Revista Cubana de Farmacia

ISSN 0034-7515 versin impresa

Rev Cubana Farm v.41 n.2 Ciudad de la Habana Mayo-ago. 2007

Empresa Laboratorio Farmacutico "Julio Trigo"

Desarrollo de un mtodo analtico para el control de la calidad del colirio de pilocarpina 2 %

Martha Botet Garca,1 Caridad Margarita Garca Pea,2 Jacqueline Aylema Romero,3 Caridad Rodrguez4 y Vivian Martnez Espinosa5

Resumen
Se desarroll y valid un mtodo analtico alternativo para el control de la calidad del colirio de pilocarpina por espectrofotometra ultravioleta, ya que este mtodo resulta ms rpido, sencillo y econmico. Adems, se valid el mtodo analtico reportado para el estudio de estabilidad por cromatografa lquida de alta resolucin. Ambos mtodos se compararon estadsticamente y resultaron especficos, lineales, precisos y exactos en el rango de concentraciones estudiadas. Palabras clave: Pilocarpina, cromatografa lquida de alta resolucin, espectrofotometra ultravioleta. El clorhidrato de pilocarpina es una amina terciaria, parasimpaticomimtica que estimula directamente los receptores colinrgicos. Produce la contraccin del msculo esfnter del iris, da lugar a la constriccin del msculo pupilar (miosis); constriccin del msculo ciliar (acomodacin), lo que provoca el aumento de la acomodacin y una reduccin de la presin intraocular, asociada con un incremento del flujo de salida y un decremento del flujo de entrada del humor acuoso. Adems tambin puede inhibir la secrecin del humor acuoso.1 La espectrofotometra ultravioleta es un poderoso instrumento en una variedad de problemas analticos. Aunque en muchas oportunidades tiene el inconveniente de la falta de especificidad, debido a la interferencia con los productos de degradacin, los cuales en ocasiones pueden presentar un espectro idntico al componente sin degradar, y en otras las concentraciones a determinar son muy pequeas y estn por debajo del lmite de sensibilidad del mtodo o dentro de su error experimental.2 La cromatografa lquida de alta resolucin (CLAR) le brinda la posibilidad al analista de emplear esta herramienta para solucionar los inconvenientes de los mtodos espectrofotomtricos en los estudios de estabilidad, pues adems de presentar una alta sensibilidad y exactitud, es en esencia un mtodo separativo, lo que permite medir con gran selectividad el compuesto deseado, siempre y cuando se encuentre un sistema cromatogrfico que asegure una adecuada separacin.3 La validacin es el proceso establecido para la obtencin de pruebas documentadas de que el mtodo es lo suficientemente fiable para producir el resultado esperado.4-6

Los parmetros analticos que pueden ser considerados en la validacin de un mtodo analtico, segn se expresa en la United States Pharmacopoeia (USP 26, USP 27), son exactitud, precisin, especificidad, lmite de deteccin, lmite de cuantificacin, linealidad, rango, tolerancia y robustez.

El presente trabajo tiene como objetivo desarrollar un mtodo analtico alternativo para el control de la calidad del colirio de pilocarpina y su validacin. Adems, demostrar si existen diferencias significativas entre el mtodo desarrollado y el reportado en la Farmacopea de los Estados Unidos, USP 27, previamente validado.

Mtodos
Las muestras del colirio de pilocarpina al 2 %, utilizadas para el desarrollo de este trabajo fueron identificadas como lote 2004, fabricado en la Empresa Farmacutica Julio Trigo.
Validacin del mtodo analtico para la cuantificacin por CLAR

