2.

Preparao das culturas mltiplas de meristema

No incio da cultura, foram utilizados brotos simples in vitro. Estes foram cortados e reduzidos a 0,5 cm sobre o meristema apical, inoculados em tubos de ensaio de 150 ml com 15 ml meio de multiplicao inicial, constitudo de sais e vitaminas do MS (Murashige & Skoog, 1969) suplementado com 10 M 6benzylaminopurine (BAP), 1 M cido indolactico (AIA), 10 cido ascrbico de mg.L-1, 30 sacarose de g.L-1, e solidificado com 3 g.L-1 Phytagel. O pH do meio de cultura foi ajustado para 6,2 e autoclado por 20 minutos a 121C. Depois de um ms de cultura (1 ciclo), com a formao de brotos, estes foram selecionados, cortados e transferidos para o mesmo meio fresco. A cultura de brotos foi mantida em sala de crescimento com temperatura de 26 2C e com fotoperodo de 16 horas. Depois de 2 ciclos de cultura os brotos mltiplos foram transferidos para o mesmo meio de cultura acrescentando 100 M BAP cultivados no escuro. Os explantes foram subcultivados mensalmente

Sbado, 27 de Setembro de 2008

muda de banana multiplicada por biotenologia
II- Muda para ser multiplicada por biotecnologia O processo de produo de mudas de bananeiras por biotecnologia, tambm conhecido por mudas de laboratrio feito a partir de uma gema apical de crescimento ou de uma lateral de brotao, que tratada por hormnios e nutrientes, em condies climticas especficas e asspticas, para que ela se multiplique intensivamente. Os laboratrios de biotecnologia, assim como as propriedades com bananais devem ter um banco de germoplasma de onde retiraro as mudas para seu uso. O banco deve ser instalado longe de plantaes de bananeiras e de Cucurbitaceas spp. Ele deve ser mantido sempre limpo de ervas daninhas, por meio de herbicidas e ter ainda ao seu redor uma faixa de no mnimo 10 metros igualmente no limpo, para se reduzir s possibilidades de contaminaes das bananeiras por vrus. recomendvel que os laboratrios realizem, a cada seis meses, a indexao das suas matrizes, usando-se de preferncia tcnicas moleculares, que possibilitam identificar todas as espcies e estirpes de vrus. Na obteno de gemas apicais de crescimento, o maior rendimento que se consegue a partir da muda tipo pedao de rizoma, que foi cevada em canteiros, quando ento suas gemas laterais de brotao se desenvolvem e se transformam em gemas apicais de crescimento. Estas mudas so obtidas pela diviso radial dos rizomas inteiros. Pode-se tambm utilizar a gema apical da muda tipo rizoma inteiro, conhecida como

filhote. Neste caso, ela no deve ter peso superior a 300 gramas, quando j limpa, ou seja, sem terra e razes. Rizomas maiores, alm de serem mais difcil seu transporte, acabam tendo no laboratrio, o mesmo rendimento dos pequenos. Caso as mudas selecionadas para multiplicao intensiva no estejam prximas do laboratrio, seu transporte pode ser dispendioso devido ao grande volume e a distncia. A ceva da muda no local onde ela foi produzida uma soluo muito vivel para esse problema. Apenas na formao das mudas produzidas por pedaos de rizoma, deve-se p-las em canteiro de ceva (ver item III-3), onde se criam condies para acelerar o intumescimento e o crescimento de suas gemas laterais, as quais se transformaro pequenos rebentos que tero, cada um, sua gema apical de crescimento. Porm, importante lembrar que, se a touceira selecionada para produo de mudas em laboratrio foi plantada com muda j produzida em laboratrio, somente poder-se- utiliz-las como planta matriz aps a colheita da planta neto (terceira gerao). Esta carncia de tempo para que a planta elimine todos os hormnios que foram aplicados no laboratrio para sua produo, evitando-se assim a formao de muitas mudas com variao somaclonal. II.1- A produo de mudas pedao de rizoma para ceva. Em uma touceira que nunca foi desbastada e onde se tenha colhido o primeiro cacho recentemente, a quantidade de gemas apicais de crescimento que se obtm dos rebentos jovens e de plantas quase adultas, que ainda no tenham sofrido a diferenciao floral, pequena, dificilmente ultrapassando a 15 delas. Entretanto, dessa mesma touceira pode-se, com relativa facilidade, preparar de 30 a 35 mudas tipo pedao de rizoma, para utilizao em canteiros de ceva, a partir de todos os rizomas que ainda no produziram e tambm o rizoma da planta me. Em geral, cada uma dessas mudas cevadas tem uma ou mais gemas laterais de brotao que, ao se desenvolverem, se transformam em gemas apicais de crescimento. Do rizoma de uma planta adulta bem vigorosa, que j tenha

