TCNICAS DE SEMEADURAS Objetivo: Desenvolver as tcnicas bsicas de semeadura de material para isolamento de germes Princpio: Uma populao microbiana,

sob condies naturais, contm muitas espcies diferentes. Os microbiologistas devem ser capazes de isolar, enumerar, e identificar os microrganismos em uma amostra, para ento classific-los e caracteriz-los. Os microrganismos na natureza normalmente existem em cultura mistas, com muitas espcies diferentes ocupando o mesmo ambiente. Ao determinar as caractersticas de um microrganismo, ele deve estar em cultura pura, ou seja, em que todas as clulas na populao so idnticas no sentido de que elas se originaram de uma mesma clula parental. Em laboratrio, os microrganismos so cultivados ou desenvolvidos em material nutriente denominado meio de cultura. O tipo de meio utilizado depende de vrios fatores : Mtodo Consideraes sobre a origem do material a ser analisado a espcie que se imagina estar presente nesta amostra as necessidades nutricionais dos organismos Material: Ala de platina, meio slido em placa (gar Mueller-Hinton, gar sangue, EMB, etc.,), tubos contendo 10ml de meio Mueller-Hinton, pipetas de 1ml, tubos com 4,5ml de salina estril, ala de Drigalsky, bico de Bunsen, swab esteril, galeria para tubos de ensaio, placas de Petri estreis, becker de 100ml com lcool, estufa a 37C, banho-maria a 100C, material biolgico (saliva, sec. nasal, sec.ouvido, sec.orofaringe, fezes, urina, etc.) MTODOS: Tcnica de Esgotamento: A mais utilizada para isolamento de germes em meio slido (gar sangue, gar EMB, etc ), onde se utiliza uma ala de platina, previamente flambada e esfriada Com a ala de platina, tocar suavemente na amostra. Passar a ala sobre o meio de cultura em movimento de zigue-zague sem sobrepor as linha e sem recarregar a ala1. Incubar as placas a 37C por 24 a 48 horas Espalhamento Pour Plate: Consiste em fazer uma prvia diluio da amostra e colocar em uma placa de Petri vazia e depois derramar o meio sobre a amostra e agitar para homogenizar a amostra diluda com o meio de cultura. Tcnica: Fazer diluio seriada da amostra, ex. 1/10, 1/100 e 1/1000. Colocar 1 ml de cada diluio em uma placa de Petri estril Fundir 10 ml de meio slido e refriar a 65C Derramar sobre a amostra na placa e aplicar movimentos suaves na placa para misturar a amostra com o meio;
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Tomar cuidado para no ferir o meio de cultura.

 Esperar o meio solidificar novamente e incubar as placas a 37C por 24 a 48 horas Espalhamento Pos Plate: Consiste em espalhar a amostra diluida ou no sobre o meio com auxilio da ala de Drigalsky, para obter colonias isoladas. Interpretao: Observar as colnias isoladas, caracterizadas pela formao de pontos isolados sobre o meio de cultura, aps a incubao. Recomendaes Para Semeadura de Material Biolgico Para execuo de uma boa semeadura, certas precaues especiais devem ser observadas pelo manipulador, com o fim de preservar a pureza do cultivo e minimizar os riscos de infeco ou intoxicao no Laboratrio: Todo processo deve ser feito em ambiente limpo e desinfectado, prximo de uma chama azul de um bico de Bunsen, ou ento dentro de uma cmara de fluxo laminar; Ala de platina utilizada para semear, deve ser flambada antes e depois da semeadura; As placas semeadas devem ser incubadas com tampa invertida para no haver transpirao do meio sobre a tampa Regular a entrada de ar do bico de Bunsen, para obter uma chama azul ( zona de esterilidade ); Os tubos ou recipientes com meios de cultura, estreis ou com material a ser inoculado, devero ser abertos ou manipulados, somente na proximidade da chama do bico de Bunsen (zona estril); As manipulaes devem ser feitas, preferencialmente, por trs da chama do bico de Bunsen. As alas ou agulhas, de platina ou nquel-cromo, devem ser flambadas imediatamente antes e depois de qualquer transferncia. Elas devem ser flambadas em todo seu comprimento, a partir de alguns centmetros do cabo de Kolle, at ao rubro, mantendoas em posio vertical chama do bico de Bunsen. Nunca iniciar a flambagem pela extremidade livre da ala ou agulha. Deixar esfriar nas proximidades da chama; Passar, ligeiramente, dentro da chama do Bico de Bunsen, imediatamente antes e depois da transferncia, pipetas graduadas estreis, pipeta Pasteur, ou ala de Drigalsky; Nunca abrir ou deixar aberto verticalmente os tubos ou frascos com culturas, inclinlos a aproximadamente em ngulo de 30; No caso de tubo com gar inclinado, este deve ficar de preferncia na horizontal. Flambar tambm a boca dos tubos ou frascos contendo culturas e meios, imediatamente antes e depois da transferncia; Nunca depositar a tampa ou tampo de algodo dos tubos ou frascos sobre a bancada ou mesa de trabalho; Descartar pipetas usadas em recipientes contendo solues detergentes ou desinfetantes; Tratar de dispor o material de trabalho em posio adequada fcil manipulao, sem riscos de acidentes ou trocas. Manter os tubos, alas e agulhas sempre na posio vertical, em suportes e estantes apropriadas; Identificar adequadamente o material de trabalho.

QUESTES PROPOSTAS 1. As condies necessrias para semeadura do material foram observadas? Qual a influencia dessas condies para a concluso dos trabalhos? 2. Os procedimentos realizados esto de acordo com o protocolo. Comente as alteraes ou adaptaes realizadas 3. Por no recomendado semear uma amostra com o prprio swab que se coletou a amostra? 4. Relacione os matrias listados neste protocolo que no foram utilizados e quais outros materiais utilizados. Ser que houve alguma falha no procedimento pela falta ou substituio do material? 5. Por que se faz necessrio diluir uma amostra liquida quando se desja quantificar uma cultura 6. Uma colnia observado fora da linha de semeadura. Que concluso se pode tirar com essa informao 7. Em que circunstncia se deve utilizar a semeadura por plate e pos-plate de uma amostra diluda? 8. Quais as dificuldades encontradas na realizao dessa prtica? 9. Os procedimentos de biossegurana foram seguidos com rigor? Quais os possveis riscos de acidente de trabalho que os alunos e o professor sofreram? Comente sobre as normas de biossegurana. 10. Elabore 10 questes a respeito da prtica ao seu professor, para melhor esclarecimento das suas dvidas