UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO DEPARTAMENTO DE AGRONOMIA REA DE FITOTECNIA

BIOTECNOLOGIA VEGETAL TPICO 5: TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

Prof Anglica Virgnia Valois Montarroyos E-mail: angelicavalois@gmail.com

RECIFE - 2013

PARTES CONSTITUINTES DE UM GENE

GENE isolado

Promotor

Sequncia Codificante

Terminador

CONSTRUO GNICA
GENE isolado
Promotor
ATG

Sequncia Codificante

Terminador

Novo Promotor Terminador

ATG

GENE especialmente ordenado

CONSTRUO GNICA

SEQUNCIAS PROMOTORAS: iniciam a transcrio determinam quando, onde e em que intensidade o produto da expresso do gene ser produzido.

SEQUNCIA DE TERMINAO: marca o final do gene

ENZIMAS DE RESTRIO
ENDONUCLEASES STIO-ESPECFICAS ISOLADAS DE ORGANISMOS PROCARIOTOS. PROTEGEM AS BACTRIAS DO ATAQUE DE VRUS (FAGOS). PROTEGEM SEU PRPRIO DNA METILANDO-O NOS STIOS DE RESTRIO DAS ENZIMAS. MAIS DE 3.500 ENZIMAS DE RESTRIO TM SIDO ESTUDADAS EM DETALHE. CERCA DE 600 ENZIMAS ESTO DISPONVEIS COMERCIALMENTE E SO USADAS ROTINEIRAMENTE PARA A MODIFICAO E MANIPULAO DE DNA EM LABORATRIOS.

AS ENZIMAS DE RESTRIO SO CLASSIFICADAS EM: ENDONUCLEASES: clivam internamente o DNA fita dupla por meio da hidrlise das ligaes fosfodister.

EXONUCLEASES: clivam nucleotdeos de uma extremidade de uma fita dupla de DNA.

1 enzima de restrio descoberta: Hind II Bactria: Haemophilus influenzae, cepa d, subtipo II

Local: Laboratrio de Hamilton Smith, Universidade de John Hopkins, EUA

NOMENCLATURA DAS ENZIMAS DE RESTRIO

AcaI AluI BamHI EcoRI HaeIII Sau3AI

Acinetobacter calcoaceticus Arthrobacter luteus Bacillus amyloliquefaciens H Escherichia coli Haemophilus aegyptius Staphylococcus aureus 3

TIPOS DE EXTREMIDADES (CORTES) PRODUZIDOS PELAS ENZIMAS DE RESTRIO

a) ROMBAS OU SIMTRICAS

b) COESIVAS

DNA LIGASE

A Escherichia coli e o fago T4 produzem enzimas DNA ligase capazes de selar fragmentos de DNA fita dupla.
Existem duas classes de DNA ligases: a) A que utiliza NAD+ como cofator (s encontrada em bactrias); b) A que utiliza ATP como cofator (encontrada em eucariontes, vrus e bacterifagos).

LIGAO DAS EXTREMIDADES COESIVAS GERADAS

VETORES DE CLONAGEM = so molculas de DNA fita dupla que permitem a introduo e multiplicao do inserto dentro do hospedeiro. TIPOS DE VETORES PLASMDEO ( inserto 8Kb) FAGO (inserto 20Kb) COSMDEO (inserto > 40Kb) BACTERIFAGO (inserto 75 a 100Kb) BAC (inserto >300Kb)

1 Kb = 1.000 pb (pares de bases) BAC = Cromossomo artificial de bactria

REQUISITOS DE UM VETOR DE CLONAGEM

ETAPAS PARA CONSTRUO DE UMA MOLCULA DE DNA RECOMBINANTE Corte do DNA de interesse (inserto) com enzima de restrio de corte coesivo; Corte do vetor com enzima de restrio de corte coesivo (a mesma usada para o corte do DNA); Ligao do inserto com o vetor a partir da utilizao da enzima DNA ligase.