sofrido a diferenciao floral ou produzido recentemente, pode-se obter de 6 a 8 mudas padro para ceva, quando convenientemente retalhado. II.2- Preparo das mudas a serem postas para cevar. As mudas rizoma inteiro, independentemente de seu tamanho, no devem passar pelo processo de ceva e nem pelo plantio em copos de plstico com substrato vegetal. Sempre que possvel, deve-se arrancar toda a touceira selecionada, pois, com isso, se obtm maior rendimento da mo de obra e menores perdas do material bsico. Para haver maior rendimento no servio de arrancamento das mudas, interessante que dois dias antes do seu incio se faa uma boa irrigao. Com um enxado abre-se uma vala, ao redor da touceira e distante 20 a 30 cm dela, com a profundidade de 30 a 40 cm. A seguir tomba-se toda a touceira para um dos lados. Os rebentos maiores da planta me so separados dela seccionando-se seus cordes umbilicais (rgo esse que faz a ligao entre cada rizoma filho com o da me), com a introduo de uma ferramenta cortante entre os rizomas filho e me, que pode ser um faco ou uma p reta tambm conhecida por vanga. Os rebentos pequenos (menores do que 40 cm) que estejam brotando de filhos maiores ou da prpria me sero separados com um corte feito com um faco, em seu cordo umbilical. Desta forma evita-se danificar esses pequenos rebentos.

Foto 1- Se o solo estiver mido, o arrancamento mais fcil. Depois de destacados todos os filhos que estavam ao redor da me, seus pseudocaules sero aparados entre 20 a 30 cm acima das razes mais altas, inclusive o da planta me, pois seu rizoma tambm poder ser utilizado para produo de mudas de pedao, desde que seu cacho tenha sido colhido h menos de 30 dias. Recomenda-se que se retire a terra que esteja agregada aos rizomas, com um jato de gua, no mesmo local onde a touceira estava plantada. No sendo possvel, deve-se eliminar, ao mximo, a terra que ainda esteja junto aos rizomas, usando-se a costaneira do faco, tomando-se o cuidado de no os ofender e, em seguida, transport-los para onde possam ser lavados. importante que durante a movimentao e transporte dos rizomas at ao canteiro de ceva, eles no sejam jogados para que suas pequenas gemas laterais no sejam danificadas. A lavagem feita previamente nos rizomas facilita muito a poda das razes e deixam as gemas laterais mais visveis e a diviso radial do rizoma executada com maior rendimento e velocidade. A eliminao das razes deve ser feita, grosseiramente, com uma faca ou um faco bem afiado, de modo que todas elas fiquem com no mximo um centmetro, cuidando-se, contudo, que a ferramenta no danifique o rizoma. Nestas condies de limpeza, a diviso radial do rizoma

muito mais fcil de ser executada.

Foto 2- A retirada da terra possibilita se visualizar melhor as gemas. Rizomas de plantas que j sofreram diferenciao floral e aqueles com mais de 3 kg produziro mudas tipo pedao de rizoma com 300 a 400 g. No caso dos rizomas de plantas que j sofreram a diferenciao floral ou que j produziram, sua parte fibrosa interna pode ser reduzida, uma vez que nela no existem gemas laterais. Porm, os rizomas com menos de 3 kg, sero retalhados de modo a se obter mudas de menor peso, o qual no ser inferior a 150 a 200 g.

