PRUEBAS DE SENCIBILIDAD 1.

INTRODUCCIN
Durante las ltimas dcadas, el aumento en la prevalencia de las infecciones fngicas ha sido constante, relacionado fundamentalmente con el incremento de pacientes inmunocomprometidos y con el uso generalizado de antimicrobianos, la utilizacin de inmunosupresores, maniobras diagnsticas invasoras y la implantacin de alimentacin parenteral. Junto a estas micosis invasoras, que podramos llamar oportunistas, coexisten otras micosis, que podramos considerar primarias, causadas por hongos muy adaptados para la supervivencia en los tejidos infectados. Algunas de ellas se comportan como micosis profundas, y se caracterizan porque se distribuyen en determinadas zonas geogrficas, donde resultan endmicas. Otras, ubicuas, se caracterizan por afectar a piel y mucosas: se trata de las dermatomicosis y candidosis de las mucosas. Con menos frecuencia, se encuentran las micosis subcutneas, caracterizadas por la agresividad local y poca tendencia a la diseminacin a distancia, y que suelen contar con antecedentes traumticos que justifican la inoculacin del hongo. El cultivo sigue siendo el "gold standard" del diagnstico microbiolgico, ya que permite la identificacin del agente etiolgico y la realizacin del estudio de sensibilidad. Sin embargo, no est exento de inconvenientes: la necesidad de obtener muestras por mtodos invasores, la posible contaminacin de la muestra, su dificultad para diferenciar fcilmente entre infeccin y colonizacin, la baja sensibilidad que presenta y su lentitud para el diagnstico. En los ltimos aos se han desarrollado nuevas tcnicas diagnsticas independientes del cultivo con la intencin de mejorar la sensibilidad y reducir el tiempo necesario para realizar el diagnstico. Las principales tcnicas podemos clasificarlas de la siguiente manera: a) deteccin en sangre de antgenos y/o anticuerpos, y b) deteccin de otros componentes fngicos. Algunas de estas tcnicas se han convertido en herramientas bsicas en el laboratorio de Microbiologa Clnica para el diagnstico de las infecciones fngicas invasoras, como la deteccin del antgeno capsular de Cryptococcus neoformans, la deteccin de antgeno galactomanano en pacientes con aspergilosis invasora, la deteccin de antgeno manano, anticuerpos anti-manano y anticuerpos anti-micelio para el diagnstico de la candidosis invasora, y por ltimo, la deteccin de otros componentes fngicos no antignicos, como el (1 3)--D-glucano, para la deteccin de las infecciones fngicas invasoras en general (excepto criptococosis y mucormicosis). Junto a estos mtodos rpidos, que podramos denominar no convencionales, coexisten mtodos clsicos que permiten el diagnstico rpido, en ocasiones permitiendo la diferenciacin entre colonizacin e infeccin, si bien con baja sensibilidad. Nos referimos a los distintos mtodos de tincin, incluyendo las preparaciones histolgicas. En la ltima dcada se han desarrollado varios mtodos para realizar pruebas de sensibilidad in vitro a los antifngicos. Estas tcnicas han mostrado una buena reproducibilidad interlaboratorio y cierta capacidad para detectar la resistencia in vitro a estos frmacos, por lo que la mayora de los expertos creen que las pruebas de sensibilidad a los antifngicos tienen utilidad clnica. Existen varios mtodos de referencia para realizar estas pruebas con levaduras y con hongos filamentosos. Los ms difundidos son los del CLSI estadounidense ( Clinical and Laboratory Standards Institute, antiguo NCCLS), aunque otras sociedades e instituciones tambin han desarrollado mtodos de referencia, como el EUCAST, European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing perteneciente a la Sociedad Europea de Microbiologa Clnica y Enfermedades Infecciosas (ESCMID). Las pruebas de sensibilidad a los antifngicos estn basadas en las tcnicas de microdilucin en caldo, que se desarrollaron para conocer la actividad in vitro de los antibacterianos. Estas tcnicas determinan la CMI (concentracin mnima inhibitoria), que se obtiene calculando porcentajes de inhibicin respecto a un control de crecimiento. Los estndares incluyen recomendaciones para la conservacin, la preparacin y la interpretacin de las pruebas, as como un sistema para controlar la calidad de los resultados. La introduccin de estas tcnicas produjo un cambio cualitativo en los estudios de sensibilidad a los antifngicos. Por primera vez se dispona de mtodos reproducibles para detectar la resistencia in vitro a estos antimicrobianos, por lo que se poda evaluar su utilidad clnica. La aplicabilidad prctica de una tcnica de determinacin de sensibilidad reside en la fiabilidad de sus resultados; si estos no son reproducibles no pueden establecerse puntos de corte que guen las recomendaciones teraputicas. Adems, la aparicin de estos estndares ha permitido disear y validar varios mtodos de difusin en agar y tcnicas comerciales para realizar pruebas de sensibilidad a los

antifngicos, que pueden utilizarse para detectar la resistencia a los azoles, particularmente la resistencia a fluconazol en levaduras, que es el reto asistencial ms destacable en este campo. En el presente documento tambin se describen los procedimientos de referencia ms utilizados en la actualidad para realizar estas pruebas de sensibilidad. Adems, se recogen las tcnicas comerciales que se podran utilizar, dada su buena correlacin con los mtodos de referencia.

2. CONSIDERACIONES CLNICAS
Las infecciones fngicas pueden causar un gran nmero de entidades clnicas, con manifestaciones variadas que dependen del lugar de infeccin y del tipo de paciente. En general, podran clasificarse segn un criterio de profundidad, en superficiales, cutneomucosas, subcutneas y profundas (endmicas y oportunistas). Son las micosis profundas oportunistas las que han adquirido un protagonismo especial en los ltimos tiempos debido, entre otros motivos, al aumento de incidencia, gravedad y trascendencia del diagnstico precoz, a lo que habra que aadir la dificultad para diferenciar la colonizacin de la infeccin invasora. El aumento significativo de las infecciones fngicas sistmicas oportunistas es debido, entre otras causas, a las medidas de soporte vital, al aumento del uso de antibiticos de amplio espectro, a la implantacin de material protsico, a la terapia con corticoides y, en general, cualquier tipo de inmunosupresin (teraputica o adquirida). Sin el tratamiento adecuado, la mortalidad de las infecciones fngicas sistmicas es muy alta, lo que unido a los costes de hospitalizacin que este tipo de infecciones genera, las convierten en entidades de gran trascendencia en la prctica diaria en el medio hospitalario. El diagnstico micolgico tradicional, basado en el cultivo, se caracteriza por su lentitud y, en el caso de las micosis sistmicas, por su baja sensibilidad y por la necesidad de obtener muestras por mtodos invasores. El hemocultivo, por ejemplo, es, sin lugar a duda, un buen mtodo diagnstico de las micosis sistmicas; pero requiere incubacin prolongada y posee una sensibilidad global de alrededor del 50% en el caso de la infeccin producida por levaduras, que en el caso de la aspergilosis invasora no llega al 10%. Sigue siendo, sin embargo, el mtodo de eleccin para el diagnstico de las micosis superficiales y mucocutneas. En los ltimos aos se han desarrollado nuevas tcnicas diagnsticas independientes del cultivo con la intencin de mejorar la sensibilidad y reducir el tiempo necesario para realizar el diagnstico. El papel del laboratorio de microbiologa es de gran importancia, siendo fundamental para la eleccin de un tratamiento adecuado la identificacin del agente causal de la infeccin. 2.1. MICOSIS SUPERFICIALES Y CUTANEAS Estas micosis incluyen infecciones muy frecuentes que afectan al estrato crneo de la piel, a la epidermis y a los anejos cutneos: pelo y uas. Son infecciones que constituyen una parte importante de las consultas dermatolgicas y cuyo diagnstico de eleccin sigue siendo el examen directo y el cultivo de las muestras de piel y anejos cutneos. 2.2 MICOSIS SUBCUTNEAS Estn causadas por hongos ambientales inoculados directamente en el tejido celular subcutneo mediante un traumatismo. Presentan una agresividad local variable. Caractersticamente no se diseminan a distancia. Entre ellas se incluyen la cromoblastomicosis, esporotricosis, micetomas y una serie de cuadros raros: rinosporidiosis, entomophtoramicosis y lobomicosis. El diagnstico de estas infecciones suele realizarse por examen microscpico directo y cultivo. En algunas de ellas, como la lobomicosis, el hongo causal no ha podido cultivarse y el diagnstico es histolgico. 2.3. MICOSIS TROPICALES ENDMICAS Conforman un grupo de infecciones cuyos agentes causales acumulan una serie de caractersticas curiosas: 1) presentan dimorfismo de temperatura, 2) son patgenos primarios, 3) causan patologa diseminada, incluso en pacientes no inmunocomprometidos, 4) tienen una distribucin geogrfica caracterstica. Aunque pueden afectar a individuos inmunocompetentes, las infecciones en pacientes inmunodeprimidos son ms frecuentes y graves. El diagnstico se realiza por una combinacin de mtodos convencionales: histologa, cultivos y serologa; y no convencionales, como la deteccin de antgenos especficos en sangre y orina (histoplasmosis). 2.4. CRIPTOCOCOSIS

