I.

INTRODUCCION: El gnero Streptococcus es un grupo formado por diversos cocos grampositivos que normalmente se disponen en parejas o en cadenas. La mayora de las especies son anaerobios facultativos, y algunos crecen nicamente en una atmsfera enriquecida con dixido de carbono (crecimiento capnoflico). Sus exigencias nutricionales son complejas, y su aislamiento requiere el uso de medios enriquecidos con sangre o suero. Son capaces de fermentar hidratos de carbono, proceso que produce cido lctico, y son catalasa-negativos, a diferencia de las especies del gnero Staphylococcus. La especie ms importante de los estreptococos del grupo A es S. pyogenes. S. pyogenes origina diversas enfermedades supurativas y no supurativas. Aunque este microorganismo constituye la causa ms frecuente de faringitis bacteriana, la fama de estos microorganismos se debe a las llamativas enfermedades potencialmente mortales provocadas por estas bacterias necrosantes. (1) Las cepas de S. pyogenes son cocos esfricos de dimetro comprendido entre 1 y 2 mm que forman cadenas cortas en las muestras clnicas y cadenas de mayor longitud cuando crecen en medios de cultivo. Su crecimiento es ptimo en el medio de agar sangre enriquecido, pero se inhibe cuando contiene una concentracin elevada de glucosa. (1) Los enterococos (cocos entricos) se clasificaron previamente como estreptococos del grupo D debido a que poseen el antgeno de la pared celular del grupo D, un cido teicoico con glicerol que se asocia a la membrana citoplsmica. (2) A pesar de este dato, se observ que estos microorganismos diferan de los restantes estreptococos del grupo D (conocidos como estreptococos del grupo D no enterocccos [p. ej., Streptococcus bovis]). Los grupos enterocccos y no enterocccos se diferenciaron inicialmente por sus propiedades fisiolgicas y a travs del anlisis de cidos nucleicos. En el ao 1984, los enterococos se clasificaron en el nuevo gnero Enterococcus, el cual consta actualmente de 29 especies. Las especies que se aslan con una mayor frecuencia y que son clnicamente las ms importantes son Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium. (1)

Los enterococos son cocos grampositivos que tpicamente se disponen en parejas o en cadenas cortas. A menudo, la morfologa microscpica de estos microorganismos no se puede distinguir de la de Streptococcus pneumoniae. (2) Son anaerobios facultativos y su temperatura ptima de crecimiento es de 35C, aunque la mayor parte de las cepas pueden crecer en un intervalo de temperatura comprendido entre 10 C y 45 C. Los enterococos son exigentes desde el punto de vista nutricional, ya que requieren vitaminas B, bases de cidos nucleicos y una fuente de carbono como la glucosa. Los enterococos son microorganismos comensales que no fabrican ninguna toxina potente ni otro factor de virulencia definido. En consecuencia, por lo general se considera que estas bacterias poseen una limitada capacidad patgena, aunque las enfermedades potencialmente mortales, en especial en sujetos hospitalizados, se han convertido en un grave problema. (1) Neisseria gonorrhoeae es un agente etiolgico de gonococia, enfermedad de transmisin sexual. Es un diplococo gram negativo, oxidasa positivo. Requiere medios muy nutritivos para el crecimiento, como agar chocolate. Igualmente para su cultivo requiere una atmsfera con 5% de CO2. Las Neisseriaceae constituyen una familia de bacterias Gram-negativas con algunas caractersticas similares a las pseudomonas. Las neisserias son pequeos cocos Gramnegativos que usualmente se presentan en pares enfrentados de forma arrionada. La mayor parte de ellos son comensales que viven en las membranas mucosas de los mamferos. En humanos son residentes usuales del tracto respiratorio superior y de la garganta, siendo Neisseria gonorrhoeae una de las especies patgenas para el hombre.

II.

OBJETIVO: Preparar los medios de cultivo, reactivos y material de laboratorio que se utilizan en la identificacin de los gneros Streptococcus, as como saber identificar el agente causal de las patologas ms frecuentes por medio de tcnicas especiales, bioqumicas y serolgicas.

III.

MATERIAL Y PROCEDIMIENTO: 1. Materiales: Material biolgico: S. pyogenes. Enterococos (agua de albaal). S. pneumonie (lmina montada). Neisseria gonorrhoeae.

Material de vidrio: Placas Petri. Tubos de ensayo. Balones. Matraces. Probetas. Pipetas.

