UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE INGENIERIA CAMPUS GUANAJUATO

Ingeniera Farmacutica
Prctica #2 CUANTIFICACIN DE PROTEINAS

Equipo Arroyo Ganem Yvan Negrete Bosques Nora Liliana Pedroza Rodrguez Gloria Roxette Ramrez Urtiz Juan Emmanuel Rivera Carreras Jessica de los Dolores

Bioqumica Farmacutica

Grupo 3FV1
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Febrero de 2013

OBJETIVOS
GENERAL
Aprender a realizar curva de calibracin para cuantificacin de protenas en base a mtodo colorimtrico.

PARTICULARES
Conocer mtodos para cuantificacin de protenas. Elaborar curva de calibracin usando mtodo de Lowry y solucin albmina como protena patrn. Conocer la importancia de una curva de calibracin para cuantificacin de protenas.

MARCO TERICO
Para el estudio de las estructura de una protena, de la actividad de una enzima o el contenido proteico de un alimento, es necesario conocer cuantitativamente la concentracin de las protenas. Existen diversos mtodos para la cuantificacin de las protenas, todos ellos basados en alguna de sus propiedades tpicas, como pueden ser patrones de adsorcin de las radiaciones electromagnticas de los grupos aromticos, la reactividad del enlace peptdico, su contenido de nitrgeno, etc. Aqu se presentan los principios de algunos mtodos: Mtodo de absorcin en el ultravioleta La mayora de las protenas absorben en el UV a 280 nm. Debido bsicamente a grupos cromforos de tirosina y triptfano. Si se considera que la cantidad de estos dos aminocidos es siempre constante, la absorbencia debe ser proporcional a la concentracin proteica. (Badui, 1993) Mtodo de Biuret Las sustancias que contienen dos o ms enlaces peptdicos forman un complejo purpura-violeta con sales de cobre en soluciones alcalinas. Es posible que el color se desarrolle por la formacin de un ion coordinado tetra cprico con dos grupos
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-CO-NHadyacentes. La intensidad del color es determinada espectroscpicamente a 540 nm con una curva patrn. (Badui, 1993) Mtodo de Bradford Se fundamenta en la fijacin del colorante Azul de Coosmasie (Fast Blue B) a las protenas, dando lugar a un cambio de en el color que puede ser medido en un espectrofotmetro. El mtodo es extremadamente sensible, detectando cantidades de 1 g o incluso inferiores. (Battaner, 1993) Mtodo de la acido Bicinconnico (BCA) Es un mtodo que permite la determinacin colorimtrica de la protena total de una muestra. Combina la reduccin del Cu2+ a Cu+ por las protenas en un medio alcalino y la determinacin de los iones cuprosos formados por el establecimiento de un complejo con el BCA. Este presenta coloracin purpura, con un mximo de absorcin a 562 nm. (Roca-Oliver-Rodrguez, 2003) Mtodo de Lowry Este es el mtodo que se utilizo en esta prctica. Se basa en el desarrollo de un cloro azul debido a: 1) Reaccin de Biuret. 2) Reduccin del reactivo fosfomolidno-fosfotungstico por aminocidos como tirosina y triptfano presentes en las protenas. Este mtodo ha sido modificado varias veces. La absorbencia se mide a 750 nm (alta sensibilidad) o a 500 nm (baja sensibilidad) para protenas concentradas. Se requiere de una curva patrn que es recomendable hacer con la misma protena. La sensibilidad va desde 0.2 g hasta 300 g.

Figura 1: Reaccin de lowry.

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Una de las ventajas de este mtodo es que es el ms sensible, 100 veces ms que el de Biuret y relativamente rpido (1 hora). Pero requiere de muchos cuidados en la estandarizacin ya que: 1. La intensidad de color vara entre las protenas 2. El color no es siempre proporcional a la concentracin. Existe inferencia de sacarosa, lpidos, amortiguadores de pH, monosacridos y hexosaminas, ya que reaccionan con los reactivos de Lowry. El sulfato de amonio, los sulfhidrilos y los fosfatos tambin interfieren en la determinacin. (Badui, 1993)

RESULTADOS
ELABORACIN DE CURVA DE CALIBRACIN
Experimento 1
Calculo de concentraciones Se realizaron 6 disoluciones, cada una con distinta concentracin de BSA (albmina). En la tabla 1 se muestran los resultados ya con las concentraciones finales de albumina.

