5.

Purificacin de ADN plsmido Cuando un bilogo molecular piensa en la produccin de ADN plasmidial "a gran escala", el rango de 10-100 mg de ADN por lo general viene a la mente. Sin embargo, en un producto farmacutico

figura 7. Etapas de purificacin de plsmido de ADN a gran escala. Cada paso importante est aqu, junto con las opciones (izquierda) y los problemas de escala hacia arriba (derecha) para cada tecnologa aplicable.

La produccin a gran escala, los requisitos de plsmidos de ADN pueden superar 50 g por lote. En casos extremos, se necesitarn muchos kilogramos de ADN plsmido por ao para cubrir la demanda finalizacin de las vacunas de ADN actualmente en ensayos clnicos. La siguiente seccin es para ser considerado en conjunto con varios comentarios publicados recientemente [110-112]. A continuacin, destacamos especialmente el potencial de problemas de escala-up frente a las tecnologas de purificacin de ADN plsmido existentes practicidad y publica cultivo, la purificacin de ADN plsmidial en la gran escala (> 10 g) por lo general implica los pasos que se

indican en el diagrama que se muestra en la figura. 7. El orden de los pasos es a menudo la siguiente manera: la recogida de clulas, lisis celular, la eliminacin de restos celulares, la afinidad de la precipitacin, adsorcin e intercambio de tampn / concentracin. En un primer momento, y para comprender mejor los peligros de gran escala de purificacin de ADN plasmidial, es pertinente considerar las dificultades asociado a la ampliacin directa de algunos procedimientos comunes de laboratorio. Histricamente, purificacin de ADN plasmdial se lleva a cabo a travs del uso de bromuro de cesio (CsCl / EtBr) boyante separacin por gradiente de densidad de cloruro / bromuro [113114]. Este mtodo permite la separacin de ADN de plsmidial por densidad de flotacin en bandas de diferentes formas (por ejemplo, superenrollado, circular abierta y lineal, multmeros) purificada cuando el CsCl / EtBr / se mezcla de ADN de plasmido se somete a ultracentrifugacin. La banda de ADN plasmidial covalentemente cerrado se retira entonces de la botella ultracentrfuga (s) y de piel-Ther se extrae y se precipita en el alcohol para eliminar tanto de CsCl y EtBr. Mientras se produce altamente purificado el plsmido, este enfoque no es escalable debido a problemas de seguridad del personal y las consideraciones de residuos peligrosos asociados con el uso de cloruro de cesio y bromuro de etidio. Adems, el uso de ultracentrifugacin es tambin un obstculo importante para la ampliacin de esta tecnologa. Sin embargo, este procedimiento todava se considera el punto de referencia contra el cual pureza se evalan todas las otras tcnicas de purificacin de ADN plsmidial. Mtodos de purificacin actuales a escala de banco emplean kits comercializados por empresas comerciales que se aprovechan de varias de las tcnicas crticas a continuacin, incluyendo lisis alcalina y el uso de columnas de cromatografa de desechables. Sin embargo, estas condiciones de purificacin no se prestan ellos mismos a escala hasta porque pueden emplear sustancias qumicas peligrosas, tales como fenol y cloroformo, requieren el uso de grandes cantidades de resina cromatogrfica por miligramo de plsmido purificado, o necesitar el uso de relativamente gas- Sive enzimas para degradar los contaminantes (por ejemplo, RNasa y proteasa K). Por ltimo, el uso de soluciones diluidas bastante conducira a equipos de proceso extremadamente grande en la > 50 g plsmido escala de produccin de ADN y se traducira en una considerable inversin de capital. Debido a su simplicidad, estos mtodos de purificacin son, sin embargo el mtodo de eleccin para la purificacin de pequeas cantidades de ADN de plsmido (<20 mg) y se utilizan ampliamente en la investigacin Laboratorios. Para una ms detallada discusin de purificacin de ADN plsmiddial a pequea escala, Sambrook y Russell [114] ofrecen una extensa revisin y puesta al da de esta tecnologa. A partir de la cosecha de clulas, las siguientes secciones siguen la progresin se muestra en la figura. 7 y detalles de cada etapa en la purificacin de ADN plasmdico a gran escala tpica. Adems, comn cuestiones de escala hasta se resumen.