Medios de Cultivo: Otros: Asas bacteriolgicas. Mechero. Cocina elctrica. Encendedor. Franela. Marcador. Agar Sangre. Caldo Tioglicolato. Agar Glucosa Azida. Caldo Violeta de Etilo Azida.. Agar Chocolate

Hisopos.

2. Procedimiento: Caldo glucosa azida: Extracto de carne Peptona de casena Glucosa NaCl Sodio azida Agua destilada 4.8g 15g 7.5g 7.5g 0.2g 1000ml pH: 7.2 0.2

Disolver, distribuir y esterilizar en autoclave (121 C por 15 minutos). No recalentar! El medio de cultivo preparado es claro y amarillento. Pequeas cantidades de la muestra a ensayar (1ml), se incorporan en el caldo. Incubacin a 37 C por 24 48 horas. Muestra: agua de albaal.

Caldo Violeta de Etilo Azida (EVA): Bactotriptosa Dextrosa K2HPO4 KH2PO4 NaCl Sodio azida Violeta de etilo Prpura de bromocresol Agua destilada 10g 5g 2.7g 2.7g 5g 0.4g 0.00083g 15mg 1000ml pH: 7.0 0.1

Disolver, distribuir y esterilizar en autoclave, el medio de cultivo preparado es claro y de color violeta

 Debido al intenso efecto inhibidor de ste cultivo, conviene sembrarlo masivamente. Incubacin a 37 C hasta las 48 horas. Muestra: agua de albaal. Caldo tioglicolato: Casena Extracto de levadura Glucosa Cistena NaCl Tioglicolato de sodio Rezarsurina sdica Agar Agua destilada 15g 5g 5.5g 0.5g 2.5g 0.5g 0.001g 0.75g 1000ml pH: 7.1 0.1

Disolver, distribuir en tubos y esterilizar en autoclave. Los medios de cultivos preparados son claros y de color amarillento. El medio de cultivo ya no puede utilizarse cuando est de color rosa debido a la penetracin de oxgeno, en ms del tercio superior de la altura del medio y cuando dicha coloracin no quede eliminada por ebullicin. (una sola vez). La muestra, el hisopado farngeo, se siembra en profundidad en el medio de cultivo. Incubacin, varios das y a temperatura ptima.

Agar sangre: Agar Nutritivo .. 100ml Sangre desfibrinada de humano. 5-10% El agar nutritivo convenientemente esterilizado al autoclave se enfri a 45 C y se agreg sangre desfibrinada, en una concentracin del 5%. El agar luego se sirvi en placas Petri estriles. De una muestra obtenida por hisopado farngeo se sembr por

estra S.pyogenes en un rea estril ayudada por el mechero. Dejamos incubar a 37 C por espacio de 24-48h. Luego de esto lemos los resultados.

Pruebas hostiles: CALDO TRIPTOSA: Triptosa Extracto de carne NaCl Agua destilada FASES: (cultivo puro) Pruebas hostiles; despus de 2 das se siembran: Enriquecimiento selectivo; sembrar en caldos EVA y glucosa azida ( potente inhibidor de toda la flora bacteriana Gram negativa) Fases de aislamiento; en agar glucosa azida o en frasco inclinado 10g 3g 5g 1000ml pH: 7.0 0.1

CALDO TRIPTOSA + BILIS DE BUEY AL 4.0 %: En 50ml de caldo triptosa preparado agregamos bilis de buey al 40% y enseguida servimos en tubos de 13x100 en razn de 5ml por tubo llevamos a autoclave a 121 C x 15a 15 lb de presin. Dejamos enfriar y del cultivo puro obtenido despus de las identificaciones bioqumicas correspondientes sembramos enterococos en el caldo para ver su posterior resultado en este medio hostil.

CALDO TRIPTOSA A 45 C y pH 7 Servimos caldo triptosa en tubos de 13x100 en razn de 5ml por tubo llevamos a autoclave a 121 C x 15a 15lb de presin. Dejamos enfriar y del cultivo puro obtenido despus de las identificaciones bioqumicas correspondientes sembramos

enterococos en el caldo y lo sometemos a Temperatura de 60 C manteniendo un pH 7. Luego de esto dimos lectura a los resultados en este medio hostil. CALDO TRIPTOSA + NaCl 6.5% En 50ml de caldo triptosa preparado agregamos NaCl al 6.5% y enseguida servimos en tubos de 13x100 en razn de 5ml por tubo llevamos a autoclave a 121 C x 15a 15lb de presin. Dejamos enfriar y del cultivo puro obtenido despus de las identificaciones bioqumicas correspondientes sembramos enterococos en el caldo para ver su posterior resultado en este medio hostil. CALDO TRIPTOSA A pH 9 En 50ml de caldo triptosa preparado ajustamos el pH a 9 y enseguida servimos en tubos de 13x100 en razn de 5ml por tubo llevamos a autoclave a 121 C x 15a 15lb de presin. Dejamos enfriar y del cultivo puro obtenido despus de las identificaciones bioqumicas correspondientes sembramos enterococos en el caldo para ver su posterior resultado en este medio hostil.

