METODOS DE ESTUDIO Y DIAGNOSTICO VIRAL

I. INTRODUCCION Los mtodos utilizados para reconocer las infecciones por virus humanos pueden clasificarse en DIRECTOS e INDIRECTOS, segn persigan demostrar la presencia del virus o de alguno de sus constituyentes (antgeno o genoma viral) o bien la respuesta de anticuerpos especficos por parte del husped en el curso de la infeccin. Gran parte de las tcnicas utilizadas en el diagnstico clnico se basan en pruebas serolgicas que identifican anticuerpos especficos frente a diversas protenas antignicas. Sin embargo, existen circunstancias en las cuales son necesarias pruebas que detecten precozmente la infeccin viral (tratamientos especficos, medidas profilcticas, etc.). En algunas infecciones virales es posible detectar la presencia de antgenos virales previamente al desarrollo de la seroconversin, siendo esta prueba la nica evidencia de la exposicin al virus cuando no existe aumento de los niveles de anticuerpos circulantes (pacientes inmunodeprimidos). Igualmente la deteccin del genoma viral puede favorecer la precocidad del diagnstico viral y su confirmacin. En la ltima dcada se han desarrollado una serie de tcnicas para el diagnstico viral basadas en la deteccin de cidos nucleicos. De ellas la Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es la ms utilizada. En el momento actual, la tendencia en el diagnstico virolgico consiste en emplear nuevas y ms sensibles tecnologas de deteccin de antgenos y de investigacin de cidos nucleicos con el propsito de lograr un diagnstico viral ms rpido. El desarrollo de quimioterapia antiviral efectiva es responsable de esta tendencia que hace de la identificacin rpida, sensible y especfica de los virus, una necesidad. PRINCIPALES TCNICAS METODOS DIRECTOS Son aquellos que detectan: 1. El virus como agente infeccioso (aislamiento viral). 2. La presencia de antgenos virales (tcnicas inmunolgicas): Inmunofluorescencia (IF), Enzimoinmunoanlisis (EIA), Test de Aglutinacin. 3.La presencia de cidos nucleicos virales (PCR, etc.). 4.El virus como partcula viral (microscopa electrnica). 1. Aislamiento Viral - Cultivos Celulares La base del diagnstico viral es la deteccin del virus o de sus componentes. El aislamiento del virus era la tcnica standard de oro sobre la cual se medan todas las otras pruebas de diagnstico viral, pero hoy en da con el desarrollo de las nuevas tcnicas de Biologa Molecular ya no es la ms sensible. De igual forma el aislamiento de virus tiene una sensibilidad y una especificidad muy alta. Debido a que slo se amplifica el virus, se aumenta la sensibilidad sin disminuir la especificidad. Sin embargo, existen algunas desventajas en el aislamiento del virus: El proceso suele ser lento, ya que demanda das a semanas para la identificacin, y en consecuencia puede no estar disponible a tiempo para influir en la atencin del paciente. Adems, es un proceso laborioso y caro. Por otra parte requiere el uso de sistemas de cultivos adecuados, por ejemplo, se necesitan varias lneas celulares para la deteccin ptima de virus. Los cultivos celulares son, pues, los biosubstratos ms corrientemente empleados para la propagacin de los virus. Un cultivo celular es obtenido, de explantes de rganos o de embriones de animales. Estas clulas obtenidas aspticamente se disocian tratndolas con una enzima (tripsina) que rompe el cemento intercelular. La suspencin de celulas libres as obtenidas se coloca en la superficie plana de un recipiente de vidrio o plstico en donde las clulas se adhieren y multiplican formando una fina capa de clulas que se llama MONOCAPA CELULAR. Esta monocapa de clulas crece en un medio de cultivo complejo que contiene albmina, vitaminas, sales, glucosa, etc., en un sistema buffer. Se previene la contaminacin bacteriana adicionndole al medio antibiticos adecuados.