La criptococosis es una enfermedad infecciosa generalmente sistmica que afecta a animales y al hombre, sobre todo en situaciones de inmunosupresin. La criptococosis se adquiere por va inhalatoria. El hongo responsable es una levadura capsulada, que posee gran afinidad por el sistema nervioso central, siendo la meningoencefalitis la presentacin clnica ms habitual. Otras presentaciones menos frecuentes son las afectaciones cutnea, ocular, sea, articular y de la prstata, entre otras, que suelen ser consecuencia de una criptococosis diseminada. La criptococosis adquiri una importancia mayor coincidiendo con la aparicin de la infeccin por el VIH, previamente era una complicacin caracterstica de los pacientes hematolgicos. Con la introduccin de los tratamientos antirretrovirales de alta eficacia, la criptococosis ha vuelto a su situacin de micosis rara. 2.5. ASPERGILOSIS Las aspergilosis son un amplio y heterogneo grupo de enfermedades oportunistas causadas por hongos filamentosos del gnero Aspergillus. Tiene un ciclo biolgico muy simple, con alta capacidad de esporulacin y por ello alcanza altas concentraciones de conidias en el aire. La inhalacin continua de conidias por el hombre no supone en condiciones normales ningn problema, ya que son eliminadas muy eficazmente por los diferentes mecanismos de defensa. Existen presentaciones clnicas de diferente gravedad, siendo las formas viscerales y diseminadas de extrema gravedad y evolucin aguda, principalmente en pacientes que presentan neutropenias graves y prolongadas. Todas ellas exigen un diagnstico y tratamiento precoces. 2.6. CANDIDOSIS Las levaduras del gnero Candida poseen una amplia distribucin y pueden originar infecciones de distinta localizacin y gravedad, generalmente asociado a factores predisponentes por parte del husped, por lo que se las considera patgenos oportunistas. La infeccin endgena tiene gran importancia y suele suceder a la colonizacin de diferentes localizaciones del paciente predispuesto. Las manifestaciones clnicas ms frecuentes son la candidosis superficial, estomatitis crnica, candidosis mucocutnea, vulvovaginitis, y en ocasiones cuadros ms graves con manifestaciones de diseminacin en el paciente crtico o inmunocomprometido, apareciendo como entidades caractersticas, la candidosis diseminada, candidemia, endoftalmitis y peritonitis. 2.7 OTRAS MICOSIS OPORTUNISTAS Constituyen un grupo muy heterogneo de enfermedades que tienen en comn la situacin del paciente, la gravedad y la relativa dificultad de diagnstico. Por otra parte, el diagnstico etiolgico es muy importante, pues la respuesta a los distintos antifngicos vara con las especies implicadas. En este grupo se incluyen: pneumocistosis, fusariosis, penicilinosis, zigomicosis, pseudalescheriasis, pitosis, infecciones por Dipodascus capitatus, trichosporonosis, infecciones por Scedosporium prolificans y otras. Algunas de estas infecciones se diagnostican con mas facilidad, porque los hongos crecen en abundancia de muestras accesibles, como ocurre en la infeccin por Penicillium marneffei, mientras que otras requieren procedimientos muy invasores y cierta dosis de fortuna. 2.8. ESTUDIOS DE SENSIBILIDAD Existe una cierta controversia sobre la utilidad clnica de las pruebas de sensibilidad a los antifngicos. La mayora de los expertos coinciden en sealar que los estudios de sensibilidad no son necesarios en todos los enfermos, ya que la informacin epidemiolgica establece cul puede ser el tratamiento emprico ms adecuado. Otros especialistas opinan que estas pruebas deberan realizarse en todas las cepas procedentes de infecciones profundas, particularmente cuando se aslan en hemocultivos o en muestras tisulares. Por tanto, es difcil decidir cundo se deben realizar estas pruebas por parte de un laboratorio asistencial. Quiz deberan hacerse rutinariamente en cepas procedentes de enfermos en los que se ha producido un fracaso teraputico, en casos de pacientes que han recibido profilaxis o tratamiento antifngico previo, y en cepas pertenecientes a especies poco frecuentes, de las que se desconoce su espectro de sensibilidad in vitro. En estos casos, el estudio de sensibilidad puede ayudar a elegir la mejor alternativa teraputica. Tampoco debe olvidarse que las personas que suelen desarrollar micosis graves son pacientes debilitados, con enfermedades crnicas o con inmunodepresin. En estos casos, el diagnstico y el manejo de la infeccin fngica es muy complicado, por lo que los resultados de los estudios de sensibilidad deben considerarse como un dato ms a la

hora de tratar la infeccin, un dato que debe integrarse entre las variables a tomar en consideracin cuando nos enfrentamos a una micosis.

La medicina es una ciencia de probabilidades y un arte de manejar la incertidumbre. Dicha incertidumbre se extiende no slo a las actividades preventivas, teraputicas y pronsticas sino tambin a las diagnsticas. En las fases del proceso diagnstico intervienen la historia clnica, la exploracin fsica y la realizacin de pruebas complementarias1-2. Cuando existen varias hiptesis diagnsticas, se realizar el diagnstico diferencial y las pruebas complementarias tratarn de aclarar las dudas existentes. Si solamente hay una sospecha diagnstica, las pruebas complementarias tratarn de confirmarla. La realizacin simultnea de varias pruebas complementarias se denomina pruebas complementarias en paralelo y la realizacin de pruebas complementarias segn los resultados de otras previas, se denomina pruebas complementarias en serie. Al realizar pruebas en paralelo aumenta la probabilidad de diagnosticar a un enfermo, pero tambin aumenta la probabilidad de considerar como enfermo a un sano. El riesgo de la realizacin de pruebas en serie es no diagnosticar a algunos enfermos. En cambio, pocos sanos sern considerados como enfermos. Es evidente que una buena prueba diagnstica es la que ofrece resultados positivos en enfermos y negativos en sanos. Por lo tanto, las condiciones que deben ser exigidas a un test son3:

Validez: Es el grado en que un test mide lo que se supone que debe medir. Con que frecuencia el resultado del test es confirmado por procedimientos diagnsticos ms complejos y rigurosos? La sensibilidad y la especificidad de un test son medidas de su validez. Reproductividad: es la capacidad del test para ofrecer los mismos resultados cuando se repite su aplicacin en circunstancias similares. La variabilidad biolgica del hecho observado, la introducida por el propio observador y la derivada del propio test, determinan su reproductividad. Seguridad: La seguridad viene determinada por el valor predictivo de un resultado positivo o negativo. Con que seguridad un test predecir la presencia o ausencia de enfermedad? Ante un resultado positivo de un test qu probabilidad existe de que este resultado indique presencia de la enfermedad? Veremos posteriormente que esta probabilidad est muy influenciada por la prevalencia de la patologa.

A su vez, es conveniente que el test sea sencillo de aplicar, aceptado por los pacientes o la poblacin general, que tenga los mnimos efectos adversos y que econmicamente sea soportable.

En este trabajo se revisarn fundamentalmente los conceptos que determinan la validez de un test (sensibilidad y especificidad) y su seguridad (valores predictivos positivos y negativos). La validez de una prueba diagnstica: Sensibilidad y especificidad El caso ms sencillo que se nos puede plantear es el de una prueba dicotmica, que clasifica a cada paciente como sano o enfermo en funcin de que el resultado de la prueba sea positivo o negativo. En casos como ste, generalmente un resultado positivo se asocia con la presencia de enfermedad y un resultado negativo con la ausencia de la misma. Cuando se estudia una muestra de pacientes, los datos obtenidos permiten clasificar a los sujetos en cuatro grupos segn una tabla 2x2 como la que se muestra en la Tabla 1. En ella, se enfrenta el resultado de la prueba diagnstica (en filas) con el estado real de los pacientes (en columnas) o, en su defecto, el resultado de la prueba de referencia o gold standard que vayamos a utilizar. El resultado de la prueba puede ser correcto (verdadero positivo y verdadero negativo) o incorrecto (falso positivo y falso negativo). El anlisis de su validez puede obtenerse calculando los valores de sensibilidad y especificidad4: Sensibilidad Es la probabilidad de clasificar correctamente a un individuo enfermo, es decir, la probabilidad de que para un sujeto enfermo se obtenga en la prueba un resultado positivo. La sensibilidad es, por lo tanto, la capacidad del test para detectar la enfermedad. Cuando los datos obtenidos a partir de una muestra de pacientes se clasifican en una tabla como la que se muestra en la Tabla 1, es fcil estimar a partir de ella la sensibilidad como la proporcin de pacientes enfermos que obtuvieron un resultado positivo en la prueba diagnstica. Es decir:

