PRACTICA #6 COCOS GRAMPOSITIVOS

OBJETIVO DE LA PRACTICA Aprender a aislar e identificar los cocos grampositivos. INTRODUCCION El tracto respiratorio superior es rico en microorganismos de la flora normal, incluyendo estreptococos, estafilococos, neiserias, difteroides, levaduras y bacilos entricos Gramnegativos. Los cocos grampositivos patgenos se aislan en agar enriquecido y suplementado con sangre de carnero. Algunas especies presentan capacidad hemoltica, parcial (alfa hemlisis) o total (beta hemlisis) El gnero Staphylococcus se separa de otros cocos grampositivos por sus propiedades microscpicas, morfolgicas coloniales y bioqumicas. S. aureus es el nico coagulasa positivo y forma grandes colonias cremosas y frecuentemente con pigmentacin amarilla si se incuba a temperatura ambiente y es beta hemoltico. Es muy resistente a la accin del calor, luz, desecacin, temperaturas extremas, agentes qumicos, sobrevive semanas o meses en el polvo, pus o esputo. Es altamente tolerante a altas concentraciones de sales, sobreviviendo en alimentos preservados. En sal-manitol desarrolla colonias amarillas de 3mm y vira el indicador del pH a amarillo. Es resistente a la penicilina. A diferencia de aqul, S. epidermidis es coagulasa negativo, no-hemoltico. Antignicamente, los estreptococos presentan 13 grupos (clasificacin de Lancefield) en base al carbohidrato C de la pared celular y son denomminados de la A a la O. Los estreptococos del grupo A, tambin denominados Streptococcus pyogenes constituyen la causa mas comun de faringitis en humanos. Al crecer en medio de cultivo forman colonias de 1-2 mm, sin color, muy transparentes, beta hemolticas y son los ms virulentos. La protena M es el principal antgeno en las cepas virulentas. Son sensibles a la Bacitracina. Sobreviven semanas en esputo u otras excretas y meses en sangre o pus. Los estreptococos del grupo B incluyen a S. agalatiae y dan la prueba de CAMP positiva: una hemlisis marcada en forma de punta de flecha en el punto de unin de su crecimiento con S. aureus. Streptococcus faecalis (gpo. D) es el nico que crece en EMB. El Streptococcus pneumoniae (Diplococcus pneumoniae) es conocido como neumococo y desarrolla colonias de 1-3 mm, apigmentadas, alfa hemolticas en condiciones aerobias y beta hemolticas en anaerobiosis. Las cepas virulentas dan colonias mucoides debido a que presentan una gran cpsula, lo que constituye su factor de virulencia. Es difcil de mantener en las resiembras. Es

sensible a la Optoquina. MATERIALES Y METODOS I. Aislamiento e identificacin de cocos gram-positivos

1. Tome un exudado farngeo de un compaero con un hisopo estril en la forma tradicional y deposite la muestra en el extremo de una placa de agar sangre. Extienda el inculo con un asa por estra cruzada. Incube a 37 C por 24 hs. 2. El resto de la muestra que qued en el hisopo depostelo en un portaobjetos y haga un frotis. Tia con gram. 3. Simultneamente, Haga un Gram de cepas control de Staphylococcus aureus, Staphylococcus sp, Streptococcus pyogenes y Streptococcus pneumoniae. Observe al microscopio. 4. Siembre las cepas control en agar sangre. Incube a 37 C por 24 hs. 5. Haga una tincin de Gram con las cepas control. 6. Determine en todas las placas sembradas, cules colonias produjeron hemlisis y de qu tipo. 7. Haga un gram de las colonias del exudado. 8. Para la cepa control de S. aureus y las colonias semejantes a S. aureus o a Staphylococcus sp., desarrolladas del exudado faringeo, haga la siguientes pruebas: - Prueba de la catalasa: tome una colonia bien aislada con el asa estril y sumrjala en una gota de agua oxigenada. Observe una efervescencia por desprendimiento del O2. - Prueba de la coagulasa: Con el asa estril obtenga una colonia beta hemoltica bien aislada y mzclela con 0.5 ml de plasma. Incube a 37 C por 30 min. y lea el resultado. Si hay coagulacin del plasma, es coagulasa positivo. - Cultivo en medio sal-manitol. Tome con el asa estril una colonia bien aislada, beta hemoltica y simbrela en una placa de sal-manitol-agar por estra cruzada. Incube a 37 C durante 24 hs. Observe el desarrollo de colonias color dorado y el cambio de color del medio a amarillo. Esto, debido a la fermentacin de la lactosa y acidificacin. 9. Para S. pyogenes (estreptococos del gpo. A) y en las colonias semejantes del exudado, determine su sensibilidad a la Bacitracina. Para ello siembre una colonia bien aislada en la mitad de una placa de agar-sangre y coloque un crculo de papel filtro impregnado con Bacitracina 10. En el otro sector de la caja , coloque un crculo impregnado con Trimetroprin para determinar su resistencia. Incube a 37 C por 24 hs. Determine el dimetro del halo de inibicin alrededor de cada antibitico para determinar la sensibilidad. 11. Para la identificacin del estreptococo beta hemoltico del gpo. B (Streptococcus agalactiae), realice la prueba de CAMP, en la forma siguiente: - Tome una colonia beta hemoltica con el asa y simbrela en una sola lnea perpendicular a otra lnea previamente sembrada con S. aureus. Incube a

