Faculdade De Cincias Administrativas E Contbeis De Itabira

Fundao Comunitria De Ensino Superior De Itabira

Colorao de Gram

Alunas: Anna Luisa Corradi Magalhes Nepomuceno Gabriela Lhorrana Ribeiro Ferreira Ivy Nayra Nascimento Gonalves Thalita Fernanda Fonseca Cunha Curso: Biomedicina Perodo: 6 Professora: Leandra Barcelos Figueiredo

Itabira Agosto 2013 1 INTRODUO A colorao de gram uma tcnica muito utilizada, pois diferencia os microrganismos atravs das cores e muito importante para a identificao das bactrias, tem esse nome para homenagear o mdico que a descobriu, Hans Cristian Joaquim Gram. Quando em meados de 1984 observou que quando utilizados diferentes corantes as bactrias coravam tambm de cores diferentes, sendo roxo e vermelho. Dessa forma, classificou as que se coravam de roxo de gram-positivas e as de vermelho de gram-negativas. Ento estudos mais aprofundados foram feitos atravs da microscopia eletrnica e foi observado que esse evento ocorria devido a diferena da estrutura e composio de cada uma dessas bactrias. Vemos, que quando observadas no microscpio as gram-positivas apresentam uma parede celular espessa e homogenia de pepitdoglicano, enquanto as gramnegativas, uma parede celular mais fina, apresentando mais de uma camada, alm de apresentarem uma elevada concentrao de lipdeos e protenas. Logo, com a microscopia eletrnica de varredura foi possvel observar outras caractersticas marcantes dessas bactrias. Essa tcnica se baseia primeiramente na colorao com cristal violeta, seguido com o tratamento de lugol (fixar o corante primrio), para descorar utilizado um composto (lcool, lcool acetonado) que nem sempre consegue cumprir o seu papel, como no caso das gram-positivas, se corando de roxo, pois retm desde o primeiro corante. J as gramnegativas se descoram com facilidade, ficando vermelhas pelas fucsina bsica. chamada ento de gram-labilidade das bactrias, essa habilidade da mudana inesperada da cor. 2 OBJETIVOS Os objetivos da prtica de colorao Gram so a aprendizagem das tcnicas de colorao de clulas microbianas para o exame microscpico, o treinamento do manuseio adequado do microscpio tico composto e a diferenciao das bactrias de acordo com a resposta de cada uma colorao Gram.

3 MATERIAIS Culturas de bactrias Gram-positivas e Gram-negativas; Lminas; Lamnulas; Pipetas de Pasteur; Ala de repicagem; Bico de Bunsen; Soluo azul de metileno; Cristal violeta; Fucsina; Lugol (soluo de iodo); lcool acetonado; gua destilada; leo de imerso; Microscpico tico composto.

4 PROCEDIMENTOS Primeiramente foi realizado o preparo do esfregao, iniciando com a limpeza da lmina com etanol, para retirar toda a gordura. Em seguida foi feita a flambagem da ala de platina e utilizando culturas de Escherichia coli e Staphylococcus aureus foram retiradas pequenas alquotas da cultura e confeccionadas as lminas, esperando a secagem completa ao ar antes de proceder a fixao. Para realizar a fixao do esfregao lmina a mesma foi passada sobre a chama do Bico de Bunsen rapidamente por trs vezes, em um ngulo aproximado de 45.

Aps a confeco da lmina foi realizada a colorao do esfregao. Para isso cobriu-se o esfregao com corante por 60 segundos, lavando em seguida a lmina em gua corrente por 2 a 3 segundos. Seguindo, cobriu-se o esfregao com soluo de lugol por 60 segundos, lavando a lmina em gua corrente por 2 a 3 segundos, removendo o excesso de gua cuidadosamente. Cobriu-se ento o esfregao com lcool acetonado por 15 a 25 segundos, lavando a lmina em gua corrente por 2 a 3 segundos imediatamente aps o tratamento com lcool, removendo o excesso de gua cuidadosamente. Por fim cobriu-se o esfregao com fucsina por 30 segundos, lavando o excesso do corante e removendo o excesso de gua cuidadosamente com papel toalha. Para a visualizao ao microscpio foi adicionada uma gota de leo de imerso sobre a superfcie do esfregao, fazendo a visualizao em objetiva de 100X. 5 RESULTADOS Aps a visualizao das lminas confeccionadas com as culturas de E. coli e S. aureus foi possvel evidenciar os seguintes aspectos:

Microrganismo E. coli S. aureus

Forma Bacilo Cocos

Arranjo Predominante Bastonetes isolados e agrupados Cocos e diplococos

Gram Negativa Positiva

Imagem ilustrativa de S. aureus.

