MICROBIO LOGA APLICADA

PRCTICA No. 7 PRODUCCIN DE PROTENA UNICELULAR MEDIANTE LA TCNICA DEL CULTIVO EXTENDIDO OBJETIVOS. Realizar un proceso fermentativo de produccin de protena unicelular programando la alimentacin de sustrato a partir de la simulacin del proceso basada en los modelos, las constantes cinticas y estequiomtricas que rigen el crecimiento del microorganismo. INTRODUCCIN. Los cultivos por lote co - suministro de sustrato han recibido a lo largo de su historia diversas denominaciones; proceso "Zulauf - trmino introducido por investigadores daneses y alemanes a principios de este siglo -, proceso "batch fed", "Semibatch" y "fed-batch" en los pases de habla inglesa. Este ltimo trmino es actualmente el de uso ms generalizado y fue introducido por Yoshida en 1973. Existen otras denominaciones para casos particulares como son los de: "cultivo extendido" y el de "fed-batch exponencial" que se aplican para describir un cultivo alimentado en donde la concentracin de sustrato limitante del crecimiento es mantenida constante por manipulacin de la velocidad de suministro de nutrientes. Ocasionalmente, estos cultivos son referidos como fermentaciones de volumen variable.. La tcnica del cultivo extendido (CE) se ha venido utilizando desde hace por lo menos medio siglo. Su uso fue completamente emprico hasta bien entrada la dcada de los setenta en que coinciden; el desarrollo de modelos matemticos para este tipo de cultivos con el auge de la aplicacin de los microprocesadores en la tecnologa de fermentaciones, coincidiendo adems con el desarrollo de nuevos sensores y servomecanismos para el seguimiento y control de procesos. Para que un cultivo alimentado sea realmente productivo y en l se obtengan valores elevados de conversin de nutrientes a productos, se requiere de una exacta prediccin de los eventos que ocurrir n en el cultivo, tales como variacin en los indicadores cuantitativos de: crecimiento, produccin de metabolitos y consumo de nutrientes y de oxgeno, del microorganismo; as como de un estricto control de las variables ambientales que afectan al proceso fermentativo. Una inadecuada prediccin de eventos puede resultar en alteraciones ambientales que modifiquen de forma imprevista la fisiologa del microorganismo, provocando una desviacin en la fermentacin hacia la produccin de metabolitos indeseables, abatindose la productividad, el rendimiento o ambos. Dependiendo del objetivo de una fermentacin, la estrategia de alimentacin de nutrientes a un cultivo puede ser de dos tipos: velocidad de suministro constante o variable. En este ltimo caso, la velocidad de suministro se incremento paulatinamente con el fin de sostener un nivel constante del sustrato limitante en el cultivo. La variacin en este suministro puede programarse previamente para satisfacer la demanda creciente del cultivo por nutrientes o bien, puede introducirse un sistema de control capaz de estimar y satisfacer dicha demanda. Tal sistema tendra una serie de sensores que suministraran informacin a una unidad de procesamiento de datos, la cual enviara a servomecanismos perifricos especficos (vlvulas, bombas, motovariadores, etc.) para modificar velocidades de suministro de nutrientes o de oxgeno, cuando esto fuera necesario.

BASES TERICAS DEL CULTIVO EXTENDIDO. a) Ecuaciones de balaiwe. Consideremos un reactor con un volumen inicial [Vo] de medio de cultivo con una concentracin de sustrato limitante [s] y una densidad de poblacin celular [x] que