AGAR CHOCOLATE Lleva como base agar nutritivo, al que se agrega sangre desfibrinada cuando el medio est a una temperatura de aproximadamente 80 C. El calentamiento tiene como fin la liberacin de los factores X (hemina) y V (difosfo-piridnadenn nucletido), necesarios para el desarrollo de algunos microorganismos. Est especialmente indicado para Neisseria y Haemophilus.

- Se obtiene la muestra - Luego se procede a realizar una coloracion simple Gram - Posteriormente, se procedi a la observacin microscpica. - Luego la bacteria N. gonorrhoeae se aislo en el medio de cultivo Agar chocolate para luego proceder a la lectura.

Luego la bacteria N. gonorrhoeae se aislo en el medio de cultivo Agar chocolate para luego proceder a la lectura.

IV.

RESULTADOS:

1. Caldo glucosa azida: Resultados: -Se produce turbidez. -Color amarillo turbio. -Posible enterococo. -Presencia de un botn.

2. Caldo Violeta de Etilo Azida (EVA): Resultados: -Se produjo acidez. -Viraje de color (de prpura a amarillo verdoso). - Presencia de un botn. -Posible enterococo.

3. Caldo tioglicolato:

Presencia de Streptococcus Crece en la pared del tubo formando grumos.

4. Aislamiento en agar sangre: - Se observaron colonias hemolticas - hemoltico: halo trasparente. - Degradan la hemoglobina - Colonias pequeas, puntiformes, grisceas y de bordes regulares.

5. Pruebas hostiles:

De izquierda a derecha:

TTO. pH 7 a 45 pH 9 NaCl 6,5% SALES TERMICO 30 Presencia de botn Presencia de de BILIARES 4.0%Presencia Presencia de blanco en el fondo botn blanco en botn blanco en Presencia de botn botn blanco en el del tubo, el fondo del el fondo del tubo: cremoso en el fondo del tubo, no sedimento: tubo: crecimiento de fondo del tubo: forma esporas crecimiento de crecimiento de enterococos. crecimiento de enterococos. enterococos. enterococos.

6. Neisseria gonorrhoeae

Observaciones microscpicas:

Neisseria gonorrhoeae Aumento: 100X

Observaciones macroscpicas:

V.

COMENTARIOS: Caldo glucosa azida: Medio para el ensayo previo orientativo de enterococos y para el enriquecimiento selectivo de los mismos. La azida sdica est presente en una concentracin que respeta al mximo a los enterococos e inhibe notablemente a la flora gramnegativa que las puede acompaar. La aparicin de turbidez durante la incubacin (crecimiento) permite sospechar la presencia de Enterococos. En ste caso para su confirmacin, se resiembra en caldo EVA. Si no se presenta turbidez alguna, puede desecharse con seguridad la presencia de Enterocos. Caldo Violeta de Etilo Azida (EVA): Medio para la confirmacin de la presencia de Enterococos, especialmente en la investigacin bacteriolgica de aguas. La azida sdica inhibe toda la flora acompaante que eventualmente hubiera podido desarrollarse en el ensayo previo. Los Enterococos fermentan la glucosa que contiene ste medio, formando cido, lo que se hace patente por el viraje hacia el amarillo que sufre el indicador de pH prpura de bromocresol. La utilizacin de ste caldo ha sido prevista sobre todo en conexin con el ensayo previo mediante el caldo glucosa azida. Medio tioglicolato: Medio para el cultivo y aislamiento de anaerobios estrictos y facultativos, de grmenes microaerfilos y para ensayos de esterilidad. Las sustancias reductoras, tioglicolato y cistena, proporcionan una anaerobiosis suficiente, incluso para anaerobios exigentes. Debido a sus grupos sulfihidrilos, se inactivan los compuestos de arsnico, mercurio y de otros metales pesados. Los medios con tioglicolato son adecuados, por lo tanto, para la investigacin de materiales pesados o conservantes en cuya composicin participen dichos metales pesados. La elevada viscosidad del medio de cultivo tioglicolato impide la penetracin rpida de oxgeno. El eventual aumento del contenido de oxgeno