Foto 3- Retalhando o rizoma para produzir mudas pedao de rizoma. As mudas sero retalhadas radialmente, sendo que o corte inicial no rizoma deve ser feito colocando o faco prximo de uma gema lateral bem visvel e em seguida aplicando-se uma pancada no seu dorso, com um pequeno macete de madeira. O corte no deve ultrapassar o centro do rizoma. Os cortes seguintes sero feitos de modo a transformar o rizoma em vrios prismas triangulares. Estando as mudas retalhadas, pode-se rebaixar suas bainhas de modo que as mais internas fiquem com 3 a 5 cm acima do seu ponto de insero. Entretanto, a parte inferior da muda no ser recortada.

As mudas a serem postas para cevar devem estar livres de nematides e da broca das bananeiras (Cosmopolites sordidus). Porm, se assim no estiverem e estando a muda j retalhada, preciso fazer-se uma toalete com um faco, de modo a se eliminar todas as necroses e galerias causadas por aquelas pragas. A despeito disto, estas mudas no tm um desenvolvimento satisfatrio e muito freqentemente, morrem sem brotar. II.3- O canteiro de ceva das mudas. Em nvel de produtor rural, o canteiro de ceva dever ser instalado a cu aberto, em local bastante ensolarado e formado apenas com mudas tipo pedao de rizoma. Entretanto, a nvel empresarial, ele dever ser feito em estufa onde a temperatura e a umidade sejam controladas. O canteiro de ceva deve ser preparado em um local levemente inclinado, sendo que o solo deve estar bem limpo. O canteiro ser limitado por pranchas de madeira com 15 a 20 cm de altura e comprimento varivel, tendo no mximo 120 cm de largura. No se tendo possibilidade de se usar as pranchas de madeira, pode-se escavar uma caixa no cho com 15 a 20 cm de profundidade em sua substituio. As mudas sero postas para brotar diretamente no solo, uma ao lado da outra, sendo acomodadas na mesma posio em que estavam no rizoma, ficando suas gemas levemente voltadas para o alto. Depois de convenientemente arrumadas, elas sero coberta com uma camada de casca de arroz, serragem ou areia grossa. Em seguida executa-se uma irrigao abundante e completa-se os vazios que se formaro entre as mudas, com o mesmo material j utilizado na sua cobertura, at a altura de 2 a 2,5 cm acima delas. Para evitar que essas mudas venham a ser parasitadas por formigas ou outros insetos e tambm para se reduzir os focos de infeces fngicas, recomendvel fazer-se uma irrigao usando 2 litros/m de uma soluo contendo: um inseticida (PM ou lquido) ou nematicida a 0,2% de princpio ativo e um fungicida a 0,2% de princpio ativo (Cerconil ou Benlate ou Dithane ou Bayfidan no usar produto que contenha cobre, pois ele dificulta o enraizamento). Aps a aplicao da soluo de defensivos, as mudas sero cobertas com uma manta de polietileno com espessura de 0,01 mm ou com

sacos plsticos (os mesmos utilizados com adubo) para reduzir sua desidratao e mant-las mais aquecidas durante a noite. Sobre os plsticos, coloca-se uma camada de folhas de bananeiras ou de mato, para evitar a incidncia de luz direta sobre as mudas, principalmente nos dias de vero. Se o canteiro de ceva for instalado dentro de estufa, conforme foi citada anteriormente, no haver necessidade de se fazer cobertura das mudas com mantas de plstico.

Foto 4- Canteiro de mudas pedao de rizoma descobertas (1) e cobertas com areia (2) e j coberto com manta de plstico (3).

Foto 5- O posicionamento das mudas pedao de rizoma no canteiro de ceva. O fato delas ficarem soltas sobre o terreno (no plantadas) facilita as inspees, para se avaliar o desenvolvimento de suas gemas e das razes. II.4- O desenvolvimento das mudas nos canteiros de ceva. Depois de uma semana da instalao do canteiro de ceva, deve-se retirar a cobertura feita com o plstico e fazer-se a primeira irrigao. A fim de manter a umidade no canteiro, ser feita uma segunda irrigao aos 15 dias.

Decorrido os primeiros 21 dias da instalao do canteiro de ceva, as inspees para avaliar a umidade e tambm o desenvolvimento das gemas, passam a ser feitas semanalmente. Durante o perodo de temperaturas mais baixas, o desenvolvimento das gemas mais lento, porm, nas estufas esses tempos so encurtados.

