Davide Severinopdf

Universidade da Beira Interior
Faculdade de Cincias da Sade
GENTICA DOS
FEOCROMOCITOMAS E PARAGANGLIOMAS FAMILIARES
Dissertao de Mestrado Integrado em Medicina Davide Jos da Silva Severino Maio de 2009
Universidade da Beira Interior
Faculdade de Cincias da Sade
GENTICA DOS FEOCROMOCITOMAS

E PARAGANGLIOMAS FAMILIARES
Dissertao de Mestrado Integrado em Medicina
Por: Davide Jos da Silva Severino
Orientado por: Professor Doutor Manuel Carlos Lemos
Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares
Davide J S Severino
RESUMO
Os feocromocitomas/paragangliomas so neoplasias raras com origem nas clulas cromafins presentes na medula adrenal e na paragnglia simptica e parassimptica. Apesar de a grande maioria ser espordica, uma percentagem significativa, aproximadamente 25%, pode ocorrer em indivduos portadores de mutaes germinais que favorecem o seu desenvolvimento. As formas sindrmicas mais comuns associadas a feocromocitomas/paragangliomas familiares englobam as sndromes de von Hippel-Lindau, a Neoplasia Endcrina Mltipla tipo 2, e as Sndromes de Paragangliomas Familiares. Este trabalho visa discutir as bases genticas destas sndromes e elaborar uma lista das principais mutaes associadas a
feocromocitomas/paragangliomas, salientado a relao gentipo/fentipo presente em cada uma destas doenas. Palavras-chave: feocromocitomas, paragangliomas, VHL, MEN 2, SDH, mutaes
Davide J S Severino
ABSTRACT
The pheochromocytomas/paragangliomas are rare neoplasias that originate in the cromafin cells present in the adrenal medulla and the sympathetic and parasympathetic paraganglia. Although the vast majority are sporadic, a significant percentage, approximately 25%, can occur in individuals with germline mutations that favor their development. The most common syndromic forms associated with familial pheochromocytoma/paraganglioma syndromes include the von Hippel-Lindau, Multiple Endocrine Neoplasia type 2, and Familial Paraganglioma Syndromes. This review aims to discuss the genetic basis of these syndromes and to establish a list of key mutations associated with pheochromocytomas/paragangliomas, emphasizing the genotype/phenotype relationship in each of these diseases. Key words: pheochromocytomas, paragangliomas, VHL, MEN 2, SDH, mutations
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AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Doutor Manuel Carlos Lemos, professor na Faculdade de Cincias da Sade da Universidade da Beira Interior e especialista em Endocrinologia, pela grande honra ter aceite ser o orientador desta tese e por toda a disponibilidade, auxlio, tempo dispendido e simpatia.
Ao amor da vida, Anne Carvalho, pelo permanente apoio e colaborao na execuo desta tese, ajudando a superar os obstculos e dificuldades com toda a pacincia e disponibilidade.
Aos meus pais, pelo permanente apoio e estimulao ao longo do meu percurso acadmico e por sempre proporcionarem condies de vida compatveis com a realizao desta tese.
A todos os tutores, professores, tcnicos, colegas e funcionrios que comigo se cruzaram e que, de uma forma mais ou menos activa, possibilitaram o desenvolvimento de atitudes e aptides, no s profissionais, mas tambm, e mais importantes, pessoais e sociais no crescimento da minha pessoa.
III
Davide J S Severino
NDICE
RESUMO ........................................................................................................... I ABSTRACT ........................................................................................................ II AGRADECIMENTOS .......................................................................................... III NDICE ............................................................................................................ IV LISTA DE FIGURAS ............................................................................................ VI LISTA DE ABREVIATURAS ................................................................................. VII 1 - INTRODUO .............................................................................................. 1
A) B)
ENQUADRAMENTO DO TEMA.................................................................................... 1 OBJECTIVOS ........................................................................................................ 2
2 - MTODOS .................................................................................................... 4 3 - SNDROME DE VHL ....................................................................................... 6

A) B)
GENE VHL ........................................................................................................... 8 PROTENA VHL..................................................................................................... 9 (i) A pVHL como reguladora dos genes induzveis pela hipxia.................................................... 9 (ii) O complexo pVHL-ubiquitina ligase........................................................................... 10 (iii) Ubiquitinizao do HIF pela pVHL ........................................................................... 10 (iv) Hidroxilao do HIF ........................................................................................... 11 (v) Funes alternativas da pVHL ................................................................................. 11 MECANISMOS FISIOPATOLGICOS DA SNDROME DE VHL ................................................. 12 MODELOS ANIMAIS PARA A SNDROME DE VHL.............................................................. 13 CORRELAES GENTIPO-FENTIPO NA SNDROME DE VHL ............................................. 14
C) D) E)
4- SNDROME MEN 2 ......................................................................................... 18

A) B) C) D) MEN 2A ............................................................................................................ 18 MEN 2B ............................................................................................................ 19
GENE RET ......................................................................................................... 20 PROTENA DO GENE RET ........................................................................................ 20 (i) Activao do receptor RET pelo GFL .......................................................................... 21
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(ii) Activao do RET por outros factores de crescimento ......................................................... 21 (iii) Vias de sinalizao intracelulares ............................................................................. 22
E) F) G)
MECANISMOS FISIOPATOLGICOS DA SNDROME MEN 2 ................................................... 23 MODELOS ANIMAIS PARA A SNDROME MEN 2 ............................................................... 23 CORRELAES GENTIPO FENTIPO NA SNDROME MEN 2 ............................................ 24
5 SNDROMES DE PARAGANGLIOMAS FAMILIARES ............................................ 27

