RECOPILADO POR: EL PROGRAMA UNIVERSITARIO DE ALIMENTOS

NMX-V-014-1986. BEBIDAS ALCOHLICAS DESTILADAS DETERMINACIN DE ALCOHOLES SUPERIORES (ACEITE DE FUSEL). DESTILLATED ALCOHOLIC BEVERAGES DETERMINATION OF ALCOHOLS HIGHER. (FUSEL OIL). NORMAS MEXICANAS. DIRECCIN GENERAL DE NORMAS. PREFACIO En la elaboracin de esta Norma, participaron los siguientes Organismos: Cmara Regional de la Industria Tequilera. Tequila Sauza, S.A. de C.V. Tequila Cuervo, S.A. Tequila Herradura, S.A. Tequila la Unin, S.A. Industrias Vincolas Domecq, S.A. Bufete Qumico, S.A. de C.V. Comit Consultivo de Normas de Bebidas Alcohlicas. Bacard y Compaa, S.A. de C.V. 1 OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACIN

Esta Norma Mexicana establece dos mtodos para la determinacin de alcoholes superiores (aceite de fusel) en bebidas alcohlicas destiladas. Mtodo Qumico y Mtodo Cromatogrfico (Cromatografa de Gases). 2 REFERENCIAS

Esta Norma se complementa con la siguiente Norma Mexicana vigente: NMX-V-013 Bebidas Alcohlicas destiladas - Determinacin del porciento de alcohol en volumen en la escala Gay Lussac a 288 K (15C). 3 3.1 MTODO QUMICO Reactivos y materiales

Los reactivos deben ser de grado analtico; y por agua debe entenderse agua destilada. 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 Acido sulfrico concentrado Alcohol isobutlico Alcohol isoamlico Disolucin de p-dimetilamino benzaldehdo:

Disolver 1 g de la sal de p-dimetilamino benzaldehdo en una mezcla de 5 cm de cido sulfrico y 40 cm de agua, contenida en un matraz volumtrico de 100 cm, llevar al aforo con agua y homogeneizar.

3.1.5 Alcohol etlico bidestilado Por destilacin simple, eliminando el 15 % de cabezas en cada una de las destilaciones y recolectando el 50 %. Estas destilaciones deben efectuarse a una velocidad aproximada de 250 cm/30 min. 3.1.6 Disolucin patrn de aceite de fusel al 0.1 % m/v Transferir 2 g de alcohol isobutlico y 8 g de alcohol isoamlico a un matraz volumtrico de 1000 cm, llevar al aforo con agua y homogeneizar. Tomar de la disolucin anterior una alcuota de 10 cm y transferirla a un matraz volumtrico de 100 cm3, llevar al aforo con agua y homogeneizar. 3.1.7 Preparar con alcohol etlico bidestilado una disolucin de grado alcohlico igual al que se espera tener en la muestra cuando es pasada al tubo de anlisis. 3.2 Aparatos y equipo

3.2.1 Balanza analtica 3.2.2 Espectrofotmetro o colormetro 3.2.3 Equipo comn de laboratorio 3.3 Curva de calibracin

3.3.1 Disoluciones tipo para la curva de calibracin Preparar seis disoluciones tipo, conteniendo de 1 a 6 mg de aceite de fusel por100 cm, poniendo en matraces volumtricos de 100 cm alicuotas de 1 a 6 cm de la disolucin patrn de aceite de fusel (vase 3.1.6) y llevar al aforo con la disolucin de grado alcohlico igual al que se espera tener en la muestra cuando esta es pasada al tubo de anlisis. (Vase 3.1.7). Para comprobar la disolucin patrn de aceite de fusel sinttica, simultneamente preparar un testigo con 6 cm de la disolucin patrn de aceite de fusel, en un matraz volumtrico de 100 cm, llevar al aforo con alcohol etlico bidestilado al 95% en volumen. Tratando este testigo como en el inciso 7 debe dar una absorbancia de 0.83 0.03 a una longitud de onda de 530 nm, de lo contrario preparar nuevamente la disolucin patrn de aceite de fusel. 3.4 Preparacin de la muestra

3.4.1 Cuando el extracto seco de la muestra exceda de 0.7 g/1 o esta presente coloracin, destilar como se indica en NMX-V-013. 3.4.2 En un matraz volumtrico de 100 cm colocar un volumen conocido del destilado de la muestra, dependiendo del contenido de alcoholes superiores de la muestra y llevar al aforo con agua, homogeneizar y proceder como se indica en el inciso 3.5.