En el ensayo se emple un cromatgrafo (KNAUER) con detector UV/VIS (KNAUER) ajustado a 215 nm, un dosificador de 20 L e integrador (SHIMADZU CR 8 A). La separacin se realiz isocrticamente sobre una columna hypersil ODS, longitud de 25 cm, dimetro interno 4 mm y tamao de partculas 5 m. La fase mvil utilizada consisti en una mezcla desgasificada de KH2PO4 0,02 M, Acetonitrilo (88:12) con una velocidad de flujo de 1,5 mL/min. Con el objetivo de evaluar la especificidad del mtodo se analiz la sustancia de referencia qumica del clorhidrato de pilocarpina (de calidad USP, con 100 % de pureza), el placebo y una muestra del producto terminado sometida a condiciones drsticas como: hidrlisis cida HCl 0,1 N e hidrlisis bsica, almacenada a una temperatura de 70 oC durante 21 das. Para el estudio de la linealidad de la respuesta del detector se prepar una curva de calibracin con soluciones patrn de clorhidrato de pilocarpina en un rango de concentraciones de 48 a 112 g/mL, que representan del 60 al 140 % de la concentracin terica del principio activo en la solucin. Se evalu la precisin del mtodo. La repetibilidad se estudi sobre la base de 6 determinaciones y se efectuaron valoraciones por 2 analistas en 2 das diferentes para comprobar la precisin intermedia del mtodo. En el estudio de la exactitud se emple el mtodo de recuperacin; se prepararon muestras con diferentes niveles de clorhidrato de pilocarpina que representan el 80, 100 y 120 % de la concentracin terica del principio activo en la solucin, segn la formulacin propuesta. Con el objetivo de verificar la relacin lineal de la respuesta analtica con respecto a los diferentes niveles de concentracin utilizados, se realiz el estudio de linealidad a travs de los coeficientes de variacin de los factores de respuesta CVf, los cuales deben ser menores que el 5 %. Adems se realiz la prueba de proporcionalidad, para lo cual se utiliz el estadgrafo t Student, con el objetivo de demostrar la proporcionalidad de la seal obtenida. Tambin se determin la influencia del factor concentracin en la variabilidad de la respuesta obtenida, a travs de la prueba de Cochran (G calculada debe ser menor que G tabulada).4-6
Desarrollo y validacin del mtodo analtico para la cuantificacin por espectrofotometra ultravioleta (UV)

En el desarrollo del mtodo analtico por espectrofotometra ultravioleta se utiliz un espectrofotmetro Spectronic GnesisTM 2PC. Para la seleccin adecuada de la longitud de onda a utilizar, se realizaron previamente espectros UV, en la zona de 200 a 400 nm, con la sustancia de referencia, producto terminado, placebo y materia prima del clorhidrato de pilocarpina, disueltos en agua destilada; se observ un mximo de absorbancia a 215 nm. La solucin de referencia se obtuvo disolviendo el clorhidrato de pilocarpina, sustancia de referencia, en agua destilada hasta obtener una concentracin de 20 mg/mL aproximadamente. En la preparacin de la solucin de ensayo para la valoracin se disolvi una alcuota de la muestra del colirio en agua destilada hasta una concentracin de alrededor de 20 mg/mL. Se lee a 215 nm contra un blanco de agua destilada. Con el objetivo de evaluar la especificidad del mtodo se emplearon muestras con la sustancia de referencia qumica del clorhidrato de pliocarpina, placebo, muestra de producto terminado pilocarpina colirio y muestras sometidas a condiciones drsticas de hidrlisis cida y bsica, realizando un scanning de las soluciones entre 200 y 400 nm. Para el estudio de la linealidad de la respuesta del detector se prepar una curva de calibracin con solucin patrn de clorhidrato de pilocarpina en un rango de concentraciones de 10 hasta 30 mg/mL que representan del 50-150 % de la concentracin terica del principio activo en la solucin. Se evalu la precisin del mtodo. La repetibilidad se estudi sobre la base de 6 determinaciones y se efectuaron valoraciones por 2 analistas en 2 das diferentes para comprobar la precisin intermedia del mtodo; para el estudio se utilizaron los estadgrafos F-Fischer y t-Student, con el objetivo de determinar la existencia de diferencias significativas entre las precisiones alcanzadas por ambos analistas y entre las medias obtenidas, respectivamente. Primeramente, se realiz la prueba de Fischer y se verific la homogeneidad de las varianzas alcanzadas por diferentes analistas; se debi obtener un valor calculado menor que el tabulado. En el caso del estadgrafo t-Student se debe obtener tambin un valor calculado menor que el tabulado. En el estudio de la exactitud se emple el mtodo de recuperacin, para lo cual se prepararon muestras con diferentes niveles, que representan el 80, 100 y 120 % de la concentracin terica del principio activo en la solucin.
Comparacin estadstica