A) B) C) D) PGL 1 .............................................................................................................. 28 PGL 3 .............................................................................................................. 28 PGL 4 .............................................................................................................. 29
COMPLEXO SUCINATO-DESIDROGENASE .................................................................... 29 (i) Genes SDH ...................................................................................................... 29 MECANISMOS FISIOPATOLGICOS DAS SNDROMES DE PARAGANGLIOMAS FAMILIARES ............... 33 MODELOS ANIMAIS PARA AS SNDROMES DE PARAGANGLIOMAS FAMILIARES ........................... 33 CORRELAES GENTIPO-FENTIPO NAS SNDROMES DE PARAGANGLIOMAS FAMILIARES .......... 34 (ii) Complexo Mitocondrial II ...................................................................................... 30
E) F) G)
6 - VIA TUMORIGNICA COMUM ....................................................................... 38 7 - TESTES GENTICOS ...................................................................................... 42 8 - CONCLUSES E PERSPECTIVAS FUTURAS ....................................................... 45 BIBLIOGRAFIA.................................................................................................. 47 ANEXO 1 MUTAES IDENTIFICADAS NO GENE VHL ......................................... 63 ANEXO 2 - MUTAES IDENTIFICADAS NO GENE RET .......................................... 72 ANEXO 3 - MUTAES IDENTIFICADAS NO GENE SDHB ........................................ 74 ANEXO 4 - MUTAES IDENTIFICADAS NO GENE SDHC ........................................ 77 ANEXO 5 - MUTAES IDENTIFICADAS NO GENE SDHD ....................................... 78
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Estrutura do gene VHL e localizao das principais mutaes exnicas identificadas.. . 15 Figura 2 - Estrutura do gene RET e localizao das principais mutaes exnicas identificadas.... 25 Figura 3 - Estrutura do gene SDHB e localizao das mutaes exnicas identificadas.. ............ 35 Figura 4 - Estrutura do gene SDHC e localizao das mutaes exnicas identificadas. ............. 35 Figura 5 - Estrutura do gene SDHD e localizao das mutaes exnicas identificadas. ............. 36 Figura 6 - Modelo unificador dos genes envolvidos na gnese das sndromes de feocromocitomas/paragangliomas familiares. .............................................................. 39 Figura 7 - Algoritmo para o diagnstico gentico dos feocromocitomas/paragangliomas.. ........ 43
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LISTA DE ABREVIATURAS
ADN: cido desoxirribonucleico Ala: alanina AP 2: Activating Protein 2 aPKC: protena cinase C Arg: arginina ARNm: cido ribonuclico mensageiro ARTN: artemin Asn: asparagina Asp: aspartato ATP: adenosina trifosfato Ca2+: io clcio c-Jun: factor de transcrio c-jun CoA : coenzima A CRG: Clinical Research Group Cul 2: cullina 2 Cys: cistena DAG: diacilglicerol Egl-9: Egg Laying defective nine EgLN 1, 2 e 3: Egg Laying defective Nine type 1, 2 and 3 FAD: Flavin Adenine Dinucleotide Feo: feocromocitoma GAB 2: Growth factor receptor-bound protein 2-Associated Binding protein GDNF: Glial cell line-Derived Neurotrophic Factor GFL: Glial cell line-derived neurotrophic factor - Family of Ligands GFR : GDNF Family Receptors alpha Gln: glutamina Glu: glutamato Gly: glicina GRB7/10: Growth factor Receptor-Bound protein docking proteins 7/10 GTP: guanosina trifosfato HIF : subunidade alfa do factor induzvel pela hipxia HIF: factor induzvel pela hipxia HIF-1: subdomnio 1 do HIF His: histidina Ile: isoleucina IP 3: inositol-1,4,5-trifosfato junB: factor de transcrio junB Kb: kilopares de bases nucleotdicas
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Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares kDa: kilodalton Leu: leucina Lys: lisina MEN 2A: neoplasia endcrina mltipla tipo 2A MEN 2B: neoplasia endcrina mltipla tipo 2B MEN: neoplasia endcrina mltipla Met: metionina MLTP: Mutations Leading to Truncated Protein NADH: Nicotinamide Adenine Dinucleotide NRF 1 e 2: Nuclear Respiratory Factor 1 e 2 NRTN: neurturin Para: paraganglioma Pb: pares de bases PDGF : Platelet-Derived Growth Factor beta PGL 1: paragangliomas familiares tipo 1 PGL 2: paragangliomas familiares tipo 2 PGL 3: paragangliomas familiares tipo 3 PGL 4: paragangliomas familiares tipo 4 Phe: fenilalanina PLC: fosfolpase C Pro: prolina PSPN: persephin
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pVHL 19: forma curta da protena de VHL pVHL 30: forma longa da protena de VHL pVHL: protena de von Hippel-Lindau Rbx 1: ring-box type 1 RET 150: forma imatura do receptor RET com 150 kDa de peso molecular RET 170: forma matura do receptor RET com 170 kDa de peso molecular RET: rearranged during transfection SDH: complexo sucinato desidrogenase SDHA: subunidade A do complexo sucinatodesidrogenase SDHB: subunidade B do complexo sucinatodesidrogenase SDHC: subunidade C do complexo sucinatodesidrogenase SDHD:subunidade D do complexo sucinatodesidrogenase Ser: serina SHANK 3: multiple ankyrin repeat domains 3 Shc: Src-homology collagen SNC: sistema nervoso central Sp1: Specificity Protein 1
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Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares Tyr: tirosina TGF : Transforming Growth Factor alpha Thr: treonina TNF : factor de necrose tumoral alfa Trp: triptofano
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UTR: untranslated region Val: valina VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor VHL: von Hippel-Lindau
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1- INTRODUO
A) ENQUADRAMENTO DO TEMA
Os feocromocitomas e os paragangliomas so tumores derivados das clulas endcrinas provenientes da crista neural. Os primeiros surgem na medula supra-renal a partir das clulas cromafins a presentes, enquanto que os segundos so provenientes das clulas cromafins localizadas na paragnglia simptica e parassimptica distribuda ao longo do eixo para-artico e para-vertebral, desde a base do crnio at ao pavimento plvico, sendo, na sua grande maioria, intra-abdominais e adjacentes s glndulas supra-renais (85%). 1, 2 A sua incidncia mundial ronda os 2 a 8 milhes de casos por ano, sendo a sua prevalncia de 0,2 a 4% entre a populao hipertensa e de aproximadamente 4% entre a populao com incidentalomas adrenais. 2 Esta neoplasia muitas vezes conhecida como estando associada regra dos 10%, de acordo com a qual 10% so extra adrenais; 10% so encontradas em indivduos sem hipertenso; 10% so malignas; 10% so bilaterais; 10% ocorrem em idade peditrica e 10% so hereditrias. No entanto, um estudo longitudinal realizado por Neumann et al3 colocou em dvida esta suposio. Este estudo envolveu 241 indivduos portadores de feocromocitoma e aps a realizao do estudo gentico, constatou-se a existncia de mutaes germinais num dos quatro genes associados a feocromocitomas e paragangliomas em quase 25% dos casos. Assim, 30 pessoas apresentavam mutaes no gene VHL (45%), 13 no gene RET (20%), 12 no SDHB (18%) e 11 no gene SDHD (17%). 2, 3 A grande maioria dos feocromocitomas e paragangliomas so espordicos, mas existem sndromes caracterizadas pela existncia de uma predisposio familiar para o seu desenvolvimento. De acordo com a referida regra, estas representariam 10% de todos os casos,
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mas o estudo, atrs referido, apontou para a possibilidade desta percentagem ser maior. De facto, alguns estudos mais recentes prevem uma prevalncia, para este tipo de neoplasias, que ronda os 21 a 30%.4,5 Estas formas hereditrias podem diferir, entre si, quanto frequncia de desenvolvimento da neoplasia, no seu potencial maligno e no fentipo bioqumico associado. Desta forma, a identificao dos genes associados a estas sndromes pode no s permitir o diagnstico gentico, mas tambm contribuir para os conhecimentos dos mecanismos tumorignicos e identificao de novos alvos teraputicos. 4,5 A necessidade de melhor compreender estas sndromes e as especificidades a elas associadas motivaram-me para a elaborao desta tese de mestrado.
B) OBJECTIVOS
O conhecimento das influncias genticas nos feocromocitomas e paragangliomas tem adquirido uma importncia cada vez maior. Neste sentido, proponho-me rever a literatura cientfica mais relevante e analis-la, de forma a avaliar o estado-da-arte sobre este tema. Como objectivos principais, destaco os seguintes: 1. Realizar uma reviso sobre as principais sndromes associadas a
feocromocitomas/paragangliomas familiares, nomeadamente: Sndrome de von HippelLindau, Neoplasia Endcrina Mltipla tipo 2 e Sndromes de Paragangliomas Familiares; 2. Rever os principais aspectos associados aos vrios genes envolvidos nestas sndromes, nomeadamente VHL, RET, SDHB, SDHC e SDHD; 3. Descrever as principais correlaes gentipo-fentipo associadas s vrias sndromes e a sua importncia clnica; 4. Descrever o modo como os vrios genes se inter-relacionam numa via tumorignica comum;
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5. Elaborar uma lista das mutaes descritas na literatura para os vrios genes envolvidos nestas sndromes.
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2 - MTODOS
Para a realizao desta tese foram usadas as seguintes bases de dados: PubMed, Medscape, Google Scholar e OMIM. A estratgia de pesquisa, nestas bases, teve quatro grupos de itens: (i) Revises das principais sndromes abordadas - para este tpico optaram-se pelas seguintes palavras-chaves: familial pheochromocytoma; MEN 2; Paragangliomas; von Hippel-Lindau. (ii) Para abordar todos os aspectos clnicos e genticos da sndrome de VHL utilizei como palavras-chaves: mutations VHL; genotype correlations VHL, animal models. (iii) Relativamente sndrome MEN 2, optei por usar como palavras-chaves as seguintes: MEN 2A; MEN 2B; mutations RET; genotype correlations MEN2; animal models. (iv) Para as Sndromes de Paragangliomas Familiares recorri s palavras-chaves: succinate dehydrogenase complex II; SDHB; SDHB mutations; SDHC; SDHC mutations; SDHD; SDHD mutations; PGL 1; PGL 3; PGL 4. Utilizei a base de dados OMIM para efectuar uma pesquisa mais especfica e direccionada para alguns temas relacionados com a componente gentica do trabalho, nomeadamente modelos animais e correlaes gentipo-fentipo. Foram ainda objecto de pesquisa alguns livros da rea da Medicina Interna e Endocrinologia. Devido natureza do trabalho, no foram colocadas restries na data de pesquisa, excepto quando se procuraram artigos mais generalistas (campo i), onde se optou por obter os artigos mais recentes possveis. Houve restrio de idiomas tendo-se privilegiado artigos escritos em ingls, portugus, espanhol e francs.
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Decidi exluir os casos de feocromocitomas que ocorrem no contexto da MEN tipo 1 e da Neurofibromatose tipo 1 devido sua baixa incidncia nestas sndromes (0,1% a 5,7% na Neurofibromatose e ainda mais baixa na MEN 1). 5
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3 - SNDROME DE VHL
A sndrome de VHL caracterizada por hemangioblastomas cerebrais, medulares e retinianos, por quistos e carcinomas das clulas renais, por feocromocitomas e tumores do saco endolinftico, sendo as suas manifestaes e severidade muito variveis.1, 4 Os hemangioblastomas do SNC so a leso caracterstica desta sndrome. Aproximadamente 80% desenvolvem-se no crebro, enquanto que os restantes 20% se localizam na medula espinhal. Dentro do crebro, a grande maioria apresenta uma localizao infratentorial com preferncia pelos hemisfrios cerebelares. As neoplasias multifocais, quer sincrnicas quer metacrnicas, so frequentes no SNC. Os hemangioblastomas medulares so intradurais ocorrendo, principalmente, nas regies cervicais e torcicas, mas podem, em situaes raras, envolver toda a medula ou afectar os nervos perifricos. 6, 7 Os sintomas clnicos dependem principalmente da localizao do tumor. Se infratentoriais, as cefaleias, emese e alteraes da marcha predominam no quadro clnico, ao passo que se a sua localizao for supratentorial, o modo de apresentao depende da sua localizao especfica. Como caractersticas globais, estes tumores apresentam um crescimento lento mas a presena de formaes qusticas, que podem apresentar um desenvolvimento mais rpido que a restante neoplasia, pode ocasionar uma hidrocefalia com papiledema. Os hemangioblastomas medulares manifestam-se por dor, mas medida que a doena evoluiu comum desenvolveremse dfices sensitivos e motores por compresso da medula espinhal. 7, 8 Os hemangioblastomas retinianos so, histologicamente, em tudo idnticos aos hemangioblastomas presentes no SNC. Cerca de 70% dos indivduos afectados por esta sndrome so portadores de hemangioblastomas retinianos pela idade dos 25 anos. Estes localizam-se com frequncia nas regies temporal e perifrica da retina, mas situam-se no plo posterior e no disco ptico em 1 e 8% dos casos, respectivamente. Podem ser assintomticos, sendo detectados
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durante o decorrer de um exame oftalmolgico de rotina ou podem cursar com defeitos do campo visual ou diminuio da acuidade visual devido ao descolamento da retina, exsudao ou hemorragia. O nmero de angiomas no parece aumentar com a idade mas a probabilidade de perda de viso aumenta com esta. 9, 10 Os quistos renais na sndrome de VHL so frequentemente mltiplos. O carcinoma renal, principalmente o tipo de clulas claras, pode desenvolver-se quer dentro do quisto, quer a partir do parnquima envolvente e ocorre em 40% dos indivduos afectados, sendo a principal causa de mortalidade associada a esta patologia. 7 Os feocromocitomas ocorrem em 10 a 20% dos indivduos. A idade de apresentao varia entre os 10 e os 40 anos, com uma idade mdia de cerca de 20 anos. Podem manifestar-se como uma hipertenso arterial mantida ou episdica ou podem ser totalmente assintomticos. Esto, por norma, localizados a uma ou a ambas as glndulas adrenais, podendo, tambm, situar-se ao longo de todo o trajecto simptico localizado no trax e abdmen (paragangliomas) ou na cabea e pescoo (quemodectomas - 10% do total de casos). Possuem um dimetro superior a 2 cm e, por norma, so de natureza benigna apesar de poderem sofrer, em casos raros, uma degenerao maligna (< 5%). 4, 11 As leses pancreticas so, na sua grande maioria, quistos simples. Apesar de serem com frequncia mltiplas, raramente causam insuficincia endcrina ou excrina a no ser que sejam extensas. Ocasionalmente, se localizadas na cabea do pncreas, podem causar obstruo biliar e um quadro clnico de ictercia colesttica. Os tumores neuroendcrinos podem desenvolver-se mas no so hormonalmente activos. Estes tm um crescimento lento, mas um comportamento maligno, mais notrio naqueles com um dimetro superior a 3 cm. 7 Os tumores do saco endolinftico podem manifestar-se como uma hipoacsia de gravidade varivel, muitas vezes severa, profunda e de incio sbito. Outras formas de apresentao incluem vertigens e acufenos. As neoplasias de grandes dimenses podem envolver
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outros nervos cranianos e ocasionar dfices isolados dos mesmos. Este tipo de neoplasias observado em 10% dos indivduos portadores desta patologia. Em raros casos podem ser malignos. 12 Os cistadenomas epididimrios e papilares so relativamente comuns nos homens portadores desta sndrome. Raramente causam problemas, mas alguns casos bilaterais encontramse descritos como causa de esterilidade. A leso equivalente nas mulheres o cistadenoma papilar do ligamento largo, que no entanto menos comum. 7 Como foi possvel constatar, a variabilidade fenotpica associada doena de von HippelLindau grande, mas as caractersticas dos quadros clnicos possibilitam a sua diviso em vrios tipos e subtipos. Desta forma, possvel classificar esta doena em tipo I, quando o feocromocitoma no faz parte do quadro clnico, e em tipo II quando o mesmo compe o referido quadro. Alm desta diviso, a variante II pode, ainda, ser subclassificada nos tipos IIA, IIB e IIC. O subtipo IIA caracteriza-se pela presena de feocromocitomas e hemangioblastomas do SNC e pela ausncia de carcinoma das clulas renais. O subtipo IIB engloba feocromocitomas, carcinoma das clulas renais e outros tumores do sistema nervosos central, enquanto que o subtipo IIC apresenta unicamente feocromocitomas. 1, 3 Esta sndrome autossmica dominante resulta de mutaes no gene de supresso tumoral VHL, localizado no cromossoma 3p25-26. Tem uma incidncia aproximada de 1 caso por cada 36.000 nascimentos/ano, dos quais 20% resultam de mutaes de novo, no existindo, portanto, histria familiar da doena. 2
A) GENE VHL
O gene VHL apresenta 10.444 pb de ADN genmico, tendo a molcula de ARNm, por ele codificada, um total de 4.700 pb. Apresenta dois codes iniciadores (metionina 1 e metionina 54) e a regio codificadora da protena proveniente do primeiro codo iniciador possui 639 pb que se encontram distribudos por 3 exes de 340, 123 e 179 pb. 13
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A regio promotora apresenta vrios locais de ligao para numerosos factores de transcrio, entre os quais se encontra o Sp 1, importante para o controlo da transcrio deste gene. 14
B) PROTENA VHL
O gene VHL apresenta dois produtos conhecidos que parecem reflectir o uso de codes iniciadores alternativos. O produto mais longo, denominado de pVHL 30, constitudo por 213 aminocidos e tem um peso aproximado de 24 a 30 kDa, ao passo que o segundo, denominado de pVHL 19, composto pelos aminocidos 54 a 213 da pVHL 30 e tem um peso, aproximado, de 19 kDa. 15 A pVHL apresenta um movimento contnuo entre o ncleo e o citoplasma que se revela fundamental para a sua funo. Alguns dados apontam para a possibilidade da pVHL 30 se localizar preferencialmente no citoplasma, enquanto a pVHL 19 parece situar-se predominantemente no ncleo, o que sugere que as suas funes, apesar de sobrepostas, no so idnticas. 15
(i) A pVHL como reguladora dos genes induzveis pela hipxia Os tumores ligados inactivao do gene VHL so muito vasculares e produzem factores angiognicos como o VEGF. Para alm disso, os carcinomas renais, hemangioblastomas e feocromocitomas tm sido associados presena de eritrocitose paraneoplsica devida hiperproduo de eritropoietina. Estes ARNm so prototpicos de molculas de ARNm induzveis pela hipoxia e pode-se dizer que a hiper-expresso destes ARNm caracterstica das clulas VHL-/-. Este facto foi confirmado pela descoberta de que este tipo de clulas v a hiper-expresso desses ARNm suprimida aps a reposio da funo da pVHL e na presena de oxignio. 16, 17
Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares (ii) O complexo pVHL-ubiquitina ligase
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Estudos bioqumicos revelaram que as pVHL formam um complexo multi-proteico que engloba quatro componentes denominados de elongina B e C, Cul 2 e Rbx 1. A elongina C e a Cul 2 so similares a outros componentes individuais de complexos multi-proteicos presentes em leveduras, os quais marcam protenas especficas para a degradao, atravs de fenmenos de ubiquitinizao. 18 A estrutura tridimensional do complexo multi-proteico pVHL sustenta a hiptese de que este complexo, tal como o presente nas leveduras, possa ter actividade de ubiquitina ligase. Com esta ideia em mente, alguns investigadores cedo mostraram que, de facto, os complexos pVHL so dotados da capacidade de ubiquitinizao, regulando substratos especficos para a degradao.
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(iii) Ubiquitinizao do HIF pela pVHL Muitos dos genes regulados pela hipxia encontram-se sob o controlo de factores de transcrio referidos como HIF. Este constitudo por duas subunidades no idnticas (alfa e beta) e liga-se a sequncias especficas de ADN, favorecendo o processo de transcrio gnica. A subunidade beta do HIF uma protena estvel, enquanto que a alfa se apresenta instvel na presena de oxignio, restringindo a formao do HIF activo a condies de hipxia. 19 Em 1999, Maxwell et al19, mostraram que as clulas VHL-/- no evidenciavam degradao da subunidade , na presena de oxignio e que a pVHL e a subunidade HIF podiam ligar-se uma outra. No seguimento destas observaes, foi estabelecido que o complexo VHL tem, de facto, capacidade ubiquitina ligase e que esta se encontra direccionada para a ubiquitinizao e consequente destruio da subunidade alfa do HIF, constituindo o elo de ligao entre a inactivao da pVHL e a hiper-expresso de ARNm induzveis pela hipxia.
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Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares (iv) Hidroxilao do HIF
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A estabilizao do HIF , que ocorre em condies de hipxia, implica a sua ligao pVHL. Os primeiros estudos identificaram um subdomnio presente nesta subunidade, denominado de HIF-1, que era determinante para a instabilidade da molcula na presena de oxignio. Outros grupos mostraram que o HIF-1 sofre uma modificao ps-translacional dependente de oxignio para ser reconhecida pela pVHL. Este fenmeno parece relacionar-se com a hidroxilao de resduos de prolina, bastante conservados, presentes no referido subdomnio. A anlise da estrutura tridimensional do HIF ligado pVHL revelou que os grupos hidroxilo so crticos para esta associao ao interagir com domnios especficos presentes na pVHL. 20 Estudos em modelos animais conduziram identificao do gene codificador das prolilhidroxilases, acima referidas, denominado de Egl-9. As clulas dos mamferos contm trs genes EgLN 1, 2 e 3 - ancestralmente relacionados com o Egl-9, e os seus produtos proteicos so capazes de hidroxilar o HIF in vitro. A EgLN 1 parece ser a prolil-hidroxilase principal, no entanto as isoformas 2 e 3 podem desempenhar um importante papel em condies de hipxia prolongada. 21 As prolil-hidroxilases apresentam, na sua constituio, um tomo de oxignio e, como consequncia, alteraes na concentrao de oxignio afectam a actividade cataltica das vrias isoenzimas e o processo de hidroxilao do HIF . 21
(v) Funes alternativas da pVHL Para alm de todas as funes atrs referidas, o gene VHL parece desempenhar um papel preponderante no processo de montagem de protenas, pois verifica-se uma deposio anmala da fibronectina na matriz extracelular em carcinomas renais e em embries de ratinhos Vhl-/-. A pVHL participa na proteco, in vivo, dos microtbulos contra a despolimerizao, estando esta funo relacionada com a pVHL 30. Alm destas, este gene encontra-se envolvido na manuteno
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ciliar e no processo embriognico, onde parece exercer uma aco fulcral na diferenciao e proliferao neuronal. 22,23
C) MECANISMOS FISIOPATOLGICOS DA SNDROME DE VHL

