ACETALDEHDO

PROCEDIMIENTO DE ENSAYO
K-ACHYD 11/05 (50 Ensayos por Kit)

Este folleto se puede conseguir en www.megazyme.com en los siguientes idiomas: Ingls-Francs-Alemn-Italiano-Portugus

Megazyme International Ireland Limited 2005

INTRODUCCIN: El acetaldehdo se genera en muchos procesos metablicos y por tanto se produce en todos los organismos vivos1. Cuando los procesos de fermentacin desempean una funcin en la produccin de alimentos y bebidas, la concentracin de acetaldehdo aumenta de forma considerable. Se ha encontrado acetaldehdo en el vino, en concentraciones de hasta 100 mg/L y en la cerveza hasta 20 mg/L. El acetaldehdo en la sangre humana se origina del etanol que se ha ingerido en comidas y bebidas. El consumo excesivo de etanol puede provocar un envenenamiento por acetaldehdo despus de una oxidacin del etanol en el hgado por el alcohol deshidrogenasa. PRINCIPIO: El acetaldehdo se oxida cuantitativamente en cido actico en presencia de aldehdo deshidrogenasa (Al-DH) y nicotinamida-adenina dinucleotido (NAD ) (1). (Al-DH) (1) Acetaldehdo + NAD + H2O
+ +

cido actico + NADH + H

La cantidad de NADH que se forma en esta reaccin es estequiomtrica con la cantidad de acetaldehdo. Lo que se mide es el NADH, por el aumento de la capacidad de absorcin a 340 nm. ESPECIFICIDAD, SENSIBILIDAD, LINEALIDAD Y PRECISIN: Al-DH acta sobre otros aldehdos distintos al acetaldehdo pero a un porcentaje reducido. En las condiciones del ensayo descritas, el acetaldehdo y el propionaldehdo se convierten cuantitativamente en glicoaldehdo si el tiempo de reaccin es superior ~ 20 min. La presencia de benzaldehdo y gliceraldehdo puede dar como resultado reacciones de fluencia lenta dependientes de la muestra, que pueden justificar la extrapolacin al momento en que se aadi Al-DH. El diferencial de absorcin menor del ensayo es de 0,005 unidades. Esto corresponde a 0,044 mg/L de solucin de muestra a un volumen mximo de muestra de 2 mL. El lmite de deteccin es de 0,176 mg/L, que se deriva de un diferencial de absorcin de 0,020 con un volumen mximo de muestra de 2 mL. El ensayo es lineal a lo largo del intervalo de 0,5 a 20 g de acetaldehdo por ensayo. En determinaciones dobles utilizando una solucin de muestra, se puede producir una diferencia de absorcin de 0,005 a 0.010. Con un volumen de muestra de 2 mL, esto corresponde a una concentracin de acetaldehdo de aproximadamente entre 0,044 y 0,088 mg/L de solucin de muestra. Si la muestra se diluye durante su preparacin, el resultado se multiplica por el factor de dilucin, F. Si