NOTA: En el caso de bebidas alcohlicas con bajo contenido de alcoholes superiores, tomar la muestra directamente del destilado y proceder como se indica en el inciso 3.5. 3.5 Procedimiento

En el tubo de ensayo poner 2 cm de la muestra preparada (Vase 3.4.2), en una serie de tubos poner 2 cm de cada una de las soluciones tipo preparadas (vase 3.3.1). En otro tubo poner 2 cm de disolucin testigo (vase 3.3.1) y en otro tubo poner 2 cm de agua como blanco. Los tubos se colocan en un bao de hielo, agregarles 1 cm de solucin de pdimetilamino benzaldehdo, dejarlos en el bao de hielo durante 3 minutos. Adicionar a cada tubo lentamente gota a gota por medio de una bureta 10 cm de cido sulfrico concentrado, dejndolo escurrir por las paredes del tubo, agitar los tubos individualmente, colocarlos nuevamente en el bao de hielo durante 3 minutos y pasarlos a un bao de agua en ebullicin durante 20 minutos. Colocarlos despus en el bao de hielo entre 3 y 5 minutos sacarlos y llevarlos a la temperatura ambiente. Leer el por ciento de transmitancia de los tipos y las muestras en el espectrofotmetro a una longitud de onda entre 538 y 543 nm contra el blanco usado como referencia. Usar la misma longitud de onda para tipos y problemas. Con los datos obtenidos construir en papel semilogartmico la curva de calibracin, colocando en las abscisas las concentraciones de las disoluciones tipo de aceite de fusel y en las ordenadas el por ciento de transmitancia de las mismas. Utilizando la curva de calibracin, interpolar el por ciento de transmitancia de las muestras a mg de aceite de fusel. 3.6 Expresin de resultados

El contenido de alcoholes superiores (aceite de fusel), expresado en mg por 100 cm3 de alcohol anhidro, se calcula con la siguiente frmula: P x FD x 100 A.S. = - G.A.R. En donde: A.S. = Alcoholes superiores (aceite de fusel) en mg por 100 cm de alcohol anhidro. P= mg de aceite de fusel por 100 cm de muestra, calculados a partir de la curva de calibracin.

Vol. Total de la disolucin FD = Vol de la muestra empleada en la dilucin.

G.A.R. =

Grado alcohlico real de la muestra a 288 K (15C) en la escala GayLussac, determinado de acuerdo con la NMX-V-013.

3.7

Repetibilidad del mtodo

La diferencia entre dos resultados sucesivos, obtenidos en las mismas condiciones, no debe exceder de 5 % del promedio de los mismos. En caso contrario repetir las determinaciones. 3.8 Reproducibilidad del mtodo

La diferencia entre dos determinaciones no deber exceder de 15 % del promedio de las mismas. 4 4.1 MTODO CROMATOGRFICO ("CROMATOGRAFA DE GASES") Fundamento

4.1.1 Este mtodo se basa en los principios de la Cromatografa de gases y consiste en la inyeccin de una pequea cantidad de la muestra (Constituida por una mezcla de sustancias voltiles) en el inyector de un Cromatgrafo de Gases en el que son vaporizadas y transportadas por un gas inerte a travs de una columna empacada o capilar con lquido de particin que presenta solubilidad selectiva con los componentes de la muestra, ocasionando superacin. Los componentes que eluyen de la columna pasan uno a uno por el "Detector", el cual genera una seal elctrica proporcional a su concentracin, la que es transformada por el registrador (o integrador) en una grfica de concentracin contra tiempo llamada cromatograma. 4.1.2 La identificacin de cada componente registrado como un pico en el cromatograma, se realiza por inyeccin del o los componentes que se sospecha contiene la muestra en forma pura y en las mismas condiciones que la muestra midiendo el tiempo de retencin en esas condiciones, tambin se puede comprobar por adicin del componente a la muestra e inyectndola nuevamente para apreciar el incremento de altura o rea del pico correspondiente. 4.1.3 La cuantificacin se puede efectuar por cualquiera de 3 mtodos; Normalizacin, Estandarizacin Externa y Estandarizacin Interna, siendo este ltimo el nico que se describe a continuacin: La cuantificacin por Estandarizacin Interna; consiste en obtener el cromatograma de la muestra estandarizada, o sea adicionada de una sustancia llamada estndar interno que deber aparecer en un sitio del cromatograma, libre de traslapes y desde luego no deber ser componente de la muestra por cuantificar (alcoholes isobutlico e isoamlico). Debern obtenerse cromatogramas paralelos con soluciones de concentracin conocida de cada componente por cuantificar y del estndar interno (por ejemplo Butanol o Hexanol) y trazar una curva de calibracin que tenga por ordenadas la relacin de concentraciones correspondientes al componente por cuantificar y al estndar interno.