De ah que tambin la sensibilidad se conozca como fraccin de verdaderos positivos (FVP). Especificidad Es la probabilidad de clasificar correctamente a un individuo sano, es decir, la probabilidad de que para un sujeto sano se obtenga un resultado negativo. En otras palabras, se puede definir la especificidad como la capacidad para detectar a los sanos. A partir de una tabla como la Tabla 1, la especificidad se estimara como:

De ah que tambin sea denominada fraccin de verdaderos negativos (FVN). Ejemplo: Como ejemplo de lo visto hasta ahora, consideremos los datos de un estudio en el que se incluy a 2.641 pacientes con sospecha de cncer prosttico que acudieron a una consulta de Urologa durante un periodo de tiempo determinado. Durante su exploracin, se recogi el resultado del tacto rectal realizado a cada uno de estos pacientes, segn fuese ste normal o anormal, y se contrast con el posterior diagnstico obtenido de la biopsia prosttica. Los datos del estudio y los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 2. Se encontraron en total 1.121 casos de cncer, lo cual representa un 42,45% del total de sujetos estudiados. La sensibilidad del tacto rectal para detectar cncer fue de 56,56% (634/1121) y la especificidad de 82,3% (1251/1520). As, el tacto fue anormal en un 56,56% de los casos de cncer prosttico y normal en un 82,3% de los casos que presentaron finalmente otras patologas. Esto significa que un 100-56,56=43,44% de los pacientes que efectivamente tenan cncer presentaban tactos normales. Claramente ello indica la necesidad de utilizar otros marcadores ms sensibles, como el PSA o sus derivados, para poder establecer el diagnstico de forma ms precisa. Resulta obvio que lo ideal sera trabajar con pruebas diagnsticas de alta sensibilidad y especificidad, pero esto no siempre es posible. En general, las pruebas de screening deben ser de alta sensibilidad para poder captar a todos los enfermos. Una prueba muy sensible ser especialmente adecuada en aquellos casos en los que el no diagnosticar la enfermedad puede resultar fatal para los enfermos, como ocurre con enfermedades peligrosas pero tratables, como los linfomas o la tuberculosis, o en enfermedades en las que un falso positivo no produzca serios trastornos psicolgicos o econmicos para el paciente (por ejemplo, la realizacin de mamografa en el cncer de mama). Por otra parte, la especificidad se refiere, como se seal previamente, a la probabilidad de que un sujeto sano sea clasificado adecuadamente. En general, las pruebas confirmatorias del diagnstico deben ser de alta especificidad, para evitar falsos positivos. Los tests de alta especificidad son necesarios en enfermedades graves pero sin tratamiento disponible que las haga curables, cuando exista gran inters por conocer la ausencia de enfermedad o cuando diagnosticar a un paciente de un mal que realmente no padece pueda acarrear graves consecuencias, ya sean fsicas, psicolgicas o econmicas (por ejemplo, en el caso del SIDA).

La seguridad de una prueba diagnstica. Valores predictivos. Los conceptos de sensibilidad y especificidad permiten, por lo tanto, valorar la validez de una prueba diagnstica. Sin embargo, carecen de utilidad en la prctica clnica. Tanto la sensibilidad como la especificidad proporcionan informacin acerca de la probabilidad de obtener un resultado concreto (positivo o negativo) en funcin de la verdadera condicin del enfermo con respecto a la enfermedad. Sin embargo, cuando a un paciente se le realiza alguna prueba, el mdico carece de informacin a priori acerca de su verdadero diagnstico, y ms bien la pregunta se plantea en sentido contrario: ante un resultado positivo (negativo) en la prueba, cul es la probabilidad de que el paciente est realmente enfermo (sano)?. As pues, resulta obvio que hasta el momento slo hemos abordado el problema en una direccin. Por medio de los valores predictivos completaremos esta informacin5: Valor predictivo positivo: Es la probabilidad de resultado positivo en estimarse, por tanto, resultado positivo en enfermos: padecer la enfermedad si se obtiene un el test. El valor predictivo positivo puede a partir de la proporcin de pacientes con un la prueba que finalmente resultaron estar

Valor predictivo negativo: Es la probabilidad de que un sujeto con un resultado negativo en la prueba est realmente sano. Se estima dividiendo el nmero de verdaderos negativos entre el total de pacientes con un resultado negativo en la prueba:

Retomando el ejemplo anterior sobre cncer prosttico, el valor predictivo positivo es en este caso del 70,21% (634/903) y el valor predictivo negativo del 71,98% (1251/1738). Ello significa que en un 70,21% de los pacientes con un tacto anormal finalmente se confirm la presencia de cncer, mientras que de los que no se detectaron anomalas en el tacto un 71,98% estaban efectivamente sanos. La influencia de la prevalencia.

Hemos visto cmo los valores de sensibilidad y especificidad, a pesar de definir completamente la validez de la prueba diagnstica, presentan la desventaja de que no proporcionan informacin relevante a la hora de tomar una decisin clnica ante un determinado resultado de la prueba. Sin embargo, tienen la ventaja adicional de que son propiedades intrnsecas a la prueba diagnstica, y definen su validez independientemente de cul sea la prevalencia de la enfermedad en la poblacin a la cual se aplica. Por el contrario, el concepto de valores predictivos, a pesar de ser de enorme utilidad a la hora de tomar decisiones clnicas y transmitir a los pacientes informacin sobre su diagnstico, presenta la limitacin de que dependen en gran medida de lo frecuente que sea la enfermedad a diagnosticar en la poblacin objeto de estudio. Cuando la prevalencia de la enfermedad es baja, un resultado negativo permitir descartar la enfermedad con mayor seguridad, siendo as el valor predictivo negativo mayor. Por el contrario, un resultado positivo no permitir confirmar el diagnstico, resultando en un bajo valor predictivo positivo. Ilustraremos lo anterior con un sencillo ejemplo. Para el diagnstico del VIH se emplean tests que han confirmado tener una alta validez, con valores aproximados de sensibilidad y especificidad de un 99,5%. Supongamos que se aplicase esta prueba a la totalidad de la poblacin gallega, que se cifra en 2.800.000 habitantes. Si asumimos que en Galicia existen 6.000 pacientes VIH positivos (lo cual implicara una prevalencia de 6000/ 2.800.000 =0,21%), el test resultara positivo en un total de 19.940 sujetos, obtenindose un valor predictivo positivo del 29,9% (Tabla 3). As pues, slo un 29,9% de los sujetos con un resultado positivo en el test resultaran estar realmente afectados, mientras que un 70,1% de los mismos no presentaran la enfermedad. Resulta obvio que en una comunidad como la gallega la utilizacin de esta prueba no resultara til, debido a la alta proporcin de falsos positivos que conllevara. Veamos ahora que ocurrira si se aplicase la misma prueba a una poblacin en la que el nmero de enfermos VIH+ fuese de 800.000 (resultando en una prevalencia mucho mayor de un 800.000/2.800.000=28,6%). En este caso, la predictividad de una prueba positiva aumenta de un 29,9% a un 98,7%, disminuyendo la proporcin de falsos positivos a tan slo un 1,3% (Tabla 4). Por lo tanto, si la prevalencia es alta, un resultado positivo tiende a confirmar la presencia de la enfermedad, mientras que si la prevalencia es baja, un resultado positivo no permitir afirmar su existencia. Razones de probabilidad

Queda claro pues cmo la prevalencia es un factor determinante en los valores predictivos de un test. Por lo tanto, stos , no pueden ser utilizados como ndices a la hora de comparar dos mtodos diagnsticos diferentes, ni tampoco a la hora de extrapolar los resultados de otros estudios a datos propios. Por ello, resulta necesario determinar otros ndices de valoracin que sean a la vez clnicamente tiles y no dependan de la prevalencia de la enfermedad en la poblacin a estudiar. As, adems de los conceptos de sensibilidad, especificidad y valores predicitivos, se suele hablar del concepto de razn de verosimilitudes, razn de probabilidad, o cociente de probabilidades6. Estos miden cunto ms probable es un resultado concreto (positivo o negativo) segn la presencia o ausencia de enfermedad:

Razn de verosimilitudes positiva o cociente de probabilidades positivo: se calcula dividiendo la probabilidad de un resultado positivo en los pacientes enfermos entre la probabilidad de un resultado positivo entre los sanos. Es, en definitiva, el cociente entre la fraccin de verdaderos positivos (sensibilidad) y la fraccin de falsos positivos (1-especificidad):

Razn de verosimilitudes negativa o cociente de probabilidades negativo: se calcula dividiendo la probabilidad de un resultado negativo en presencia de enfermedad entre la probabilidad de un resultado negativo en ausencia de la misma. Se calcula por lo tanto, como el cociente entre la fraccin de falsos negativos (1-sensibilidad) y la fraccin de verdaderos negativos (especificidad):

