Pesquisa

SEXAGEM DE EMBRIES BOVINOS

Atualidades sobre a aplicao da tcnica de Sexagem aliada ao PCR (Polymerase Chain Reaction), desde o campo at a comercializao de embries sexados.
Fotografias e ilustraes cedidas pelos autores

sexagem de embries por anlise de DNA, agregada produo in vitro, constituem ferramentas importantes que permitem intensificar e acelerar o melhoramento gentico de animais de alto valor zootcnico. Atravs destas tecnologias o criador pode escolher o sexo desejado ainda na fase embrionria,

estudadas h mais de 25 anos e a reao em cadeia da polimerase (PCR) reproduz artificialmente a forma como o DNA replicado na natureza (HASLER et al, 2002). Apresentada comunidade cientfica em 1984, a PCR foi adotada como uma ferramenta de pesquisa essencial dado potencialidade de utilizao na rea de biologia molecular (OLIVEIRA; HENKES, 2002). A sexagem de Embries Bovinos pela tcnica de PCR (do ingls Polymerase Chain Reaction) uma biotecnologia relacionada transferncia de embries (REICHENBACH et al., 2001), que contribui diretamente na otimizao da eficincia reprodutiva para a melhora da performance produtiva e da lucratividade dos rebanhos bovinos (SCARCELLI et al, 2004). COLHEITA DE OCITOS O primeiro passo a colheita in vitro de ocitos, geralmente efetuada por puno folicular, utilizando agulha acoplada a uma seringa ou bomba a vcuo, guiada por ultrasonografia transvaginal (GONALVES et al., 2002), este mtodo de colheita por ser no-cirrgico tem mostrado praticidade na utilizao repetida da mesma doadora (HAFEZ, 1995). A puno folicular transvaginal contribui para reduzir o intervalo entre geraes, para acelerar o melhoramento gentico, bem como pode ser repetida em vrias oportunidades num mesmo animal sem prejuzo de sua capacidade reprodutiva

Figura 1: Colheita de ocitos Fonte: Gonalves, 2001

PAOLA GOMES PASSAGLIA BILOGA CENTRO DE ENSINO SUPERIOR DE UBERABA paolapassaglia@hotmail.com ANTONIO HAMILTON CHAVES DOUTOR EM ZOOTECNIA PROFESSOR DO CENTRO FEDERAL DE EDUCAO TECNOLGICA DE UBERABA ahchaves@terra.com.br

diminuindo custos com receptoras, tratamentos hormonais para sincronizao, manejo e locao de espao na propriedade. O Brasil tem se destacado como um dos pases que mais aplica comercialmente e em larga escala as diversas biotecnologias utilizadas na reproduo animal. As tcnicas para a determinao do sexo em embries bovinos tm sido

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ocito e melhora o posterior desenvolvimento embrionrio. Alm do meio, outros fatores relacionados com o ambiente de cultivo celular devem ser considerados como fundamentais. Geralmente, a maturao de ocitos bovino realizada a 37,8oC por 24 horas em atmosfera de 5% de CO2 em ar e umidade saturada (GONALVES; 2002). FECUNDAO IN VITRO A FIV tambm uma tcnica fundamental para o uso de todas as novas biotcnicas da reproduo animal, pois atravs dela possvel produzir embries pr-sexados e embries ou zigotos em vrios estgios de desenvolvimento, para os estudos de transgnese e clonagem. Recentemente, tambm tem sido sugerido o uso da FIV para avaliar o potencial reprodutivo de touros, avaliando com mais preciso a fertilidade de um reprodutor (DODE, 2000). As tcnicas mais utilizadas para separao de espermatozides vivos dos demais componentes do smen e dos crioprotetores so o swim up, o gradiente de percoll e o lavado espermtico. A tcnica ideal para separao espermtica deve ser rpida, simples, de baixo custo, capaz de recuperar a maioria dos espermatozides mveis, no resultar em alteraes espermticas, remover espermatozides mortos e outras clulas, incluindo mi-

Figura 2: ocito maturado Fonte: Folheto de divulgao do Congresso Brasileiro de Reproduo Animal, 2006

(PIETERSE et al., 1991). Com o desenvolvimento de tcnicas de reproduo assistida em animais, ocorreu um grande avano na otimizao e multiplicao de fmeas de interesse para a produo animal. A aspirao de ovcitos imaturos por puno folicular, associada maturao e fecundao in vitro dos mesmos, e ao cultivo in vitro dos embries, permite que sejam produzidas, em mdia, 36 crias/ano de uma nica fmea. (RUMPF, 2006). MATURAO IN VITRO A maturao dos ocitos (Figura 2), envolve as transformaes nuclear e citoplasmtica, e est ligada a uma srie de mudanas estruturais e bioqumicas que tornam o gameta feminino apto a ser fecundado e ter desenvolvimento embrionrio subseqente.. O ocito presente no folculo primordial, uma vez ativado, deve crescer e sofrer vrias modificaes de ordem ultra-estrutural, citoplasmtica e bioqumica com a finalidade de se tornar competente para reiniciar e completar

a maturao (GONALVES et al, 2002). Tambm usual a utilizao do LH, ou do hormnio folculo estimulante (FSH) ou ainda a combinao dessas gonadotrofinas. A maioria dos resultados publicados demonstra que a adio de gonadotrofinas ao meio de maturao de ocitos bovinos, aumenta a capacidade de fecundao do