Los cultivos celulares en monocapa son los ms usados, aunque hay otros sistemas (cultivos en suspensin, explantos, cultivos de rganos, cultivos en microcarriers, etc.). Los cultivos celulares se dividen en: Cultivos Primarios: Se obtienen a partir de clulas, tejidos u rganos tomados directamente del organismo y pueden subcultivarse una o dos veces. Lneas Celulares Diploides: Son aquellas que crecen en pasajes sucesivos hasta aproximadamente 50 subcultivos y que conservan por lo menos en un 75% el cariotipo correspondiente a la especie de que provienen. Lneas Celulares Continuas: Permite un nmero finito de subcultivos y son heteroploides. Para considerar que se ha logrado establecer una lnea continua, esta debe de haber sido subcultivada por lo menos 70 veces. Las lneas celulares continuas ofrecen las siguientes ventajas: Disponibilidad para todos los investigadores de stocks de clulas idnticas, ya sea congeladas en ampollas o en monocapa de botella de cultivos, con la posibilidad de reconstituirlas cuando sea necesario. Facilidad relativa del pasaje y mantenimiento en todos los laboratorios. Libre de contaminacin con agentes extraos. Los distintos cultivos celulares varan en cuanto a su susceptibilidad a los diferentes virus, ya que existe una relacin especfica husped-virus, y es en funcin de los datos clnicos y del tipo de muestra que se elige el cultivo para inocular el material. Luego de inoculado el cultivo celular, se incuba a 35-37 C por un perodo de hasta 14 das promedio, esperando la aparicin de efecto citoptico, toxicidad o degeneracin celular, observando el cultivo al microscopio a las 24, 48, 72hs y luego 2 veces por semana. Se usan cultivos celulares no inoculados para control y comparacin con cualquier cambio morfolgico observado en los cultivos inoculados. El efecto citoptico es la visualizacin de cambios morfolgicos ms o menos caractersticos en las clulas inoculadas producidas por la accin del virus sobre el cultivo celular. Cuando los virus no producen efecto citoptico, se puede recurrir a tcnicas que ponen en evidencia la presencia de aquel en el cultivo. Las ms usadas son: hemadsorcin, hemaglutinacin y tinciones con anticuerpos monoclonales. (Ver 2) Hemadsorcin: Hay virus que durante su multiplicacin intracelular, expresan en la membrana de la clula husped elementos estructurales virales llamados hemaglutininas, glicoprotenas capaces de unirse a receptores especficos en la membrana de glbulos rojos de diferentes especies animales. De modo que si se agregan glbulos rojos a un cultivo inoculado, se puede poner en evidencia la infeccin de esas clulas a travs de la unin de los glbulos rojos a la superficie celular. Hemaglutinacin: Las hemaglutininas pueden ponerse en evidencia en el sobrenadante de los cultivos utilizando el mismo fundamento que para la hemadsorcin. 2. Deteccin de Antgenos - Tcnicas Inmunolgicas Las siguientes tcnicas inmunolgicas pueden utilizarse tanto para la deteccin de antgenos (mtodos directos), como de anticuerpos (mtodos indirectos). En el caso de deteccin de antgenos, se utiliza un anticuerpo especfico antiviral (por lo general IgG) a cuya fraccin Fc se ha conjugado una molcula marcada, que puede ser isotiocianato de fluorescena (Inmunofluorecencia), un istopo radioactivo 125I o 131I (RIA), o una enzima: peroxidasa, fosfatasa alcalina, o biotina-avidina (EIA), para objetivar la reaccin. Para el procedimiento indirecto (deteccin de anticuerpos), se emplea un anti-anticuerpo marcado y la reaccin se realiza sobre un cultivo celular infectado por el virus en estudio. INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (ID) Es una de las tcnicas ms antiguas y de uso ms difundido en el laboratorio clnico. El principio bsico de la inmunofluorescencia directa . Muestras clnicas apropiadas son recolectadas y colocadas sobre portaobjetos donde se dejan secar y fijar. Luego se agregan anticuerpos especificos marcados con isotiocianato de fluorescena que difunden a travs de la membrana celular y se combinan con los antgenos vricos en el interior de las clulas. La reaccin antgeno anticuerpo se visualiza con el microscopio de fluorescencia, por la aparicin de fluorescencia de color verde manzana. Esta tcnica se puede utilizar para una identificacin rpida del virus directamente sobre la muestra (por ejemplo: clulas eluidas de un lavado nasal, o de un hisopado nasofarngeo), o se la puede emplear para la confirmacin del efecto citoptico observado en cultivos celulares. Sin embargo la realizacin de la reaccin es laboriosa, depende mucho de la calidad de los reactivos, requiere un microscopio de fluorescencia y de una persona con experiencia para llegar a un diagnstico certero, as como una recoleccin y preparacin de la muestra adecuada.