Volvamos de nuevo al ejemplo planteado en la Tabla 2 sobre el diagnstico de cncer prosttico a partir del tacto rectal. En este caso, se obtiene un cociente de probabilidades positivo de 3,20. Ello viene a indicarnos que un tacto anormal es, por lo tanto, 3 veces ms probable en un paciente con cncer prosttico que en otro sujeto sin cncer. La razn de probabilidades ofrece la ventaja de que relaciona la sensibilidad y la especificidad de una prueba en un solo ndice. Adems, pueden obtenerse razones de probabilidad segn varios niveles de una nueva medida y no es necesario expresar la informacin de forma dicotmica, como resultado de normal o

anormal o bien positivo y negativo. Por ltimo, al igual que sucede con la sensibilidad y la especificidad, no vara con la prevalencia. Esto permite utilizarlo como ndice de comparacin entre diferentes pruebas para un mismo diagnstico. Hasta ahora hemos abordado el caso de una prueba con un resultado dicotmico (positivo o negativo), pero en muchas situaciones la confirmacin de un diagnstico debe hacerse a partir de un parmetro numrico, sobre todo cuando ste se realiza a partir de determinaciones analticas. La generalizacin a estas situaciones se consigue mediante la eleccin de distintos valores de corte que permitan una clasificacin dicotmica de los valores de la prueba segn sean superiores o inferiores al valor elegido. La diferencia esencial con el caso ms simple es que ahora contaremos no con un nico par de valores de sensibilidad y especificidad que definan la exactitud de la prueba, sino ms bien con un conjunto de pares correspondientes cada uno a un distinto nivel de decisin. La estrategia de anlisis adecuada consistira en representar grficamente los pares (1-especificidad, sensibilidad) obtenidos al considerar todos los posibles valores de corte de la prueba, obtenindose as una curva llamada curva ROC. El rea bajo dicha curva se convierte as en el mejor indicador de la capacidad predictiva del test, independiente de la prevalencia de la enfermedad en la poblacin de referencia y en base al cual se podrn establecer comparaciones entre diferentes pruebas diagnsticas7-10. En definitiva, es sumamente importante el saber valorar la validez y seguridad de las diferentes pruebas diagnsticas con el fin de seleccionar la ms adecuada en cada momento. La sensibilidad, la especificidad y los valores predictivos son los criterios tradicionalmente utilizados para valorar la capacidad predictiva de un test11,12. Los estudios de evaluacin de tests diagnsticos son el instrumento adecuado para obtener esta informacin. No obstante, no debemos olvidar que existen determinados aspectos en el diseo de este tipo de investigaciones que pueden afectar a la precisin y a la validez de las estimaciones realizadas. Una vez ms, el clculo de intervalos de confianza puede ayudarnos a conocer la precisin de los ndices calculados. La poblacin de estudio, la estrategia de muestreo, la seleccin del criterio de referencia y la forma de aplicacin de las pruebas diagnsticas sern algunos de los elementos a cuidar para evitar la presencia de sesgos11,13,14. Bibliograf a

METODO DE DETERMINACION DE SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA POR DIFUSION

1.0. INTRODUCCION La tcnica actualmente utilizada para la determinacin de la sensibilidad a los antimicrobianos es

el producto de importantes esfuerzos internacionales desde hace ms de dos dcadas enfocados a normatizar el mtodo. El comit de expertos de la OMS. y grupos colaborativos internacionales dirigidos por Ericsson y Sherris sugirieron recomendaciones que fueron seguidas por la mayor parte de los pases europeos. Sin embargo, la falta de un acuerdo general sobre los puntos de corte para la interpretacin de estas pruebas continan siendo un tema de importantes esfuerzos internacionales. Europa est dividida en varias regiones de influencia con diferentes sistemas de sensibilidad antimicrobiana : Grupo Sueco de Referencia en Antimicrobianos, el Sistema DIN, el de los pases bajos, la Sociedad Britnica de Antimicrobianos, la Sociedad Francesa de Microbiologa y el Comit Americano de Estandarizacin de Laboratorios Clnicos (NCCLS). En nuestro pas y en la mayora de los pases latinoamericanos se siguen las pautas del NCCLS con algunas modificaciones. El siguiente es un resumen de la metodologa referida habitualmente como "Mtodo de la OMS.", que no difiere substancialmente del conocido "Kirby-Bauer". Las tablas de interpretacin fueron tomadas de las normas M2 A7 del National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) de Enero de 2001. El principio del mtodo involucra el uso de una cantidad constante de antimicrobianos en un reservorio (discos de papel) aplicado sobre la superficie del agar en el cual se ha cultivado el microorganismo en cuestin. Se formar as por difusin, un gradiente de concentracin del antimicrobiano y la sensibilidad del microorganismo estar indicada por el tamao de la zona de inhibicin del crecimiento alrededor del reservorio. El dimetro obtenido depender no solo de la sensibilidad del microorganismo y la carga del disco, sino tambin del espesor de la capa del agar, su pH y composicin, de la capacidad de difusin de la droga en ese medio, la temperatura, la velocidad de duplicacin bacteriana, y el tamao y fase de crecimiento del inculo. Para que los resultados sean confiables los procedimientos debern ser controlados y estandarizados cuidadosamente. El mtodo recomendado por la NCCLS (Subcomittee on Antimicrobial Susceptibility Testing) se basa en los estudios de Bauer y colaboradores (4). Este es el mtodo descripto de manera ms completa para el cual se han desarrollado tablas de interpretacin que estn respaldadas por datos clnicos y de laboratorio. El nico mtodo alternativo que ha sido estudiado adecuadamente y que demostr datos comparables de los dimetros de las zonas de inhibicin, con precisin similar y correlacin satisfactoria con la CIM, es la modificacin de doble capa de Barry, Garca y Thrupp (5). Este mtodo es una alternativa aceptable para la normalizacin del inculo en las pruebas de sensibilidad de aislamientos de grmenes patgenos de rpido crecimiento, como S. aureus, Enterobacterias y P. aeruginosa. El mtodo de doble capa en agar no es aplicable a las pruebas con otros microorganismos tales como Streptococcus spp., Haemophilus spp., etc. Las pruebas por cualquiera de los dos mtodos pueden interpretarse con las mismas tablas de medida de los halos de inhibicin si los resultados de las pruebas con las cepas controles se encuentran dentro de los rangos esperados.
Servicio Antimicrobianos - INEI ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn

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2.0. INDICACIONES PARA LA REALIZACION DE LOS TEST DE SUSCEPTIBILIDAD Las pruebas de sensibilidad estn indicadas para cualquier microorganismo, contribuyendo as a orientar el tratamiento quimioterpico de los procesos infecciosos, si su sensibilidad no puede ser predicha a partir del conocimiento de la identidad del germen. Frecuentemente estn indicadas en caso que la especie en estudio sea capaz de mostrar

resistencia a los antibiticos usados comnmente. Las pruebas de sensibilidad pueden ser necesarias cuando an, conocindose la sensibilidad del germen a drogas altamente efectivas, el paciente no puede recibir dicha medicacin (por ejemplo: S. pyogenes en pacientes alrgicos a la penicilina, en este caso puede probarse su sensibilidad frente a eritromicina y otros macrlidos). El antibiograma puede ser indicado con fines epidemiolgicos de resistencia y en el estudio de nuevos antibiticos. Las pruebas de sensibilidad se deben realizar a partir de una cepa aislada. Se debera evitar realizar el antibiograma en forma directa a partir del material clnico, excepto en las emergencias clnicas donde la coloracin directa de GRAM sugiere naturaleza monobacteriana. En este caso, debe repetirse luego usando la metodologa estandarizada. 3.0. SELECCION DE LOS AGENTES ANTIMICROBIANOS PARA LAS PRUEBAS DE SENSIBILIDAD La seleccin de los agentes antimicrobianos apropiados para el test de difusin, es una decisin de cada laboratorio clnico en consulta con el cuerpo mdico, el comit de farmacia y el comit de enfermedades infecciosas. Las Tabla 1 y 1A enumeran los agentes de eficacia clnica probada para el tratamiento de infecciones por microorganismos que muestran una respuesta aceptable con las pruebas in vitro. Las consideraciones que se han considerado en la designacin de un agente antimicrobiano a un grupo especfico incluyen: eficacia clnica, prevalencia de resistencia, costo, indicaciones del FDA, recomendaciones consenso para drogas de primera eleccin y alternativos. 3.1. Informes de rutina Para evitar una mala interpretacin, el informe de rutina al mdico, deber incluir nicamente las drogas apropiadas al uso teraputico como sugieren las Tabla 1 y 1A . Otras drogas inapropiadas para el uso teraputico pueden ser probadas para proveer datos taxonmicos o informacin epidemiolgica. Sin embargo, tales resultados debern estar disponibles slo para el laboratorio o para el comit de control de infecciones. Para la realizacin de una adecuada prueba de sensibilidad, el nmero de agentes probados debe ser limitado. En general, deber incluir slo un representante de cada grupo de drogas relacionadas con actividad casi idntica y para las cuales la interpretacin podra ser la misma. 3.2. Nombre genrico Para minimizar confusiones, todos los antibiticos debern ser referidos por su nombre genrico. 3.2.1. -Lactmicos Los antibiticos -lactmicos poseen un anillo central de cuatro tomos denominado anillo -lactmico. Su principal modo de accin es la inhibicin de la sntesis de pared celular. El agregado de grupos sustituyentes al anillo -Lactmico u otras estructuras cclicas adicionales determinan si el agente es una penicilina, un cephem, un carbapenem o un monobactam.
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3.2.1.1 Penicilinas El espectro de las penicilinas est dirigido a bacterias no productoras de -Lactamasas: gram positivas, algunos fastidiosos y gram negativos. Las acilamino-penicilinas (ampicilina y amoxicilina) poseen actividad contra muchas especies gram negativas, incluyendo miembros de la familia Enterobacteriaceae no productoras de -lactamasas. Las carboxipenicilinas (carbenicilina y ticarcilina) y las ureido-penicilinas (mezlocilina y piperacilina ) poseen un amplio espectro contra gram negativos incluyendo algunas especies de Pseudomonas. Las penicilinas resistentes a las penicilinasas (cloxacilina , dicloxacilina, meticilina, nafcilina y oxacilina) poseen actividad contra gram positivos, inclusive los Staphylococcus productores de penicilinasas.