Figura 3: Clulas (em estgio de clivagem) de embries bovinos cultivados .in vitro. Foto de divulgao do curso de Fecundao in vitro da Universidade Federal de Pelotas, 2006

Figura 4: Sistema de micromanipulao composto por microscpio invertido, 2 microseringas para a aspirao e 2 micromanipuladores mecnicos (GARCIA; UVO, 2002)

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crorganismos, remover substncias txicas e bioativas, permitir o processamento de grandes volumes de smen, alm de permitir o controle da concentrao e volume final da suspenso espermtica (GONALVES et al., 2002). A composio qumica dos meios para o cultivo in vitro de embries foi determinada pela avaliao de suas necessidades metablicas. A maioria dos meios consiste de solues salinas acrescidas de um componente macromolecular, podendo ser preparadas em laboratrios prprios, ou adquiridas comercialmente (MATTOS et al, 1991). CULTIVO O cultivo de clulas in vitro (Figura 3) requer o uso de substncias com propriedades especiais como, presena de protenas, propriedades sulfarctantes e ausncia de toxinas, para um bom desenvolvimento celular (SOLANO & PILAR, 1984). A composio qumica dos meios para o cultivo in vitro de embries foi determinada pela avaliao de suas necessidades metablicas. A maioria dos meios consiste de solues salinas acrescidas de um componente macromolecular, podendo ser preparadas em laboratrios prprios, ou adquiridas comercialmente (MATTOS et al, 1991). MICROASPIRAO DO DNA (BIPSIA) Para realizar a bipsia de embries utiliza-se um micromanipulador Leitz (Figura 4). Uma placa acoplada e montada em um dos lados do micromanipulador. Antes da biopsia, os embries so individualmente lavados atravs de trs microgotas (100 l) de protenalivre PBS em uma placa de petri de 100 mm2 . Os embries so aderidos ao fundo da placa de petri e so visualizados a uma amplificao de 100 vezes e alinhados ao centro. Uma pequena poro ideal de 6 a 10 clulas do blastocisto removida pelo movimento direto da lmina (Figura 5), geralmente na borda do embrio. Depois que cada embrio biopsiado, a lmina descartada.
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Figura 5: Etapas do processo de micromanipulao para a retirada de bipsia embrionria por aspirao (GARCIA; UVO, 2002)

Para facilitar a liberao dos embries biopsiados do fundo da placa de petri, adicionado a cada microgota contendo embrio biopsiados, 50l de Sur-

factant Fluramic a 0,4% ou 50l de lcool polivinil a 1% (HASLER et al, 2002). Segundo Ardais et al (2005); os embries geralmente so biopsia-

Figura 6. Diagrama ilustrando as diferentes etapas durante a amplificao de DNA utilizando a tcnica de PCR (OLIVEIRA; HENKES, 2002)

Figura 7: Ilustrao de resultado da PCR em bipsia de embries bovinos com eletroforese em gel de agarose corado com Brometo de Etdio (ALONSO, 2006)

Embries analisados como machos Embries presumveis fmeas Total de embries biopsiados

N de Embries Testados 79 31 110

ResultadosConfirmadosPor US ou Nascimento 74 25 99

Taxa de Acerto 93.7% 80.5% 90.0%

Tabela 1: Resultados gerais de sexagem por PCR obtidos entre abril de 1999 e maro de 2001, para embries j transferidos e com resultado de sexagem por ultra-sonografia (GARCIA e UVO, 2002).Nos ltimos anos, o Brasil apresentou uma demanda crescente do uso desta tecnologia em animais de gentica superior, utilizando a aspirao, a amplificao da regio repetitiva Y especfica do cromossomo, seguida da eletroforese, protocolos estes recentemente mais utilizados comercialmente (GARCIA e UVO, 2002)

dos no 6 dia de cultivo, mediante microaspirao utilizando um micromanipulador mecnico. POLIMERASE CHAIN REACTION (PCR) Esta tcnica utilizada para amplificar e detectar DNA especfico do cromossomo Y (Fig. 6), presente somente nas clulas dos embries do sexo masculino. As clulas biopsiadas so submetidas lise com proteinase K, segundo Luz et al (2000); Almodim et al (2005) e Ardais (2005). O DNA sintetizado em um ciclo inicial e passa a ser o molde para a sntese posterior de DNA dos ciclos subseqentes. Aps aproximadamente 30 ciclos de sntese os produtos de PCR devero incluir, alm do DNA original, aproximadamente 105 cpias da seqncia alvo. A reao envolve ci-

