (http://www.affymetrix.com/support/technical/manual/expression_manual.affx ). La normalizacin se realiz de acuerdo con el protocolo estndar de Affymetrix para permitir la comparacin de las muestras para cada grupo de experimentos. El complemento de Excel para el anlisis de la importancia microarrays se utiliz para identificar DEGs entre el control y el T-ADN insercin de la lnea mutante tt2- 5 . Clasificacin funcional de los DEGs se ha realizado mediante el proceso biolgico categora de ontologa de genes de Arabidopsis ( http://www.geneontology.com ). El porcentaje (columna extrema derecha) se refiere a la proporcin de los genes con relacin al total hasta reguladas o hacia abajo-regulada DEGs en cada categora funcional. Para el experimento de microarrays, tres repeticiones biolgica independiente se llevaron a cabo, y los DEGs con log2 ratios o 1,00 -1,00 (slo GO IDs de Slim con P valores 0,5) fueron analizados.
Anlisis de la expresin gnica por RT -PCR y QRT -PCR

The RNA samples were isolated using the Invisorb spin plant RNA mini kit (Invitek; microarray experiments) following the manufacturers instructions. The RNA samples were treated with RNase-free DNAse I (New England Biolabs) to remove any trace genomic DNA. For semiquantitative RT-PCR andqRT-PCR templates, first-strand complementary DNA (cDNA) were synthesized in a 20-L

reaction solution containing approximately 0.5 and 3 g total RNA, respectively, using PrimerScript RT (Takara) and oligo (dT) 12-18 as a primer. EF1aA4 and UBIQUITIN4 (AT5G44340) were used as internal controls in the RT-PCR and qRT-PCR. All primer pairs used in the RT-PCR and qRT-PCR analyses are listed inSupplemental Table S1. The real-time amplification reactions were performed using the SYBR Green kit (Takara) and iCycler iQ thermocycler (Bio-Rad) according to the manuals from the manufacturers.
Analysis of the Seed Germination Rate and Seedling Establishment of tt2-5 Mutant Lines under Stressed Conditions

The seeds used for the germination assays were harvested at nearly the same time from plants grown under the same growth conditions as previously described, allowed to mature for 5 weeks at room temperature, and stored in a dry cabinet (approximately 15% moisture level). The Arabidopsis seeds were surface sterilized and then placed on MS medium containing 3% (w/v) Glc, 100 m M NaCl, or 1 M ABA as previously described. The seed germination frequency (defined as radicle emergence) was scored daily (Cernac et al., 2006). Arabidopsis plants at 10 DAS were photographed and harvested for RNA analysis.
Statistical Analysis

A completely randomized block design with at least three biological replicates was conducted for each experiment in this study. Data were classified with Win-Excel and analyzed via an ANOVA using the SPSS statistical package (version 8.0). Comparisons between the treatment means were made via a Tukeys test at a probability level of P 0.05.
Supplemental Data

The following materials are available in the online version of this article.
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Supplemental Table S1. Primers used for RT-PCR and qRT-PCR analyses. Supplemental Table S2. Primers used for the genotyping of the tt2 mutants. Supplemental Table S3. A list of up-regulated genes in the developing seeds of SALK_005260 plants at 6 DAP. Supplemental Table S4. A list of down-regulated genes in the developing seeds of SALK_005260 plants at 6 DAP. Supplemental Table S5. A list of up-regulated genes in the developing seeds of SALK_005260 plants at 16 DAP. Supplemental Table S6. A list of down-regulated genes in the developing seeds of SALK_005260 plants at 16 DAP. Supplemental Table S7. A list of TFs and genes encoding key enzymes for FA biosynthesis at 6DAP. Supplemental Table S8. A list of TFs and genes encoding key enzymes for FA biosynthesis at 16DAP.

NOTES

Glossary Faz fatty acids EM embryonic morphogenesis DAPd after pollination RTreverse transcriptase DW dry weight VLCFAs very-long-chain fatty acids Col-0 Columbia-0 DEGs differentially expressed genes TFS transcription factors q quantitative QRT quantitative reverse transcriptase ABA abscisic acid DAS d after sowing FAS fatty acid synthesis Ler Landsberg erecta Ws-2 Wassilewskija-2 TEM transmission electron microscopy MS Murashige and Skoog CDNA complementary DNA

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