Con el objetivo de realizar una comparacin estadstica entre los resultados por CLAR y los obtenidos por el mtodo analtico alternativo desarrollado por espectrofotometra ultravioleta se aplic el estadgrafo de la t de Student para determinar si existan diferencias significativas entre los 2 mtodos.

Resultados
Validacin del mtodo analtico para la cuantificacin por CLAR

La figura muestra los resultados obtenidos en el estudio de especificidad del mtodo. Como se observa al comparar la seal obtenida para la sustancia de referencia (I) y la muestra de pilocarpina clorhidrato (II), existe similitud en cuanto al tiempo de retencin. En el cromatograma correspondiente al placebo (III) no se obtuvo ninguna seal en la zona de inters, lo cual indica que los excipientes o sustancias auxiliares de la solucin no

interfieren en la determinacin del principio activo. En cuanto a las muestras sometidas a condiciones drsticas; se observan en los cromatogramas (IV, V) la aparicin de picos secundarios, atribuibles a un posible producto de degradacin, el cual no interfiere en la determinacin del principio activo.

Fig. Resultados del estudio de especificidad del mtodo cromatogrfico. I-Cromatograma de la sustancia de referencia qumica. II- Cromatograma del producto terminado (muestra). III- Cromatograma del placebo. IV- Cromatograma de la muestra degradada por hidrlisis cida. V- Cromatograma de la muestra degradada por hidrlisis bsica. Simultneamente se realiz un scanning al pico correspondiente al principio activo en un rango de 200 a 400 nm, para una pureza del 99,5 %. En la tabla 1 se reportan los resultados del estudio de la linealidad del sistema y la exactitud. Los resultados del estudio de precisin del mtodo desarrollado aparecen reportados en la tabla 2. Tabla 1. Resultados del estudio de la linealidad del sistema y exactitud Parmetros CLAR y= 0,30663 X + 2,018 r = 0,99956 CVf= 0,94 % tcalc= 2,03 ttab= 3,18 y= 1,14589 x - 0,89245 r= 0,99945 CVf= 1,58 % Exactitud R= 99,28 % tcalc = 1,69 ttab = 2,57 Gcalc= 0,5879 Gtab = 0,9750 UV y= 23,677 x + 0,00193614 r= 0,99948. CVf = 1,13 % tcalc= 2,99 ttab= 3,18 y = 0,999788 x + 0,0138373 r= 0,99916 CVf= 2,17 % R= 99,70 % tcalc= 1,77 ttab= 3,18 Gcalc= 0,8709 Gtab= 0,9750 Lmites y= a x + b r 0,99900 CVf 5,0 % tcalc < ttab y= a x + b r 0,99000 CVf 5,0 % R= 98,0 102,0 % tcalc < ttab Gcalc < Gtab

Linealidad del sistema

Tabla 1. Resultados del estudio de la linealidad del sistema y exactitud Parmetros CLAR y= 0,30663 X + 2,018 r = 0,99956 CVf= 0,94 % tcalc= 2,03 ttab= 3,18 y= 1,14589 x 0,89245 r= 0,99945 CVf= 1,58 % Exactitud R= 99,28 % tcalc = 1,69 ttab = 2,57 Gcalc= 0,5879 Gtab = 0,9750 UV y= 23,677 x + 0,00193614 r= 0,99948. CVf = 1,13 % tcalc= 2,99 ttab= 3,18 y = 0,999788 x + 0,0138373 r= 0,99916 CVf= 2,17 % R= 99,70 % tcalc= 1,77 ttab= 3,18 Gcalc= 0,8709 Gtab= 0,9750 Lmites y= a x + b r 0,99900 CVf 5,0 % tcalc < ttab y= a x + b r 0,99000 CVf 5,0 % R= 98,0 102,0 % tcalc < ttab Gcalc < Gtab