A maioria das pessoas portadoras da sndrome de VHL herdou um alelo do gene VHL mutado de um familiar afectado pela doena e um alelo normal de um familiar no afectado. De acordo com a hiptese two-hit proposta por Knudson, o processo carcinognico inicia-se quando ambos os alelos so inactivados. As mutaes germinais esto presentes em todas as clulas individuais afectadas, no entanto, apenas aquelas clulas submetidas a eventos mutacionais no alelo normal desenvolvem o processo tumoral. 4, 14 Perante situaes de pVHL ausentes ou disfuncionais, a sua capacidade de supresso tumoral encontra-se alterada. A referida funo supressora depende, em larga medida, da capacidade de degradao do HIF , pelo que a alterao da funo da pVHL contribui para o processo carcinognico. Quando a pVHL est ausente ou v a sua funo alterada, o HIF pode estimular os processos angiognicos por meio da expresso de VEGF e/ou PDGF , os quais desempenham um importante papel na proliferao das clulas endoteliais e pericitos. Este facto pode explicar a natureza vascular dos tumores associados a esta sndrome, em particular os hemangioblastomas e carcinomas das clulas renais. Alm do mais, a elevada permeabilidade vascular, resultante da hiper-expresso de VEGF, parece ser a base do edema peritumoral e quistos observados com frequncia nesta patologia. Um outro processo que pode contribuir para o mecanismo carcinognico prende-se com a hiper-produo de TGF , que alm de ser um potente factor neurotrfico, pode favorecer a expresso do receptor do factor de crescimento epidrmico. Outros efeitos independentes de HIF podem, tambm, estar envolvidos na gnese tumoral. Estes englobam processos to variados como: (1) alterao do ciclo celular, uma vez que se verifica que os indivduos afectados apresentam uma diminuio do nmero de clulas que
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entram na fase G0 do ciclo celular; (2) potenciao dos fenmenos angiognicos atravs da hiper secreo de VEGF, como consequncia de uma alterao do processo de transcrio; (3) alteraes na matriz extracelular. 4, 14, 23
D) MODELOS ANIMAIS PARA A SNDROME DE VHL