3.2.1.2. Combinacin de -Lactmico / inhibidor de -Lactamasas Esta combinacin antimicrobiana incluye a una penicilina y un segundo agente que posee una actividad antibacteriana mnima pero funciona como inhibidor de algunas -lactamasas. 3.2.1.3. Cefalosporinas y otros Cephems Las distintas cefalosporinas y cephems frecuentemente poseen un espectro de actividad levemente diferente contra bacterias gram positivas y gram negativas. Estos agentes son frecuentemente referidos como cefalosporinas de "primera", "segunda" o "tercera" generacin, dependiendo en gran parte de su actividad frente a bacterias gram negativas con alto grado de resistencia. Debido a las diferencias de actividad de algunos miembros de este grupo, deberan selecccionarse representantes de cada grupo para los test de rutina. 3.2.1.4. Carbapenemes La estructura de los carbapenemes difiere levemente de la estructura de la penicilinas y son mucho ms resistentes a la hidrlisis por las -lactamasas. Esta caracterstica les provee un amplio espectro de actividad contra muchas bacterias gram negativas y gram positivas. 3.2.1.5 Monobactames Los monobactames son estructuralmente los nicos antibiticos que muestran actividad slo contra bacterias gram negativas aerbicas. Hasta el momento, el aztreonam es el nico monobactam aprobado para su uso por el USFDA. 3.2.2. Glicopptidos Los glicopptidos poseen una compleja estructura qumica y actan inhibiendo la sntesis de pared celular en un sitio diferente al de los -Lactmicos. La actividad de este grupo est dirigida a las bacterias gram positivas. La vancomicina es aceptada para el tratamiento de infecciones por bacterias gram positivas en pacientes alrgicos a la penicilina y tambin es til para la terapia de infecciones debidas a especies bacterianas resistentes a Lactmicos, pej: Staphylococcus aureus meticilino resistentes (MRSA) y algunos enterococos. 3.2.3. Aminoglucsidos Son un grupo de antibiticos de estructura similar que inhiben la sntesis de protenas a nivel ribosomal. el espectro de actividad de los miembros de este grupo, est determinado por la existencia de enzimas bacterianas inactivantes de aminoglucsidos . Pueden utilizarse para el tratamiento de infecciones causadas por bacilos gram negativos aerbicos o en combinaciones sinrgicas (con antibiticos inhibidores de la sntesis de pared celular) contra algunas bacterias gram positivas resistentes, pej. enterococos.
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3.2.4. Macrlidos Los macrlidos son antibiticos estructuralmente relacionados que inhiben la sntesis proteica a nivel ribosomal. Hay varios miembros de este grupo disponibles en el mercado que podran ser considerados para ensayar en bacterias gram positivas o en algunos gram negativos fastidiosos. 3.2.5. Tetraciclinas Las tetraciclinas inhiben la sntesis de protenas a nivel ribosomal, de ciertas bacterias gram positivas y negativas. Las drogas de este grupo estn relacionadas y salvo escasas excepciones, slo la tetraciclina debera ser ensayada de rutina. 3.2.6. Quinolonas Este grupo de compuestos incluye un nmero de agentes antimicrobianos ntimamente relacionados que funcionan primariamente inhibiendo la actividad de la DNA-girasa de muchas bacterias gram positivas y negativas. Diferencias sutiles en sus espectros de actividad, pueden requerir que se las ensayen como agentes individuales. 3.2.7. Sulfonamidas y Trimetoprima Este grupo de compuestos, abarcan varios agentes quimioteraputicos con similar espectro de actividad, los cuales inhiben el metabolismo del folato. El sulfisoxazol es la sulfonamida ms comnmente usada para el tratamiento de infecciones del tracto urinario y por lo tanto podra ser apropiada su seleccin para un test in-vitro. El sulfametoxazol es usualmente ensayado en combinacin con trimetoprima, estos producen una inhibicin secuencial en dos pasos del metabolismo del folato de algunas bacterias gram positivas y negativas. 3.2.8. Clases de antibiticos con una nica droga Cloranfenicol, clindamicina y rifampicina son antibiticos que inhiben la sntesis de protenas. No presentan otros compuestos relacionados y deben ensayarse en los test invitro. La nitrofurantoina acta inhibiendo varios pasos en la sntesis proteica. Esta ltima es

til solamente para infecciones en el tracto urinario, dado que su concentracin en otros fluidos es extremadamente baja. 3.3. Guia para la seleccion de antimicrobianos Como se ve en la Tabla 1 y 1A los agentes del Grupo A se consideran apropiados para los test de rutina. El Grupo B comprende agentes que son de importancia clnica particularmente para infecciones hospitalarias, y se debern incluir en un test primario. Sin embargo, ellos deben ser informados selectivamente en el caso en que el microorganismo en estudio sea resistente a los agentes de la misma familia de Grupo A . Otro ejemplo en donde debe informarse la sensibilidad a los agentes de este grupo, sera cuando el foco de infeccin lo justifique (por ejemplo: trimetoprima-sulfametoxazol para aislamientos del tracto urinario o una cefalosporina de tercera generacin para bacilos gram negativos). Tambin debern informarse en caso de alergia, infecciones polimicrobianas, infecciones que involucren mltiples sitios del organismo, intolerancia, falla de respuesta a los antibiticos del Grupo A o como ayuda epidemiolgica en el control de infecciones. El Grupo C est compuesto por agentes antimicrobianos alternativos o suplementarios que deben ser testeados en el caso de instituciones que presenten cepas endmicas o epidmicas resistentes a varias de las drogas primarias (especialmente en la misma familia, por ejemplo betalactmicos, aminoglucsidos), para el tratamiento de pacientes alrgicos a las drogas primarias, as como tambin para el tratamiento de microorganismos inusuales (por ejemplo:
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cloranfenicol para aislamientos extraintestinales de Salmonella spp. o algn enterococo con resistencia a vancomicina) o como ayuda epidemiolgica en el control de infecciones. El Grupo U (Orina) enumera ciertos antimicrobianos, cuyo uso se limita a las infecciones del tracto urinario (p. ej. nitrofuranos y ciertas quinolonas). Estos agentes no se deben informar en caso de infecciones que se encuentren en otra localizacin que no sea la va urinaria. El Grupo O (Otros) incluyen antibiticos que poseen indicacin clnica para un grupo de organismos determinado, pero en general no son candidatos para las pruebas de rutina e informe en los Estados Unidos. El Grupo Inv. (Investigacin) incluye agentes que estn bajo investigacin y an no han sido aprobados por el FDA. Informe Selectivo: Cada laboratorio debera elegir los agentes listados en las Tablas 1 y 1A para el informe de rutina (Grupo A) y aquellos que podra informar solo selectivamente (Grupo B), en consulta con la farmacia, el comit de teraputica y control de infecciones y el plantel mdico del hospital. El informe selectivo debera ayudar a mejorar la relevancia clnica y minimizar la seleccin de cepas multirresistentes nosocomiales por abuso de antibiticos de amplio espectro. Los resultados del Grupo B deberan informarse solo a pedido, o para algn microorganismo seleccionado. Resistencias inusuales deben ser informadas. Las resistencias inusuales deben informarse siempre que sean confirmadas. LABORATORIO

GENERALIDADES:
En nuestro pas, los Laboratorios de Microbiologa desarrollan actividades asistenciales, docentes y de investigacin. En algunos Laboratorios se realizan estudios para evaluar la eficacia, seguridad y calidad de algunos diagnosticadores, sean producidos en el pas o importados, con el propsito de utilizar los resultados de esos estudios para fines de registro y posterior comercializacin de dichos productos. Tambin con frecuencia la eficacia de un medicamento se comprueba a travs de los resultados emitidos por los Laboratorios que participan en ensayos clnicos. El objetivo del presente trabajoes establecer un conjunto de requisitos que deben cumplir los Laboratorios de Microbiologa, y que pueden ser aplicados al resto de los Laboratorios Clnicos lo cual es considerado necesario para

demostrar que son competentes y que brindan un servicio de calidad para el mejoramiento de la salud de nuestra poblacin. El contenido de este documento es aplicado a los Laboratorios de Patologa Clnica, Anatoma Patolgica y Laboratorios Clnicos que efecten o participen en:

Investigaciones clnicas. Evaluaciones de diagnosticadores. Ensayos clnicos de medicamentos.