Foto 6 - Mudas pedao de rizoma com gema brotando e j com razes. Os pedaos de rizoma postos para cevar, cujas brotaes j se transformaram em pequenos rebentos com mais de 12 cm de altura e seu rizoma com 3 a 4 cm de dimetro, sero retirados do canteiro. Com uma faca bem afiada, separa-se esse pequeno rebento formado da muda cevada de modo a no o ferir, deixando-o totalmente integro. Para se evitar que ele seja danificado, pode-se deixar pequenos pedaos da muda cevada, com a espessura de 2 a 3 cm, agregados ao mesmo. Estes rebentos depois de individualizados, podem ter seu pseudocaule reduzido metade, assim como suas eventuais

razes, ao comprimento de 2 cm para facilitar seu manuseio. As demais mudas que estejam cevando e que no tenham rebentos no ponto de serem utilizados para laboratrio, sero reagrupadas e continuaro cevando, nos moldes j descritos. Sero feitas outras trs inspees semanais, para retirada de rebentos que j tenham atingido as condies desejadas. Aps esse perodo, deve-se abandonar o canteiro, pois as mudas que sobraram sero fracas e de pouco aproveitamento.

Foto 7- Muda pr-brotada pronta para ser enviada ao laboratrio. Eventualmente, as mudas podem ficar maiores, chegando at mesmo a comear a formar as primeiras rudimentares folhas, mas isto no recomendvel. Esses rebentos, aps sua separao, sofrero uma toalete de modo a reduzir seu pseudocaule ao comprimento de 6 a 8 cm. Se eles j tiverem razes com mais de 2 a 3 cm, elas devem ser reduzidas a essas dimenses. Entretanto, se houver necessidade das mudas precisarem permanecer por mais tempo no canteiro de ceva, deve-se descobri-lo completamente e esparramar sobre elas mais casca de arroz, serragem ou areia grossa, at cobri-las por completo. Com esse artifcio, elas podero ficar at formar algumas folhas para depois serem aproveitadas, quando ento se aplicar a mesma metodologia j descrita para a toalete nas razes e nas folhas. Neste caso o manuseio e o seu transporte exigiro maiores cuidados. II.5- Mudas para laboratrio.

As mudas j brotadas no canteiro de ceva e recortadas nas dimenses acima descritas sero enviadas para o laboratrio. Porm, durante o processo de retalhamento da touceira, as mudas tipo rizoma inteiro, cujo peso no permita sua diviso em pedaos com mais de 150 g, tero seu rizoma bem

escalpelado, ficando, portanto, completamente limpo. Seu pequeno pseudocaule ser aparado transversalmente de modo a se eliminar apenas seus ltimos 3 a 5 cm. Em seguida esse pequeno filhote ser enviado para o laboratrio.

Foto 8 - Menor filhote que pode ser enviado ao laboratrio, com poucas chances de perda.

Foto 9 - Maior filhote j escalpelado, aparado pronto para laboratrio. No laboratrio, esse pequeno rebento ter sua gema apical de crescimento extirpada (explante), a partir da qual se inicia o processo de multiplicao intensiva, da mesma forma que se faz para a muda cevada (pr-brotada), aproveitando-se apenas a sua nica gema. Na hiptese do laboratrio no estar anexo do canteiro de ceva, os rebentos sero remetidos para ele utilizando caixa de papelo ou de isopor. Na embalagem em caixas de papelo, deve-se inicialmente embrulhar todos os rebentos em jornal umedecido e em seguida coloca-los em um saco plstico que ser fechado. Se a caixa utilizada for de isopor, deve-se forrar apenas o seu fundo com jornal mido, colocar-se os rebentos e cobri-los com uma outra camada de jornal tambm mido. Estando os rebentos devidamente embalados, eles sero imediatamente enviados para o laboratrio, o qual dever ser prontamente informado da remessa.

Foto 10 - Na foto, um pice caulinar contendo o meristema de crescimento, com tamanho ainda 3 vezes maior do que o usado como explante, que contm no seu interior a gema apical de crescimento.

Foto 11 - O explante plantado em vidro com meio de cultura, inicia sua multiplicao para produo das mudas de laboratrio.