Electroforesis en gel Tecnicas para separar molculas basndose en propiedades como el tamao, la forma o el punto isoelectrico Se usa con

proposito analitico, pero se puede usar para preparar moleculas para otros procedimientos como PCR,Secuenciacion de ADN. Las Proteinas se desnaturalizan mediante adicion de detergentes, como el Dodecilsulfato sodico/dodecilfosfato sodico (SDS/SDP) y usando un agente reductor (2-mercaptoetanol) Las proteinas no tienen una carga que les permita migrar, estos detergentes, le dan una carga negativa y esto les permite migrar a traves del gel de poliaclilamida en relacion directa con su masa (La cantidad de cargas negativas que se unen a la proteina depende del tamao de esta, "relacion carga/masa") Esta desnaturalizacion hace que su velocidad de migracion sea proporcional a su tamao y no a su estructura ni interacciones. (las mas grandes se desplazan mas lentamente)

Revelado y visualizacion A traves de colorantes especificos se puede revelar que moleculas han llegado al anodo (normalmente las mas pequeas). Se usan compuestos como; Bromuro de etidio (Ac.Nucleicos), Tincion de plata, azul de coomassie o tincion fluorescente (Proteinas) Si el resultado es fluorescente bajo la luz UV se puede hacer una fotografia de la placa bajo luz.

Tipos de electroforesis Grandes muestras de ADN y ARN-- Geles de agarosa (Tambien se usa para fijar moleculas a su estructura como anticuerpos, antigenos y enzimas, ademas usado para el cultivo celular y micreobiologia) Electroforesis de proteinas en los geles de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) Electroforesis Capilar Electroforesis de ADN Zimografia Extraccion en gel

Hibridacion: proceso por el cual se combina dos cadenas de acidos nucleicos (ADN o ARN) antiparalelas y con secuancia de bases complementarias en una unica molecula de doble cadena (la cual toma forma de doble helice) Este proceso se puede revertir simplemente calentando la solucion que contiene la molecula GC (se unen mediante tres puentes de hidrogeno) AU mediante dos. Procedimiento: La helice de doble cadena es separada, mediante calor (fisico) o soda caustica (quimico), esto rompe los puentes de hidrogeno que mantiene unidas a los dos hebras de ADN, cuando se separan, el ADN se desnaturaliza. Una muestra de cadenas simples (ya desnaturalizadas) se mezcla con otra muestra de cadenas, asi combinadas se enfrian lentamente las moleculas sencilla se van a emparejar con su zona complentaria y asi se forma una nueva molecula Hibridada.

Hay dos tipos de hibridacion que se usan en los laboratorios, los dos utilizan las cadenas de ADN marcada por metodo fisico-quimico, esta cadena tiene una secuencia ya conocida y se utiliza una sonda para detectar otras moleculas de ARN o ADN de cadena de sencilla de secuancia rapida

Microarray: Soporte solido donde se encuentran representados de manera ordenada, genes o fragmentos genomicos. Conjugacion del AC o AG con enzima., se tiene que producir y que pueda ser valorada visualmente o cuantificada por medio de un espectrofotometro. Se tiene que dar durante un determinado periodo de tiempo, Si ese tiempo no transcurre se evidenciara como un falso negativo no observandose ningun color. Disminuyendo la sensibilidad de la tecnica.

PCR (Reaccion de cadena de polimerasa): Tecnica de biologia molecular que permite obtener un gran numero de copias de un Fragmento de ADN particular, partiendo de un minimo. Se fundamente en la propiedad natural de las ADN polimerasas, para replicar las hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de alta temperatura alternadas para separar las hebras de AND recien formadas entre si, tras cada fase de replicacion y a continuacion dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas Para que no se desnaturalize la proteina entera con la temperatura, se utilizan lo que se llaman ADN polimerasas termoestables extraidas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas. Se usan las Taq y hay otras que son capaces de corregir errores PUF. El aparato en el que se efectua la PCR se llama Termociclador, este permite calentar y enfriar los tubos de reaccion, necesarios para cada etapa de la reaccion. Muchos usan un efecto llamado Efecto Peltier, que cambia las temperaturas invirtiendo cla corriente electrica. Es una tecnica comun e indispensable para los laboratorios medicos y biologicos, tienen una gran variedad de aplicaciones. Clonacion, Secuenciacion ADN, analisis funcional de Genes, diagnosticos hereditarios (huellas geneticas) y deteccion y diagnostico de enfermedades infecciosas. Cebadores, 2 de estos son los que permiten que la polimerasa inicie su accion, delimitan la zona del ADN a amplificar ,corresponden a los nucleotidos que definen los extremos de la secuencia a replicar. Iones divalentes, Magnesio(cloruro de magnesio) o manganeso, se usan para la mutagenesis del ADN. Actuan como cofactores de la polimerasa. Los buffer mantienen el ph adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa

Inmunohistoquimica: Tecnica mediante la cual detectas la prescencia de un peptido o proteina en un tejido, utilizando un anticuerpo (el cual puede ser monoclonal o policlonal, IgG o IgM)Especifico contra el. Se basa en el concepto de reaccion Antigeno-Anticuerpo Los Antigenos pueden tener un numero variables de Epitomes (que es un epitope?, es aquella parte del antigeno que provoca una respuesta inmune) Anticuerpos, Son producidos por las celulas B, pueden ser monoclonales o Policlonales Monoclonal: Especificos a un solo epitope, originalmente producidos por 1 linfocito B (misma secuencia) se utilizan para la deteccion de proteinas con altos niveles de expresion, donde se requiera alta especificidad.

Policlonal: Anticuerpo producidos por diferentes tipos de Linfocitos B, los cuales reconocen diferentes Epitopes de la misma proteina. Utiles en la proteinas de bajo nivel de expresion, ya que varios AC pueden unirse a una unica molecula proteica, esto aumenta la capacidad de deteccion Metodo Directo: Es conjugado con una enzima o substancia fluorescente (Fosfatasa alcalina, Fluoresceina, Rodamina) La muestra se hace reaccionar con el anticuerpo conjugado, si el anticuerpo reconoce el antigeno hay un cambio de color o fluoresecnia. (Es mas directo pero menos sensible) Metodo indirecto: El AC no esta conjugado (Anticuerpo Primario), se hace reaccionar este AC primario con la muestra, se le agrega el anticuerpo secundario (este esta conjugado con fluorocromo, o una enzima). Se agrega el sustrato para que la enzima cambie de color. Mas sensible que el directo.

Inmunofluorescencia: Tecnica de IH que consiste en conjugar colorantes fluorescentes (Isotiocianato de fluoresceina) con AC o AG, exponiendo despues este conjugado a los AC o Ag correspondientes en cortes de tejidos, frotis de microorganismo o de celulas o cultivos de tejidos. Cuando la reaccion es positiva y se expone a luz UV se producira fluoresceina obstervable bajo MO La fluorescencia es el proceso por el que una molecula absorbe luz, aumenta su energia y vuelve al estado basal emitiendo un foton.

VENTAJAS Alta sensibilidad Rpida Sencilla Evidencia de antgenos intracelulares Reactivos estables DESVENTAJAS Costo equipo Lectura subjetiva