CONSTRUO DE UMA MOLCULA DE DNA RECOMBINANTE

Fragmento de DNA de interesse = Inserto

Ligao enzimtica: DNA Ligase

Vetor de clonagem

GENE
Promotor

ATG

Sequencia Codificante

Terminador

Sitio onde se incorpora o inserto

Vector=Plasmdio

ETAPAS PARA REALIZAO DE CLONAGEM MOLECULAR Corte do DNA de interesse (inserto) com enzima de restrio que gere extremidade coesiva;

Corte do vetor com enzima de restrio que gere extremidade coesiva (a mesma usada para o corte do DNA);
Ligao do inserto com o vetor a partir da utilizao da enzima DNA ligase; Seleo das molculas de DNA recombinante; Seleo do sistema vetor/hospedeiro;

Introduo da molcula do DNA recombinante no hospedeiro;

Seleo e identificao dos clones recombinantes.

A TRANSFORMAO GENTICA (INTRODUO DA MOLCULA DO DNA RECOMBINANTE NO HOSPEDEIRO) ENVOLVE DOIS ESTGIOS:

1. A TRANSFERNCIA DO DNA EXGENO PARA O ORGANISMO A SER TRANSFORMADO; 2. A INTEGRAO DO DNA EXGENO NO GENOMA DO HOSPEDEIRO.

A integrao gentica um processo que apresenta menor eficincia que a transferncia!!

MTODOS DE TRANSFORMAO GENTICA DE PLANTAS (TRANSFERNCIA DE GENES PARA CLULAS VEGETAIS)

BASEADOS NA FORMA PELA QUAL O DNA DE INTERESSE INTRODUZIDO NO NCLEO DAS CLULAS VEGETAIS:
TRANSFORMAO INDIRETA FAZ USO DE VETORES PARA PROMOVER A TRANSFERNCIA DO DNA EXGENO PARA O GENOMA DAS PLANTAS (VIA Agrobacterium tumefaciens ou rhizogenes OU VIA VRUS). TRANSFORMAO DIRETA PROMOVE A TRANSFERNCIA DIRETA DE GENES PARA A CLULA VEGETAL UTILIZANDO PROCESSOS FSICOS OU QUMICOS QUE CAUSAM MODIFICAES NAS PAREDES, MEMBRANAS CELULARES E ENVELOPE NUCLEAR FACILITANDO A INTRODUO DO DNA EXGENO (VIA ELETROPORAO, BIOBALISTICA).

TRANSFORMAO POR AGROBACTERIUM Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenese so patgenos naturais das plantas. Possuem uma capacidade natural de introduzir parte de seu DNA (T-DNA) em plantas hospedeiras, que passa a ser expresso como parte do genoma da planta.

 Pedaos de tecidos jovens (ex: folhas cotiledonares) so colocadas em uma placa de petri com suspeno contendo Agrobacterium sp. possuidoras da molcula de DNA recombinante (plasmdeo + inserto). Os pedaos de folhas so colocados em meio de cultura especfico para a regenerao in vitro. Aps regenerao as plantas sero avaliadas em laboratrio, em casa-de-vegetao e campo.

A transformao mediada pela Agrobacterium o mtodo mais amplamente utilizado para plantas dicotiledneas.

TRANSFORMAO POR BIOBALSTICA

 Tecidos jovens (ex: embries imaturos, folhas cotiledonares) so colocadas em uma placa de petri. Micropartculas de ouro ou tungstnio envolvidas com fragmentos de DNA (inserto) so colocadas em uma cmara dentro do equipamento denominado acelerador de partculas. As micropartculas so lanadas sobre os tecidos e as que penetrarem nas clulas e se localizarem dentro do ncleo so geralmente incorporadas ao DNA da clula vegetal.

Os tecidos so colocados em meio de cultura especfico para a regenerao in vitro.

Aps regenerao as plantas sero avaliadas em laboratrio, em casa-de-vegetao e campo. A transformao realizada por meio da biobalstica o mtodo mais amplamente utilizado para plantas monocotiledneas.

TRANSFORMAO POR ELETROPORAO

 Neste mtodo de transformao so utilizados protoplastos (clulas desprovidas de parede celular). Estes so colocados em uma cubeta juntamente com os fragmentos de DNA (insertos). Em seguida a cubeta colocada em um eletroporador onde a partir de uma curta descarga eltrica poros so abertos na membrana plasmtica possibilitando que os insertos entrem nos protoplastos e possam ser incorporados no DNA da clula vegetal.
Este mtodo pode ser empregado para transformao tanto de espcies mono como de dicotiledneas. Entretanto sua aplicao ainda est muito limitada ao estabelecimento de protocolos de regenerao dos protoplastos in vitro.