Linealidad del sistema

Validacin del mtodo analtico para la cuantificacin por UV

Los resultados obtenidos en el estudio de especificidad del mtodo realizado a 215 nm, al placebo, la sustancia de referencia qumica, y el colirio de pilocarpina se muestran en la tabla 3. Tabla 3. Estudio de especificidad por espectrofotometra ultravioleta Muestra Placebo Sustancia de referencia qumica de clorhidrato de pilocarpina Colirio de pilocarpina 2 % Absorbancia (310 nm) 0,002 0,410 0,406 0,003 0,403 0,399 0,003 0,405 0,404

En la tabla 1 se reportan los resultados del estudio de la linealidad del sistema y la exactitud, mientras que los resultados correspondientes a la precisin aparecen en la tabla 4. Tabla 4. Resultados del estudio de la precisin por espectrofotometra Analista 1 Da 1 99,7 % 99,6 % 99,9 % 100,5 % 100,9 % Da 2 99,8 % 98,9 % 100,8 % 100,8 % 101,7 % Da 1 100,7 % 98,7 % 99,4 % 99,9 % 100,9 % Analista 2 Da 2 99,3 % 99,6 % 100,5 % 100,9 % 98,1 %

101,9 % CV= 0,80 % tcal= 1,79 ttab= 2,33

99,7 % CV= 0,90 %

101,2 % CV= 0,88 % Fcal= 2,45 Ftab= 5,05

99,6 % CV= 0,98 %

Leyenda: CV: coeficiente de variacin; t: estadgrafo t-Student; F: estadgrafo F-Fischer.

Comparacin estadstica

Los resultados de la comparacin estadstica de los resultados obtenidos por CLAR y el mtodo analtico desarrollado por espectrofotometra ultravioleta se aprecian en la tabla 5. Tabla 5. Comparacin estadstica de los mtodos por CLAR y UV CLAR (%) 102,9 102,5 102,4 103,6 103,0 102,6 Media= 101,5% CV= 1,35 % Espectrofotometra (%) 100,5 100,9 101,9 101,7 101,2 100,9 Media= 101,4 % CV= 1,38 % Tcal = 1,98 ttab= 2,33 CVf = 2,09 CVf 5,0 % tcal< ttab Lmites

Discusin
Como se puede apreciar en la figura el mtodo reportado por CLAR resulta especfico al no detectarse interferencias de picos adicionales en la zona de elusin del producto principal. El scanning realizado con el objetivo de determinar la pureza del pico de pilocarpina, en el rango de 200 a 500 nm demostr que no exista solapamiento de otros productos de degradacin. Los resultados obtenidos en el estudio de especifidad del mtodo espectrofotomtrico, reflejados en la tabla 3, al analizar muestras del placebo, la sustancia de referencia de clorhidrato de pilocarpina y el producto terminado, indican que los excipientes no interfieren en la determinacin del principio activo, lo que demuestra la especificidad del mtodo para el control de la calidad al no observarse absorbancia del placebo a la longitud de onda mxima del principio activo. Sin embargo, al analizar las muestras sometidas a condiciones drsticas se observaron interferencias de los productos de degradacin a la longitud de mxima absorbancia de la pilocarpina, lo que demuestra que el mtodo no es especfico para el estudio de estabilidad del colirio. Las curvas de calibracin de los mtodos validados para el control de la calidad y el estudio de estabilidad del colirio de pilocarpina resultaron ser lineales. Al aplicar la prueba del intercepto a cada uno de los mtodos, resultaron no significativos ya que las t tab fueron mayores que las t cal, por lo que se rechaza la hiptesis nula de que el intercepto es igual a cero, para ambos mtodos. En la prueba de linealidad mediante el coeficiente de variacin de los factores de respuesta CVf, se obtuvieron coeficientes de variacin menor

