UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

TRABAJO DE INVESTIGACIN

Ttulo: OBTENCION DE LINEAS PURAS POR ENDOGAMIA EN EL RATON COMUN (Mus musculus) ABRIL-JULIO 2013 Autores: Giron Santa Cruz Yesenia Medina Achin, Liliana Judith Rueda Gutierrez Jadit Estefanny

Asesor: MSc. Jhon W. Garca Lpez

LAMBAYEQUE-PERU, 2013

I.

GENERALIDADES: 1. Ttulo de la Investigacin:

OBTENCION DE LINEAS PURAS POR ENDOGAMIA EN EL RATON COMUN (Mus musculus) ABRIL-JULIO 2014

1. Personal investigador Giron Santa Cruz, Yesenia Medina Achin, Liliana Rueda Gutierrez, Jadit 2. Asesor: MSc. Jhon W. Garca Lpez

3. Carrera profesional/especialidad Escuela Profesional de Biologa / rea de Biologa General

4. Tipo de investigacin: 4.1 De acuerdo al fin que persigue: Aplicada

4.2 De acuerdo a la tcnica de contrastacin: Explicativa

5. Rgimen de investigacin Libre

6. Localidad e institucin donde se desarrollar el proyecto Laboratorio de Gentica de la Facultad de Ciencias Biolgicas en la Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo, Lambayeque.

7. Duracin del proyecto 4 meses (indicar las fechas)

I.

RESUMEN

El presente trabajo de investigacin se realiz en el Laboratorio de Gentica de la Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo en Lambayeque; como proyecto dirigido en el curso de Gentica aplicada de la carrera profesional de Biologa general. El objetivo principal fue la obtencin de cepas consanguneas de ratn comn (Mus musculus) por seleccin artificial en base a caracteres fenotpicos. Se caractersticas fenotpicas heterogneas y

observaron y analizaron las homogneas

en los individuos de la progenie obtenida por endogamia.

Asimismo, se determinaron los cambios fenotpicos en la progenie postendogamia previamente. con respecto a los caracteres parentales observados

La investigacin se inici con una pareja de ratones hermanos, quienes por reproduccin endogmica originaron la primera generacin filial en la cual

Una descripcin muy breve del mtodo y procedimientos

se observaron

Los resultados mas importantes

Por lo tanto, la investigacin .. Las

conclusiones.

II.

INTRODUCCIN El ser humano en la bsqueda del conocimiento y en beneficio de la

salud humana ha utilizado a los animales a travs de los siglos, comenzando aproximadamente 300 aos a.C. con los estudios de Aristteles y continuando, a travs de los tiempos, con figuras como Erasistratus, Galeno, William Harvey, Claude Bernard, Paul Ehrlich entre los ms destacados, este conocimiento generado durante siglos es en la actualidad el cimiento de Ciencia de los Animales de Laboratorio.

La importancia de la utilizacin de los animales de laboratorio se basa principalmente en la razn de entender los problemas de salud y desarrollar los caminos adecuados para resolverlos. Algunas enfermedades y problemas de salud involucran procesos que solamente pueden ser estudiados en la mayor parte de los casos en organismos vivientes. Los animales son necesarios para la investigacin biomdica cuando es imprctico o no tico su utilizacin en seres humanos, por lo que los animales son buenos modelos de estudio por varias razones: son similares biolgicamente a los seres humanos,

susceptibles a problemas similares de salud y tienen en general ciclos cortos de vida por lo que pueden ser estudiados a travs de toda su vida y por generaciones. Asimismo, los cientficos pueden controlar fcilmente el medio ambiente del animal (dieta, temperatura, luz, etc.) por lo que representa una ventaja ms en su utilizacin.

Los animales ms utilizados en la investigacin son principalmente la rata y el ratn (90%), conejos y otros roedores (9%) y el perro, gato, primates no humanos y otras especies (1%). El ratn de laboratorio es fcil de manejar debido a su pequeo tamao. Es tambin muy fcil de criar y mantener, ya que no requieren demasiados cuidados y estos no son muy costosos, tienen numerosas cras y tienen un periodo de gestacin relativamente corto (21 das). El ratn es un animal mamfero, como el ser humano. Su genoma se ha secuenciado y es muy similar al nuestro, siendo muchos de los genes homlogos, por lo que estudiando y manipulando estos genes (es relativamente sencillo aadir, eliminar o modificar genes en los ratones)

podemos investigar qu funcin tienen en el ser humano las protenas que codifican . . El parecido gentico entre las dos especies permite comparar los genes casi directamente, y permite a los cientficos encontrar los mismos genes en humanos para decodificar las rutas y mecanismos de las enfermedades humanas, porque los ratones tambin pueden

desarrollarlas. Los ratones son criados para ser como genticamente similares como sea posible, por lo que se produce la endogamia.