Aun as, el mtodo, en manos de una persona con experiencia resulta til para la identificacin rpida de ciertos virus como los virus respiratorios, ya que nos proporciona un diagnstico etiolgico en el curso de una jornada de trabajo. Adems puede estudiar varias muestras simultneamente. El advenimiento de los anticuerpos monoclonales, ha incrementado la especificidad y en algunos casos la sensibilidad de estos ensayos. Esta tcnica requiere slo 2-4hs, y se ha reportado una sensibilidad del 70-80 % comparada con cultivos celulares para la identificacin de virus Herpes Simple, 80-95% para VRS y 71% para Influenza A. La tincin con inmunoperoxidasa es similar a la de la inmunofluorescencia y es la tcnica de eleccin en algunos laboratorios. El procedimiento implica unos pocos pasos adicionales ya que en este caso el anticuerpo monoclonal esta marcado con una enzima que requiere la adicin de un substrato para evidenciar la reaccin por un cambio de color que es visible micro y macroscpicamente. TEST DE AGLUTINACION El test de aglutinacin es un mtodo simple, de un solo paso, que a veces se usa para la deteccin de antgenos virales en muestras clnicas. Los ensayos de aglutinacin, dependen de la fijacin inicial de anticuerpos antivirales especficos sobre eritrocitos o partculas de ltex. Luego este reactivo se incuba con la muestra clnica en la cual se investiga el antgeno y las partculas se aglutinan si el antgeno adecuado se encuentra presente. Estas pruebas en general se complementan o se confirman por medio de otros ensayos debido al elevado porcentaje de reacciones inespecficas. El test de aglutinacin ha sido usado para detectar antgeno de Rotavirus en heces (el ms importante) mostrando una buena sensibilidad cuando se lo compara con el EIA para Rotavirus. Adems es una tcnica rpida y barata. Tambin se la ha usado para detectar antgenos de Adenovirus. RADIOINMUNOENSAYO (RIA) Fue originalmente aplicado para identificar el antgeno de superficie de la Hepatitis B (HBsAg) y el anticuerpo anti-HBsAg. Estos ensayos tienen una buena sensibilidad y especificidad, pero la aparicin de un mtodo como el ensayo inmunoenzimtico (EIA) con su mayor tiempo de conservacin de los reactivos, su costo relativamente ms bajo y la ausencia de residuos radioactivos, ha reemplazado las tcnicas de RIA en la mayor parte de los casos de deteccin de antgeno viral. ENZIMOINMUNOANALISIS (EIA) Los EIA para la deteccin de antgeno se basan habitualmente en la captura del antgeno por anticuerpos especficos unidos a una fase slida, en general el pocillo de una microplaca o una pequea esfera de plstico. El antgeno viral presente en la muestra clnica se combina con el anticuerpo fijado a la fase slida y el antgeno viral se detecta mediante la adicin de otro anticuerpo especfico conjugado a una enzima. La enzima conjugada suele ser peroxidasa o fosfatasa alcalina. El substrato para esas enzimas vara. En la reaccin con la peroxidasa el substrato es un perxido capaz de oxidar un compuesto qumico incoloro que en su forma oxidada tiene un color caracterstico. En el caso de la fosfatasa la desfosforilizacin es la responsable directa de la aparicin del color. Por esta tcnica se puede procesar gran nmero de muestras en forma rpida y automatizada, no requiriendo de un observador experimentado para leer los resultados, ya que estos se leen por medio de espectrofotmetros especialmente diseados, siendo entonces una tcnica ms objetiva. Fig. 2. 3. Tcnicas de Biologa Molecular Investigacin de cidos nucleicos virales Las tcnicas de estudio y diagnstico que a continuacin se presentan, constituyen una herramienta ingeniosa desarrolladas a partir de los estudios de la Biologa Molecular. SONDAS DE ACIDOS NUCLEICOS Actualmente es posible extraer secuencias especficas de un fragmento de ADN por medio de las endonucleasas de restriccin. Luego estas secuencias extradas, se pueden desnaturalizar y marcar ya sea con una enzima o con un istopo radioactivo. A estas cadenas marcadas y que tienen una secuencia conocida se llaman sondas de cidos nucleicos. Hoy en da se estn produciendo sondas de cidos nucleicos sintticas, con lo que se obtiene sondas de oligonucletidos de muy alta especificidad que estn disponibles comercialmente y son las ms usadas en los laboratorios. DETERMINACION DE ACIDOS NUCLEICOS VIRALES POR SONDA SINTETICA Es un ensayo de hibridacin molecular con una sonda marcada. Las hibridaciones pueden ser: DNA-DNA, RNA-RNA y RNA-DNA.