5.1. Cosecha clula

Al completar el cultivo de clulas, casi todos los pasos de lisis de clulas se requiere el uso de una suspensin concentrada de clulas producido a travs de una microfiltracin [115] o centrifugacin continua [116]. Adems de proporcionar una suspensin concentrada de clulas, este paso elimina la mayora del caldo de fermentacin agotada, lo cual puede interferir con la lisis aguas abajo ms comn y / o pasos de purificacin. Cuestiones de escala-up incluyen potencial ensuciamiento de la membrana y la limpieza de centrfugas continas. 5.2. La lisis celular

Tcnicas de lisis de clulas bacterianas ms actuales (homogeneizacin, congelacin / descongelacin, extraccin con detergente a base, etc) se han optimizado para la purificacin de protenas recombinantes y la mayora no son aplicables a la purificacin de ADN plsmido. Dado que la produccin de ADN plsmido a gran escala est en su infancia, se utilizan actualmente slo un puado de tcnicas de lisis. Por el momento, la tcnica ms comn utilizado en la produccin de ADN plsmido es la de lisis alcalina [117]. Este procedimiento se basa en el uso de hidrxido de sodio y el sulfato de sodio detergente dode-cil (SDS) cuyos efectos combinados dan como resultado la disrupcin de la membrana celular, que conduce a la lisis y la liberacin de los componentes intracelulares. Subsiguiente neutralizacin con acetato de sodio precipita protenas y ADN genmico. Tras la neutralizacin, se hibrida superenrollado de ADN plsmido a partir de su estado de pH desnaturalizado mientras que el peso molecular grande (~ 200 kb) de ADN genmico no se puede difundir y recocido adecuadamente, lo que resulta en una sola hebra de ADN genmico precipitacin. Adems, a pH alto, el ARN se degrada, lo que beneficia posteriores etapas de separacin. Sin embargo, esta lisis es bastante delicado como ADN plas-mid puede degradarse a pH alto si los altos con-diciones de corte se producen durante este procedimiento [118]. Dado que el ADN no se desnaturalizan durante este lisis, algunos de los ADN superenrollado se convierte a formas alternativas (por ejemplo, superenrollado desnaturalizado, multimrica crculo, abierta, y lineal). Adems, la lisis alcalina puede provocar la fragmentacin del ADN genmico, que puede hacer ms difcil la eliminacin abajo. Otro mtodo de lisis utilizado en la produccin de ADN plasmedial es el de la lisis celular de ebullicin introducido por primera vez por Holmes y Quigley [119]. Este mtodo de lisis utiliza una digestin lisozima para romper el peptidoglicano de la pared celular (a travs de la hidrlisis de enlaces glicosdicos) seguido de calentamiento hasta el punto de que las membranas se disocian, que conduce a la liberacin de ADN plasmdico a partir de su localizacin citoslica. Adems, ADNasas indeseables son inactivadas y las protenas se desnaturalizan y se precipitaron durante este paso de calentamiento. Cuestiones de escala-para arriba con la lisis de calor incluyen el diseo y la limpieza de intercambiadores de calor. En el ejemplo de ampliacin principal de esta tcnica LY-sis utiliza un intercambiador de calor continuo con un rpido calentamiento y