37C durante 24 hs. Determine si hubo hemlisis en forma de punta de flecha, en el lugar donde se unen las dos bacterias. 12. Para identificar S. pneumoniae, practique en las colonias semejantes al control positivo la prueba de la optoquina, colocando un crculo de papel impregnado con el antibitico en un medio con agar-sangre donde se sembr la bacteria. Incube a 37 C por 24 hs. Mida el halo de inhibicin para determinar la sensibilidad. 13.En todos los experimentos compare los resultados de las colonias sospechosas con los de las cepas control. II. Prueba de las estreptolisinas Esta prueba es utilizada para detectar infecciones por Streptococcus Gpo. A causante de faringitis, glomerulonefritis, fiebre reumtica, endocarditis bacteriana y fiebre escarlatina, proceso que demuestra la presencia de anticuerpos generados contra la enzima estreptolisina O, producida por la bacteria y que causa hemolisis de eritrocitos. Los anticuerpos antiestreptolisinas pueden detectarse en la sangre durante semanas o meses despus de que desaparecio la fuente primaria de la infeccion. Procedimiento: 1. Siga las instrucciones del juego de reactivos de inmunodiagnostico y reconstituya el frasco de estreptolisina. 2. Como fuente de eritrocitos use sangre humana o de conejo, recin obtenida y desfibrinada. Para lavarlos diluir la sangre 1:1 con NaCl 0.85 % . Puede utilizar 6 ml de cada uno. Centrifugar a 2000 rpm durante 5 min. Eliminar el sobrenadante y repetir la operacin de lavado con NaCl tres veces, hasta quedar el sobrenadante incoloro. 3. Eliminar el sobrenadante y resuspenda 1 ml del paquete de eritrocitos en 19 ml de la solucin amortiguadora, para quedar al 5 %. 4. Para la prueba de estreptolisinas obtenga sangre del paciente y separe el suero. 5. Diluya el suero del paciente 1: 75, colocando 7.4 ml de solucin amortiguadora para estreptolisina y 0.1 ml de suero. 6. En seis tubos de ensayo de 12 x 75 mm coloque las siguientes cantidades de solucin amortiguadora: No. del tubo 1 2 3 4 5 6 ml de sol. amortiguadora 0.0 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

7. Coloque suero diluido en los tubos, en las siguientes cantidades: Coloque 0.2 ml en el tubo #1. Coloque 0.2 ml en el tubo #2. Mezcle y pase 0.2 ml al tubo #3. Mezcle y pase 0.2 ml al Tubo #4. Mezcle y pase 0.2 ml al tubo #5. Mezcle y pase 0.2ml al tubo#6. Mezcle y descarte 0.2 ml. 8. En cada tubo adicione 0.1 ml de sol. de estreptolisina, mezcle e incube a 37 C por 15 min. 9. En cada tubo adicione 0.1 ml de suspensin de glbulos rojos al 5% y mezcle suavemente. Incube a 37 C por 15 min. Agite suavemente y vuelva a incubar a 37 C por 30 min. 10. Centrifugue a 1000-1500 r.p.m. durante 1 minuto. 11. Para la lectura de hemlisis, se toma como como el nmero de unidades de estreptolisinas, la dilucion en el ltimo tubo que no present hemlisis. No. del tubo 1 2 3 4 5 6 Unidades 75 150 300 600 1200 2400

12. Se deben utilizar controles de glbulos rojos, de estreptolisina y un suero con titulo conocido de antiestreptolisinas. - Glbulos rojos: 1.5 ml de sol. Amortiguadora + 0.5 ml de eritrocitos - Estreptolisina: 1.5 ml de sol. Amortiguadora + 0.5 ml de eritrocitos + 0.5 ml de estreptolisinas - Suero de titulo conocido: sol. Amortiguadora + suero conocido + Estreptolisina + eritrocitos, en cantidades iguales a las de la prueba. - Valores normales: el nivel es usualmente menos de 160 unidades Todd por mililitro.

RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES.