Cromatografia

Prof. Natalia Fernandes

INTRODUO: Cromatografia = kroma [cor] + graph [escrever] (grego) CROMATOGRAFIA Cromatografia uma tcnica na qual os componentes de uma mistura so separados com base nas diferenas de velocidades nas quais so transportados atravs de uma fase fixa estacionria por uma fase mvel lquida ou gasosa. A fase estacionria em cromatografia imobilisada em uma coluna ou sobre uma superfcie plana.

A fase mvel em cromatografia movimenta-se atravs da fase estacionria transportando a mistura dos analitos. A fase mvel pode ser um gs, um lquido ou um fludo supercrtico

A interao dos componentes da mistura com estas duas fases influenciado por diferentes foras intermoleculares, incluindo inica, bipolar, apolar, e especficos efeitos de afinidade e solubilidade Histria

Foi o botnico russo, Mikhail Semyonovich Tswet que inventou a primeira tcnica cromatografica em 1900 durante suas pesquisas sobre a clorofila. Ele usou uma coluna de absoro lquida contendo carbonato de clcio para separar pigmentos de folhas de plantas. Os extractos de folhas contm dois pigmentos verdes(clorofila a e b) e diversos pigmentos amarelos(carotenides). O mtodo foi descrito em 30 de dezembro de 1901 no 11 Congresso de Mdicos e Naturalistas em So Petersburgo. A primeira publicao feita foi em 1903 Ele usou pela primeira vez o termo cromatografia em uma publicao em 1906 no jornal de botnica alemo, Berichte der Deutschen Botanischen Gesellschaft. Em 1907 ele demonstrou sua cromatografia para a Sociedade Botnica Alem.

Em 1952, Archer John Porter Martin e Richard Laurence Millington Synge ganharam o Prmio Nobel de Qumica pela inveno da cromatografia de partio. Desde ento, a tecnologia tem avanado rapidamente. A cromatografia pode ser utilizada para a identificao de compostos, por comparao com padres previamente existentes, para a purificao de compostos, separando-se as substncias

indesejveis e para a separao dos componentes de uma mistura. 1. Classificao pela forma fsica do sistema cromatogrfica 2. Em relao forma fsica do sistema, 3. a cromatografia pode ser subdividida 4. em cromatografia em coluna e 5. cromatografia planar. 6. EM COLUNA: cromatografia lquida, gasosa e supercrtica. 7. PLANAR: Centrfuga, em papel e camada delgada

2. Classificao pela fase mvel empregada So de 3 tipos: a cromatografia gasosa, a cromatografia lquida e a cromatografia supercrtica (CSC). A cromatografia lquida apresenta uma importante subdiviso: a cromatografia lquida clssica (CLC) e a cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE). No caso de fases mveis gasosas, separaes podem ser obtidas por cromatografia gasosa (CG) e por cromatografia gasosa de alta resoluo (CGAR).

3. Classificao pela fase estacionria utilizada

Quanto fase estacionria, distingue- se entre fases estacionrias slidas, lquidas e quimicamente ligadas. No caso da fase estacionria ser constituda por um lquido, este pode estar simplesmente adsorvido sobre um suporte slido ou imobilizado sobre ele. Suportes modificados so considerados separadamente, como fases quimicamente ligadas, por normalmente diferirem dos outros dois em seus mecanismos de separao.

4. Classificao pelo modo de separao Separaes cromatogrficas se devem adsoro, partio, troca inica, excluso ou misturas desses mecanismos. Separaes cromatogrficas se devem adsoro, partio, troca inica, excluso ou misturas desses mecanismos.

Cromatografia de adsoro

Neste processo, o de mais ampla utilizao, duas substncias so ligadas por uma interface onde no ocorre solubilizao. A fase estacionria slida e a fase mvel pode ser lquida ou gasosa. Baseia-se nas atraces electrostticas ou bipolares da superfcie da fase estacionria pelas molculas da substncia a separar. A cromatografia de adsoro em carvo activado, alumina, slica gel tem ampla aplicao, sendo utilizada na separao de muitos tipos de compostos.