enfriamiento [120]. Esta lisis se ha llevado a cabo a la escala mltiple-gramo y es altamente escalable. Adems, lisozima sola puede ser utilizado para lisar las clulas en presencia de un detergente (por ejemplo, Triton X-100) [114]. Sin embargo, cabe sealar que la lisozima es tradicionalmente producida a partir de los blancos de huevo de gallina y no es un material en bruto deseable en la produccin de cGMP de plsmido de ADN debido al riesgo de contaminacin de este material aviar derivado. Una alternativa a la lisozima de huevo de gallina, aunque un poco ms costosa, ha sido el uso de una lisozima recombinante, purificada a partir de E. coli [121122]. Desafos Escalaup incluyen minimizar el uso de lisozima costo relativamente alto, sin embargo, el LY-sis es muy simple y se puede hacer en un tanque de proceso individual con muy altas recuperaciones de ADN plsmido. Una ventaja importante de una lisis lisozima basada, al lado de simplicidad, es que la degradacin de producto no es un problema (por ejemplo, formacin de desnaturalizada super enrollado, crculo abierto y plsmido lineal). Una importante desventaja de la lisozima comn frente a lisis alcalina procedimiento es que la lisis lisozima libera contenido celular y no ayuda en la purificacin. El uso de lisis mecnica es un nuevo desarrollo en el campo de la separacin de cidos nucleicos. Un problema comn, y una ventaja de la lisis mecnica de purificacin de protenas, que es de alta cizalladura degradan los cidos nucleicos [123]. Se ha demostrado que un nmero relativamente bajo cizallamiento inducido por un molino de perlas puede liberar el ADN plasmdico a partir de E. coli mientras que lo mantiene hasta el 90% intacta [124]. Actualmente, el nico trabajo publicado utilizando lisis mecnica en la purificacin de ADN plsmido es a una escala relativamente pequea, sin embargo, la lisis mecnica se utiliza en la fabricacin de protenas a gran escala y el equipo es fcilmente disponible. 5.3. Afinidad precipitacin de ADN plsmido

La mayora de los procesos de produccin a gran escala utilizan una precipitacin afinidad aguas arriba de ADN plsmido. Alcoholes, a saber, etanol e isopropanol, son bien conocidos agentes de precipitacin de ADN. Adems, polietilenglicol [125], detergentes catinicos, por ejemplo, CTAB, [122,126], ciertas sales tales como LiCl y CaCl2 [127], poliaminas tales como espermidina [128], y polietileno imina [129], se utilizan para eliminar la mayora de los contaminantes en una preparacin a gran escala sin tener que recurrir a las costosas separaciones cromatogrficas. Un ejemplo prctico de la afinidad de la precipitacin es el uso de CTAB. Cuando se emplea esta tecnologa, los rendimientos de ADN plasmdico son normalmente mayor que 90% y este procedimiento de precipitacin se ha utilizado en la escala de gramo mltiple por Lander et al. [122]. Un ejemplo adicional de la precipitacin de afinidad, en la prctica es el uso de poliaminas, especficamente espermidina. Una vez ms los rendimientos son comnmente mayor que 90% y Murphy et al. [128] han aplicado esta estrategia de purificacin a escala de gramo.

Adems, los ligandos de unin a ADN (interaccin triplex) fijados a polmeros sensibles a la temperatura se han utilizado en la purificacin de ADN plsmido. Estos polmeros son solubles a temperatura baja, pero son insolubles a temperaturas ms altas que resultan de un agente de precipitacin-litacin afinidad controlable temperatura [130]. Ms recientemente, la empresa Dr. Mller AG ha aplicado este enfoque y est comercializando una estrategia de separacin de ADN plsmido a gran escala basada en ligandos de afinidad triplex unidos a un polmero sensible estmulo. Problemas de escalabilidad con precipitaciones de afinidad principalmente en-Volve una mezcla adecuada, la separacin de los precipitantes, el lavado de los precipitantes, y el mtodo de adicin del agente de precipitacin affin-dad. Temperatura, pH, grado de mezcla, y el tiempo de mezcla pueden afectar el tamao de partcula precipitante y el alcance de cualquier precipitacin. La mezcla y el mtodo de adicin del agente de precipitacin de afinidad tambin son importantes porque la alta concentracin local de los agentes de afinidad puede causar la coprecipitacin de impurezas. Adems, la cantidad de lquido residual que queda antes de la re-suspensin puede afectar en gran medida los niveles de impurezas. 5.4. Separacin slido-lquido en la produccin de ADN plasmdico