TABLA 1. Valores de concentracin y absorbancia experimentales Muestra 1 2 3 4 5 Longitud de onda 750 750 750 750 750 T% 82.5 70.6 69.4 62 60.1 A% 0.084 0.151 0.158 0.208 0.217

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Absorbancia Vs. concentracin

0.25 0.2 Absorbancia

0.15

0.1

0.05

0 0 1 2 3 4 Concentracin (mg/mL) 5 6 y = 0.0323x + 0.0667 R = 0.9193

Figura 3. Grafica de Absorbancia vs Concentracin, con la ecuacin de la recta que mejor se ajusta al comportamiento de la curva y con un coeficiente de correlacin de 0.9193 DUPLICADO La prueba anterior se volvi a realizar especificados en la tabla 5. y los resultados obtenidos nuevamente fueron los

TABLA 2. Valores de concentracin y absorbancia experimentales Muestra 1 2 3 4 5 A 0.004 0.097 0.125 0.128 0.175

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0.2 0.18 0.16 0.14 Absorbancia 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0 1 2 3 4 Concentracin (mg/mL) 5 6 y = 0.0373x - 0.0061 R = 0.8646

Absorbancia Vs. concentracin

Figura 3. Grafica del duplicado Absorbancia vs Concentracin. Con la ecuacin de la recta mejor ajustada y con un coeficiente de correlacin de 0.8646.

OBSERVACIONES
Al llevar a cabo la preparacin de las soluciones necesarias para poder realizar la prueba de para la elaboracin de curva de calibracin se pudo observar que al agregar el reactivo C en todas las muestras se existe una leve tonalidad de color lila excepto en la del H2O (ver figura 1), posterior a ello las muestras se dejaron en incubacin durante un lapso de 10 minutos a temperatura ambiente. Al trmino de la incubacin no se observ cambio alguno en la coloracin de ningunas de las muestras.

Figura 1. Muestras despus de adicionar reactivo C. BIOQUMICA FARMACUTICA Pgina 6

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Teniendo ya las muestras en cada uno de los tubos de ensayo y habiendo pasado los 10 min de incubacin, se procedi a adicionar el reactivo D (reactivo de Foln) a cada uno de los tubos, como resultado de esto se observ en las muestras que tomaron un color violeta-azul y se distingua como la tonalidad era cada vez ms intensa como lo muestra la figura 2 esto conforme incrementaba la cantidad de protena de cada tubo.

Figura 2. Muestras despus de adicionar reactivo D.

CUANTIFICACIN DE PROTENAS EN MUESTRAS PROBLEMA

Experimento 1
TABLA 3. Valores de concentracin y absorbancia experimentales para las soluciones problema de albmina y leche (solucin problema 1 y 2 respectivamente)

Muestra 1 2 3 4

T% 37.1 20.7 0.9 0.5

A 0.431 0.684 2.058 2.325

Solucin Solucin problema 1 (0.2 ml) Solucin problema 1 (0.4 ml) Solucin problema 2 (0.2 ml) Solucin problema 2 (0.4 ml)

Se utilizar la ecuacin de Beer y Lambert para calcular la concentracin de las soluciones problema, tomando en cuenta que el coeficiente de extincin molar, de la Albumina de Suero Bovino (BSA) que es 43 824 M-1 cm-1 o bien usando el coeficiente dado en porcentaje que es de 6.6 para una solucin de BSA al 1% (10 mg/mL). La frmula para determinar la concentracin de la muestra.
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Ecuacin 1. Ecuacin de Beer y Lambert para calcular concentracin de soluciones problema Solucin problema 1 C0.2= C0.4= x 10 = 0.6530 mg/ml x 10 = 0.9818 mg/m

Solucin problema 2 C0.2= C0.4 = x 10 = 3.118 mg/ml x 10 = 3.5227 mg/ml

Experimento 2
TABLA 4. Valores de concentracin y absorbancia experimentales para las soluciones problema de albmina y leche (solucin problema 1 y 2 respectivamente).