Cromatografia de partio

A fase estacionria lquida. Este tipo de cromatografia(semelhante extraco por solvente) se baseia na distribuio das molculas do soluto entre duas fases lquidas imiscveis de acordo com as solubilidades relativas.

Cromatografia Inica

A cromatografia inica uma variante da cromatografia lquida que utiliza resinas de troca inica para separar ies atmicos ou moleculares com base na sua interaco com a resina. A separao dos analitos conseguida de forma isocrtica ou por aplicao de gradiente. A vantagem desta tcnica prende-se com a simplificao da determinao de espcies inicas em simultneo cuja alternativa mais complexa e demorada. utilizada para a anlise de ies inorgnicos em vrias matrizes como guas residuais ou caldos de fermentao (anies tais como cloreto, fluoreto, nitrito, nitrato e sulfato; caties como ltio, clcio, amnia, magnsio, potssio e sdio). Permite analisar cidos orgnicos alifticos e cidos sulfnicos orgnicos, espcies bioqumicas como carbohidratos mono, dissacridos e alguns oligossacridos ; lcoois derivados de carbo-hidratos, amino-cidos, protenas e outros compostos. Alm das aplicaes enunciadas possvel desenvolver mtodos especficos para outros analitos desde que estejam dentro da gama de operao do equipamento.

O limite de deteco da ordem dos ppm podendo-se identificar analitos aninicos na ordem dos ppb.

CROMATOGRAFIA

PLANAR

COLUNA

CENTRFUGA

CCD

CSC

GASOSA

CP

CG

CGAR

LQUIDA

CLSSICA

CLAE

Cromatografia planar A cromatografia em papel (CP) uma tcnica de partio lquidolquido. Baseia-se na diferena de solubilidade das substncias em questo entre duas fases imiscveis, sendo geralmente a gua um dos lquidos. Este mtodo muito til para a separao de compostos

polares, sendo largamente usado em bioqumica

Utiliza-se pequena quantidade de amostra

(microgramas a miligramas). As manchas podem ser reveladas por meio de luz UV, vapores de iodo, solues de cloreto frrico e tiocianoferrato de potssio, etc) Cromatografia em papel com fase normal (papel saturado com a fase estacionria polar, p. ex. gua) e com fase reversa (papel tratado com outro lquido, por ex.: acetona e dimetilformamida, parafina, leo, silicone, solventes orgnico).

Cromatografia planar

Na cromatografia planar, tambm chamada de camada fina, ou TLC ("Thin Layer Chromatography"), a fase estacionria, por exemplo alumina ou slica, suportada sobre uma placa plana ou nos poros de um papel. Nesse caso, a fase mvel desloca-se atravs da fase estacionria, slida e adsorvente, por aco da capilaridade ou sob a influncia da gravidade. til em separao de compostos polares. Encontra-se bastante difundida devido sua facilidade experimental e ao seu baixo custo.

A cromatografia em camada delgada (CCD) uma tcnica de adsoro lquidoslido. Nesse caso, a separao se d pela diferena de afinidade dos componentes de uma mistura pela fase estacionria

de slica. O solvente sobe na camada adsorvente por capilaridade e, numa mistura, os vrios componentes deslocam-se a velocidades diferentes, que dependem da sua afinidade para o adsorvente. Os adsorventes comerciais mais utilizados so: slica, alumina, celulose, e poliamida. Utiliza-se tambm pequena quantidade de

amostra. Assim como na cromatografia em papel, as manchas podem ser reveladas por meio de luz UV, vapores de iodo, solues de cloreto frrico e tiocianoferrato de potssio, fluorescncias, radioactividade, etc. A escolha do solvente para eluir depende da mistura ou da substncia a ser analisada. A seguir apresenta-sA distncia percorrida pelos componentes pode ser aumentada usando um solvente de polaridade mais elevada e vise versa. Por exemplo, uma substncia polar, como um cido, requerer um solvente de poder eluente elevado, como o metanol, ao passo que um composto no polar, como um ster, requerer um solvente menos polar, como clorofrmio. O poder eluente de um solvente para uma dada substncia pode ser ajustado misturando um solvente com outro de diferente polaridade(por exemplo, clorofrmio e metanol).