Para analisar a importncia do gene VHL durante o desenvolvimento embrionrio, Gnarra et al24 desenvolveram linhagens de ratinhos knockout para este gene. Desta forma, verificaram que os ratinhos heterozigticos Vhl+/- sobreviviam at aos 15 meses sem evidncia de qualquer doena espontnea, mas que os ratinhos homozigticos Vhl-/- desenvolviam leses placentares entre os 9,5 e os 10,5 dias de gestao e morriam in utero entre os 10,5 e os 12,5 dias. O trofoblasto parece ser normal e vivel at aos 9,5 dias de gestao mas no progride para o sinciciotrofoblasto. Alm do mais, entre os 11,5 e os 12,5 dias o labirinto vascular placentar mostra uma grande disrupo e perda de estrutura culminando no desenvolvimento de hemorragias e de enfartes placentares, sendo esta alterao a causa da elevada mortalidade in utero destes ratinhos. Associada a estes fenmenos, verifica-se uma diminuio da expresso do VEGF devido a uma menor estabilizao do seu ARNm, cuja funo realizada pelo produto do gene Vhl. A perda de um dos alelos do gene Vhl no parece estar associada a uma predisposio significativa para o desenvolvimento de neoplasias renais, pois os ratinhos Vhl+/- no revelaram qualquer diferena, estatisticamente significativa, na frequncia de neoplasias renais comparativamente aos ratinhos normais Vhl+/+ aps a administrao de 50 a 200 mg/kg de estreptozotocina, um conhecido agente carcinognico renal. Apesar dos ratinhos Vhl+/- no exibirem uma maior frequncia de leses renais, eles tendem a desenvolver leses proliferativas vasculares no fgado, tero, ovrio, bao e corao que variam entre angiectasias e hemangiosarcomas. Estas leses ocorrem em mltiplos rgos, mas as de origem heptica so claramente as de maior incidncia. Este padro de mltiplas neoplasias vasculares que ocorrem em ratinhos Vhl+/- assemelha-se ao da sndrome de VHL no humano. 25
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E) CORRELAES GENTIPO-FENTIPO NA SNDROME DE VHL