Muestra 1 2 3 4

T% 8.2 2.4 0 0

A 1.088 1.624 4 4

Solucin Solucin problema 1 (0.2 ml) Solucin problema 1 (0.4 ml) Solucin problema 2 (0.2 ml) Solucin problema 2 (0.4 ml)

Solucin problema 1 Utilizando la misma ecuacin anterior para calcular las concentraciones de las soluciones problema. C0.2= x 10 = 1.6484 mg/ml

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C0.4= Solucin problema 2 C0.2= C0.4 = x 10 = 6.060 mg/ml x 10 = 6.060 mg/ml x 10 = 2.4606 mg/m

ANALISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS

La albumina es tratada con reactivo alcalino conteniendo iones cprico, fosfotungstato e iones fosfomolibdato, por lo que hace que la presencia de cadenas peptdicas tomen las muestras color de dos formas, violeta y azul, este ltimo por la presencia de grupos tirosilo y triptofanilo. (Dicho esto en conceptos bioqumicos del autor Robert W. McGilvery) La clara de huevo, que en este caso fue una de las muestras utilizadas contiene varias protenas las cuales son, ovoalbmina, con albmina, ovomucoide, lisozima. Por esta razn es til identificarlas con la reaccin de Lowry. Puesto que esta prueba como se mencion en la parte terica de este documento, sirve para la identificacin de protenas. CURVA DE CALIBRACIN Experimento 1 En la parte uno se siguieron los pasos tal como marcaba la prctica, no se realizo algn cambio en el procedimiento. De acuerdo con los resultados obtenido se puede decir que los valores de absorbancia fueron los esperados ya que a mayor concentracin de protena debe de subir la absorbancia esto porque hay ms molculas de la protena y por ende existe un rea mayor en la cual pueden chocar los rayos de luz y as medir un nmero mayor de absorbancia. Se obtuvo un coeficiente de correlacin alto, lo que nos indica que nuestros resultados son ms exactos a la linealidad pues no vara tanto en el comportamiento lineal. Experimento 1 (Duplicado)
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En esta parte los valores de absorbancia tambin fueron en aumento en relacin con una mayor concentracin, aunque estos valores fueron un poco ms pequeos que en la primera prueba, esto pudo haber sido por un error de medicin de la concentracin, aunque lo ms importante es que los resultados fueron coherentes en cuanto a la absorbancia, pero en comparacin con los resultados obtenidos en la primera parte fueron un poco ms pequeos. Se puede ver la diferencia en el coeficiente de correlacin en el experimento 1, el coeficiente fue ms cercano a 1 y esto indica mas ajuste a la linealidad. Soluciones problema Equipo 1 Es importante mencionar que los valores de absorbancia fueron coherentes, pues como se esperaba aumentaron conforme al aumento de concentracin de la solucin. Al calcular la cantidad de protena que hay en ellas se utilizo la ecuacin de Beer y Lambert para determinar la concentracin de protena se uso el coeficiente de extincin de la albmina y se obtuvo una mayor concentracin de protena en la solucin problema 2 (leche lquida), que contiene protenas como casena, albumina, globulina. Que en la solucin 1 que es clara de huevo (las protenas contenidas se mencionan al inicio de las discusiones).

Soluciones problema Equipo 2 Los valores obtenidos de concentracin en las muestras del equipo dos fueron mucho mayores debido a que usaron leche en polvo. La baja termo estabilidad de algunas protenas que son solubles, tambin el grado de desnaturalizacin de las protenas solubles es mayor ( Romero del Castillo R. 2004). Se puede entonces considerar la posibilidad que la leche lquida no presenta la misma concentracin de protenas que la leche en polvo debido a la desnaturalizacin de las protenas solubles y por esta razn la concentracin fue mayor.

CONCLUSIONES
Se logr realizar la curva de calibracin para la cuantificacin de protenas a partir de los datos obtenidos en la experimentacin mediante el mtodo de cuantificacin de protenas de Lowry y la espectrofotometra.