en la preparacin de la muestra, la muestra se pesa, por ejemplo, 10 g/L, cabe esperar una diferencia entre 0,02 a 0,05 g/100 g. INTERFERENCIA: Los compuestos en extractos animales no interfieren en el ensayo. Sin embargo, los polifenlicos de los materiales de las plantas pueden reducir la velocidad de la reaccin. Los alcoholes interfieren en el ensayo solo cuando estn presentes en muy altas concentraciones. La reduccin de sustancias tales como el cido ascrbico y el anhdrido sulfuroso, no afectan al ensayo. Si la conversin del acetaldehdo se ha completado en el tiempo especificado en el ensayo (aprox. 3-4 minutos min), en general se puede concluir que no se ha producido ninguna interferencia. Sin embargo, se puede hacer otra comprobacin aadiendo acetaldehdo (aprox. 5 g en 0,1 mL) en la cubeta, cuando se complete la reaccin. Se debera observar un aumento significativo de la absorcin. Las sustancias que interfieren en la muestra analizadas se pueden identificar incluyendo un estndar interno. Cabe esperar una recuperacin cuantitativa de este estndar. Las prdidas en la manipulacin y extraccin de la muestra se pueden identificar realizando experimentos de recuperacin, es decir, aadiendo glicerol a la muestra en las fases iniciales de la extraccin. SEGURIDAD: En general, los reagentes utilizados en la determinacin del acetaldehdo no son materiales peligrosos segn el Reglamento de Sustancias Peligrosas. Sin embargo, el concentrado tampn contiene azida de sodio 0,02 % (w/v) como conservante. Es necesario observar todas las medidas generales de seguridad que se aplican a todas las sustancias qumicas. Las muestras que contienen altas concentraciones de acetaldehdo se deben manipular en una campana con buena ventilacin. El trimero del aldehdo actico de amoniaco que se entrega como material de control es un irritante de la piel e inflamable [Merck Index 10 Edicin (1983) pgina 30]. Cuando manipule materiales slidos, pngase guantes de seguridad y gafas de proteccin y evite cualquier contacto con la piel. En caso de contacto con la piel, lvese bien con agua.

KITS: Megazyme dispone de kits idneos para realizar 50 determinaciones. Los kits contienen el mtodo completo de ensayo adems de: Botella 1: Tampn de pirofosfato de potasio (12 mL, 1,5 M, pH 9,0) ms azida de sodio 0,02 % (w/v) como conservante. Estable durante > 2 aos a 4C. NAD (138 mg). Estable durante > 5 aos a -20C. Suspensin de aldehdo deshidrogenasa (1,1 mL, 15 U/mL). Estable durante > 2 aos a -20C. Polvo de control de acetaldehdo. Trmero de acetaldehdo de amoniaco (~ 2 g). Estable en un contenedor bien sellado (segn se suministra) druante > 2 aos a 4C.
+

Botella 2: Botella 3: Botella 4:

PREPARACIN DE SOLUCIONES/SUSPENSIONES DE REAGENTES: 1. Use el contenido de la botella 1 segn se suministra. Estable durante > 2 aos a 4C. Disuelva el contenido de la botella 2 en 11,0 mL de agua destilada. Divdala en partes alcuotas del tamao adecuado y gurdelas en tubos de polipropileno a -20C entre uso y uso y mantgalos frescos durante su uso. Una vez disuelto, el reagente es estable durante > 2 aos a -20C. Use el contenido de la botella 3 segn se suministra. Antes de abrir por primera vez, agite la botella para eliminar cualquier enzima que se haya quedado en el tapn de goma. A continuacin, guarde las botellas en posicin vertical. Agite la botella para que se mezcle su contenido antes de utilizarlo. Estable durante > 2 aos a -20C. Disuelva aproximadamente 80 mg de trmero de acetaldehdo de amoniaco (que corresponde aproximadamente a 50 mg de acetaldehdo) en 1 L de agua destilada. Gurdelo en una botella Duran bien sellada y utilcelo en el da de la preparacin (vase nota de seguridad en la pgina 2).

2.

3.

4.

NOTA: La solucin estndar de acetaldehdo solo se utiliza en el ensayo cuando existe alguna duda sobre la precisin del espectrofotmetro que se est utilizando o cuando se sospecha que las sustancias que intervienen en la muestra estn produciendo una inhibicin. La concentracin de glicerol se determina directamente a partir del coeficiente de extincin de NADH (vase pgina 6).
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EQUIPO (RECOMENDADO): 1. 2. 3. 4. Matraces (50 mL y 100 mL). Cubetas de plstico desechables (paso de luz de 1 cm, 3,0 mL). Micropipetas, p. ej. Gilson Pipetman (20 L, 100 L y 200 L). Pipeta de desplazamiento positivo p.ej. Eppendorf Multipette

- con 5 mL de Combitip (para administrar partes alcuotas de 0,2 mL de tampn de pirofosfato y solucin NAD+). - con 25 mL de Combitip (para administrar partes alcuotas de 2 mL de agua destilada). Balanza de precisin. Espectrofotmetro a 340 nm. Agitador vibrador de tubos Vortex (p.ej. Agitarod de tubos de prueba IKA Yellowline TTS2). Cronmetro. Papel filtro Whatman No. 1 (9 cm).