se incremento con una velocidad especfica de crecimiento [ ]. A un tiempo dado se comienza a suministrar al cultivo un flujo [F] de medio fresco que contiene al sustrato limitante del crecimiento a una concentracin [Sr]. No habiendo salida del mosto del reactor durante el proceso, el volumen de medio en el fermentador variar continuamente, a menos que la alimentacin se haga con sustrato puro (slido o lquido), en cuyo caso el volumen se mantendr constante. Se consideran las siguientes restricciones para el sistema: 1. La suspensin celular es homognea. 2. An cuando la poblacin consiste de un nmero de partculas discretas, su concentracin es o suficientemente alta y el tamao de partcula lo suficientemente pequeo para considerar como una variable continua a la densidad de poblacin [x]. Por otra parte, el volumen ocupado por las partculas representa slo una fraccin del volumen total del sistema y se considera despreciable. 3. Tan pronto como los nutrientes entran al cultivo son instantneamente dispersados en l. 4. Toda la poblacin celular permanece viable. 5. La velocidad especfica de crecimiento [] es una funcin de la concentracin de un solo sustrato limitante [s] y se asume la funcionalidad de Monod. =mxs/(Ks+s) 6. Si el sustrato que limita al crecimiento es la fuente de energa, la cantidad de biomasa producida por unidad de sustrato limitante utilizado no ser constante. Este rendimiento celular [Y] ser una funcin de la velocidad especfica de crecimiento y est dado por la ecuacin: Yxs = Yg/( + mYg) (2) Donde: Yg= Rendimiento celular m ximo para crecimiento. m = Coeficiente de mantenimiento celular. Si el sustrato que limita al crecimiento no es la fuente de energa, el valor de [Yxs] se asume constante. 7. Durante el proceso no existe inhibicin del crecimiento por los metabolitos producidos por el mismo microorganismo. Con base en las anteriores consideraciones, las ecuaciones de balance en el reactor sern las siguientes: Balance de biomasa: Acumulacin global Entrada - Salida + Crecimiento global [d(Vx)/dt]ac = 0 - 0 + [d(Vx)/dt]crec = (Vx) Haciendo (Vx = X): V(dx/dt)ac + x(dV/dt) = dX/dt = X (3) Pero (dV/dt = F); despejando de la ecuacin anterior a (dx/dt) ac y haciendo (F/V=D), se obtiene la velocidad de acumulacin volumtrica de biomasa: (dx/dt)ac = x( - D) (4) Siendo [D] la velocidad de dilucin del cultivo. Balance de sustrato: Acumulacin global = Entrada - Salida - Consumo global. [d(Vs)/dt]ac = F(Sr) - 0 - qs(Vx) = F(Sr) - (/Yxs)(Vx) (5) Siendo (qs = /Yxs), donde [qs] es la velocidad especfica de consumo de sustrato. s(dV/dt) + V(ds/dt) = F(Sr) - (/Yxs)(Vx) Por lo tanto la velocidad volumtrica de acumulacin de sustrato estar dada por:

(ds/dt)ac = D(Sr - s) - x/Yxs (6) Cuando interesa describir la acumulacin de algn producto en el reactor, se hace a partir de la ecuacin de balance para producto. Las ecuaciones de balance anteriores pueden considerarse como las fundamentales para el cultivo alimentado. b) Comportamiento de un cultivo extendido. Partiendo de la base de que el suministro de nutrientes se mantendr igual a la demanda del cultivo; se tendr un valor constante de la concentracin de sustrato limitante [s], y por lo tanto una velocidad especfica de crecimiento [m] constante. En estas condiciones tendremos que en la ecuacin de balance (6), el valor de la acumulacin volumtrica de sustrato ser cero. Por tanto: (F/V)(Sr - s) = (x/Yxs) De donde: F = [(xV)/Y(Sr - S)] (7) Sustituyendo el valor (xV = X) en la ecuacin de balance (3) e integrando entre los lmites (to = 0 -> t): X = Xo e(t) = xV (8) Sustituyendo esta expresin en la ecuacin (7), tendremos: F = [Xo/Yxs(Sr - s)] e(t) (9) Con base en las consideraciones iniciales planteadas (s= cte, = cte.) tendremos que de acuerdo a la ecuacin (2); el valor d [Y] ser tambin constante. Por lo tanto tendremos que el flujo variar exponencialmente de acuerdo a la ecuacin: F = a e(t) (10) Donde: a = [.Xo/Yxs(Sr - S)] = Constante. La variacin en volumen se obtiene sustituyendo el valor de [F] en la diferencial: dV/dt = F = a e(t) Integrando entre los lmites (to = 0 -> t), obtendremos: V=Vo + [Xo/ Yxs(Sr - s)] [e(t) 1] (11) Por sustitucin de las ecuaciones (2) y (11) en la ecuacin (8), obtendremos la trayectoria de la concentracin celular en un cultivo alimentado exponencialmente: x = [(XoVo) e(t)]/(Vo +[xoVo ( + mYg)/(Yg)(Sr - s)][e(t) 1]} (1,2) Para poder alimentar exponencialmente a un cultivo, manteniendo un nivel constante del sustrato limitante, se requiere de un control muy preciso de la velocidad de operacin de Ia bomba de suministro de nutrientes. Para efectuar tal control puede recurriese al uso de equipo relativamente sofisticado; bombas acopladas a un trazador automtico de curvas, con el objeto de alimentar nutrientes de acuerdo a un perfil grfico predeterminado o bien, alimentar bajo el control de una computadora. Cuando no se dispone de tal equipo, es posible hacer una aproximacin al suministro exponencial mediante la adicin (manual o autom tica) de volmenes discretos de medio de suministro a intervalos de tiempo programados, para mantener los niveles de sustrato limitante dentro de un intervalo de valores preestablecidos. METODOLOGA. 1. Se realizar un cultivo por lote en donde se estimarn los siguientes valores: [mx] y [Yxsl. Estos, junto con otros valores obtenidos anteriormente (m, Y g y Ks), para Candida utilis Y-900 en cultivo continuo a 35'C, ser n utilizados para establecer el programa de alimentacin del cultivo.