Esta curva servir para situar en sus ordenadas la relacin de reas correspondientes al componente por cuantificar y al estndar interno del cromatograma de la muestra estandarizada y as ubicar la relacin correspondiente de concentraciones. 4.2 Reactivos y materiales

Los reactivos debern ser de pureza adecuada; y por agua debe entenderse agua destilada o desmineralizada. 4.2.1 Alcohol etlico de alta pureza y libre de alcoholes superiores 4.2.2 Disolucin de alcoholes isobutlico al 0.5 % m/v (1 g/200 cm) e isoamlico al 0.5% m/v (1 g/200 cm) en alcohol etlico de 40 G.L. 4.2.3 Disolucin de alcoholes isobutlico al 0.1% m/v e isoamlico al 0.1 % m/v. Poner 20 cm de la disolucin de alcoholes isobutlico e isoamlico ( vase 4.2.2) en un matraz volumtrico de 100 cm y aforar con alcohol etlico de 40 G.L. Se pueden usar mltiplos de estas cantidades conservando las mismas concentraciones. 4.2.4 Disolucin de estndar interno al 0.5 % m/v (1 g/200 cm) en alcohol etlico de 40G.L. 4.2.5 Disolucin de estndar Interno al 0.1 % m/v, poner 20 cm de disolucin de estndar interno al 0.5 % (vase 4.2.4) en un matraz volumtrico de 100 cm y aforar con alcohol etlico de 40C G.L. Se pueden usar mltiplos de estas cantidades conservando las mismas concentraciones. El estndar interno puede ser N-Butanol, N-Hexanol u otro alcohol que no se traslape con los componentes de la muestra. 4.2.6 Disoluciones de estndar interno y alcoholes isobutlico e isoamlico para muestras que contengan de 256 a 1300 mg de alcoholes isobutlico e isoamlico por 100 cm de alcohol anhidro (estas concentraciones corresponden a las disoluciones "A" y "E" respectivamente de la tabla 1). Disoluciones de trabajo A, B, C, D y E, para las curvas de calibracin, vase la siguiente tabla: TABLA 1

En la tabla anterior las diluciones de las columnas 4 y 5 se refieren a cm de las disoluciones al 0.5 % de los alcoholes isobutlico e isoamlico y del estndar que se debern diluir a 100 cm en el mismo matraz con etanol de 40 G.L. para tener las concentraciones que se indican en las columnas 1, 2 y 3 y la relacin de concentraciones que se indican en la columna 6 que sern abscisas de las curvas de calibracin, las ordenadas sern las relaciones de rea del pico del alcohol por cuantificar isobutlico o isoamlico entre el rea del pico del estndar. 4.2.7 Solucin de muestra estandarizada (adicionado de estndar interno).

En un matraz volumtrico de 100 cm, poner 30 cm de estndar interno (vase 4.2.4) y aforar con la muestra preparada (vase 4.4). 4.2.8 En caso de bebidas que contengan menos de 256 mg de alcoholes isobutlico e isoamlico por 100 cm de alcohol anhidro (Esta concentracin corresponde a la disolucin "O" de la Tabla 2), elaborar una curva de calibracin equivalente a la del inciso 4.2.6, pero cambiando las concentraciones de alcoholes isobutlico e isoamlico y estndar interno, vase Tabla 2: TABLA 2

En la tabla anterior las diluciones de las columnas 4 y 5 se refieren a cm de las soluciones al 0.1 % de los alcoholes isobutlico e isoamlico y del estndar que se debern diluir a 100 cm en el mismo matraz con alcohol etlico de 40 G.L. para tener las concentraciones que se indican en las columnas 1, 2 y 3. 4.3 Aparatos y equipo