5. 6. 7. 8. 9.

PROCEDIMIENTO: 340 nm Paso de luz de 1 cm (vidrio o plstico) NOTA: Es esencial tapar las cubetas Temperatura: ~ 25C Volumen final: 2,52 mL Solucin de muestra: 0,5-20 g de acetaldehdo por cubeta (en 0,10-2,00 mL de volumen de muestra) Medir contra corriente de aire (sin cubeta en el paso de luz) o contra agua Longitud de onda: Cubeta: Pipeta en cubetas agua destilada (~ 25C) solucin de muestra solucin 1 (tampn de pirofosfato) solucin 2 (NAD+) Muestra sin tratar 2,10 mL 0,20 mL 0,20 mL Muestra 2,00 mL 0,10 mL 0,20 mL 0,20 mL

Mezcle*, lea la absorcin de las soluciones (A1) transcurridos aproximadamente 2 min e inicie las reacciones aadiendo: suspensin 3 (Al-DH) 0,02 mL 0,02 mL Mezcle*, lea las absorciones de las soluciones (A2) al final de la reaccin (aprox. 3-4 min). Si la reaccin no se ha detenido transcurridos 5 min, contine leyendo las absorciones a intervalos de 2 min hasta que no cambien durante 2 min**. * por ejemplo con una esptula de plstico o dndole la vuelta con cuidado despus de tapar la cubeta con tapa o Parafilm . ** si este porcentaje de fluencia lenta es superior con muestra que sin muestra, extrapole las absorciones al momento en que ha aadido la suspensin 3 (utilizando Mega-CalcTM). CALCULO: Calcule las diferencias de absorcin (A2-A1) con muestra y muestra sin tratar. Reste la diferencia de absorcin de la muestra sin tratar de la diferencia de absorcin de la muestra, obteniendo con ello Aaceltaldehdo. El valor de Aacetaldehdo por regla general deber ser de al menos 0,100 unidades de absorcin para conseguir resultados suficientemente precisos.

La concentracin de adetaldehdo se puede calcular de la siguiente forma: c = V x MW x d x v Donde: V = MW = = = d = v = x Aacetaldehdo [g/L]

volumen final [mL] peso molecular de acetaldehdo [g/mol] coeficiente de extincin de NADH a 340 nm 6300 [l x mol-1 x cm-1] paso de luz [cm] volumen de muestra [mL]

Sigue para el acetaldehdo: c = 2,52 x 44,05 6300 x 1,0 x 0,10 0,1762 x Aacetaldehdo x Aacetaldehdo [g/L]

[g/L]

Si la muestra se ha diluido durante la preparacin, el resultado se debe multiplicar por el factor de dilucin, F. Cuando se analicen muestras slidas o semi-slidas que se pesan para preparar la muestra, el contenido (g/100 g) se calcula a partir de la cantidad pesada de la siguiente forma: Contenido de acetaldehdo = cacetaldehdo [g/L solucin de muestra] pesomuestra [g/L solucin de muestra] x 100 [g/100 g]

NOTA: Estos clculos se pueden simplificar utilizando la aplicacin Mega-CalcTM de Megazyme, que se puede descargar desde la pgina web donde aparece el producto (www.megazyme.com).