Primero se trata a muestras con reactivos que solubilizan y desnaturalizan los cidos nucleicos. Posteriormente se aade un DNA marcado, complementario del DNA del virus y se incuba en condiciones para que se produzca la hibridacin. La muestra se pasa entonces por una columna que contiene un gel que separa la sonda ligada al DNA viral hibridado de la no hibridada. Dependiendo de como este marcada la sonda, se detecta la hibridacin: Si est marcada con un istopo radiactivo se puede hacer una lectura en un contador gamma de manera que la cantidad de radiacin medida en la columna es directamente proporcional a la cantidad de DNA viral presente en el suero problema o tambin se puede realizar la electroforesis del DNA hibridado con la sonda marcada en gel de poliacrilamida y detectar la radioactividad emitida por la sonda mediante la aplicacin de una placa de rayos X (Autoradiografa). Si esta marcada con una enzima se detecta por una simple evaluacin colorimtrica. AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS VIRALES MEDIANTE UNA REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Una nueva tcnica, llamada Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR), fue desarrollada por Saiki et al., para incrementar el nmero de molculas de DNA blanco en las muestras. Tiene una sensibilidad tan alta que puede amplificar una nica molcula de DNA y una sola copia de genes puede ser extrada, de mezclas complejas de secuencias genmicas y visualizada como bandas diferentes en geles de agarosa. La PCR es, por tanto, una amplificacin de secuencias especficas del DNA. Se basa en la utilizacin de secuencias cortas de nucletidos sintticos llamados primers o cebadores, que se hibridan de forma especifica con cada una de las cadenas de DNA , previamente desnaturalizadas, llamadas moldes o templados. Para que la reaccin tenga lugar se usa una enzima, Taq pol (ADN Polimerasa termoestable obtenida de la bacteria Thermus aquaticus) y deoxinucletidos trifosfatos. La funcin natural de la DNA polimerasa consiste en reparar y replicar el DNA. Los deoxinucletidos trifosfatos se necesitan como ladrillos para la construccin. El nucletido al cual se una la polimerasa ser complementario de la base en la posicin correspondiente de la cadena templado. Se sintetiza as una cadena simple de DNA, complementaria y alineada a cada "primer ". Se realiza una serie repetida de ciclos cada uno compuesto por 3 pasos bsicos: a. Desnaturalizacin del ADN doble cadena por la elevada temperatura (95C). b. Acoplamiento de los primers, desciende la temperatura (entre 55C-72C). c. Elongacin del primers, aqu se eleva la temperatura a 72C permitiendo la incorporacin de los deoxinucletidos. Mientras tanto se van deplecionando los primers y los deoxinucletidos, y se van sintetizando nuevas cadenas de DNA. Al final se consiguen miles de copias de DNA del fragmento de DNA limitado por los "primers ". Los fragmentos de DNA as obtenidos se pueden identificar por varias tcnicas: visualizacin en geles de agarosa o poliacrilamida mediante tincin con bromuro de etidio y examen con luz ultravioleta, o hibridacin con una sonda marcada. La combinacin de la PCR y las sondas de cidos nucleicos marcadas promete ser el mtodo ms sensible para la deteccin e identificacin de los virus. 4. Microscopa Electrnica Mediante el microscopio electrnico es posible observar la morfologa de los viriones presentes en muestras clnicas. La limitacin del mtodo adems del costo del microscopio, es que necesita de una alta concentracin de viriones (aproximadamente 109 partculas virales/ml, dependiendo del virus) presentes en la muestra, por ello es poco sensible. Esto hace que sea una tcnica poco utilizada, ms an con el desarrollo de tcnicas alternativas de utilidad similar. Si la concentracin de virus en la muestra clnica es baja, y por tanto no visible directamente por microscopio electrnico, se pueden utilizar tcnicas que aumenten la visualizacin, por ejemplo, la inmunoelectromicroscopa, que consiste en el agregado de anticuerpos especficos