As, las

cepas de ratones de laboratorio deben ser puras y

genticamente idnticos, lo que hace que sea ms fcil ver los efectos de un tratamiento experimental o un cambio en un solo gen. Para establecer experimentos con ellos, se intenta que sean de una cepa endogmica (que se reproduzcan con miembros de su propia familia). De este modo, es seguro que tengan los mismos genes, lo que facilita la comparacin de los efectos de los diferentes tratamientos

experimentales (frmacos, entorno fsico, etc.), sin que se produzca confusin debido a las diferencias genticas

El desarrollo de cepas consanguneas ha proporcionado modelos estandarizados y uniformes en el desarrollo de estudios en reas como la gentica, fisiologa y la patologa, estudios toxicolgicos, como tambin han sido usadas herramientas novedosas de biotecnologa y la bioinformtica. Para establecer cepas consanguneas es necesario realizar endogamia en la poblacin de animales, de este modo se logra la transmisin de los mismos genes, alcanzando la purificacin de la raza por homocigosis.

Las cepas consanguneas presentan varias caractersticas generales que le confieren importancia cientfica. Estas caractersticas son: homocigosis, isogeinicidad o igualdad gnica, uniformidad fenotpica, larga estabilidad gnica, identidad, individualidad, distribucin internacional, datos del

background o fondo gentico (Institute of Laboratory Animal Research, 1979; Benavides y Guenet, 2003).

La mayor utilidad de las cepas consanguneas radica en el hecho de que permiten realizar experimentos eliminando la variabilidad de origen gentico, y como sus caractersticas pueden permanecer constantes por largos periodos de tiempo estas pueden ser usadas como base en la planificacin de diferentes estudios (Papaioannou y Festing, 1980).

Las cepas consanguneas de ratones usadas en la investigacin deben presentar dos caractersticas importantes tales como homocigocis en el 99% de los alelos e isogenicidad en el 99% de los loci de la colonia. Cuando se hace referencia a una homocigosis tan elevada en el genoma se habla de pureza gentica. Una alteracin de esta puede darse por el apareamiento entre ratones de una cepa consangunea con otros de un grupo no consanguneo, producindose entonces ratones heterocigotos, por lo que se habla de una contaminacin gentica de las cepas consanguneas. La presencia de la condicin heterocigtica altera las caractersticas particulares de las cepas consanguneas y por tanto modifican sus respuestas fisiolgicas, conduciendo a resultados no esperados en las pruebas realizadas en estos animales.

Por lo anteriormente mencionado, este trabajo de investigacin objetivo general comn Mus musculus. del ratn albino

tuvo como ratn

la obtencin de lneas puras por endogamia en el

De este modo, las cepas consanguneas obtenidas utilizarse en estudios posteriores, reduciendo la

podran

alteracin de los resultados causada por la variabilidad gentica de la cepa experimental.

III.

ANTECEDENTES

El ratn de laboratorio (Mus musculus) es una especie ampliamente utilizada como organismo modelo en diversos campos de la Biologa. Su