Imagem ilustrativa representando E. coli. 6 DISCUSSO

A E. coli uma bactria Gram-negativa, que assume colorao em tons de roxo. Tm o formato de bacilos, que podem ser encontrados como bastonetes isolados ou em agrupamentos nos diversos campos da lmina. Em algumas lminas, a colorao das bactrias no obteve o resultado desejado, corando-se em tons diferentes do esperado. Esse erro pode ter sido proveniente de alguma alterao nos corantes utilizados ou em erros no momento da realizao das tcnicas de colorao, como excesso do tempo ideal para cada corante ou lavagem do excesso de corante de forma incorreta. O S. aureus uma bactria Gram-positiva, que adquire colorao em tons de rosa. Tem o formato de cocos e foi encontrada em arranjos de cocos e diplococos. Era esperado que fosse encontrado um arranjo sarcina, porm esse formato no foi visualizado na leitura da lmina. A ausncia desse formato pode ser explicada por erros que possam ter ocorrido durante a confeco da lmina, por problemas com os corantes, tempo demasiado exposio ao fogo durante a fixao, ou ainda erros ocorridos durante a colorao, como dito anteriormente, o erro na contagem do tempo ideal, ou lavagem excessiva entre os corantes. Alm desses possveis erros, em ambos os casos, pela falta de tempo, a colorao foi concluda na semana seguinte ao incio; sendo que neste tempo, as lminas ficaram armazenadas em uma estufa, sem a vigilncia dos alunos, e algum erro pode ter acontecido neste tempo e comprometido a qualidade das lminas. 6.1 Questes propostas 1. Descreva como se prepara um esfregao a partir de uma cultura bacteriana. Ao realizar um esfregao a partir de uma cultura bacteriana deve-se, primeiramente, pegar uma lmina devidamente limpa e seca e, posteriormente, flamb-la rapidamente na chama do bico de Bunsen. Aps essa etapa, deve-se identificar a lmina que ser utilizada na realizao do esfregao e pingar uma gota de soluo fisiolgica no centro da superfcie laminar. Depois se deve flambar a ala bacteriolgica (ala de platina), deixa-la esfriar prximo chama do bico de Bunsen (ou na parede da placa de Petri que

se encontra a cultura). Ainda ao redor da chama, deve-se abrir a placa contendo a cultura teste e, com a ala de platina, toca-se a colnia escolhida, coletando assim, o material biolgico para a realizao do esfregao. O material deve ser esfregado levemente na lmina com soluo fisiolgica, em movimentos circulares, com o intuito de obter um esfregao fino e uniforme, que ir propiciar uma boa visualizao de suas colnias ao final da atividade. recomendado deixar a lmina secar em um local prximo chama para evitar grandes contaminaes, e aps isso, deve-se fixar o esfregao passando a lmina, rapidamente, cerca de 5 vezes no bico de Bunsen.