PREPARACIN DE LA MUESTRA: 1. Dilucin de la muestra. La cantidad de acetaldehdo presente en la cubeta (es decir, en los 0,1 mL de muestra que se est analizando) deber situarse entre 0,5 y 20 g. La solucin de muestra por tanto se debe diluir lo suficiente como para conseguir una concentracin de acetaldehdo entre 0,005 y 0,20 g/L. Tabla De la Dilusin Concentracin estimada de cido actico (g/L) < 0,20 0,20-2,00 2,00-20,00 20,0-200 > 200

Dilucin con agua No es necesaria dilucin 1 + 9 1 + 99 1 + 999 1 + 9999

Factor de dilucin (F) 1 10 100 1000 10000

Si el valor de Aacetaldehdo es demasiado bajo (p.ej. < 0,100), pese ms muestra o diluya con menos fuerza. Como alternativa, la muestra que se debe verter en la cubeta se puede aumentar a 2 mL, asegurndose de que los componentes de la muestra y el agua destilada en la reaccin sumen 2,10 mL, utilizando el nuevo volumen de muestra en la ecuacin. 2. Manipulacin de la muestra. (a) El acetaldehdo es extremadamente voltil (punto de ebullicin ~ 20C), por lo que todas las muestras y controles del ensayo se deben guardar en contenedores bien tapados. (b) Las soluciones que contengan acetaldehdo deberan administrar con el tampn o soluciones acuosas, para reducir al mnimo la prdida por evaporacin. (c) El acetaldehdo se oxida rpidamente por el oxgeno de la atmsfera. En consecuencia, es fundamental analizar las muestras tan pronto sea posible despus de la preparacin. Las soluciones de control se deben utilizar el da de la preparacin. (d) El material de ensayo que se debe utilizar es el trmero de acetaldehdo de amoniaco, ya que es menos voltil y no se oxida o polimeriza tan pronto.

3. Clarificacin de la muestra. a. Soluciones: Solucin Carrez. Disuelva 3,60 g de hexacianoferrato de potasio (II) {K4[Fe(CN)6].3H2O} (Sigma cat. no. P-9387) en 100 mL de agua destilada. Gurdelo a temperatura ambiente. Solucin Carrez II. Disuelva 7,20 g de sulfato de cinc (ZnSO4.7H2O) (Sigma cat. no. Z-4750) en 100 mL de agua destilada. Gurdelo a temperatura ambiente. Hidrxido sdico (NaOH, 100 mM). Disuelva 4 g de NaOH en 1 L de agua destilada. Gurdelo a temperatura ambiente. b. Procedimiento: Vierta la muestra lquida en un matraz aforado de 100 mL que contenga aproximadamente 60 mL de agua destilada, o pese suficiente cantidad de muestra en un matraz de 100 mL y aada 60 mL de agua destilada. Aada con cuidado 5 mL de solucin Carrez I, 5 mL de solucin Carrez II y 10 mL de solucin de NaOH (100 mM). Mezcle cada vez que aada un componente. Llene el matraz aforado hasta la marca, mezcle y filtre. 4. Consideraciones generales. (a) Muestras lquidas: muestras claras, ligeramente coloreadas y aproximadamente neutras se pueden utilizar directamente en el ensayo. (b) Muestras cidas: Si se va a analizar ms de 0,1 mL de muestra cida sin diluir (como vino tinto o zumo de fruta con color), el pH de la solucin se debe aumentar a 9,0 aproximadamente, utilizando 2 M NaOH, y la solucin incubada a temperatura ambiente durante 30 min. (c) Dixido de carbono: las muestras que contengan dixido de carbono se deben desgasificar aumentando el pH a 9,0 aproximadamente con 2 M NaOH y agitando suavemente o removindolo con una varilla de vidrio. (d) Muestras coloreadas: es posible que haya que realizar una muestra adicional en vaco, es decir, una muestra sin Al-DH, en caso de muestras coloreadas. (e) Muestras muy coloreadas: Si se utilizan sin diluir, las muestras muy coloreadas se deben tratar aadiendo 1 g/100 mL de carbn activado. Agite durante 2 minutos y a continuacin filtre. (f) Muestras slidas: homogeneizar o triturar muestras slidas en agua destilada y filtrar si fuera necesario.