A sndrome de VHL apresenta uma grande variabilidade inter-individual, pelo que as correlaes entre o gentipo e fentipo tm, cada vez mais, maior importncia. Durante a realizao desta tese identifiquei 357 mutaes diferentes para o gene VHL (ver anexo 1), as quais consistem em mutaes do tipo missense (46,8%), frameshift (36,7%), nonsense (8,7%), inframe (4,2%) e splice site (3,6%). Estas encontram-se distribudas por toda a sequncia codificadora deste gene existindo, no entanto, alguns locais onde, pelas mais variadades razes, estas assumem uma especial importncia (ver figura 1). As mutaes que afectam o gene VHL podem impedir a sua expresso mutaes do tipo frameshift, nonsense ou splice site - ou podem conduzir expresso de uma protena funcional, embora com algumas alteraes estruturais mutaes do tipo missense. Sabe-se que as mutaes do tipo missense, que resultam no subtipo I desta sndrome, diminuem a estabilidade e alteram a capacidade de ligao e interaco com a elongina C e HIF , e que as associadas ao subtipo II tendem a afectar os aminocidos responsveis pela ligao da elongina C pVHL. Esta alterao foi exemplificada por Olschwang et al26 que, aps a anlise de 92 doentes, detectaram 61 mutaes diferentes, das quais 18 ocorriam a montante ao codo 156, uma regio que, quando afectada, altera a capacidade de interaco entre a pVHL e as elonginas B e C. As mutaes missense associadas aos subtipos IIA e C resultam numa protena que retm a capacidade de ubiquitinizar o HIF , na presena de oxignio, em contraste com as mutaes que esto na base da variante sindrmica IIB. 23
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c.481C>G c.481C>T c.482G>A c.482G>C c.484T>C c.485G>A c.485G>T c.486C>G
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c.232A>C c.233A>C c.233A>G c.233A>T c.233insTCT c.229_231delTGC c.230delG c.230_232delGCA
c.238A>C c.238A>G c.239delG c.239G>A c.239G>T c.240T>A c.240T>G c.241C>T c.242delC c.244C>T c.244delC c.245G>C
c.496G>T c.497T>A c.497_501delTCCGG c.498delC c.498A>G c.469delA c.470C>T c.472C>G c.472insTTT c.472_473delCT c.473T>A c.473T>C c.474_476delGA AinsC c.499C>G c.499C>T c.500G>A c.502insTTGTTCGT c.506T>C c.508G>T c.509T>A c.509T>G c.509T>C
2
c.523delT c.523T>G c.524delA c.525C>G c.525delC c.526delA c.532ins8 c.533T>A c.533T>C c.533T>G
3
c.562C>G c.562delC c.563delT c.563T>A c.563T>C c.538A>G c.539T>A c.540delC c.540_543delCGTC
c.224T>G c.224_226delTCT c.226T>A c.226_228delTTC c.227T>C c.227insC c.227_229delTCT
Figura 1 - Estrutura do gene VHL e localizao das principais mutaes exnicas identificadas. Estas mutaes afectam sobretudo duas regies, situadas entre os codes 75 e 82 no exo 1, e entre os codes 157 e 189 no exo 3. Por razes de clareza, os intres e as regies UTR no foram representados.
Em 1995, Chen et al27 demonstraram que microdeleces/inseres, mutaes nonsense ou delees extensas ocorriam em 56% das famlias com doena tipo I, enquanto que na doena tipo II as mutaes missense ocorrem em 96% das pessoas afectadas. De salientar que mutaes especficas no codo 167 representam 43% do total de mutaes encontradas na doena tipo II. Zbar et al28 realizaram uma anlise com vista a detectar mutaes germinais em 469 famlias portadoras da sndrome de VHL provenientes da Amrica do Norte, Europa e Japo, tendo identificado um total de 137 mutaes distintas. Os resultados obtidos permitiram verificar: (1) que mutaes similares produziam fentipos semelhantes nos Caucasianos e Japoneses, tendo sido identificados trs fentipos distintos: a) carcinoma renal sem feocromocitoma, b) carcinoma renal com feocromocitoma e c) feocromocitoma isolado; (2) que existiam seis eventos mutacionais mais comuns (c.226_228delTTC; c.233A>G; c.481C>T; c.499C>T; c.500G>A;
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c.533T>C); (3) que as mutaes que afectavam o codo 167 (c.499C>T; c.500G>A) estavam associadas a um maior probabilidade de desenvolvimento de feocromocitoma e carcinoma das clulas renais (risco de 62%); (4) que o gene VHL apresenta trs regies, onde a frequncia de eventos mutacionais maior, localizando-se uma dessas regies entre os codes 75 e 82, outra entre o 157 e 189 (local de ligao s elonginas) e a ltima regio entre os exes 2 e 3. Hes et al29 conduziram uma investigao que lhes permitiu verificar que famlias com delees germinais do gene VHL (parciais ou totais) apresentavam um baixo risco de desenvolverem feocromocitoma, mas possuam uma forte associao com a ocorrncia de hemangiomas do sistema nervoso central. Ong et al30 verificaram que a idade de incio desta patologia era significativamente mais precoce e que os riscos, relacionados com a idade, de angiomas da retina e de carcinoma renal eram mais elevados em indivduos com mutaes nonsense ou frameshift, relativamente aos que apresentavam mutaes missense. Os resultados obtidos confirmaram, ainda, a associao entre o feocromocitoma e mutaes missense, particularmente quando estas resultavam em substituies dos aminocidos mais superficiais. Gallou et al31 investigaram o fentipo renal em 247 indivduos portadores da sndrome de VHL, tendo identificado 92 mutaes diferentes. Analisando o exo onde estas ocorriam, verificou-se que o mais afectado era o 3, com um total de 43 mutaes, e que o menos afectado era o exo 1, com um total de 26 mutaes. A anlise gentipo-fentipo mostrou a existncia de um elevado nmero de mutaes que afectavam o terminal amina da pVHL entre os indivduos com leses renais, estando estas mutaes localizadas, mais frequentemente, no codo codificador do aminocido 131. Verificou-se, tambm, que 105 das 129 mutaes (81%) do tipo MLTP ou grandes rearranjos estavam associadas a uma frequncia mais elevada de leses renais, enquanto que apenas 63% dos indivduos com mutaes missense desenvolviam este tipo de leses. As mutaes do tipo MLTP esto presentes ao longo de todo o gene VHL, no se verificando a
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existncia de uma correlao entre o tamanho da pVHL e a severidade do fentipo renal. Por sua vez, as mutaes do tipo missense encontravam-se distribudas entre os codes 52 e 188, com 45% a localizarem-se entre os codes 157 e 172. Analisando a distribuio das mutaes pela pVHL, identificaram-se duas zonas de maior densidade mutacional, que se correlacionavam com uma maior probabilidade de desenvolvimento de leses renais. As mutaes que afectam a primeira zona (entre os codes 74 e 90) parecem estar associadas a um maior risco de desenvolvimento de carcinoma renal do que as que afectam a segunda (entre os codes 130 e 136), que se associam a uma maior probabilidade de patologia renal benigna (p. ex. quistos renais) sem contudo conferirem um maior risco de tumores renais malignos. Wong et al32, em 2007, caracterizaram as mutaes germinais detectadas em 335 indivduos portadores da sndrome de VHL associada a hemangioblastomas capilares. Como principais resultados obtidos deve-se referir que: (1) a prevalncia de hemangioblastomas capilares era menor (14,5%) entre os doentes com delees completas, os quais apresentavam uma acuidade visual mdia mais elevada e que (2) a prevalncia de hemangioblastomas com localizao justapapilar foi mais baixa entre os doentes com mutaes que conduziam formao de protena truncadas comparativamente aos doentes com substituies de aminocidos. No entanto, as alteraes genotpicas no apresentam qualquer correlao com a uni ou bilateralidade da doena ocular ou com o nmero e extenso de hemangioblastomas capilares. As mutaes ocorridas no gene VHL parecem influenciar a gravidade da doena como evidenciado por Maranchie et al33 em 2004, quando demonstraram que 11 de 13 famlias portadoras da sndrome de VHL, com delees germinais completas, apresentavam um fentipo atenuado da doena, enquanto que as outras duas famlias, portadoras de mutaes parciais, tinham uma forma particularmente agressiva, o que sugere a possibilidade da severidade da doena se poder correlacionar, pelo menos em parte, com o tamanho da deleo.
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4- SNDROME MEN 2
A MEN 2 uma doena autossmica dominante, com uma prevalncia estimada de 1 a 10 casos por 100.000 pessoas na populao geral. Esta pode ser dividida em duas formas sindrmicas - (1) MEN 2A e (2) MEN 2B - e o seu mecanismo fisiopatolgico reside num defeito associado ao proto-oncogene RET. 34
A) MEN 2A
Esta forma sindrmica representa 60 a 90% do total de casos, tendo uma prevalncia aproximada de 1 caso por cada 35.000 pessoas. 34, 35 A sua penetrncia relaciona-se com a idade e as suas manifestaes fenotpicas englobam feocromocitomas, carcinoma medular da tiride e hiperparatiroidismo primrio. Com o advento dos testes genticos tornou-se aparente que 95% dos indivduos portadores desta sndrome desenvolvem carcinoma medular da tiride, 50% desenvolvem feocromocitomas e 20 a 30% desenvolvem hiperparatiroidismo. 34, 35 O carcinoma medular da tiride , por norma, a primeira manifestao desta sndrome. As manifestaes bioqumicas (elevao dos nveis de calcitonima plasmtica) surgem entre os 5 e os 25 anos. Num indivduo portador, esta neoplasia apresenta-se como uma massa ou dor no pescoo entre os 15 e os 20 anos, no entanto mais de 50% destes indivduos iro apresentar doena metasttica, nos ndulos linfticos cervicais, na altura do diagnstico. A doena neoplsica precedida de uma fase de hiperplasia celular de distribuio multifocal, sendo a diarreia o sintoma que, com mais frequncia, est associado a esta manifestao fenotpica. 36 Os feocromocitomas manifestam-se aps o carcinoma medular da tiride, na maioria dos casos, como uma hipertenso arterial resistente teraputica. A morte sbita, devido a uma crise hipertensiva induzida pela anestesia, tem sido descrita em alguns indivduos portadores desta sndrome e com feocromocitomas no detectados antes da cirurgia. Estes so frequentemente
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bilaterais e a transformao maligna ocorre em 4% dos casos. Como podem ser a primeira manifestao, o seu diagnstico pode justificar a necessidade de se excluir esta sndrome. 37 As alteraes da funo paratiroideia podem oscilar entre uma hiperplasia paratiroideia e mltiplos adenomas associados a hipercalcmia, urolitase ou ostete fibrosa qustica. O hiperparatiroidismo primrio ocorre em 20 a 30% dos indivduos e tende a ser assintomtico na sua grande maioria. Uma reviso cuidadosa da histologia dos adenomas paratiroideus revelou que estes podem ter origem em leses de hiperplasia paratiroideia, de forma semelhante do carcinoma medular da tiride. 38 Outras associaes raras tm sido descritas, tal como o lquen amilide cutneo - uma leso pruriginosa localizada na regio escapular e caracterizada por deposio de tecido amilide ou a doena de Hirschsprung. 4
B) MEN 2B
O subtipo 2B representa aproximadamente 5% de todos os casos da sndrome MEN 2. Esta variante caracterizada pelo desenvolvimento precoce de uma forma agressiva de carcinoma medular da tiride. Os indivduos portadores, que no so submetidos a tiroidectomia numa idade precoce, tendem a desenvolver, com grande probabilidade, uma doena metasttica. Os feocromocitomas ocorrem em 50% dos casos, sendo em cerca de metade mltiplos e com frequncia bilaterais. Caso no sejam diagnosticados atempadamente, muitos podem vir a falecer durante o perodo peri-operatrio, devido a um colapso cardiovascular. Ao contrrio da variante 2 A, a patologia das paratirides extremamente rara. 35, 39 Muitas vezes, os doentes so identificados durante a infncia devido presena de neuromas da mucosa, localizados na superfcie dorso-anterior da lngua, palato ou faringe e por uma aparncia facial distinta. Os lbios tendem a tornar-se proeminentes e podem coexistir ndulos submucosos. Caso os neuromas se desenvolvam nas plpebras, podem causar espessamento e everso das margens palpebrais superiores. Um espessamento proeminente dos
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nervos corneanos pode ser visualizado atravs da realizao de um exame oftalmolgico com uma lmpada de fenda. Em 40% dos indivduos, pode haver uma ganglioneuromatose difusa do aparelho gastrointestinal, que se manifesta atravs de um quadro de distenso abdominal, megaclon, obstipao ou diarreia. Em 75% dos casos pode haver um aspecto marfanide, muitas vezes com cifoscoliose ou lordose, laxidez articular e diminuio do tecido adiposo subcutneo, sendo que a atrofia e fraqueza muscular proximal podem tambm estar presentes. 34
C) GENE RET
O gene RET um proto-oncogene que codifica um receptor tirosina-cinase, presente na superfcie das clulas, que regula os fenmenos de crescimento e diferenciao celular. 40 Este gene constitudo 21 exes e apresenta um tamanho de 55 Kb, sendo que os exes 2 a 20 esto contidos numa regio com uma extenso de 31 Kb. A estrutura global deste gene muito semelhante de outros genes que codificam receptores tirosina cinase, sendo a sua orientao no cromossoma 10q11.2 tal que a sua regio 5 est orientada para o centrmero e a 3 para a regio telomrica. 41
D) PROTENA DO GENE RET