2. El suministro de medio fresco ser exponencial y se iniciar cuando la concentracin de sustrato llegue a un valor mnimo preestablecido. La alimentacin programada a partir de la simulacin del comportamiento del cultivo, se har por medio de una bomba peristltica de velocidad variable para mantener un valor de [s] constante. 3. Durante el cultivo por lote y el cultivo extendido se tomar n muestras, a las que se les determinar inmediatamente la concentracin celular y la concentracin de glucosa. La concentracin celular se estimar por turbiedad y por peso seco, y la glucosa por ensayo enzimtico con glucosa oxidasa. RESULTADOS. Calcular [mx], y los valores de rendimiento y productividad celular media de Candida utilis Y-900 en el cultivo por lote. Para el cultivo extendido, construir curvas comparativas (tericas y experimentales) de: x = f(t) X = f(t) = f(t) s = f(t) Estimar los valores de productividad media y los de rendimiento celular medio en el cultivo extendido (tericos y experimentales). Discusin de resultados y conclusiones. REFERENCIAS. Araujo, M. D. 1980. Produccin de protena unicelular a partir de desechos de pltano mediante un proceso fermentativo de volumen variable con alimentacin programada. Tesis profesional. ENCB. Dunn, 1. J., y J. R. Mor. 1975. Variable-volume continuous cultivation. Biotechnol. Bioeng. 17.1805-1822. Edwards, V. H. 1970. Extended culture: the growth of Candida utilis at controlled acetate concentrations. Biotechnol. Bioeng. 15: 975-999. Lim, H. C., S. J. Che, y C. C. Creagan. 1.977. An analysis of extended and exponentially fed-batch cultures. Biotechnol. Bioeng. 19:425-433. Matin, A. 1981. Regulation of enzyme synthesis as studied in continuous culture en Continuous Culture of Cells. P. H. Calcott (Ed.), CRC Press, Vol. II:69-97. Ohno, H., E. Nakanishi, y T. Takematsu. 1978. Optimun operating mode of a class of fermentation. Biotechnol. Bioeng. 20:625-633. Pirt, S. J. 1975. 'Principles of Microbial and Cell Cultivation. Blackweil ScientificPublications, London. Reed, G., y H. J. Peppler. 1973. Yeast Technology. AVI Publishing, Co., New York. Wang H. Y., C. L. Cooney, e 1. C. Wang. 1977. Computer aided Baker's yeast fermentations. Biotechnol. Bioeng. 19:69-86. Whitaker,-A. 1980. Fed-batch culture. Process. Bochem. 15: 10-15.

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