del 5 % y se demostr el cumplimiento de la linealidad en el intervalo de concentraciones estudiados para ambos mtodos validados. En los estudios de repetibilidad se obtuvieron coeficientes de variacin adecuados, menores que 1,5 % lo que demuestra la buena precisin de los mtodos. Los valores obtenidos para los estudios de la precisin intermedia demostraron que no existen diferencias significativas entre las precisiones alcanzadas por los analistas en diferentes das para una probabilidad de 0,05 %, ya que los valores de F cal son menores que la F tab. Al realizar las prueba de la t de Student para ambos mtodos, el valor calculado result ser menor que el tabulado, lo cual demuestra que no existen diferencias significativas entre las medias alcanzadas con un nivel de significacin del 5 %. En los estudios de exactitud realizados para los 2 mtodos, los valores de porcentaje de recobro estuvieron dentro de los lmites establecidos para los mtodos espectrofotomtricos y cromatograficos (98-102 %), y los valores del coeficiente de variacin para cada uno de los niveles de concentracin estudiados resultaron menores que el 5 %. En la influencia del factor concentracin sobre la variabilidad de los resultados de la exactitud al aplicar la prueba de Cochran, las concentraciones empleadas son equivalentes, lo que indica que la concentracin no influye en la variabilidad de estos. No existieron diferencias significativas entre las recuperaciones medias y el 100 % de recuperacin al aplicar la prueba de la t de Student, ya que la t cal fue menor que la t tab, por lo que el mtodo es exacto. La curva de recuperacin reportada de mg tericos contra los mg prcticos demostr un comportamiento lineal. La prueba de significacin del intercepto result no significativa y el valor de la pendiente no difiere significativamente de la unidad. Los valores alcanzados de la pendiente, el intercepto y el coeficiente de correlacin demostraron la exactitud y linealidad del mtodo. Al analizar estadsticamente los resultados obtenidos de los mtodos analticos por CLAR y el desarrollado por espectrofotometra ultravioleta, para la cuantificacin del colirio de pilocarpina 2 %, para el estudio de estabilidad y control de la calidad, respectivamente, se pudo comprobar que no existen diferencias significativas entre los resultados, al ser la t cal menor que la t tab.

Summary
Development of a analytical method for quality control of 2 % Pilocarpine eyedrops

A alternating and analytical method was developed and validated for quality control of Pilocarpine eyedrops by UV spectrophotometry, since this method is more fast, simple, and cheap. Also, for stability study by high performance liquid chromatography, reported analytical method was validated. Both methods were statistically compared, and were specific, linear, accurate, and in the rank of study concentrations. Key words: Pilocarpine, high performance lilquid chromatography, UV spectrophotometry.

Referencias bibliogrficas
1. Martindale W. The extra Pharmacopoeia 28th ed. London: Pharmaceutical Press; 1989. p. 1224-6. 2. Cromatografa en la Qumica Clnica. HPLC en Reactivos Merck. Alemania. 1988. p. 3-16.

3. Quattrocchi OA, Laba RF. Introduccin a la HPLC en Aplicacin y prctica. Buenos Aires: Ed. Artes Grficas Farro SA; 1992. p. 106-22; 284; 302-28. 4. Asociacin Espaola de Farmacuticos de la Industria. Validacin de Mtodos Analticos. Seccin Catalana de AEFI. Comisin de normas de buena fabricacin y control de la calidad. Sept. Barcelona: AEFI; 1999. p. 1-94. 5. United States Pharmacopoeial Convention, USP 23-NF 17. Validation of compendial methods. 23 ed. Rockville; Mack Printing; 1995. p. 1982- 4. 6. International Conference on Harmonization (ICH) of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Validation of analytical procedures: Methodology, ICH-Q2B, Geneva, 1996. ICH harmonized tripartite guideline. Methodology of validation of analytical method. Recomendado en nov. 1996. Geneva: ICH; 1996. Recibido: 8 de enero de 2007. Aprobado: 9 de febrero de 2007. MC. Martha Botet Garca. Empresa Laboratorio Farmacutico "Julio Trigo". Avenida Independencia km 7.5, Boyeros, La Habana, Cuba. Correo electrnico: caridad@cidem.quimefa.cu