clos seqenciais completos compreendendo trs etapas bsicas: desnaturao, anelamento e sntese do DNA (OLIVEIRA e HENKES, 2002) e extenso dos .primers. (PEREIRA, 1996). a) Desnaturao: Compreende a dissociao das ligaes que mantm unida a dupla fita de DNA. Isso obtido tipicamente pela utilizao de temperaturas entre 93-95C; b) Anelamento: Ligao das seqncias iniciadoras com a seqncia alvo. Esse passo normalmente utiliza temperaturas entre 50 e 70C dependendo da Tm ou temperatura de dissociao (do ingls temperature of milting) calculada. Temperaturas de anelamento mais elevadas aumentam a especificidade da reao. c) Sntese do DNA: A partir dos iniciadores j ligados seqncia alvo, comea a sntese de uma nova seqncia complementar. As temperaturas

que conferem maior eficincia nessa etapa esto entre 70-75C (OLIVEIRA e HENKES, 2002). d) Extenso dos primers: Esta etapa feita a 72C, que a temperatura tima para a enzima Taq DNA polimerase, que durante esta fase utiliza-se dos nucleotdeos includos entre os reagentes para a reao de PCR e completa a fita sintetizada, de acordo com a fita original, a partir dos .primers. . Ao final desta etapa, repetem-se novamente os ciclos por aproximadamente 30 vezes, o que faz com que a seqncia alvo seja amplificada 1 bilho de vezes (PEREIRA, 1996). Segundo Oliveira e Henkes (2002), Essa quantidade de material pode ser facilmente visualizada como bandas de tamanho especfico quando submetida

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eletroforese em gel de agarose (Figura 7). Ardais (2005), Almodim (2005) e Alonso (2006), ressaltam que, duas bandas representam machos, podendo ser visualizados os cromossomos X e Y, e nas fmeas apenas a visualizao do cromossomo X. A separao de molculas de cidos nuclicos em laboratrios de biologia molecular realizada com o auxlio da tcnica de eletroforese em gel de agarose. Os gis de agarose so, geralmente, corados com solues de brometo de etdio (EtBr), uma substncia intercalante de alta toxicidade e mutagenicidade, que revela os cidos nuclicos ao fluorescer sob luz ultravioleta (AZEVEDO et al., 2003). O USO COMERCIAL DA SEXAGEM DE EMBRIES Todos os setores da indstria do gado derivam do benefcio econmico da habilidade de determinar o sexo de embries antes que a prenhez esteja estabelecida. Os benefcios maximizados pela sexagem de embries durante a transferncia rotineira e superovulao das doadoras, esto sendo realizados agora em uma variedade de aplicaes comerciais. Os embries sexados podem ser congelados com sucesso, contudo realando a utilidade comercial do procedimento da biopsia como uma ferramenta rotineira da produo (HEER; REED, 1991). A atual situao econmica da pecuria mundial exige dos produtores mxima eficincia para garantia de retorno econmico. Desta forma, elevados ndices de produo, associados alta eficincia reprodutiva devem se constituir em metas para tcnicos e os criadores alcanares melhor produtividade e satisfatrio retorno econmico (SCARCELLI et al, 2004). Segundo Bredbacka; Kankaanp; Peippo (1995) e Shea (1999) a sexagem de embries bovinos baseada na metodologia
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de PCR tm se tornado mais comum para fins comerciais, onde se observa uma eficincia (proporo de amostras diagnosticadas) de 90-95% e acurcia de 93-98%, conforme dados coletados por Garcia e Uvo (2002) publicado no jornal o Embrio, da Sociedade Brasileira de Tecnologia de Embries (Tabela 1). Nos ltimos anos, o Brasil apresentou uma demanda crescente do uso desta tecnologia em animais de gentica superior, utilizando a aspirao, a amplificao da regio repetitiva Y especfica do cromossomo, seguida da eletroforese, protocolos estes recentemente mais utilizados comercialmente (GARCIA e UVO, 2002). CONSIDERAES FINAIS A sexagem de embries bovinos pela tcnica de PCR uma biotcnica, bastante utilizada atualmente; todavia, complexa que requer equipamentos, experincia e habilidade profissional para a sua execuo, alm disso, uma tcnica que indicada somente para a produo de crias geneticamente privilegiadas e com alto valor de Mercado. No Brasil, a sexagem j tem relevncia comercial, visto que vrios profissionais e empresas de biotecnologia da reproduo oferecem servios para a realizao da sexagem de embries a nvel comercial. A estreita relao da sexagem e transferncia de embries com a produo animal tm alterado o comrcio tradicional de reprodutores, elevando substancialmente o valor das fmeas geneticamente superiores. BIBLIOGRAFIA 1. ALMODIN, C. G. A bovine protocol for training professionals in preimplantation genetic diagnosis using polimerase chain reaction. Fertility and Sterility, V.84, no 4, p. 895 . 900, 2005. 2. ALONSO, R.V.; WEPPERT, M.; GARCIA, J.F.; REICHENBACH, H.D. Effect of biopsy by peizo-micromanipulation on development capacity of in vitro produced bovine morulae and blastocysts. Acta Scientiae Veterinari-

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