A seguinte srie emprica til para a maior parte das aplicaes em slica. Os solventes encontram-se indicados por ordem crescente de polaridade (poder eluente). Ciclohexano Heptano Pentano Tetracloreto de carbono Clorobenzeno Tolueno Benzeno Clorofrmio ter diisoproplico ter dietlico Acetato de etilo Etanol gua Acetona cido actico Metanol

O parmetro mais importante a ser considerado em CCD o factor de reteno (Rf), o qual a razo entre a distncia percorrida pela substncia em questo e a distncia percorrida pela fase mvel. Os valores ideais para Rf esto entre 0,4 e 0,6. A CCD pode ser usada tanto na escala analtica quanto na preparativa. Por ser um mtodo simples, rpido, visual e econmico, a CCD a tcnica predominantemente escolhida para o acompanhamento de reaces orgnicas, sendo tambm muito utilizada para a purificao de substncias e para a identificao de fraces colectadas em cromatografia lquida clssica.

Centrfuga - CROMATOTRON Cromatotron uma cromatografia em camada delgada preparativa e acelerada centrifugamente. Foi desenvolvida pelos autores do Compndio de Mtodos Orgnicos Sintticos. Substitui as CCD (cromatografia De camada delgada) preparativas, pequenas colunas com dimenses de 30cm.

Princpio de operao

A amostra a ser separada aplicada

como uma soluo no centro do disco giratrio humedecido com o solvente. A eluio com solvente gera bandas circulares de separao dos componentes que so removidos juntamente com o solvente para um tubo de recepo.

Capacidade: 500 mg por componente, cerca de 1 g total.

Adsorventes: Slica gel, alumina e slica gel - nitrato de prata.

Solventes: Compatvel com todos os solventes comummente usados nas outras tcnicas cromatogrficas, inclusive cido actico. No apropriada para uso com cidos minerais. Vantagens especiais:

* No aplicao de raspagem de bandas. * Separaes so rpidas, cerca de 20 min.

* Permite a observao direta por UV ou de compostos coloridos durante a eluio. Cromatografia em coluna

A cromatografia lquida clssica muito utilizada para isolamento de produtos naturais e purificao de produtos de reaces qumicas.

As fases estacionrias mais utilizadas so slica e alumina, entretanto estes adsorventes podem servir simplesmente como suporte para uma fase estacionria lquida. Fases estacionrias slidas levam separao por adsoro e fases estacionrias lquidas por partio.

A Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE) uma tcnica analtica usada para separar e quantificar componentes numa mistura lquida. A utilizao de suportes com partculas diminutas so os responsveis pela alta eficincia desse mtodo de cromatografia. A fase mvel (lquida) movimenta-se continuamente atravs da coluna contendo a FASE ESTACIONRIA (slido). O soluto interage com as fases estacionria e mvel por adsoro, partio, excluso molecular, troca inica. As separaes em CLAE podem se dar por adsoro (separao slido-lquido), partio (separao lquidolquido) ou ambos.

INSTRUMENTAO BSICA DA CLAE

O detector mais utilizado para separaes por CLAE o detector de ultravioleta (Absoro da luz na faixa UV visvel), sendo tambem em pregados detectores de fluorescncia, de indce de refrao, e eletroqumicos, entre outros. Cromatografia Gasosa Tcnica de separao e anlise de misturas por interao dos seus componentes entre uma fase estacionria e uma fase mvel

Mecanismo de separao A amostra injetada (injetor de amostra) e arrastada pela fase mvel (gs arrastador) atravs da coluna que contm a fase

estacionria (coluna CG aquecida), onde ocorre a separao da mistura. As substncias separadas saem da coluna dissolvidas na fase mvel e passam por um detector que gera um sinal eltrico proporcional quantidade de material separado. Mas o que um detector? um dispositivo que indica os componentes separados pela coluna. Examinam continuamente o material, gerando um sinal na passagem de substncias que foram separadas.