La separacin de los slidos de los lquidos es una necesidad en la produccin de ADN plsmido. Con dosis de ADN de plsmido en el orden de miligramos por dosis y el lmite de solubilidad del crudo que contiene ADN lisados a 1-2 mg / ml, extremadamente grandes volmenes de solucin con niveles moderados de volumen de slidos necesitan ser procesados. Los medios ms econmicos de slidos de compensacin es una separacin por centrifugacin basada, sin embargo, este mtodo de separacin slido-lquido no puede producir una solucin altamente aclarado y sin tiempos de residencia sustanciales, en parte debido a la alta viscosidad del plsmido de ADN en solucin. Tiempos de permanencia grandes requieren ya sea muy grande centrifugadoras o largos tiempos de procesamiento, ninguno de los cuales es ptimo en un entorno de fabricacin. Adems, se han reportado problemas de limpieza con centrifugadoras industrial actual [131]. El ms atractivo separacin slido-lquido de filtracin basado en para el procesamiento a gran escala de ADN plsmido es la de una filtracin de alimentacin del cuerpo (por ejemplo, adicin de un coadyuvante de filtracin tal como diatomaceous tierra (DE)). Esta torta de filtracin de la capacidad de-aumenta la cantidad de ensuciamiento del filtro como la superficie de filtracin se regenera continuamente como ayuda de filtro se deposita, lo que permite la eliminacin de las grandes cantidades de residuos de clulas resultantes de la lisis de E. coli. Adems, DE se sabe que se unen ARN [132], ayudando a etapas de purificacin aguas abajo. Sin embargo, un inconveniente ma-jor en la ampliacin de las filtraciones de alimentacin del cuerpo es slido la eliminacin de residuos. Con comunes lechadas DE AT ~ 50 g DE / l, mtodos de produccin a gran escala pueden producir toneladas de residuos slidos contaminada por ao.

Filtracin de flujo tangencial (TFF) de lisados alcalinas de ADN que contiene el plsmido se ha demostrado como una operacin de unidad de purificacin factible. TFF se puede lograr para el intercambio de tampn y la eliminacin de iones pequea. Sin embargo, en una alta carga, las grandes molculas biolgicas no pueden ser eliminados adecuadamente durante TFF sin el uso de nucleasas caros, la exposicin a largo plazo a un pH alto, y proteasas costosos debido a la formacin de una capa de gel de ADN [133]. Adems, a grandes escalas, los caudales de lquido elevados alcanzados necesitan el uso de bombas de alto cizallamiento que pueden degradar el sensibles al cizallamiento plasmediados ADN y el rea de la membrana necesaria puede llegar a ser excesiva. 5.5. adsorbente basado separacin de ADN plsmido

Cromatografa, un sello distintivo de bioseparacin, resulta ser un paso muy tedioso en la purificacin de ADN plsmidial. Resinas de cromatografa comunes utilizados en la separacin de cidos nucleicos son de intercambio aninico (por ejemplo, grupos funcionales de amina cuaternaria (Q) y dietil aminoetil (DEAE)), fase inversa, interaccin hidrfoba, hidroxiapatita, exclusin por tamao, y cromatografa de afinidad por metales inmovilizados [78 , 95,134,135]. La mayora de los medios de separacin cromatogrficos producidos actualmente estn optimizados para la produccin de protenas. El tamao de poro medio de cromatografa comn contribuye a es menor que o aproximadamente el mismo tamao que el radio de giro de una molcula de ADN plsmidial [136]. Por lo tanto, el ADN plsmidial no puede acceder a los poros de los medios de comunicacin cromatogrficas estndar y slo puede unirse a la superficie externa de las partculas, por lo tanto, slo aproximadamente el 0,2-2 g plasmediados de ADN se unen por litro de resina en contraste con las protenas, donde la carga puede rango de 10 a 100 g por litro de resina. Esto significa que se necesita una cantidad sustancial de la cromatografa de los medios de comunicacin en una separacin de ADN plsmido a gran escala (~ 500-2000 l de resina / kg de ADN plsmidial procesado). Sagar et al. [121] entra en ms detalles acerca de la aplicacin de las tcnicas cromatogrficas para la purificacin de ADN plsmidial. Cromatografa de afinidad de metal inmovilizado se ha aplicado recientemente a la purificacin de ADN plsmidial. Por ejemplo, se encontr una resina de cido iminodoacetic (IDA), encargado de Cu (II) para vincular bases de purina libres en solucin. Por lo tanto, el ADN y ARN daados se unen a una resina de IMAC a travs de modo de flujo mientras que el ADN plsmidico no se conserva, permitiendo de ese modo pulido corriente abajo de manejar> 100 g de ADN plasmdico por litro de resina IMAC (para una alimentacin con 2% ( w / w) RNA contaminacin de) [135]. IMAC slo se ha aplicado en el ADN plsmidico en la escala de 10 mg a este punto, sin embargo, debido a la escalabilidad de flujo a travs de cromatografa (no degradados o pasos), las cuestiones de escala debern ser mnimas.