 Uma vez que os genes de interesse so integrados ao DNA das clulas vegetais se manipulam as condies de crescimento para que estas clulas regenerem plantas completas.

Alguns mtodos de seleo so utilizados para confirmao da incorporao dos insertos nas clulas vegetais, bem como anlises das plantas regeneradas tambm so realizadas para confirmar a presena do gene introduzido e a sntese da protena produto desse gene.

APLICAO DA TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE NA AGRICULTURA: PLANTAS TRANSGNICAS

Fontes: EMBRAPA E CIB, 2012

 SEGUNDO A FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION (FAO) PARA ATENDER AS NECESSIDADES DA POPULAO, A PRODUO DE ALIMENTOS DEVER AUMENTAR EM 60%, NOS PRXIMOS 30 ANOS. CONSIDERANDO QUE 90% DAS PESSOAS VIVERO NA FAIXA INTERTROPICAL, ONDE EST SITUADA A MAIORIA DOS PASES EM DESENVOLVIMENTO, A FALTA DE ALIMENTOS PODER SE AGRAVAR. EM PARTE PORQUE, SALVO ALGUMAS EXCEES SIGNIFICATIVAS (CH, CAF, CACAU, BANANA, ETC.), OS ALIMENTOS PRODUZIDOS SO CONSUMIDOS QUASE NA SUA TOTALIDADE NO LUGAR ONDE SO PRODUZIDOS E, TAMBM, PORQUE IR AUMENTAR O NMERO DE PESSOAS QUE EM VEZ DE PRODUZIR ALIMENTOS IRO COMPR-LOS, EM FUNO DA TENDNCIA MIGRATRIA PARA AS GRANDES CIDADES.

 APESAR DA NECESSIDADE DE MAIS REAS AGRCOLAS PARA O CULTIVO A EXPANSO DAS FRONTEIRAS AGRCOLAS IMPROVVEL, UMA VEZ QUE BOA PARTE DAS REAS NO UTILIZADAS SE ENCONTRAM EM REGIES POUCO FRTEIS, DISTANTES, CARENTES DE INFRAESTRUTURA OU COBERTAS POR FLORESTAS. A OCUPAO DESSAS REAS ACELERARIA A DEGRADAO DE ECOSSISTEMAS COM PERDA DE BIODIVERSIDADE, RISCO DE APARIO DE DOENAS E DESASTRES CLIMTICOS. DOIS GRANDES DESAFIOS AGUARDAM A HUMANIDADE: AUMENTAR A PRODUTIVIDADE DOS SISTEMAS AGRCOLAS NAS REAS J EM USO E REDUZIR A DESIGUALDADE DE ACESSO AOS ALIMENTOS.

ORGANISMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS OU TRANSGNICOS

SO ORGANISMOS QUE POSSUEM ALTERAES EM SEU GENOMA REALIZADAS POR MEIO DA TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE (ENGENHARIA GENTICA), DE MODO A APRESENTAR CARACTERSTICAS DESEJADAS PELO HOMEM.

POSSVEIS VANTAGENS APRESENTADAS PELAS PLANTAS TRANSGNICAS Resistncia a pragas e doenas Permite a reduo da necessidade de pulverizaes com agrotxicos (herbicidas, inseticidas e fungicidas) Reduo da poluio ambiental Reduo dos custos de produo Adaptao a condies adversas Economia de inseticidas, gua, combustvel, mo-de-obra Elevao do valor agregado do produto

1983
Herrera-Estrella et al. Primeira planta transgnica

1987 - primeiro teste em campo de planta transgnica nos E.U.A.

1994 - Tomate FlavrSavr (poligalacturonase): primeiro produto vegetal transgnico aprovado para comercializao.

Batata New Leaf

(Monsanto 1995)
Possuidora do gene Bt

Foi registrada pelo EPA como a primeira planta- pesticida

Abbora resistente a vrus - Freedom II (Asgrow 1995) Possuidora de gene marcador e 2 genes para vrus distintos Liberao para plantio comercial

Fontes: Clive, 2012 e ISAAA, 2012

Fontes: Clive, 2012 e ISAAA, 2012

Fontes: Clive, 2012; CTNBIO, 2012 e ISAAA, 2012

Fontes: CTNBIO, 2011 e ISAAA, 2012

Fontes: ISAAA, 2012

DIFERENTES GERAES DE PLANTAS TRANSGNICAS 1 GERAO

Foram incorporados genes relacionados com a caractersticas que conferiam vantagens agronmicas simples, ou seja, dependentes de genes nicos ou de alguns poucos genes, dirigidas para a tolerncia a herbicidas, resistncia a insetos e alguns vrus.