O receptor tirosina-cinase RET uma protena transmembranar composta por uma poro extracelular, onde esto presentes quatro regies de adeso celular dependentes de Ca2+ domnio caderina - e uma regio rica em cistena, localizada na poro justa-membranar domnio cistena. Esta poro contm vrios locais passveis de glicosilao, que definem o estado de maturidade da protena. O RET 170 encontra-se totalmente glicosilado e est presente na membrana celular, enquanto o RET 150, parcialmente glicosilado, se encontra no citoplasma e retculo endoplasmtico. A poro intracelular engloba dois domnios tirosina-cinase, os quais esto envolvidos em numerosas vias de transduo de sinal. 42, 43
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O gene RET est sujeito a processos de splicing alternativos, dos quais resultam trs isoformas diferentes que contm 9 (RET 9), 43 (RET 43) e 51 (RET 51) aminocidos no terminal carboxil, a contar aps a glicina presente na posio 1063. O RET 9 e o 51 consistem em 1072 e 1114 aminocidos, respectivamente e so as principais isoformas in vivo. 43
(i) Activao do receptor RET pelo GFL O RET um receptor para ligandos pertencentes famlia dos GFL: GDNF, NRTN, PSPN e ARTN. Os vrios ligandos associam-se a vrios receptores denominados globalmente de GFR correspondendo a cada um deles um ligando, com o qual interage com alta afinidade. Deste modo, o GDNF associa-se preferencialmente ao GFR 1, o NRTN ao GFR 2, o ARTN ao GFR 3 e a PSPN ao GFR 4. Desta associao resulta a formao de um complexo GFR /GFL, que interage com o RET conduzindo fosforilao dos seus resduos tirosina presentes no domnio tirosina-cinase. 43 Apesar de, por regra, se apresentarem ligados membrana plasmtica, os GFR podem encontrar-se na forma solvel. Como consequncia, a activao do RET pode ocorrer por duas vias distintas denominadas de cis e trans. A primeira baseia-se na ligao entre o GDNF dimrico e o GFR 1. O complexo de sinalizao resultante interage com o receptor RET estando, esta etapa, dependente de trs aminocidos localizados no domnio caderina do referido receptor. O modelo trans sugere que o GDNF pode, como alternativa, interagir com a forma solvel do seu receptor culminando na formao de um complexo que, ao associar-se ao receptor tirosina-cinase, resulta na sua activao e dimerizao. 44
(ii) Activao do RET por outros factores de crescimento Apesar do RET ser activado principalmente pelos GFL, outros factores de crescimento possuem a capacidade de interagir com este receptor, do qual exemplo o factor de crescimento
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neurotrfico. Da interaco com este factor resulta uma estimulao do crescimento e metabolismo celular e expresso de vrios genes. 43
(iii) Vias de sinalizao intracelulares Os processos de sinalizao intracelulares desencadeados pelo RET desempenham um papel fundamental no desenvolvimento do sistema nervoso entrico, na organognese renal e na espermatognese. A activao do seu domnio tirosina-cinase ocorre aps a induo da sua dimerizao pelo complexo GFL/GFR /RET e conduz fosforilao de vrias tirosinas, as quais servem de local de ancoragem para protena adaptadoras que medeiam a activao de vrias vias de transduo de sinal. 43 A tirosina 1062 desempenha um papel importante no desenvolvimento do sistema nervoso entrico e renal visto controlar as principais vias de sinalizao intracelular. Esta serve de lugar de ancoragem para vrias protenas adaptadoras - Shc, GAB 2, SHANK 3, entre outras - as quais regulam processos como a motilidade, proliferao, diferenciao e sobrevivncia celular. As interaces entre o RET e Shc ocorrem via a tirosina 981 e promovem a sobrevivncia neuronal. A fosfotirosina 905 interage com as protenas de ancoragem GRB7/10 aps activao do RET, mas o seu significado biolgico no se encontra esclarecido. A tirosina localizada na posio 1015 liga-se e activa a PLC culminando na produo de IP3 e de DAG. O primeiro promove a libertao de Ca2+ intracelular conduzindo activao de vrias enzimas, como a aPKC, as quais podem, tambm, ser reguladas pelo DAG. Estas protenas cinase parecem exercer um mecanismo regulador, por feedback negativo, sobre este receptor. A tirosina 1096, presente unicamente na isoforma longa, serve, uma vez fosforilada, como local de ancoragem para o GAB 2, o qual activa vias importantes no controlo da proliferao e diferenciao celular. 45- 47
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E) MECANISMOS FISIOPATOLGICOS DA SNDROME MEN 2

Apesar de correlaes gentipo-fentipo claras se encontrarem descritas para a sndrome MEN 2, os mecanismos moleculares no so totalmente compreendidos. A maior parte das mutaes identificadas para esta sndrome resultam num ganho de funo do receptor RET e afectam principalmente o domnio cistena - MEN 2A - ou o tirosina-cinase - MEN 2B. As mutaes que afectam o primeiro domnio condicionam a substituio de um resduo de cistena por um outro aminocido, o que altera as propriedades do receptor e conduz formao de ligaes entre dois monmeros RET e consequente dimerizao e activao do mesmo. As mutaes que afectam o domnio intracelular ocasionam a activao constitutiva do referido receptor de um modo algo diferente do acima descrito. Estas mutaes afectam directamente o centro cataltico do receptor tirosina-cinase, ocasionando a autofosforilao dos resduos de tirosina e induzindo a activao do RET na forma monomrica, no existindo, portanto, necessidade de fenmenos de dimerizao. Estudos recentes indicam a possibilidade da fosfotirosina 1062, em particular, ter uma importante funo na actividade transformadora do RET, uma vez que serve de local de acoplagem para vrias protenas que regulam as principais vias de sinalizao intracelular.40 As mutaes que afectam este domnio parecem condicionar, no s uma alterao da funo cataltica, mas tambm uma alterao da especificidade do substrato, uma vez que as protenas mutadas revelam uma preferncia por substratos como o Shc, o qual funciona como uma protena de ancoragem necessria para o correcto desenrolar de vrias vias de sinalizao intracelular. 40, 43, 52
F) MODELOS ANIMAIS PARA A SNDROME MEN 2

Smith-Hicks et al48 desenvolveram um modelo animal da sndrome MEN2B atravs da introduo de uma mutao activadora no codo 919 do gene Ret do ratinho. Os ratinhos heterozigticos RetMEN2B desenvolveram uma hiperplasia das clulas C da tiride e das clulas
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cromafins adrenais, a qual progredia, com frequncia, para feocromocitoma, enquanto que os homozigticos apresentaram ganglioneuromas da medula adrenal e uma hiperplasia da gnglia simptica, assim como defeitos no aparelho reprodutor masculino. Usando uma metodologia semelhante, Acton et al49, verificaram que trs de oitos ratinhos, portadores de uma mutao activadora do Ret, desenvolveram um carcinoma medular da tiride macroscpico e bilateral, patologia que no se verificou em qualquer um dos ratinhos no portadores da mutao. Michielis et al50 desenvolveram um modelo animal da sndrome MEN 2A atravs da introduo de uma mutao activadora no codo 634 do gene Ret do ratinho. Assim, constatou-se que os ratinhos heterozigticos RetMEN2A tendem a desenvolver uma hiperplasia das clulas C da tiride, que progride, com frequncia, para carcinoma medular da tiride multifocal e bilateral. Do mesmo modo, Kawai et al51 verificaram que o produto resultante da expresso do gene mutado, apesar de presente em vrios rgos (tiride, corao, fgado, clon, glndula paratiride e crebro), estava associado a manifestaes fenotpicas restritas ao desenvolvimento de hiperplasia das clulas C de tiride ou de carcinoma medular de tiride.
G) CORRELAES GENTIPO FENTIPO NA SNDROME MEN 2