Cromatografa de perfusin ofrece altas velocidades de flujo y moderadamente ms altas capacidades de unin de ADN plsmido [121]. Los medios de perfusin tpicas por ejemplo, tiene ~ 4000 con-poros convectiva, junto con el estndar de ~ 100-1000 poros de un medio de comunicacin tpicos. El flujo de conveccin a travs de los medios de comunicacin (normalmente ~ 5% del flujo total de lquido) disminuye la cada de presin y los poros ms grandes convectivas pueden permitir algo de ADN plasmediados para entrar en los medios de cromatografa, el aumento de la capacidad de unin al plsmido de ADN. Adems, las velocidades lineales de 1000-5000 cm / h son alcanzables utilizando una perfusin de los medios de comunicacin cromatografa (en oposicin a 50-400 cm / h para medios de cromatografa convencionales). Se tiene un soportes tentculos cromatogrficos tambin se han utilizado en la produccin a gran escala de ADN plsmiddial. Estas resinas contienen largas cadenas poli-electrolito con grandes enlazadores que se extienden desde la superficie de la resina cromatogrfica. Esto aumenta el nmero de sitios cargados en la resina, y posiblemente la capacidad de carga. Para este punto, sin embargo, slo ha habido publicaciones limitados que detallan el uso de resinas de tentculos para la purificacin de plsmido de ADN [137]. Se han completado estudios usando aditivos para incrementar la carga de ADN plsmido en las columnas, reduciendo el tamao efectivo de molculas de ADN plsmido en solucin [121138]. Sin embargo, incluso con condensados partculas, la unin de ADN a cromatografa de medios de comunicacin es bastante baja (tpicamente menos de 5 mg de ADN / ml de resina de plsmido). Adems de la cromatografa en columna clsica, el uso de la cromatografa de lecho expandido ha sido para ser aplicado a la separacin de ADN plsmidial [139140]. El diseo de cromatografa de lecho expandido es una rama de un lecho fluidizado estndar, sin embargo, el lecho expandido se opera en un rango en el que se apoyan las partculas y no se mezclan de nuevo, permitiendo para las placas de separacin para todava existen. Adems, este tipo de separacin cromatogrfica permite lisados para ser purificados con partculas limitadas y permite velocidades lineales en el modo de lecho expandido de ~ 300 cm / h. El principal inconveniente de adsorbentes de lecho expandido para la purificacin de ADN plsmido es la de la capacidad de carga. Dado que el plsmido no penetra en los poros de los medios de comunicacin ms cromatogrficas, rea de superficie (y por lo tanto del tamao de partcula) escalas con capacidad de carga. Debido adsorbentes de lecho expandido suelen tener grandes tamaos de partculas, las capacidades de carga son tpicamente mucho menor que el de las columnas de cromatografa de lecho fijo clsicos. Para combatir este problema inherente con adsorbentes de lecho expandido, prototipos de adsorbentes con tamaos de partcula ms pequeos y ligandos cromatogrficos basados en imina de polietileno (que actan como un ligando tentculo) se han utilizado con cierto xito [141]. Con los problemas inherentes con purificacin de ADN plsmido cromatogrfico, se han intentado otras formas de separacin por adsorcin. Para este fin, adsorcin discontinua de contaminantes de proceso se puede realizar en lugar de cromatografa en columna, cuando se utiliza un