Estos Laboratorios de Microbiologa y, de forma general, los antes mencionados pueden formar parte de una organizacin tal como un policlnico, hospital, instituto o centro de investigacin o funcionar independientemente.

2. DEFINICIONES:
2.1. Buenas Prcticas de Laboratorios. Conjunto de requisitos clnicos tcnicos y organizativos que deben satisfacer los Laboratorios de Investigacin Clnica para demostrar su competencia, para realizar determinados ensayos y garantizar la calidad y confiabilidad de los resultados de dichos ensayos. 2.2. Calibracin: Conjunto de operaciones que establecen, en condiciones especificadas, las relaciones entre valores indicados por un medio de mediciny los correspondientes valores conocidos de la magnitud medida. 2.3. Diagnosticadores: Productos diseados con el propsito de ser utilizados en el diagnstico in Vitro de enfermedades u otras condiciones, incluyendo la determinacin del estadode salud, para curar, mitigar, tratar o prevenir la enfermedad o sus secuelas. Comprende juegos y reactivos qumicos, materiales de referencia relacionados con estos y medios de cultivos. 2.4. Especificacin: Documentos que establece requisitos. 2.5. Laboratorio de Microbiologa: Todo Laboratorio que realice investigaciones microbiolgicas (diagnstico bacteriolgico, micolgico, virolgico y de parasitologa) a partir de cultivos y estudios serolgicos. 2.6. Literatura interior: Cualquier material impreso o grfico que acompae a un diagnosticador sin estar unido o fijado a l y que contenga instrucciones para su uso. 2.7. Manual de la Calidad: Documento que establece la poltica de la calidad y que describe el sistema de la calidad de una organizacin. 2.8. Procedimiento Normalizado de Operaciones (PNO): Documento que establece por escrito una manera especificada de realizar una actividad. 2.9. Registro: Documento que presenta evidencias objetivas de las actividades realizadas y de los resultados obtenidos. 2.10. Sistema de la Calidad: Estructura organizativa, procedimientos, procesos y recursos necesarios para llevar a cabo la gestin de la calidad.

3. ORGANIZACIN:
3.1. El Laboratorio contar con:

3.1.1. Una estructura organizativa y un reglamento adecuado para el cumplimiento de sus funciones. 3.1.2. Un director general o jefe de servicio nombrado oficialmente, con la calificacin, la autoridad y los recursos necesarios para cumplir sus deberes. 3.1.3. Un responsable para el aseguramiento de la calidad y otro a cargo de los aspectos cientfico tcnico de la actividad, aunque pudieran coincidir ambos cargos en la misma persona. 3.1.4. Requisitos de calificacin definidos y documentados para todo el personal, de acuerdo a las caractersticas y complejidad de la actividad. 3.1.5. La poltica, los procedimientos y los recursos necesarios para asegurar la proteccin de la informacin confidencial. 3.1.6. Los recursos y procedimientos que garanticen la adecuada proteccin fsica de las instalaciones. 3.1.7. Una poltica y objetivos de calidad definidos y documentados y garantizar que todo el personal los conozca, comprenda y apliquen. 3.1.8. Un controlde calidad documentado en el que participe todo el personal y que incorpore como base el presente documento. 3.1.9. Una Comisin de Bioseguridad que garantice el cumplimiento de las normasde Seguridad Biolgicas. 3.2. La responsabilidad, autoridad e interrelacin del personal, as como la lnea de sucesin demando a todos los niveles, estar definida y documentada. 3.3. El Laboratorio se organizar de modo que sus instalaciones permanentes, temporales y mviles cumplan los requisitos establecidos en este manual. 3.4. El Laboratorio funcionar de manera tal que se mantenga en todo momento la confianza en su independencia de juicio e integridad. 3.5. El Laboratorio utilizar los costos como uno de los indicadores de su actividad. 3.6. El Laboratorio mantendr un adecuado control de los ingresos y gastos en que incurre con relacin a su presupuesto. 3.7. El Laboratorio mantendr un adecuado control en la necesidad de reactivos qumicos y medios de cultivos as como su correcto almacenamiento y control en el vencimiento de estos. 3.8. El Laboratorio brindar los resultados de sus investigaciones en el tiempo que est estipulado y con la calidad que estas requieren. 3.9. El Laboratorio informar, mensualmente, las estadsticas correspondientes.

4. ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD:
Entre las funciones de aseguramiento de la calidad en el Laboratorio de Microbiologa se encuentran: 4.1. Aprobar las especificaciones y procedimientos. 4.2. Aprobar los reactivos, diagnosticadores y materiales de laboratorios que se utilicen.

4.3. Desarrollar y controlar el sistema de documentacin. 4.4. Validar los mtodos de ensayos. 4.5. Establecer y garantizar el uso de materiales de referencia apropiados, tanto calibradores como controladores, en la realizacin de las investigaciones. 4.6. Establecer y garantizar la aplicacin de procedimientos de control interno de la calidad para todos los ensayos, incluyendo algoritmos que oriente la conducta a seguir antes las diferentes alternativas posibles. 4.7. Participar sistemticamente en los programas Provinciales o Nacionales de evaluacin externa de la calidad relacionados con los ensayos que realiza el Laboratorio. 4.8. Garantizar que los informes de ensayos sean revisados antes de su entrega a los usuarios. 4.9. Elaborar, ejecutar y controlar el programade auditoria internas o autoinspecciones. Tales auditorias debern llevarse a cabo por un personal calificado independientemente de la actividad que se realiza. 4.10. Adoptar las acciones correctivas que resultarn pertinentes como resultados de una auditoria interna o inspeccin de las autoridades sanitarias. 4.11. Revisar, al menos cada dos aos el sistema de calidad adoptado. 4.12. Investigar las quejas y reclamaciones que se produzcan. 4.13. Mantener una sistemtica interaccin y educacin continuada con los mdicos usuarios del Laboratorio con relacin a los mtodos, caractersticas y resultados de los ensayos que se realizan en los laboratorios.

5. PERSONAL:
5.1. El laboratorio contar con el personal suficiente y este poseer la calificacin tcnica, el entrenamiento y la experiencia necesaria para el desarrollo de las funciones que se le asignen. 5.2. El laboratorio dispondr de un programa de capacitacinque permita la actualizacin Cientfico Tcnico, el entrenamiento y la evaluacin sistemtica de todo su personal, as como el adiestramientoinicial para los que comienzan a trabajar en la organizacin. 5.3. El laboratorio contar con procedimientos documentados para la capacitacin de todo el personal y mantendr los correspondientes registros debidamente actualizados. 5.4. El personal del laboratorio cumplir con lo establecido por la tica mdica en cuanto a sus relaciones con los pacientes, familiares y todo el personal de la organizacin. 5.5. El personal cuidar y mantendr su porte y aspecto. 5.6. La direccindel laboratorio propiciar la participacin de todo el personal en las actividades y decisiones inherente al colectivo laboral.

6. HIGIENE:
6.1. Se establecern los requisitos indispensables de salud para el personal del laboratorio y se verificar su cumplimiento mediante exmenes mdicos inicial

y peridico. Se describirn las acciones a tomar en caso de algn diagnstico positivo o sospechoso. 6.2. El laboratorio contar con programa de higiene que describa los procedimientos para el mantenimientodel orden, la limpieza e higienizacin de locales y equipos, para el control de las plagas y la verificacin de de la eficacia de dichos procedimientos. 6.3. Estar reglamentada la prohibicin de comer, beber, fumar, usar cosmticos o prendas ornamentales en aquellas reas de trabajo donde estas prcticas puedas afectar los resultados de los ensayos o conllevar un riesgoo perjuicio real o potencial a la salud de las personas. 6.4. El laboratorio establecer los procedimientos y proveer los recursos necesarios para garantizar el adecuado aseo, vestuario e higiene del personal.

7. BIOSEGURIDAD:
7.1. El laboratorio contar con reglamento de bioseguridad y designar un responsable para velar por su cumplimiento. 7.2. El laboratorio garantizar los medios de proteccin necesarios para preservar tanto el personal de laboratorio y a los usuarios como a las muestras biolgicas y se controlar el uso adecuado de los mismos. 7.3. El laboratorio contar con un programa para la capacitacin del personal en todo lo relacionado con el reglamento de la bioseguridad. 7.4. El laboratorio garantizar que el traslado de muestra fuera del laboratorio se realice en condiciones que no comprometan la integridad de las mismas ni la seguridad del personal que realice la operacin. 7.5. El laboratorio dispondr de los procedimientos y recursos necesarios para garantizar la adecuada descontaminacin y eliminacin del material desechable y de todos los residuales lquidos y slidos potencialmente infecciosos o contaminantes.