CUESTIONARIO
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1. Qu es la espectrofotometra? Es un mtodo que permite averiguar la concentracin de una sustancia conocida, por medicin de la intensidad de la luz (longitud de onda determinada) que es capaz de absorber. Cada sustancia tiene un espectro de absorcin caracterstico. (J. M. Macarulla - A. Marino - A. Macarulla, 1998) 2. Cmo funciona un espectrofotmetro? Funciona de tal manera que hay una fuente de luz, un foco, luego un selector de longitud de onda que, como su nombre lo indica, selecciona de la luz blanca tan slo un haz monocromtico, es decir, una determinada longitud de onda; luego, hay un sistema que concentra ese rayo monocromtico y lo lanza a travs de una celda donde se coloca un tubo con la solucin que deseamos medirle su absorbencia o transmitancia. La luz al pasar por el tubo con la solucin, es retenida, es parte por sta, y otra parte lograr pasar del otro lado donde se detecta por una fotocelda y de ah sale al registro. (Migoni, 1999) 3. Cul es el propsito de contar con una curva de calibracin para cuantificar protenas? Para cualquier mtodo colormetro es necesario realizar una curva de calibracin patrn para que nos sirva de apoyo en la determinacin de la concentracin de la protena de una o varias muestras problemas. La curva se elabora con una disolucin de protena cuya concentracin es conocida, como la albmina del huevo. 4. Cules son las ventajas y desventajas de usar un mtodo colormetro? Una de las ventajas de este mtodo es que permiten las medidas directas sobre la disolucin de la reaccin, sin necesidad de extraer partes alcuotas a distintos intervalos de tiempo, con todas las posibilidades de error que ello puede llevar consigo. Existe la posible desventaja de que la propiedad medida no est relacionada linealmente con la concentracin de alguno de los reactivos o productos. (Sykes, 1982) 5. Considera que el mtodo que se uso en el desarrollo de la prctica es el ms adecuado? Por qu? Justifique su respuesta

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Si debido a que es ms mucho ms sensible y especfica que la determinacin por absorcin en el ultravioleta a 280 nm. 6. Si tuviera la oportunidad de proponer algn mtodo para cuantificar protenas Cules son los criterios que tomara en cuenta? El mtodo conste de un reactivo que interactu directamente con un grupo R de los aminocidos, para conseguir una mejor identificacin o hacerlo para grupo de aminocidos especficos. y los reactivos a emplear, principalmente que sean fciles de conseguir y econmicos. Que para no existan sustancias que pudieran interferir en el resultado

7. Qu observo durante la realizacin de la curva de calibracin? Pudo usted utilizar la curva patrn para calcular la concentracin de protena de sus muestras problema? Explique su respuesta. Se observ que la absorbancia aumentaba cuando la concentracin de protena era mayor, esto porque haba ms rea de contacto a mayor concentracin con la luz del espectrofotmetro, y si ayudo la curva porque al ver el comportamiento y la absorbancia obtenida se podra predecir una concentracin mayor en la muestra. 8. Cul fue la concentracin de protena que obtuvo para la clara de huevo? Qu puede concluir de este resultado? 9. C0.2= x 10 = 6.060 mg/ml 10. C0.4 = x 10 = 6.060 mg/ml La concentracin fue mayor debido a que la leche en polvo contiene no contiene menos protenas que se desnaturalizan si son solubles. 11. Cul fue la concentracin de protena para la muestra problema 2?

C0.2= C0.4 =

x 10 = 3.118 mg/ml x 10 = 3.5227 mg/ml

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REFERENCIAS

J. M. Macarulla, A. Marino, A. Macarulla, - Bioqumica Cuantitativa-, Editorial Revert, S.A. (1998). Csar A. Migoni, -Fundamentos de Bioqumica descriptiva-, UABC. (1999). Peter Sykes, -Investigacin de Mecanismos de Reaccin en Qumica Orgnica-, Editorial Revert, S.A. (1982). Pilar Roca, Jordi Oliver, Ana Mara Rodrguez, -Bioqumica: Tcnicas y Mtodos-, Editorial Hlice (2003). Enrique Battaner Arias, -Biomolculas-, Ediciones Universidad Salamanca (1993). Salvador Badui Dergal, -Qumica de los Alimentos-, LONGMAN DE MXICO EDITORES, S.A DE C.V. (1993).

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