2. Como se faz a fixao de um esfregao bacteriano? Com o esfregao preparado e fixado, adiciona-se lmina uma soluo de cristal violeta, que um tipo de corante roxo, por 1 minuto, e, em seguida, lava-se a lmina rapidamente com gua destilada. Depois, cobre-se a lmina com uma soluo de lugol, que um mordente, por cerca de mais 1 minuto. Tal como antes, deve-se lavar a lmina com gua destilada. Aps esse procedimento, acrescenta-se a lamina lcool acetonado ou lcool 95% por apenas 15 segundo e lava-se a lmina em seguida. Como ultimo passo, adiciona-se a fucsina de Gram, por mais 30 segundos, deve-se lavar a lmina novamente e aguard-la secar. Depois de pronta, a lmina deve ser avaliada atravs de um microscpio ptico, juntamente ao leo de imerso e focalizada pela lente objetiva de 100x. 3. Como so coradas as bactrias Gram-negativas? E as Gram-positivas? As bactrias Gram- negativas coram-se de rosa/vermelho atravs das reaes com os reagentes: Na adio do cristal-violeta, a bactria cora-se de roxo. Quando o mordente aplicado (lugol), forma-se um complexo CV-I no interior da clula, que ir permanecer violeta. O lcool acetonado ou o lcool 95% iro causar a extrao dos lipdeos da parede celular com o aumento da sua porosidade, portanto, o complexo CV-I removido da clula. Quando se adiciona a fucsina, a clula bacteriana incorpora o corante e ir apresentar uma colorao avermelhada.

As bactrias Gram- positivas, por outro lado, devido a diferenas na parece celular, ir se corar de roxo. Na adio do cristal-violeta, a bactria cora-se de roxo. Quando o mordente aplicado (lugol), forma-se um complexo CV-I no interior da clula, que ir permanecer violeta. Com a adio do lcool acetonado ou do lcool 95%, a parede celular ser desidratada e sua porosidade e permeabilidade sero diminudas. Assim, o complexo CV-I ser retido na clula, que permanece violeta. Ento, quando a fucsina adicionada, o corante no incorporado na clula bacteriana, e a mesma continua com a colorao arroxeada. 4. Descreva a estrutura da parede celular das bactrias Gram-positivas. Possui uma quantidade maior de peptideoglicano em sua parede celular, o que torna a parede dessas bactrias mais espessa e rgida do que a das bactrias Gram negativas. Composta de protenas, lipdeos, peptideoglicano e cidos teicicos (cadeias de polifosfato com resduos de ribitol e glicerol), essas bactrias so sensveis lisozima e sua parede constitui o local de ao de alguns antibiticos alm de apresentar elementos bsicos para identificao sorolgica. Devido sua composio molecular, a superfcie da clula carregada negativamente. 5. No processo de esfregao bacteriano, qual o melhor lcool a ser utilizado no procedimento? Hoje se preconiza o uso do lcool etlico (99,5). Este mais seguro do que o lcool acetona, que requeria grande habilidade do operador para que no ocorresse a hiperdescolorao. Alm do que, no permitia uma boa reprodutibilidade da tcnica.

7 CONCLUSO Ao final da realizao da confeco, colorao e visualizao das lminas, pode-se concluir que de extrema importncia que todas as tcnicas sejam realizadas corretamente, utilizando-se na colorao reagentes nas concentraes adequadas e dentro do prazo de

validade, para evitar que ocorram erros provenientes da precipitao de algum dos componentes, impedindo a visualizao correta das bactrias. Sabe-se que a determinao correta da caracterstica da bactria de grande relevncia no diagnstico geral de alguma doena e mais ainda, de seu tratamento. importante ressaltar que antibiticos frmacos utilizados para combate de infeces bacterianas so medicamentos que podem causar um desequilbrio corpreo entre a flora normal residente no organismo e o prprio organismo, levando a uma piora do quadro do paciente e mais ainda, a chamada resistncia de bactrias a certo medicamentos, portanto a colorao Gram to importante quanto o tratamento correto deve ser feito. 8 BIBLIOGRAFIA TORTORA, G. J., FUNKE, B. R. e CASE, C. L., Microbiologia, 8 edio, Editora Artmed, Porto Alegre, 2005. KONEMAN, Elmer; ALLEN, Stephen; SCHRECKENBERGER, Paul. Diagnstico Microbiolgico - Texto e Atlas Colorido. 6 ed, Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 2008. Info Escola. (s.d.). Acesso em 30 de Agosto de 2013, disponvel em http://www.infoescola.com/bioquimica/coloracao-de-gram/ Portal So Francisco. (s.d.). Acesso em 30 de Agosto de 2013, disponvel em http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/coloracao-de-gram/coloracao-de-gram.php