se pone de manifiesto por un viraje a rojo del indicador Redox rezarsurina sdica. Agar sangre: Este medio constituye un medio enriquecido que permite el aislamiento y cultivo de microorganismo sumamente exigente. Adems permite observar el tipo de degradacin (hemlisis) de la hematina. Caldo triptosa: Para enriquecimiento, aislamiento, cultivo y diferenciacin de los microorganismos de esta familia se utiliza este medio; pero sobre todo para su diferenciacin se utilizan las pruebas hostiles que consisten en aadir sustancias al caldo que inhiben el crecimiento de otros microorganismos siendo tolerables para los Streptococcus. La densidad bacteriana es menor en las zonas anteriores de la boca y la cavidad bucal (particularmente la saliva) se encuentra colonizada por bacterias que inhiben el crecimiento de S. pyogenes. Por tanto, la contaminacin de una muestra bien recogida puede enmascarar o inhibir el crecimiento de S. pyogenes Es importante el empleo de sangre de carnero al 5 %, porque inhibe el desarrollo de Haemophilus hemolyticus, que muchas veces se confunde con el estreptococo por presentar -hemlisis. No debe emplearse sangre humana, porque puede contener anticuerpos y antibiticos que inhiben el desarrollo del estreptococo. Algunas cepas de S. pyogenes forman una cpsula externa de cido hialurnico que contiene molculas repetidas de cido glucurnico y N-acetilglucosamina. La cpsula no se diferencia a nivel antignico del cido hialurnico presente en los tejidos conjuntivos de mamfero, de modo que permite evitar la fagocitosis de las bacterias. Es probable que las cepas encapsuladas de esta especie originen infecciones sistmicas graves. Las bacterias pigenas comprenden un amplio nmero de organismos en el cual depende cada una del medio de donde puedan obtener las fuentes de nutricin necesarias para cada una pueda lograr un desarrollo optimo.

El pus es el resultante de la batalla entre los fagocitos (neutrfilos) y las bacterias invasoras. A medida que las bacterias son ingeridas y muertas por los fagocitos los mismos eventualmente se lisan y liberan su contenido que, junto a los productos de digestin de las bacterias, constituyen el principal material del pus.

Por otra parte como una defensa contra los fagocitos los estreptococos y estafilococos producen toxinas que matan los neutrfilos antes de que ingieran las bacterias contribuyendo al aumento del pus.

La mnima cantidad de sta forma un exudado inflamatorio purulenta causada por bacterias pigenas como Pseudomona, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pyogenes y Staphylococcus aureus. Los cuales se aislaron y cultivaron en el laboratorio en medios generales, selectivos y diferenciales

El medio de cultivo para Neisseria gonorrhoeae necesita CO2 y el crecimiento es lento, por lo tanto para diagnstico se realiza un examen directo con coloracin Gram, el cual se observo al microscopio en prctica.

En las observaciones microscpicas, se pudo observar las diferentes formas de agrupaciones como en el caso de Neisseria gonorreae se pudo observar la caracterstica esencial de esta bacteria, la forma de diplococo.

VI.

REFERENCIA BIBLIOGRAFICA:

1. MURRAY, PATRICK R.;ROSENTHAL, KEN S.;PFALLER, MICHAEL A. Microbiologa Medica. Quinta edicin. Editorial Madrid, Espaa. 2006. 2. PUMAROLA A.,RODRGUEZ TORRES A., PIEDRAHITA ANGULO G., GARCIA RODRGUEZ J. A. Microbiologa y Parasitologa Medica. Segunda Edicin. Editorial Masson. Barcelona, Espaa. 1995. 3. Madigan M. T., Martinko J.M., Parker J. BROCK MICROBIOLOGIA DE LOS MICROORGANISMOS. Editorial Grafillos.1997. 4. JAWETZ, E., J. MELNICK Y E. ADELBERG. 2005. Microbiologa Mdica. 18va Ed. Editorial el Manual Moderno S.A. Mxico. 5. ALICE LARRAINE, SMITH. 1980. Fundamentos de Microbiologa. 8 va ed. Ediciones Universidad de Navarra, S.A. Pamplona Espaa. 6. Koneman, E.W., S.D. Allen, W.M. Janda, P.C. Schreckenberger y W.C. Winn. "DIAGNSTICO MICROBIOLGICO. Texto y atlas en color". 5 Editorial. Panamericana, 1997. 7. Raquel Granados Prez y Ma Carmen Villaverde Peris. MICROBIOLOGA. Editorial Paraninfo.1997. Harcourt Brace-Elsevier.