importancia en la investigacin de temas relacionados con la salud humana, como modelos espontneos o inducidos de enfermedades genticas congnitas o espordicas y con el mejoramiento animal se encuentra profusamente documentada. Aunque las conclusiones obtenidas a partir de estos estudios no pueden ser extrapoladas directamente a la especie humana ni a las especies productivas de inters econmico, las mismas resultan de utilidad para desentraar aspectos bsicos de los diferentes procesos que dan origen a fenotipos complejos y que son comunes a diferentes especies. En muchos sentidos esta especie est considerada como un modelo animal prcticamente perfecto debido no slo a su corto intervalo generacional, fcil mantenimiento y alto potencial bitico, sino tambin a otras caractersticas que, sumadas, lo hace una opcin casi nica para la gentica experimental. Entre esas caractersticas merecen citarse la de soportar bien la consanguinidad, lo que permite obtener poblaciones virtualmente homocigotas para todos sus loci por medio de la endogamia, la de ser una especie inusual en el sentido de que es posible generar hbridos viables y frtiles entre las cepas de laboratorio y diversas especies de origen silvestre y, por ltimo, la posibilidad de producir alteraciones heredables del genoma casi a pedido mediante tcnicas de transgnesis o de knock-out gnico (Benavides y Guenet, 2003). En Mejoramiento Gentico Animal, la prctica de la seleccin se dirigi hacia el aumento del rendimiento de caracteres de inters econmico con el propsito de incrementar la produccin animal. Esta seleccin direccional trajo como consecuencia modificaciones favorables, desde el punto de vista productivo, en caracteres no seleccionados (Brien, 1986). La realizacin de experimentos a largo plazo que evalen los efectos de la seleccin en animales de inters econmico se hace difcil debido a los tiempos y los costos que insumen. Una alternativa consiste en utilizar modelos experimentales en animales de laboratorio con cortos perodos generacionales. Estos modelos, si

bien no producen resultados totalmente extrapolables, conducen a incrementar el conocimiento sobre los mecanismos bsicos involucrados y a la realizacin de planes de mejoramiento con mayor eficiencia asi como los diferentes fenotipos que se obtuvieron y otras caracterisitcas notables como el pelaje de los ratones, tamao, eso que variaron de una generacin ala otra. Aunque tambin y muy frecuentemente, ocasion deterioros de la aptitud por la presencia de problemas reproductivos y una menor resistencia a enfermedades (Rauw et al.1998).

El Proyecto Genoma ratn se puso en marcha hace una dcada para completar la secuencia del ratn, esfuerzos por promover nuevas iniciativas sobre el fenotipo en condiciones estandarizadas y la recoleccin de los datos en una base de datos pblica central, la base de datos Phenome Mouse genoma (MPD) alberga una gran cantidad de datos de las caractersticas de tensin para facilitar el uso del ratn de laboratorio en la investigacin traslacional sobre la salud humana y las enfermedades, ayudando a aliviar los problemas relacionados con la experimentacin en seres humanos que no se puede hacer prcticamente ni ticamente. Los conjuntos de datos son aportados voluntariamente por investigadores de diversas instituciones y ajustes, o en algunos casos, recuperados por personal de MPD de fuentes pblicas. MPD mantiene una coleccin cada vez mayor de datos de referencia estandarizados que ayuda a los investigadores en la seleccin de cepas de ratn para aplicaciones de investigacin, casas de tratamiento / datos para estudios de frmacos y otras intervenciones de control, ofrece una plataforma estandarizada para descubrir las relaciones genotipo-fenotipo, y proporciona herramientas para la prueba de hiptesis. MPD mejoras y actualizaciones desde nuestro ltimo informe de NAR se presentan, incluyendo la incorporacin de nuevas herramientas y funciones para facilitar la navegacin y la minera de datos, as como la adquisicin de nuevos datos (expresin fenotpica y genotpica de genes) (Maddatu TP , Grubb SC , Bult CJ , Bogue MA, 2012) .

IV.

MATERIALES Y MTODOS

A. Lugar de ejecucin de la investigacin: Laboratorio de Gentica de la Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo en Lambayeque

B. Material: -Biolgico. Un par de ratones de laboratorio Mus musculus. -De Laboratorio Alimento para ratones Jaulas Bebederos -Equipos e instrumentos: Balanza analtica. Cmara Fotogrfica. Regla milimetrada

C. Mtodos: C.1. Tamao de la muestra La muestra consisti en una pareja de ratones, un macho y una hembra, que al mismo tiempo constituyeron las unidades experimentales parentales. C.2 Condiciones de laboratorio Para evitar que las diferencias fenotpicas se ocasionaran por factores ambientales, las condiciones de laboratorio fueron homogneas para todos los cruzamientos. La temperatura y la humedad se mantuvieron dentro de los mrgenes adecuados para esta especie. La temperatura se mantuvo a 220 C 20 C. Los lugares de ubicacin de los animales se mantuvieron con ciclos continuos de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Los animales se alojaron en jaulas, provistas de una

rejilla de cierre de acero inoxidable. Los animales estuvieron en lechos de viruta en condiciones de comida y bebida. C.3. Caractersticas fenotpicas a evaluar. Debido a que las razas de ratones se guan segn el cuerpo (formas anatmicas) y la capa (el tipo de pelo), se evaluaron las siguientes caractersticas fenotpicas como indicadores de homocigosis en la progenie: Numero de dedos Tamao y color de la cola Peso Forma de ojos y orejas Color de ojos y orejas Tipo de pelaje (liso o erizado) Observacin de manchas.