Vrias so as mutaes descritas para o gene RET. Durante a realizao desta tese identifiquei 53 mutaes diferentes associadas a este gene (ver anexo 2), as quais se encontram distribudas pelos exes 5, 8 10, 11, 13, 14, 15 e 16 (ver figura 2). Relativamente aos eventos mutacionais, estes consistem, principalmente, em mutaes do tipo missense (84,9%) e, raramente, em mutaes do tipo frameshift (13,2%) e nonsense (1,9%).
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c.1858T>A c.1858T>C c.1858T>G c.1859G>A c.1859G>C c.1859G>T c.1860C>G c.1888T>C c.1889G>A c.1889G>T c.1900T>A c.1900T>C c.1900T>G c.1901G>A c.1901G>C c.1901G>T c.1901_1902 delinsTG c.1902C>G
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c.1831T>G c.1832G>A c.1832G>T c.1833C>G
c.2304G>C
c.1825T>C c.1825T>G c.1826G>A c.1826G>C
c.2647_2648delinsTT
c.2410G>A c.2410G>T c.2671T>G c.2753T>C
1 0
1 1
1 2
1 3
1 4
1 5
1 6
1 7
1 8
1 9
2 0
2 1
Figura 2 Estrutura do gene RET e localizao das principais mutaes exnicas. As mutaes associadas sndrome MEN 2A afectam principalmente os exes 10 e 11, ao passo que as identificadas na MEN 2B se situam nos exes 15 e 16. Por razes de clareza, os intres e as UTR no foram representados.
Nesta sndrome, as mutaes do tipo missense, que afectam os codes codificadores dos resduos de cistena, presentes no domnio extracelular do receptor RET, so o evento mutacional mais frequente. Os codes afectados, com mais frequncia, so: o 609, 611 e 620 localizados no exo 10 e o 630 e 634 presentes no exo 11. 52 Aproximadamente 95% das famlias afectadas pela sndrome MEN 2A so portadoras de mutaes nos codes acima referidos, tendo sido identificadas outras mutaes nos codes 631, 768, 790, 791, 804, 844 e 891. Nos indivduos afectados pela variante 2B, 95% apresentam uma mutao pontual que afecta o codo 918 (c.2753T>C), situado no exo 16, a qual se traduz numa substituio de um resduo de treonina por um de metionina. Uma segunda mutao foi, mais tarde, detectada no codo 883 em vrios indivduos com MEN2B (c.2647_2648delinsTT). Alm destas mutaes associadas variante sindrmica 2B, outras mutaes germinais missense, mais raras, foram localizadas nos codes 804 e 806, bem como no 904. 43, 53, 54 Ao contrrio do que se passa com a MEN 2B, as mutaes relacionadas com o fentipo MEN 2A tendem a envolver o domnio cistena extracelular e, com menos frequncia, o domnio tirosina-cinase intracelular. 43
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As mutaes que afectam o codo 634, localizado no exo 11, esto associadas a uma maior incidncia de feocromocitomas e de hiperparatiroidismo. Entre estas, a mutao c.1900T>C parece relacionar-se com uma maior incidncia de hiperparatiroidismo, embora alguns estudos no suportem esta observao.56 A esta mutao tem sido atribuda uma maior incidncia de metstases distncia, quando comparada com outras mutaes que envolvem este codo, como so exemplo as mutaes c.1901G>A e c.1902C>G. A associao entre MEN 2A e o lquen cutneo tem sido atribuda a alteraes na cistena codificada pelo codo 634. Isto foi comprovado atravs de um trabalho de investigao, conduzido por Verga et al57 onde se verificou que 36% dos indivduos com a associao acima referida eram portadores de uma mutao envolvendo o codo 634. 35, 56 As mutaes no codo 768, localizado no exo 13, parecem relacionar-se com o desenvolvimento de carcinoma medular familiar da tiride, enquanto as dos codes 804 e 891, que inicialmente foram relatadas como estando associados apenas a carcinoma medular familiar da tiride, foram encontradas em famlias com a sndrome MEN 2A. A estes respeito, mutaes no codo 804 localizado no exo 14, foram identificadas em feocromocitomas (c.2410G>T e c.2410G>A). O fentipo associado s mutaes neste codo extremamente varivel, mesmo dentro da mesma famlia. Uma mutao, em particular, do codo atrs referido, denominada de c.2410G>A, foi identificada num indivduo portador da sndrome MEN2B. 43
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5 SNDROMES DE PARAGANGLIOMAS FAMILIARES

As Sndromes de Paragangliomas Familiares so caracterizadas pelo desenvolvimento de neoplasias com origem na paragnglia derivada das clulas da crista neural, distribudas pelo eixo paravertebral, desde a base do crnio at plvis. A sua prevalncia no conhecida com preciso mas a sua incidncia estimada ronda 1/300.000 casos/ano. 58 Os paragangliomas localizados na cabea e pescoo esto, com frequncia, associados ao sistema nervoso parassimptico e localizam-se nas reas que envolvem o corpo carotdeo, o nervo vago e a regio jugulo-timpnica. Estes paragangliomas no hiper-secretam catecolaminas (95%) e no tendem a metastizar; as suas principais consequncias advm do seu efeito de massa, que pode condicionar compresso dos pares cranianos e da cadeia simptica na regio carotdea, sensao de preenchimento farngeo, disfagia, disfonia, dor, tosse e aspirao na presena de paragangliomas vagais e acufenos, hipoacsia e alteraes dos nervos cranianos inferiores quando perante paragangliomas jugulo-timpnicos. Os de origem torcica, abdominal e plvica esto, por norma, associados ao sistema nervoso simptico e, como tal, hiper-secretam catecolaminas. Os feocromocitomas e os paragangliomas simpticos, hipersecretores de catecolaminas, apresentam um quadro clnico constitudo por sinais e sintomas atribuveis a este estado: elevaes da presso arterial e da frequncia cardaca, cefaleias, palpitaes, hiperidrose e ansiedade. As nuseas, vmitos e perda de peso podem tambm ocorrer. Estes sintomas tm como principal caracterstica o facto de serem, por regra, episdicos. 58, 59 Os paragangliomas simpticos apresentam uma maior probabilidade de malignizao, quando comparados com os feocromocitomas e paragangliomas localizados na cabea e pescoo. 59 Os Paragangliomas Familiares encontram-se divididos em quatro formas sindrmicas denominadas de PGL 1, 2, 3 e 4. O gene responsvel pela PGL 2 ainda no est identificado,
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apesar de ser conhecida a sua regio cromossmica (11q13.1), razo pela qual esta variante sindrmica no ser abordada nesta tese. 58, 59
A) PGL 1
A PGL 1 uma doena autossmica dominante resultante de mutaes no gene SDHD, codificador da pequena subunidade do citocromo b. Esta variante sindrmica caracterizada pela presena de paragangliomas da cabea e pescoo e, com menor frequncia, por paragangliomas simpticos e feocromocitomas e apresenta uma penetrncia elevada mas relacionada com a idade (48% aos 30 anos e 86% aos 50 anos).58, 59 Em 1998, Van Schothorst et al60, analisaram dez famlias portadoras de paragangliomas da cabea e pescoo, tendo-se constatado que a bifurcao da artria carotdea o local mais afectado (57% do total de casos). Outras regies afectadas, por ordem decrescente de frequncia, so: (1) glomo jugular, (2) glomo vagal e, por ltimo, o (3) glomo timpnico. Nos casos familiares, no se verifica qualquer diferena significativa na incidncia entre os dois sexos, observando-se, no entanto, que na forma familiar os paragangliomas tendem a ser bilaterais em 31,8% dos casos, contra os 4,4% dos casos espordicos. 61 A natureza hereditria desta doena pode ser mascarada devido ao fenmeno de imprinting materno a ela associado, o que ocasiona que esta doena s se manifeste quando herdada do progenitor do sexo masculino. 62
B) PGL 3
A PGL 3 uma doena autossmica dominante com origem em mutaes no gene SDHC, o qual codifica a grande subunidade do citocromo b. Esta variante manifesta-se atravs de paragangliomas parassimpticos localizados, predominantemente, na cabea e pescoo, de natureza benigna e raramente multifocais. 63
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C) PGL 4
A PGL 4 uma doena autossmica dominante cuja base reside em mutaes no gene SDHB, o qual codifica a subunidade ferro-sulfureto do complexo sucinato-desidrogenase. Esta sndrome apresenta uma penetrncia elevada e relacionada com a idade (29% aos 30 anos e 77% aos 50 anos) e caracteriza-se pela presena de paragangliomas simpticos, que se manifestam por sintomas atribuveis ao efeito de massa por eles ocasionado, mais do que pela secreo excessiva de catecolaminas. 58, 59 O fentipo bioqumico predominante marcado por uma hipersecreo de noradrenalina e/ou dopamina, mas 10% podem ser bioquimicamente silenciosos. A dor relacionada com o tumor um dos principais sintomas (presente em 54%), sendo a nica queixa em 14% dos doentes. A hipertenso arterial ocorre em 76% e em 90% dos casos no possvel estabelecer uma histria familiar de paragangliomas. 64, 65
D) COMPLEXO SUCINATO-DESIDROGENASE
As enzimas mitocondriais no estavam implicadas na gnese de neoplasias hereditrias at recentemente, quando se descobriu que mutaes germinais envolvendo as subunidades SDHB, SDHC e SDHD, do complexo sucinato-desidrogenase, esto na gnese de vrias sndromes hereditrias envolvendo feocromocitomas e paragangliomas.
(i) Genes SDH O gene SDHB localiza-se na regio cromossmica 1p35-36 e apresenta um tamanho aproximado de 35 Kb. Apresenta sete intres e oito exes, com um tamanho compreendido entre os 86 bp (exo 3) e os 204 bp (exo 1). A regio promotora tem um tamanho aproximado de 2,4 Kb e a sua poro proximal contem dois locais de ligao para o Sp1 e vrios para possvel ligao aos NRF1 e 2. O seu produto gentico codifica uma protena matura de 280 aminocidos e tem um peso aproximado de 31 kDa. 66
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O gene SDHC localiza-se na regio cromossmica 1q21 e apresenta um tamanho aproximado de 50 Kb. constitudo por cinco intres e por seis exes, relativamente pequenos para o tamanho da protena que codificam (entre os 46 pb para o exo 1 e os 859 pb para o exo 6). A sua regio promotora contm vrios locais para possveis interaces com os NRF 1 e 2, os quais parecem ser necessrios para a correcta expresso do gene SDHB. O seu produto gentico consiste numa protena com 169 aminocidos e com 15,5 kDa de peso molecular. 67 O gene SDHD localiza-se na regio cromossmica 11q23 e possui um tamanho aproximado de 9 Kb. constitudo por quatro exes, cujos tamanhos oscilam entre os 62 pb (exo 1) e os 989 pb (exo 4) e trs intres. A anlise da regio do promotor 5 revelou vrios locais de ligao para factores de transcrio, entre os quais se encontram os NRF 1 e 2. O seu produto uma protena com 159 aminocidos e com um peso de 17 kDa. 68
(ii) Complexo mitocondrial II A enzima sucinato-desidrogenase - ou complexo mitocondrial II - um membro funcional do ciclo de Krebs e da cadeia respiratria aerbia. Este complexo associa o processo de oxidao do sucinato a fumarato, que ocorre na matriz mitocondrial, com a reduo da ubiquinona ocorrida na membrana deste organelo. 69 A estrutura das SDHA e SDHB encontra-se bastante conservada entre as diferentes espcies, enquanto que as estruturas de ancoragem membrana (SDHC e D) apresentam uma grande variabilidade. A SDHA constituiu o domnio hidroflico do complexo e contm um cofactor FAD, que forma parte do centro cataltico da enzima. A SDHB, por sua vez, contm trs locais ricos em grupos ferro-sulfureto - [2Fe-2S], [4Fe-4S] e [3Fe-4S] - necessrios para o processo de transferncia de electres entre o FAD e a quinona presente na membrana mitocondrial. A integridade do grupo [3Fe-4S] essencial para a correcta ligao desta subunidade aos domnios de ancoragem membrana e para a troca de electres com a quinona. As SDHC e SDHD formam o domnio hidrofbico deste complexo constituindo, cada um deles, trs -hlices trans30
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membranares (I, II, III e IV, V e VI); as hlices II e V possuem, cada uma, um resduo de histidina que serve de ligando ao grupo heme mais prximo do grupo [3Fe-4S], enquanto que as hlices I e IV contm uma segunda histidina para ligao a um segundo grupo heme. Estas subunidades so responsveis pela ancoragem deste complexo membrana mitocondrial e possuem os locais de ligao para a quinona e os seus inibidores. 70 A SDHA liga-se, por meio do seu grupo FAD, aos seus substratos enzimticos (sucinato e fumarato) e reguladores fisiolgicos (oxaloacetato e ATP). O oxaloacetato, um inibidor competitivo da sucinato, forma-se a partir do malato e pode ser deslocado do seu local de ligao SDHA, aps a ligao do ATP a esta enzima. Os electres fornecidos, a esta subunidade, so depois transportados pelas vrias unidades ferro-sulfureto at ao citocromo tipo b, de onde so depois transportados at s molculas de quinona. 69, 71 A enzima sucinato-desidrogenase tem a capacidade de oxidar rapidamente o sucinato a fumarato, sendo a reaco oposta raramente detectada nos tecidos humanos. Apesar disto, pensase que o processo de reduo do fumarato pode desempenhar um papel fisiolgico importante em condies hipxicas, onde parece participar na formao de espcies reactivas de oxignio. 72 A reaco de oxidao do sucinato o elo de ligao entre o complexo mitocondrial II e o ciclo de Krebs, ao participar no processo de degradao da acetil-CoA. O sucinato pode ser rapidamente transportado para o interior da matriz mitocondrial por meio de transportadores especficos e por troca com o fosfato inorgnico ou outros cidos orgnicos (p. ex. malato). So estes transportadores que controlam a acumulao de produtos de reaco e de substratos dentro e fora deste organelo podendo, deste modo, ser uma possvel explicao para a susceptibilidade de determinados tecidos perante alteraes nos genes SDH. 69, 73 O fumarato, produto final da reaco catalisada pela sucinato-desidrogenase, no capaz de atravessar a membrana mitocondrial interna acumulando-se no interior deste organelo. Esta acumulao, principalmente no tecido muscular, parece reduzir a velocidade da reaco catalisada
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pelo referido complexo. O sucinato tambm pode ser produzido na matriz mitocondrial por uma sucinil-CoA ligase formadora de GTP ou por uma cetocido-CoA transferase na presena de acetoacetato. Esta ltima enzima encontra-se em tecidos extra-hepticos (corao, rins e crebro), sendo responsvel pela cetlise e uso dos corpos cetnicos sintetizados pelo fgado (acetoacetato, hidroxibutirato) durante o stress lipoltico e em jejum. A acetoacetil-CoA derivada do sucinato favorece a secreo de insulina, ao actuar como um secretogogo, e participa na formao de mevalonato. 69, 74 Nas mitocndrias renais e hepticas, a actividade deste complexo particularmente alta quando comparada com outras enzimas mitocondriais. Nestes tecidos, esta enzima pode entregar mais electres reserva de quinona do que aquela quantidade que pode ser acomodada pelos segmentos citocromos da cadeia, favorecendo a depleo dessas reservas. Este fenmeno pode potencializar a reverso do fluxo electrnico ao longo da cadeia e o seu desvio para outras funes como a produo de NADH. A velocidade com que o fumarato deve ser removido, de modo a manter este fluxo electrnico invertido, pode ser potencializada pela elevada actividade da enzima fumarase, presente nestes tecidos. Este controlo redox, imposto pela inverso da corrente electrnica, pode induzir vias catablicas, como so a formao de CoA e de esteres de carnitina pelas mitocndrias hepticas. 75 Como so poucas as enzimas extra-mitocondriais que metabolizam o sucinato, os efeitos potencialmente deletrios por ele produzidos no podem ser compensados por uma actividade enzimtica alternativa. Deste modo, os defeitos, mesmo que parciais, nos genes SDH podem ter efeitos rpidos e devastadores no metabolismo celular. 69
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E) MECANISMOS FISIOPATOLGICOS DAS SNDROMES DE PARAGANGLIOMAS