antivirales y la formacin de agregados de partculas que son ms fcilmente visibles que las partculas solas. Fig. 5. METODOS INDIRECTOS Son aquellos que reconocen la respuesta inmune (humoral o celular) por parte del husped: . Deteccin de anticuerpos especficos antivirales por tcnicas inmunolgicas (EIA, IFI, WB, etc.). Produccin de anticuerpos in vitro. En el curso de una infeccin varan las poblaciones de anticuerpos frente al agente infectante. En una primera fase la clase predominante suele ser IgM, mientras que con el transcurso del tiempo las IgM disminuyen hasta desaparecer o quedar a baja concentracin residual y, en cambio, aumentan las IgG. La bsqueda de anticuerpos clase IgM es de utilidad para hacer diagnstico de infeccin reciente en una sola muestra de suero extrada en el perodo agudo de la enfermedad. Este mtodo se emplea para el diagnstico de enfermedades como: Rubola, Citomegalovirus, Hepatitis a virus A, etc. La bsqueda de anticuerpos clase IgG en una sola muestra se utiliza como tcnica de tamizaje, por ejemplo, para el diagnstico de la infeccin por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Posteriormente los hallazgos positivos son confirmados en la misma muestra de suero por otra metodologa.

La seroconversin es el aumento del ttulo de anticuerpos cuatro veces o ms observado en dos muestras pareadas de suero. La primera muestra se obtendr en el perodo agudo de la enfermedad y la segunda, 15 a 21 das despus de la primera, en el perodo de convalesencia. La seroconversin es til para establecer el diagnstico retrospectivo, pero no para el diagnstico temprano de una infeccin, puesto que debemos esperar al perodo de convalecencia para obtener la segunda muestra del suero. Este tipo de diagnstico es til para estudios epidemiolgicos. Las diferencias de ttulos deben ser mayores de cuatro veces para tener valor estadstico y se debera estudiar ambas muestras simultneamente. Las determinaciones serolgicas tambin nos pueden informar sobre el estado inmune del paciente frente a muchas infecciones virales, como paperas, sarampin y rubola, donde la presencia de anticuerpos especficos indica que el individuo ha estado expuesto previamente al virus y que es inmune para una nueva infeccin. A veces el diagnstico serolgico tiene dificultades, por ejemplo: cuando se realiza en recin nacidos para identificar la causa de una infeccin congnita. La evaluacin de los resultados en este caso es difcil porque los ensayos serolgicos detectan ante todo IgG, y mucha de la IgG presente en el suero del nio provino de la madre por va transplacentaria y no es posible diferenciar la IgG del nio de la IgG de la madre. Tradicionalmente, el diagnstico de las enfermedades virales congnitas se realiza mediante determinaciones seriadas de IgG en el suero. El descenso del titulo de anticuerpos indica que los anticuerpos eran maternos y que el nio no est infectado. El aumento en el ttulo de anticuerpos indica que el nio esta produciendo anticuerpos y por lo tanto esta infectado. Sin embargo, hoy en da el diagnstico serolgico viral se ha simplificado con las nuevas tcnicas que detectan IgM, ya que la deteccin de IgM especfica en el suero del nio confirma que el nio est infectado, porque la IgM no atraviesa la placenta y por tanto no puede ser de origen materno. A continuacin, se describirn los mtodos serolgicos ms comnmente usados en el diagnstico viral. Los mtodos tradicionales para el diagnstico serolgico de las infecciones virales incluyen: la neutralizacin, la inhibicin de la hemaglutinacin (IHA) y la hemaglutinacin indirecta (HAI). La confirmacin serolgica de una infeccin aguda por cualquiera de estas tcnicas tradicionales esta dada por un aumento de cuatro veces o mayor en el titulo de anticuerpos cuando se emplean diluciones al doble seriadas. En los ltimos aos se han desarrollado nuevos mtodos para la deteccin de anticuerpos virales, y en muchos casos han demostrado ser mejores que las pruebas tradicionales en trminos de economa, sensibilidad, especificidad y rapidez. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI) La IFI, es un mtodo rpido y confiable para la determinacin de anticuerpos antivirales en el suero del paciente. Se basa en la unin de anticuerpos antivirales presentes en el suero del paciente a los antgenos virales expresados en la superficie y citoplasma de clulas infectadas, que han sido fijadas a un portaobjeto de vidrio. Como control de especificidad se usan clulas no infectadas. El procedimiento es el que sigue: Se incuba el suero del paciente con las clulas infectadas y no infectadas. Luego se realiza un lavado con PBS y se agrega posteriormente anticuerpo anti IgG humana conjugada con isotiocianato de fluorescena. El isotiocianato de fluorescena es una sustancia que se vuelve fluorescente a la exposicin de la luz ultravioleta y emite una luz verde caracterstica. El conjugado se unir a los anticuerpos del paciente si la reaccin es positiva, leyndose la prueba en un microscopio de fluorescencia. La presencia de Ac se evidencia por la aparicin de fluorescencia en el citoplasma y superficie de las clulas infectadas, mientras que las clulas control no fluorescen. ENZIMOINMUNOANALISIS INDIRECTO (EIA) Los EIA indirectos se han aplicado de forma amplia en los ltimos aos al diagnstico de anticuerpos virales. Tiene las ventajas de ser un mtodo verstil, relativamente econmico, sensible y de lectura objetiva (instrumental). La metodologa es la siguiente: Los antgenos virales se inmovilizan sobre una fase slida (esferita, policubetas para microtitulacin u otros elementos de plstico) y se agregan los sueros en estudio; se incuban, se lavan y se revela la reaccin Ag-Ac por el agregado de una inmunoglobulina antiespecie conjugada con una enzima, seguida por el substrato apropiado para esta. Los resultados se pueden leer con un espectrofotmetro y en algunos casos de forma visual. TEST DE AGLUTINACION

El fundamento y el procedimiento de esta tcnica ya fue descripto para el estudio de Ag viral (mtodo directo). Ahora lo que buscamos es detectar anticuerpos antivirales, por eso se usan partculas de ltex recubiertas con Ag viral. Fig. 8. WESTERN BLOT (WB) Las tcnicas inmunolgicas de Inmunoblot estn encontrando amplias aplicaciones en el diagnstico virolgico. Son particularmente tiles para el diagnstico del HIV. La tcnica de WB se basa en la separacin electrofortica de protenas virales que son posteriormente inmovilizadas en papel de nitrocelulosa con el objeto de determinar la presencia de anticuerpos especficos contra cada una de esas protenas. Esta tcnica se realiza esquemticamente en 3 pasos: 1. Se produce en cultivos celulares grandes cantidades de virus que luego son tratados qumicamente para su disgregacin e inactivacin. Los antgenos resultantes del lisado viral se separan por electroforesis en gel de Poliacrilamida. 2. Se realiza una transferencia (blotting o electrotransferencia) de los Ag separados a membranas de nitrocelulosa. 3. Se coloca el suero del paciente sobre la membrana de nitrocelulosa. Posteriormente se aaden anticuerpos antiinmunoglobulina humana unida a una enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina) y, por ltimo, se agrega el substrato enzimtico para la visualizacin de las bandas reactivas con un producto final coloreado. La tcnica es muy similar a un EIA, menos sensible pero ms especfica que esta. En la prctica slo el 3er paso es el que se realiza en los laboratorios de diagnstico, ya que los equipos comerciales proveen de las tirillas con los antgenos. (Esto facilita la estandarizacin de las determinaciones). PRODUCCION DE ANTICUERPOS IN VITRO Se trata de una tcnica nueva que ha sido aplicada para el diagnstico de la infeccin perinatal. Este procedimiento revela la presencia de anticuerpos antivirales producidos in vitro a partir de los linfocitos B extrados de sangre total, lo que indicara que el sistema inmune del paciente ha sido estimulado por el virus. La produccin de Ac antivirales in vitro promete ser de gran valor en el diagnstico temprano de nios infectados por VIH.