4.3.1 Cromatgrafo de Gases equipado con detector de ionizacin de flama, siendo opcional el sistema dual con programador de temperatura registrador, integrador o sistema de procesamiento de datos (computador). Parmetros de operacin recomendables. En cada caso deber optimizarse de acuerdo a la situacin geogrfica y al aparato, la temperatura de la columna isotrmica 423 K 10 K (150C 10C) o programada de; inicial 343 K (70C) de cero a cuatro minutos y aumento lineal de 4 - 8 K por minuto hasta llegar a 393 K (120C). Manteniendo esta temperatura constante. Temperatura del inyector 423 K (150C). Temperatura del detector 473 K (150C). Flujo del gas portador 50 cm/min. (aproximadamente). Las condiciones de operacin ptimas varan de acuerdo a la columna e instrumentos utilizados, los cuales son determinados por medio de soluciones estndares, y curvas de nmero de platos tericos (N) contra velocidad lineal del gas o flujo. (Optimizacin por ecuacin VAN DEEMTER). Los parmetros sern ajustados para obtener resolucin ptima entre el alcohol isobutlico y cualquier componente ms cercano y resolucin ptima entre el alcohol isoamlico y cualquier componente ms cercano de acuerdo a la siguiente ecuacin: 2 nT R = ac + cs En donde: R= nT = ac = cs = Resolucin Diferencia de tiempos de retencin. Amplitudes del pico en la base correspondiente al alcohol por cuantificar. Amplitud del pico en la base correspondiente al componente mas cercano.

Nota: Las unidades de nT, ac y cs debern ser las mismas. Con objeto de obtener cromatogramas confiables debern tomarse las siguientes precauciones: Acondicionamiento y saturacin de la columna Limpieza del inyector. Deteccin de fugas del sistema. Estabilidad del flujo del gas. Optimizacin del detector (flujos de hidrgeno y aire). Estabilidad de la temperatura Repetibilidad de los cromatogramas.

4.3.2 Columnas 4.3.2.1 Columna empacada. Especificaciones: Material inerte a la muestra (Vidrio o acero inoxidable). Longitud: 1.8 - 6.0 m. Dimetro interior: 2 mm aproximadamente. Relleno (empaque): apropiado para obtener resolucin mayor o igual a uno entre el alcohol a cuantificar y el componente ms cercano. Se recomienda entre otros el siguiente: Fase fija o lquido de particin. Polietilen Glicol 1540 al 15 o 20% Soporte: Tierra de Diatomeas blanca lavada con cido y silanizada con tamao de partcula entre las cribas MO.180 y FO.125 (80 y 120 ASTM). 4.3.2.2 Otras Columnas Podrn ser empleadas otras columnas cuya resolucin sea mayor o igual a uno entre el alcohol por cuantificar y el componente ms cercano. 4.3.3 4.3.4 4.3.5 4.3.6 4.3.7 4.4 Fase mvil (gas acarreador) nitrgeno, Helio o Argn de alta pureza. Hidrgeno prepurificado. Aire seco prepurificado. Jeringa de 5 - 10 ml. Pipeta o jeringa de 100 - 500 ml. Preparacin de la muestra

Cuando el extracto seco de la muestra exceda de 5 g/1 destilar como se indica en NMXV-013. Se admite el uso de precolumna, en cuyo caso no se requiere destilar. 4.5 Procedimiento

Inyectar en el cromatgrafo de 1 a 5 microlitros de la solucin de muestra estandarizada (vase 4.2.7) y de cada una de las soluciones estndar (A, B, C, etc., de la tabla que corresponda) para obtener los cromatogramas respectivos, haciendo las atenuaciones convenientes para obtener un buen cromatograma cuantitativo, verificando que la resolucin entre el alcohol por cuantificar y el componente ms cercano sea mayor o igual a uno. 4.6 Expresin de resultados

Para que exista congruencia en la expresin de resultados entre el mtodo qumico y el mtodo cromatogrfico, en este ltimo solamente incluirn las concentraciones de los alcoholes isobutlico e isoamlico por lo que el contenido de alcoholes superiores (aceite

de fusel), expresado en mg/100 cm3 de alcohol anhdrido, se calculan como se describe a continuacin: 4.6.1 Clculos para el alcohol isobutlico

Clculo de reas y relaciones de reas: Calcule el rea correspondiente al alcohol isobutlico (Aib) y al estndar interno (Ae) en cada cromatograma de las soluciones estndar (A, B, C, etc.). dividida el rea del alcohol isobutlico entre el rea del estndar interno y con los valores obtenidos, trace la curva de relacin de concentraciones contra relacin de reas (Columna 6 de la tabla que corresponda, (vase 4.2.6 y 4.2.8). Aib = Ae = Cib = Ce = Area del pico de alcohol isobutlico. Area del pico del estndar. Concentracin del alcohol isobutlico. Concentracin del estndar.