adsorbente bajo costo. Un ejemplo de este enfoque se demostr con el uso de un silicato de calcio hidratado basado en la adsorcin por lotes de ADN y otros contaminantes [142]. En este enfoque hidratado de silicato de calcio se utiliza para unirse al ADN genmico, crculo abierto plsmido, endotoxinas, protenas, y detergentes residuales dejando-ING plsmido superenrollado en solucin. Separaciones de membrana de adsorcin tambin muestran alguna promesa con el aumento de la capacidad de carga de ADN plsmido (~ 10 mg / ml de membrana), pero relativamente alto costo de la membranas prohbe su uso a gran escala [143]. Adems, la adsorcin de ADN genmico de E. coli en los filtros basados en nitrocelulosa se ha discutido, pero la capacidad de carga baja de ADN genmico de nitrocelulosa, los hace poco prcticos a gran escala [144].

5.6. Intercambio de bfer / concentracin TFF basada en membrana se puede utilizar para el intercambio de tampn y la eliminacin de iones pequea, sin embargo, a una alta carga, biomolculas grandes no pueden ser permeados debido a la formacin de una capa de gel de ADN. Posibles temas de escala-hasta que enfrenta esta tecnologa incluyen tanto los requisitos para la amplia zona de superficie de la membrana y las altas tasas de flujo de fluido con el fin de mantener las membranas de ensuciamiento prematuramente. El cambio de tampn y la concentracin tambin puede efectuarse mediante una precipitacin con base de alcohol. Esto permite la precipitacin del ADN y la produccin de un mayor slido se sec a vaco, que es ms estable y ocupa significativamente menos espacio de almacenamiento que un tpico <10 mg / ml de solucin de ADN plsmido [95145].

5.7. El producto final Vacuna de ADN final o producto de terapia gnica deben ser 0,22 m estriles filtrados y se debe cumplir con la liberacin mnima especificaciones despus de la purificacin. Los datos espesificos de liberacin puede variar debido al hecho de que los organismos reguladores no han fijado valores definidos para los contaminantes principales en la vacuna de ADN preparaciones. Un ejemplo de una especificacin recientemente de la pureza del producto se muestra en la Tabla 3. La Formulacin final y la entrega de vacunas de ADN son un rea extremadamente importante de la investigacin para mejorar las vacunas de ADN en su conjunto. Aunque las vacunas de ADN desnudo se ha demostrado que sea eficaz, un sistema de suministro eficiente podra reducir requerimientos de dosis y aumentar la efectividad del producto, reduccin el costo del producto. Para obtener ms informacin Luo y Saltzman [146] y Lian y Ho [147] dan los exmenes a fondo de algunas de las estrategias de administracin de ADN actuales.

6. Conclusin A medida que avanza siguen en el campo de las vacunas de ADN y/o terapias gnicas basadas en plsmidos, y emergen como productos comerciales, por ao deben ser construidos fbricas capaces de producir kilogramos de plsmido de ADN. Los avances en el vector designo, la fermentacin, purificacin y formulacin de ADN plsmido estn siendo impulsados por esta nueva necesidad de grandes cantidades de ADN de plsmido y el marco regulador actual. Para usos comerciales, las consideraciones de las restricciones propiedad intelectual se deben hacer al seleccionar vectores especficos, lneas de clulas husped, y tecnologas de produccin. Un gran nmero de patentes y solicitudes de patentes que especficamente o potencialmente cubren este campo se han emitido para el diseo vector, los mtodos de cultivo, y la purificacin procedimientos. Estos ejemplos se enumeran aqu para recordar al lector que se debe prestar atencin a este campo. Sin embargo, hay que recordar que las patentes slo tienen una duracin temporal. Adems, mientras que aplicaciones publicadas son a menudo bastante amplia en su alcance, las indemnizaciones concedidas tras la emisin pueden ser mucho ms estrecho, y las reclamaciones pueden ser ms limitada (es decir invalidado) a travs de recurso judicial. Por lo tanto, en estrecha relacin con un equipo legal de revisar cuidadosamente el entorno de la propiedad intelectual aplicables es el camino ms adecuado a seguir. Las tecnologas de fermentacin y el proceso de ADN plsmido farmacutica escala aqu reseados son un buen comienzo hacia la meta de la vacuna de ADN produccin a gran escala rentable.