(g) Muestras que contengan grasas: extraiga dichas muestras con agua caliente a una temperatura por encima del punto en que se derrite la grasa, por ejemplo, en un matraz de 100 mL. Ajuste a temperatura ambiente y llene el matraz hasta la marca con agua. Gurdelo en hielo o en un frigorfico durante 15-30 min y a continuacin fltrelo. Tire los primeros mL de lo que filtre, y utilice el sobrenadante claro (que puede estar ligeramente opalescente) para el ensayo. Otra alternativa es clarificar con reagentes Carrez. (h) Muestras que contengan protena: desproteinice las muestras con protenas con reagentes Carrez. EJEMPLOS PARA PREPARAR LAS MUESTRAS: (a) Determinacin del acetaldehdo en el vino blanco. Ajuste el pH del vino blanco a aproximadamente 9,0 con 2 M NaOH y utilcelo inmediatamente para el ensayo (0,10-0,50 mL). Si el vino blanco contiene sulfito, entonces se mide el aldehdo total, es decir, la suma de los acetaldehdos libres y asociados al sulfito. Normalmente, no se requiere dilucin y un volumen de muestra de 0,2 mL es adecuado. (b) Determinacin del acetaldehdo en el vino tinto. Si fuera necesario, decolore el vino tinto antes de utilizarlo en el ensayo. Esto se consigue de la siguiente forma: en una botella sellada de Duran mezcle 25 mL de vino tinto con 0,5 g de PVPP, agtelo durante aproximadamente 5 minutos y filtre despus una parte alcuota de la solucin en papel Whatman No. 1. chelo en una botella Duran y tpelo de forma inmediata. Utilice la solucin sin color que ha filtrado en el ensayo. Normalmente, no se requiere dilucin y un volumen de muestra de 0,2 mL es adecuado. (c) Determinacin del acetaldehdo en la cerveza y el champn. Desgasifique las muestras que contienen dixido de carbono aumentando el pH a 9,0 aproximadamente con 2 M NaOH y removiendo suavemente en una botella sellada Duran. Normalmente, no se requiere dilucin y un volumen de muestra de 0,2 mL es adecuado. (d) Determinacin del acetaldehdo en el zumo de fruta, concentrados y bebidas similares. La concentracin de acetaldehdo en soluciones claras y neutrales en general se puede determinar sin tratar la muestra (salvo mediante dilucin, segn la tabla de dilucin y ajustando el pH a 9,0 aproximadamente). Los lquidos turbios en general solo hay que filtrarlos antes de la fase de dilucin. Las soluciones coloreadas en general se pueden utilizar para el anlisis despus de diluirlas en una concentracin adecuada de acetaldehdo. Sin embargo, si las soluciones coloreadas requieren un anlisis sin diluir, se pueden decolorar de la siguiente forma: en una botella sellada
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de Duran mezcle 25 mL de vino tinto con 0,5 g de PVPP, agtelo durante aproximadamente 5 minutos y filtre despus una parte alcuota de la solucin en papel Whatman No. 1. Normalmente, no se requiere dilucin y un volumen de muestra de 0,2 mL es adecuado. (e) Determinacin del acetaldehdo en productos vegetales. Homogeinice los productos vegetales con una batidora. Pese la muestra homogeneizada en un matraz y aada 60 mL de agua destilada y agite con fuera el matraz cerrado para extraer el acetaldehdo. Rellene el matraz hasta la marca y clarifique una parte alcuota filtrndola a travs de un filtro de fibra de vidrio Whatman GF/A. chelo en una botella Duran y tpelo de forma inmediata. Clarifique con reagentes Carrez si fuera necesario. Diluya, si fuera necesario, y utilice un volumen de muestra de 0,10-0,50 mL. Normalmente, no se requiere dilucin y un volumen de muestra de 0,2 mL es adecuado. (f) Determinacin del acetaldehdo en licores como el brandy. No es necesario tratar previamente el brandy. Normalmente una disolucin de 1:2 y un volumen de muestra de 0,2 mL es adecuado. REFERENCIA: 1. Beutler, O. H. (1988). Acetaldehyde In Methods of Enzymatic Analysis. (Bergmeyer, H. U. ed.) 3rd ed. Vol VI pp 601-613 VCH Publishers (UK) Ltd., Cambridge, UK.

NOTAS:

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