A alta taxa de adoo de culturas com tais caractersticas reflete a satisfao dos agricultores com produtos que oferecem benefcios significativos, como manejo mais flexvel, menor trabalho e maior produtividade, alm de benefcios econmicos e ambientais, pelo decrscimo no uso de agroqumicos.

Resistncia a herbicidas Resistncia a insetos

Milho genes Bt

Soja gene EPSPS

DIFERENTES GERAES DE PLANTAS TRANSGNICAS 2 GERAO

Foram incorporados genes relacionados com a caractersticas que conferiam melhorias na qualidade do produtos como amadurecimento e escurecimento retardados, mais doces, fibrosos e nutritivos.

A adoo de culturas com tais caractersticas reflete a satisfao dos consumidores por produtos que oferecem benefcios significativos a sade e qualidade de vida das pessoas.

leos
soja (cido leico) canola (cido lurico)

Arroz Vitamina A O nico produto desse tipo j comercializado a soja com mega 3, disponvel no mercado americano desde 2005. A Kellog's utiliza este gro nos seus produtos.

DIFERENTES GERAES DE PLANTAS TRANSGNICAS 3 GERAO

Foram incorporados genes relacionados com a preveno e tratamento de doenas em crianas e adultos, como vacinas comestveis e protenas recombinantes. Protenas - anticorpos
- antgenos para vacina
(Clera, Hepatite, diarrias, HIV)

EXEMPLOS DE ALGUNS PROBLEMAS QUE AINDA PRECISAM SER SOLUCIONADOS

AS BATATAS APRESENTAM A DESVANTAGEM DE TEREM QUE SER INGERIDAS SEM COZIMENTO, O QUE NO UMA PRTICA COMUM.

AS FOLHAS DE TABACO, EXTENSIVAMENTE ESTUDADAS, NO FAZEM PARTE DA DIETA DE NENHUMA POPULAO.

AS BANANAS NO PRECISAM SER COZIDAS, MAS DEMORAM PARA SEREM PRODUZIDAS. ALM DISSO, APS COLHIDAS APODRECEM RAPIDAMENTE. O CONSUMO COTIDIANO DE VACINAS PODERIA CAUSAR UM FENMENO CONHECIDO COMO TOLERNCIA ORAL - O ORGANISMO PODE SIMPLESMENTE PASSAR A DESLIGAR SUAS DEFESAS CONTRA ESTAS PROTENAS, SE TORNANDO SUSCETVEL AO ATAQUE DO AGENTE PATOLGICO REAL. ALM DISSO, A ME QUE COMERIA O ALIMENTO COM VACINA ESTARIA INDIRETAMENTE J VACINANDO O SEU FILHO POR MEIO DA PLACENTA OU AMAMENTAO.

PROJEO DE OBTENO DE NOVAS PLANTAS TRANSGNICAS

Fontes: EMBRAPA E CIB, 2012

PLANTAS GENETICAMENTE MODIFICADAS EM TESTE (LABORATRIO, CASA-DE-VEGETAO OU CAMPO) Herbicidas Alfafa Algodo Batata Beterraba Canola Chicria Linho Milho Morango Soja Tabaco Trigo Insetos Alfafa Algodo Batata Batata-doce Beringela Caf Cana Canola Milho Soja Vrus Abbora Arroz Batata Beringela Mamo Melo Petnia Soja Tomate Tabaco Qualidade Banana Batata Caf Canola Cravo Crisntemo Kiwi Soja Tomate

TEMPO E CUSTO PARA LANAMENTO NO MERCADO DE UMA PLANTA TRANSGNICA

Fontes: CIB, 2012 e EMBRAPA, 2012

O SISTEMA REGULATRIO DE BIOSSEGURANA NO BRASIL

Fonte: CIB, 2012

Fonte: CIB, 2012

Fonte: CIB, 2012

LEGISLAO BRASILEIRA