C. 4. Respuesta desde la variacin inicial existente para obtener cepas consanguneas de ratn albino por endogamia. La respuesta en el lmite depende del nmero de genes que influyen en el carcter seleccionado, de sus efectos y de sus frecuencias inciales. Si la mayor parte de la variacin est determinada por pocos genes de efecto grande y frecuencia intermedia el tamao de la poblacin tiene poca importancia y en la mayora de las lneas, se fijarn los alelos favorables. Esto se evaluara teniendo en cuanta las caractersticas fenotpicas observadas, analizando algn cambio en la progenie. Este anlisis se repetir para cada progenie obtenida por cruzamiento, evaluando la homocigosis para cada cruzamiento endogmico. C.5. Reduccin del censo efectivo por seleccin El hecho de practicar seleccin artificial hace que el censo efectivo disminuya respecto a una situacin sin seleccin porque la probabilidad de encontrar parientes entre los individuos seleccionados para el carcter es mayor que entre los individuos tomados al azar. Este efecto se conoce como efecto Robertson. La reduccin del censo efectivo se llevara a cabo seleccionando individuos con el mismo patrn para las caractersticas a evaluar, formando as parejas homocigotas para el cruzamiento endogmico.

C. 6. Estrategias para el criterio de seleccin Se busca aumentar la consanguinidad al incluir las relaciones de parentesco en el criterio de seleccin. La seleccin de los apareamientos posibilita utilizar en

cada generacin un nmero variable de machos y una razn variable de apareamientos. Se optimizar un esquema de seleccin factorial o jerrquico con un nmero variable de machos, hembras o descendientes por apareamiento y se usarn diferentes restricciones en diferentes generaciones. As, las parejas para el cruzamiento endogmico sern formadas a partir del nmero de individuos que el criterio de seleccin limite. 5.2.7. Anlisis de Datos En el presente trabajo se utilizarn los programas Microsoft Office Word y Excel versin 2010.

Colocar como se hizo realmente en pasado

V. RESULTADOS

VI. VII.

DISCUSIN CONCLUSIONES

VIII.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

BENAVIDES F, CAZALLA D, PEREIRA C. Evidence of genetic heterogeneity in a BALB/c mouse colony as determined by DNA fingerprinting. Laboratory Animals 32: 80-85; 1998. BENAVIDES F, GLASSCOCK E, COGHLAN LG, STERN MC, WEISS DA, CONTI CJ. PCR-based microsatellite analysis for differentiation and genetic monitoring of nine inbred SENCAR mouse strains. Laboratory Animals 35: 157-162, BENAVIDES F, GUENET J. Manual de gentica de roedores de laboratorio: principios bsicos y aplicaciones. Alcal: Sociedad Espaola para las Ciencias del Animal de Laboratorio (SECAL)-Universidad de Alcal, 2003; 312. FESTING MF. International Index of Laboratory Animals, 6th edition, 1993. Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council. Gua para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio. Edicin Mexicana. Washington: Nacional Academy Press; 1999. Disponible en: http://www.nal.usda.gov/awic/pubs/noawicpubs/careuse.htm JULIER C, GOUYON B DE, GEORGES M, GUNET J, NAKAMURA Y, AVNER P, LATHROP M. Minisatellite linkage maps in the mouse by cross-hybridization with human probes containing tandem repeats. Proceedings of the National Academy of Science of USA 87: 4585-4589, 1990. QUEZADA A. Introduccin al manejo de animales de laboratorio: roedores y pequeas especies. Mrida: Universidad Autnoma de Yucatn; 1997. Servicio Nacional de Salud Agraria (SENASA), Servicio Nacional de salud. La calidad de los animales de laboratorio y su influencia en las pruebas de diagnstico, investigacin y control de calidad. Lima: Senasa; 2004. VON HOOSIER G, The age of biology: opportunities and challenges for Laboratory Animal Medicine. Scand J Lab Anim Sci 1999; 26 (4): 176-184. http://bibliotecavirtual.dgb.umich.mx:8083/jspui/bitstream/123456789/461/1/MANEJOY SUJECCIONDEROEDORESUTILIZADOSENELLABORATORIO.pdf http://www.transtechsociety.org/docs/books/Benavides_Guenet_2003/04GENETICA.pdf http://tesis.ula.ve/pregrado/tde_busca/arquivo.php?codArquivo=2204 http://bvs.minsa.gob.pe/local/INS/962_INS68.pdf