Calcule las reas del alcohol isobutlico y del estndar interno en el cromatograma de la muestra estandarizada y obtenga el valor de Aib/Ae con el cual se localiza en la curva de calibracin el valor Cib/Ce. Con el valor de Cib/ Ce obtenido para la muestra en la curva de calibracin y conociendo la cantidad de estndar interno (Ce) agregado a la solucin de muestra estandarizada podemos calcular la concentracin de alcohol isobutlico en la muestra (Cib) con las siguientes frmulas: Cib = Ce . Rg En donde: Cib = Alcohol isobutlico expresado en mg por 100 cm3 de muestra directa. Ce = mg de estndar interno agregados a la solucin de muestra estandarizada. Rg = Relacin de Cib/Ce obtenida en la curva de calibracin. Cib x FD x 100 IB = G.A.R En donde: IB = G.A.R. = alcohol isobutlico expresado en mg por 100 cm de alcohol anhidro. Grado alcohlico de la muestra a 288 K (15C) en la escala Gay Lussac, determinado de acuerdo con la NMX-V-013. Volumen total de la muestra estandarizada FD = Volumen de la muestra diluda en la estandarizacin. 4.6.2 Clculos para el alcohol isoamlico

Clculo de reas y relaciones de reas: Calcule el rea correspondiente al alcohol isoamlico (Aia) y al estndar interno (Ae) en cada cromatograma de las soluciones de estndar (A.B.C., etc.), dividida el rea del alcohol isoamlico entre el rea del estndar interno y con los valores obtenidos, trace la curva de relacin de concentraciones contra relacin de reas (Columna 6 de la tabla que corresponda, (vase 4.2.6. y 4.2.8). Aia = Ae = Cia = Ce = Area del pico del alcohol isoamlico. Area del pico del estndar. Concentracin del alcohol isoamlico. Concentracin del estndar.

Calcule las reas de alcohol isoamlico y del estndar interno en el cromatograma de la muestra estandarizada y obtenga el valor de Aia/Ae con el cual se localiza en la curva de calibracin el valor de Cia/Ce. Con el valor de Cia/Ce obtenido para la muestra en la curva de calibracin y conociendo la cantidad de estndar interno (Ce) agregado a la solucin de muestra estandarizada podemos calcular la concentracin de alcohol isoamlico en la muestra (Cia) con las siguientes frmulas: Cia = Ce . Rg En donde: Cia = Alcohol isoamlico expresado en mg por 100 cm de muestra directa. Ce = mg de estndar interno agregados a la solucin de muestra estandarizada. Rg = Relacin de Cia/Ce obtenida en la curva de calibracin. Cib x FD x 1000 G.A.R.

IB =

En donde: IB = G.A.R. = Alcohol isoamlico expresado en mg por 100 cm de alcohol anhidro. Grado alcohlico de la muestra a 288 K (15C) en la escala Gay Lussac, determinado de acuerdo con la NMX-V-013.

Volumen total de la muestra estandarizada FD = Volumen de la muestra diluida en la estandarizacin. Los clculos anteriores pueden hacerse utilizando alturas de pico en lugar de reas. 4.7 Repetibilidad del mtodo

La diferencia entre dos resultados sucesivos, obtenidos en las mismas condiciones, no debe exceder de 15 % del promedio de los mismos. En caso contrario repetir las determinaciones.

4.8

Reproducibilidad del mtodo

La diferencia entre dos determinaciones no deber exceder de 15% del promedio de las mismas. 5 BIBLIOGRAFIA

Horwite W.- Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists Thirteenth Edition, 1980. Editor Washington, D.C. NMX-V-014-S-1980. Bebidas Alcohlicas Destiladas.- Determinacin de Alcoholes Superiores (Aceite de fusel). 6 COMPATIBILIDAD CROMATOGRFICO ENTRE LOS METODOS QUIMICO Y

La diferencia entre las dos determinaciones no deber exceder de 15 % del promedio de las mismas, para concentraciones mayores de 50 mg de alcoholes superiores alcohol isobutlico e isoamlico por 100 cm de alcohol anhidro. En caso de concentraciones menores, la diferencia podr ser mayor debido a alta sensibilidad del mtodo cromatogrfico. 7 CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES

No se puede establecer concordancia por no existir referencia al momento de la elaboracin de la presente. Fecha de aprobacin y publicacin: Abril 14, 1988. Esta Norma cancela a la: NMX-V014-1980.