8. INSTALACIONES Y CONDICIONES AMBIENTALES:

8.1. El laboratorio contar, como mnimo, con reas o locales adecuados para:

Espera de los usuarios. Recepcin y registros de muestras y pacientes y la entrega de informe de ensayos. Obtencin, identificacin y manipulacin de las muestras. Procesamiento y conservacin de las muestras. Ejecucin de los procedimientos analticos. Aseo, higiene y vestuario del personal. Almacenamiento de reactivos, diagnosticadores, materiales de laboratorio y miscelnea. Aseguramiento de la calidad y sistema de documentacin. Direccin del laboratorio. Fregado y preparacin de material. Esterilizacin y almacn de material estril. Almacenamiento de tiles de limpieza.

8.2. Las instalaciones del laboratorio, los recursos energticos, la iluminacin, la climatizacin, el nivel de ruido, los sistemas auxiliares, el drenaje y la ventilacin debern ser tales que faciliten la adecuada realizacin de los ensayos y en ningn caso afectarn negativamente en los resultados de los mismos. 8.3. El laboratorio contar con procedimientos adecuados para el control y registro de las condiciones ambientales en las reas que lo requieran. 8.4. Existir una separacin efectiva entre las reas contiguas cuando las actividades que en ellas se realicen as lo requieran. 8.5. El acceso y la utilizacin de cada una de las reas estar definido, documentado y controlado. 8.6. Todas las reas y locales del laboratorio estarn identificadas. 8.7. Las condiciones de las reas para la espera de los usuarios y la obtencin de muestras reunirn los requisitos necesarios para proporcionar un ambiente confortable a los pacientes.

9. DOCUMENTACIN:
9.1. El laboratorio contar con un sistema que establezcan los procedimientos para la elaboracin, revisin, modificacin, reproduccin, conservacin, distribucin y retiro de la documentacin. 9.2. La documentacin estar escrita de forma clara, precisa y legible, sin enmienda ni tachaduras. Estar encabezada con el nombre, titulo o tipo de documento y su organizacin ser tal que permita la fcil comprensin de su contenido, incluyendo la fecha de emisin, nombre, firma y cargo que ocupa las personas por las que fue elaborado, revisado y aprobado. 9.3. La documentacin original se archivar de forma tal que sea fcil y de rpido acceso para su utilizacin cuando se requiera. 9.4. La documentacin correspondiente estar disponible en cada puesto de trabajo para la realizacin de las actividades previstas. 9.5. El laboratorio contar con los siguientes documentos:

Manual de la calidad de la organizacin. Organigrama completo del laboratorio. Reglamento del laboratorio. Manual de Bioseguridad. Planes generales de emergencia. Descripcin de los contenidos de trabajo y los requisitos de calificacin de cada cargo. Especificaciones del servicioy de la prestacin del servicio. Procedimientos Normalizados de Operacin (PNO). Registros. Informes de investigaciones. Marchas tcnicas. Bibliografa de consulta. Horarios de servicios a la poblacin y otras entidades. Relacin de investigaciones disponibles en el laboratorio, preparacin requerida del usuario y tiempo de retorno de los resultados.

9.6. Se elaborarn los PNO de todas aquellas actividades que lo requieran. 9.7. Los PNO deben contar:

Ttulo. Objetivos. Alcance. Definiciones (si procede). Responsabilidades. Condiciones de seguridad o Bioseguridad (si procede). Equipos, materiales y reactivos (si procede). Operaciones preliminares (si procede). Procedimiento. Clculo e interpretacin de los resultados (si procede). Controles. Observaciones (si procede). Requisitos de documentacin (si procede). Referencias. Anexos (si procede). Datos acerca de la elaboracin, revisin y aprobacin del PNO.

9.8. Todo PNO deber mostrar un encabezamiento de pgina donde aparecer el nombre de la organizacin y/o laboratorio, el titulo del documento, cdigo o el nmero de parte, nmero de pgina del total de estas, fecha y nmero de edicin, fecha y motivo de la sustitucin, nombre y firma de quien aprueba. 9.9. Los modelos los diferentes tipos de registro aparecern incluidos en los requisitos de documentacin, el da y la hora (si fuera necesaria) y el nombre y firma de la persona que efectu el registro. 9.10. El procedimiento para la aprobacin de enmiendas correspondientes efectuadas en un registro estar documentado. Estas enmiendas se harn siempre de forma tal que sea posible la lectura del dato errado, sin eliminar el mismo. 9.11. Los registros sern conservados durante dos aos como mnimo, en condiciones que garanticen la proteccin de la informacin. 9.12. Los resultados de cada ensayo o serie de ensayos efectuados por el laboratorio sern informados exacta y claramente, sin ambigedades y de forma objetiva, de acuerdo con las instrucciones de cada mtodo, en un informe de Ensayo. 9.13. Los informes de Ensayos incluirn, como mnimo, la siguiente informacin:

Ttulo: Informe de Ensayo. Nombre y direccin del laboratorio. Identificacin inequvoca del informe (nmero de serie, de historia clnica u otro). Nombre del paciente. Fecha de recepcin de la muestra y de emisin del informe. Resultado, incluyendo sistema, componente, tipo de magnitud, procedimiento (si fuera necesario), cifra numrica y unidades de medidas, segn el SI. Nombre y firma de quien realiz el ensayo y quien revis el informe.

Declaracin de que el informe no ser reproducido sin la aprobacin escrita del laboratorio. El lugar donde fue realizado el ensayo, cuando el mismo sea subcontratado o conveniado con otra institucin ajena al laboratorio que emite el informe.

9.14. Los informes de ensayos no contendrn enmiendas. En caso de errores se elaborar un nuevo informe.

10. EQUIPO:
10.1. El laboratorio contar con los equipos, instrumentos y medios de medicin (en lo adelante equipos), incluyendo sus materiales de referencia, requeridas para el correcto desempeo de los ensayos. 10.2. Los equipos sern calibrados y verificados antes de ser puestos en servicios. 10.3. Cuando sea necesario utilizar equipos que no pertenezcan al laboratorio, este se asegurar que los mismos cumplan los requisitos principales establecidos para sus propios equipos. 10.4. Los requisitos requeridos para la realizacin de los ensayos y para el control de los factores ambientales que incluyan en los mismos estarn ubicados en el lugar y en la forma apropiada y poseern las caractersticas de diseo, capacidad e intervalo de medicin adecuados. 10.5. El laboratorio contar con procedimientos adecuados para la utilizacin, calibracin, mantenimiento, verificacin y limpieza de sus equipos y conservar sus registros correspondientes. 10.6. Los procedimientos para la calibracin y verificacin de los equipos tendrn en cuenta, cuando resulte aplicable, la trazabilidad de las mediciones realizadas en el laboratorio con respecto a patrones nacionales o internacionales. 10.7. El laboratorio contar con programas para la verificacin y el mantenimiento preventivo de sus equipos. 10.8. Cada equipo mostrar una identificacin adecuada para indicar su estado respecto a la verificacin.

11. REACTIVOS QUMICOS Y DIAGNOSTICADORES:

11.1 El laboratorio utilizar reactivos qumicos de calidad analtica certificada o reconocida, acorde con los requisitos establecidos en los procedimientos para la ejecucin de las investigaciones. 11.2. El laboratorio conservar los reactivos atendiendo a las especificaciones del productor o suministrador en lo referente a las condiciones de almacenamiento y de perodo de validez de los mismo. 11.3. Los reactivos que deban ser preparados o reenvasados en el laboratorio sern rotulados apropiadamente, indicando: identidad, concentracin, fecha de preparacin, fecha de vencimiento, condiciones de almacenamiento, advertencia y nombre de quien lo prepar.

11.4. La preparacin de reactivos en el laboratorio estar a cargo de un personal especialmente designado y entrenado para ello, y acorde con lo establecido en los procedimientos correspondientes. 11.5. El laboratorio utilizar diagnosticadores que hayan sido registrado por el CECMED. 11.6. El laboratorio utilizar los diagnosticadores atendiendo a las especificaciones del producto o suministrador, indicadas en la Literatura interior correspondiente. 11.7. Los materiales de referencia utilizados en el laboratorio sern trazables, siempre que sea posible, con respecto a patrones nacionales e internacionales. 11.8. El laboratorio dispondr de los procedimientos y recursos necesarios para la adecuada conservacin de las colecciones de cepas, sueros, clulas y patrones requeridos para el desempeo de su actividad.