3 tipos:
Universais geram um sinal para qualquer composto.

Seletivos geram um sinal apenas para compostos com determinadas caractersticas.

Especficos geram um sinal para compostos que tenham um determinado elemento na sua estrutura. Caractersticas da fase mvel ou gs de arraste: Inerte No interage nem com a amostra, nem com a fase estacionria, apenas transporta a amostra atravs da coluna.

Puro Isento de impurezas que possam contaminar a amostra, ou gerar rudo no sinal. Compatvel com o detector. Exemplo: H2, N2, He

Caractersticas da fase estacionria: Caractersticas prximas dos solutos a serem separados.

Seletividade, deve ser um bom solvente diferencial dos componentes da amostra. Quimicamente inerte relativamente amostra. Volatilidade baixa. Estabilidade trmica. Pouco viscoso. Fases estacionrias utilizadas Puro.

Parafinas apolares Poliglicis polares Polisteres polares

Silicones cobrem ampla faixa de Fase estacionria Mecanismo de separaopolaridade.

A amostra atinge a fase estacionria sendo parte absorvida e estabelece-se o equilbrio entre esta parte e

uma outra que permanece na fase gasosa, que por sua vez continua no gs de arraste at estabelecer o equilbrio. O gs de arraste atinge a fase estacionria, o que leva a amostra a entrar novamente neste para restabelecer o equilbrio. Aplicaes prticas da Cromatografia Gasosa: Qumica: Determinao de antioxidantes, nutrientes ou contaminantes em alimentos. Indstria: Monotorizao de processos industriais. Sade: Anlises dos constituintes do sangue. Anlise forense. Ambiente:

Determinao de resduos de pesticidas em produtos alimentares, guas ou esgotos. Determinao de gases e solventes orgnicos na atmosfera, solos ou rios.

Cromatografia gasosa de alta resoluo (CGAR

O principal mecanismo de separao da cromatografia gasosa est baseado na partio dos componentes de uma amostra entre a fase

mvel gasosa e a fase estacionria lquida. A utilizao de fases estacionrias slidas, as quais levariam separao por adsoro, apresenta poucas aplicaes. A cromatografia gasosa uma das tcnicas analticas mais utilizadas. Alm de possuir um alto poder de resoluo, muito atrativa devido possibilidade de deteco em escala de nano a picogramas. A diferena entre CG e CGAR est na coluna (tubos longos de metais como ao ou cobre, vidro ou teflon). Colunas de CGAR so maiores em comprimento, menores em dimetro, possuem a fase lquida como um filme aplicado diretamente s paredes do tubo da coluna e so mais eficientes. Cromatografia supercrtica (CSC) - Utiliza-se um vapor pressurizado(vapor uma presso aproximada da presso atm normal) , acima da sua temperatura crtica.

Instituto de Criminalstica inicia a operao com cromatgrafo

Trata-se de cromatgrafo, que tem a funo de realizar a separao dos componentes de uma amostra e do espectrofotmetro de massa cuja finalidade identificar os compostos das amostras analisadas. O espectrofotmetro muito importante, sobre tudo quando se tem amostras de origens desconhecidas e que precisam de uma identificao rpida e precisa. Ele tambm utilizado na anlise forense para identificao de vrios tipos de drogas ilcitas tais como maconha, cocana e crack, bem como nas drogas de abuso como medicamento.

O equipamento tambm realiza a anlise de combustveis, bebidas e compostos venenosos. O aparelho tambm tem vantagem de especificar a quantidade exacta de drogas presentes nas amostras e proceder identificao de materiais e fragmentos em locais de crimes quando no se conhece os compostos presentes. (Alcoolemia - lcool no sangue e dragas no organismo).

Nos casos de incndio e exploses onde existe a suspeita de aco criminosa possvel identificar o combustvel utilizado e, no caso de exploses, determinar qual foi o agente empregado na aco, contribuindo de forma decisiva na elucidao do crime.