ANEXOS
CUIDADO DE ANIMALES. Para el cuidado de los animales asignados, el Investigador Responsable, deben realizar las siguientes actividades: a) Cambiar la cama y lavar la jaula, bebedero y tapa dos veces por semana. b) suministrar agua y alimento diariamente. c) Vigilar el estado de salud. d) Manejar con cuidado los animales. e) Evitar el hacinamiento y maltrato de los animales. f) Separar a los animales enfermos y/o aquellos animales que ya no vayan a ser utilizados por el usuario.

EL RATN: SU MICROAMBIENTE Y MACROAMBIENTE

RECOMENDACIONES DE ESPACIO (DENSIDAD ANIMAL) El nmero de animales por jaula estar en relacin con el tamao corporal (edad del ratn, estado pre y postnatal) evitndose la sobrecarga. El tamao de las jaulas o cajas debe ser apropiado; por ejemplo, en el caso de ratones adultos, se requiere una superficie mnima de 80 cm2 por animal. El requerimiento mnimo es que el animal disponga de espacio suficiente para moverse y para expresar las posturas normales de conducta y sociabilidad, debe tener fcil acceso al agua y alimento y debe tener un rea suficiente con material de lecho limpio y sin obstculos para moverse y descansar. En la siguiente tabla se muestra las recomendaciones del espacio asignado a roedores alojados en grupos; si se alojan individualmente o exceden los pesos listados, podran requerir de ms espacio, de acuerdo con el criterio profesional y de experiencia. TABLA 1 Espacios recomendados para ratones de laboratorio

LECHO O CAMA Los lechos sern de material absorbente tal como la viruta de madera, la coronta molida del maz (marlo), etc.; libres de polvillo, alergenos y sustancias txicas. Deben ser esterilizables. La viruta ms adecuada es la de de pino blanco, seguida por la de tornillo. Se debe tener especificaciones de calidad de la viruta para su adquisicin, tales como: No ser nocivo. Capacidad de absorcin No se recomienda el uso de viruta procedente de cedro o caoba.

AGUA DE BEBIDA El agua debe ser potable y suministrarse libremente durante toda la vida del animal, puede ser en frascos bebederos de vidrio o de policarbonato.

El agua debe ser acidificada, esterilizada mediante autoclave o por mtodo de filtracin.

ALIMENTO: DIETAS Y REQUERIMIENTOS El alimento es el material primario a partir del cual se van a formar y renovar los tejidos y estructuras corporales, tanto las nuevas como las ya existentes, que deben ser reemplazadas debido al proceso de desgaste. La nutricin es determinante en los estados sucesivos de crecimiento y produccin de los animales, de ah que haya alimentos especficos para cada especie y hasta para cada etapa de su vida. Luego de su adquisicin, se debe tener cuidado en el transporte, almacenamiento y manipulacin del alimento para reducir al mnimo la introduccin de enfermedades, parsitos y vectores potenciales de enfermedades (por ejemplo insectos y otras plagas) y contaminantes qumicos. Se debe contar con un procedimiento para la adquisicin de alimento y los requisitos que este debe reunir, tales como: Composicin, que deber cubrir las necesidades de crecimiento, gestacin, lactancia y mantenimiento del ratn. Debe ser agradable al paladar (palatable) y digestible. Tener fecha de elaboracin y caducidad. Certificado de anlisis qumico proximal y microbiolgico por cada lote. Estar libre de harina de pescado, aditivos, drogas, hormonas, antibiticos, pesticidas y contaminantes patgenos. El alimento en forma de pellet debe tener la consistencia requerida, para evitar perdida del alimento y el animal pueda consumirlo. TABLA 2 Composicin qumica de una dieta estndar