12. ATENCIN A LOS USUARIOS, RECEPCIN Y MANIPULACIN DE LAS MUESTRAS.

12.1. El laboratorio dispondr de procedimientos apropiados para la atencin a los usuarios y la recepcin y toma de las muestras. 12.2. El personal correspondiente verificar si el usuario ha recibido la preparacin adecuada antes de proceder a la toma de la muestra. 12.3. El laboratorio garantizar que la atencin de los usuarios durante la recepcin y tema de las muestras se caracterice por un trato afable, respetuoso, con la seguridad y privacidad necesarias, en condiciones confortables y en le tiempo mnimo posible. 12.4. El laboratorio contar con procedimiento que garanticen la adecuada recoleccin identificacin, manipulacin, procedimientos y conservacin de las muestras, antes de la realizacin del ensayo.

13. MTODOS DE INVESTIGACIN.

13.1. El laboratorio contar con procedimientos documentados para la realizacin de todas las investigaciones para los cuales haya demostrado su competencia tcnica. 13.2. Los registros de cada investigacin contendrn suficiente informacin para permitir su repeticin o reclculo y debern incluir los resultados de los materiales de referencia. 13.3. Los procedimientos para la realizacin de las investigaciones incluirn, cuando resulte aplicable, la trazabilidad de los materiales de referencia utilizados en la calibracin respecto a patrones nacionales e internacionales. 13.4. Los investigaciones se realizarn en el laboratorio haciendo un uso racional de los equipos, reactivos y materiales en general y optimizando el tiempo invertido en su ejecucin 13.5. El laboratorio contar con un procedimiento documentado para la introduccin de cada nuevo mtodo de investigacin. 13.6. Cualquier modificacin a un mtodo de investigacin deber ser aprobada previamente por Aseguramiento de la Calidad.

14. SUMINISTROS Y SERVICIOS DE APOYO:

14.1. El laboratorio tendr definido los requisitos de calidad de cada uno de los materiales que intervienen en la realizacin de las investigaciones. 14.2. Cuando no se disponga de un aseguramiento independiente de los suministros o servicios de apoyos provenientes del exterior, el laboratorio contar con procedimientos que aseguren que los equipos, materiales y servicios complementarios cumplan con los requisitos establecidos. 14.3. Aseguramiento de la calidad garantizar que los equipos y materiales adquiridos no sern usados hasta que hayan sido inspeccionados, calibrados o verificados para demostrar su calidad.

15. INVESTIGACIN, DESARROLLO Y COOPERACIN:

15.1. Organizar la formacin continua del personal. 15.2. Capacitacin y adiestramientodel personal tcnico del laboratorio en cada uno de sus perfiles profesionales en relacin a la obtencin de resultados de calidad en sus investigaciones. 15.3. Revisar los planes, protocolos y procedimientos de investigacin. 15.4. Incluir aspectos relacionados con el Programa de Bioseguridad en todos los proyectos de investigacin. 15.5. Establecer planes de cooperacin y desarrollo entre los laboratorios de diagnsticos clnicos con el fin de elevar la calidad de los mismos.

Laboratorio clnico
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El Laboratorio clnico es el lugar donde los profesionales de laboratorio de diagnstico clnico (Tecnlogo Mdico, Tcnicos Superiores de Laboratorio Clnico, Bioqumicos, Qumicos Farmaco biologos (QFB) y Mdicos) realizan anlisis clnicos que contribuyen al estudio, prevencin, diagnstico y tratamiento de los problemas de salud de los pacientes. Tambin se le conoce como Laboratorio de Patologa Clnica. Los laboratorios de anlisis clnicos, de acuerdo con sus funciones, se pueden dividir en:
1. Laboratorios de Rutina. Los laboratorios de rutina tienen cuatro departamento bsicos: Hematologa, Inmunologa, Microbiologa y Qumica Clnica (o Bioqumica). Los laboratorios de rutina pueden encontrarse dentro de un hospital o ser externos a ste. Los laboratorios hospitalarios, con frecuencia tiene secciones consideradas de urgencia, donde se realizan estudios que servirn para tomar decisiones crticas en la atencin de los pacientes graves. Estudios tales como citometra hemtica, tiempos de coagulacin, glucemia, urea, creatinina y gases sanguneos.

2. Laboratorios de Especialidad. En los laboratorios de pruebas especiales se realizan estudios ms sofisticados, utilizando metodologas como amplificacin de cidos nuclicos, estudios cromosmicos, citometra de flujo y cromatografa de alta resolucin, entre otros. Estas pruebas requieren instalaciones y adiestramiento especial del personal que las realiza. Con frecuencia, estos laboratorios forman parte de programas de investigacin.

Es importante tambin considerar, dentro del proceso de anlisis, la obtencin de las muestras biolgicas. Este proceso conocido como toma de muestras, abarca la flebotoma, proceso por el cual se extre una muestra de sangre; la obtencin de otro tipo de muestras, como orina y heces; y la extraccin de otros lquidos corporales, como lquido cefalorraqudeo o lquido articular.

Ubicacin y Relacin con otros servicios clnicos [editar]

A los laboratorios acuden pacientes externos, puesto que los exmenes que se requieren de los enfermos hospitalizados se hacen mediante muestras que se toman en las unidades de hospitalizacin. En consecuencia su ubicacin ser preferentemente en la planta baja, con fcil acceso a la seccin de recepcin del Archivo Clnico y en menor grado con el departamento de Consulta Externa. Este servicio deber ubicarse en relacin cercana a los servicios de consulta externa, urgencias, terapia intensiva, quirfano y con fcil acceso hacia las reas de hospitalizacin.

reas de Servicio [editar]

Sala de Espera y Recepcin. Donde los pacientes esperarn cmodamente a ser atendidos. Cubculos de Toma de Muestras. En este punto se obtienen las muestras para luego ser distribuidas a las diversas secciones del laboratorio. Secciones de Laboratorio:
o

Hematologa:En este se efectan diversas pruebas que se resumen para el objeto que persigue este estudio en tres: pruebas de coagulacin, pruebas de contabilidad sangunea y morfologa. Qumica Clnica: Aqu se realizan anlisis que se clasifican de la siguiente forma:

Qumica sangunea de rutina Exmenes generales de orina Determinacin de reserva electroltica y bixido de carbono en la sangre

Microbiologa: Las diversas labores que se realizan aqu pueden clasificarse en la siguiente forma:

o o

Coproparasitologa:Tiene por objeto investigar la presencia de parsitos en materias fecales. Bacteriologa: Consiste en examinar directa o indirectamente la presencia o actividad de organismos microscpicos en sangre, orina, materia fecal, jugo gstrico y exudados orgnicos. Inmunologa: Realiza pruebas sobre los anticuerpos que revelan la presencia y actividad de microorganismos en el cuerpo humano Se tendr el rea de Preparacin de medios de cultivo, que por s sola se define, adems, la zona de lavado y esterilizacin de material.

Riesgos especficos [editar]

A continuacin se enumeran los diferentes riesgos a que se pueden exponer las personas que trabajan en un laboratorio clnico.

Exposicin a patgenos presentes en sangre mientras manipulan muestras contaminadas como sangre o fluidos corporales (ejemplo: lquido cerebroespinal, y semen). Exposicin a tuberculosis al trabajar con especmenes que puedan contener tuberculosis. Otros fluidos que pueden ser fuentes potenciales de tuberculosis son esputo, lquido cerebrorraqudeo en la orina, y lquidos recolectados de lavado gstrico o branquial. Exposicin a formaldehdo que es utilizado como fijador y que se encuentra comnmente en la mayora de laboratorios y morgue. Riesgos qumicos. Exposicin a solventes utilizados para fijar tejidos de especmenes y quitar manchas. Se encuentran principalmente en las reas de histologa, hematologa, microbiologa y citologa. Exposicin a PPS debido a heridas con agujas o cortaduras por objetos afilados al trabajar con especmenes, tubos de centrfugas. Exposicin a materiales / organismos infecciosos . Exposicin al ltex y alergia al ltex debido al uso de guantes de ltex. Riesgo de deslizarse o caerse si lquido o muestras caen al suelo. Dolor muscular en diferentes partes del cuerpo por permanecer tiempos prolongados en una misma posicin, ya sea sentado o de pie, o por realizar movimientos repetitivos al manipular muestras. Riesgo de quemaduras.

Obtenido de "http://es.wikipedia.org/wiki/Laboratorio_cl%C3%ADnico"
El rea de Microbiologia comprende una amplia gama de determinaciones bioquimicas destinadas al diagnostico etiolgico de distintas patologas bacterianas, parasitarias y micolgicas. La importancia de las distintas tcnicas utilizadas en esta rea reside en la posibilidad de abarcar

un amplio espectro de microorganismos patgenos para el ser humano, muchos de ellos de difcil diagnstico y que muchas veces comprometen seriamente la salud del paciente. Para el caso particular de estas patologas es sumamente importante un diagnstico certero y rpido a fin de poder detectar fehacientemente el microorganismo causal y establecer el tratamiento especfico para reducir la morbi-mortalidad de la infeccin presente. La incorporacin de metodologas de Biologa Molecular ha permitido una mayor rapidez, eficiencia y sensibilidad en la determinacion de diversas infecciones microbiolgicas, brindando al profesional mdico una importante herramienta diagnstica para una adecuada conducta terapetica.