FAMILIARES
Consistente com o modelo proposto por Knudson, uma mutao germinal heterozigtica num gene SDH est geralmente associada inactivao somtica do alelo normal nas clulas neoplsicas. A natureza das mutaes germinais que afectam o complexo sucinato-desidrogenase condiciona uma perda de funo por parte desta enzima. O processo carcinognico desencadeado pelas alteraes no referido complexo no totalmente conhecido, mas dados recentes apontam para a possibilidade de estarem envolvidos mecanismos relacionados com a hipxia. 72 Um dos mecanismos propostos para explicar o processo oncognico baseia-se no facto da disfuno do complexo sucinato-desidrogenase resultar numa acumulao de sucinato no interior da clula, de onde resulta uma inactivao da enzima prolil-hidroxilase, a qual importante para a correcta degradao do HIF em condies de normxia. Como consequncia, o HIF torna-se estvel, mesmo em condies de normxia, migrando para o ncleo onde interage com o ADN para favorecer a hiper-expresso de genes induzveis pela hipxia. Uma outra explicao envolve a produo de espcies reactivas de oxignio, as quais favorecem o processo de interaco do HIF com o ADN e consequente expresso de genes induzveis pela hipxia. A terceira explicao possvel para a associao entre mutaes nos genes SDH e feocromocitomas/paragangliomas relaciona-se com o papel apopttico desempenhado pelas mitocndrias. Assim, as referidas mutaes alterariam a capacidade de regular o processo apopttico, principalmente nas clulas precursoras neuroendcrinas, o que favoreceria o desenvolvimento de feocromocitomas e/ou paragangliomas. 69, 72, 75
F) MODELOS ANIMAIS PARA AS SNDROMES DE PARAGANGLIOMAS FAMILIARES

At ao momento no foram desenvolvidos modelos animais, nomeadamente na forma de knoctout, para os genes associados aos paragangliomas. No entanto, destaco o trabalho elaborado por Ishii et al76, em 2007. Este grupo pretendia estudar o stress oxidativo intracelular mitocondrial
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como elemento preponderante no processo tumorignico, tendo, para tal, introduzindo uma mutao no gene Sdhc de linhagens celulares de fibroblastos provenientes de ratinhos. Como consequncia, verificou-se que essas clulas hiper-produziam anies superxido, conseguindo algumas contornar o processo apopttico. Aps a re-introduo destas clulas em ratinhos verificou-se que estas originavam, com frequncia, neoplasias de caractersticas benignas, demonstrando assim o papel deste gene na supresso tumoral. 76
G) CORRELAES GENTIPO-FENTIPO NAS SNDROMES DE PARAGANGLIOMAS

FAMILIARES
As mutaes nos genes SDHB, SDHC e SDHD podem estar na gnese de feocromocitomas/paragangliomas, existindo algumas diferenas fenotpicas associadas s vrias mutaes, que podem ser teis para a prtica clnica. Vrias so as mutaes identificadas para os diferentes genes que compem o complexo sucinato-desidrogenase. No decurso da minha pesquisa identifiquei 85 mutaes diferentes para o gene SDHB, 16 para o SDHC e 62 para o SDHD (ver anexos 3, 4 e 5). As mutaes que afectam o primeiro gene encontram-se amplamente distribudas por todos os exes que o compem com excepo do oitavo (ver figura 3), sendo os eventos mutacionais, mais frequentes, as mutaes do tipo missense (47,1%) e do tipo frameshift (22,4%). Por sua vez, o gene SDHC aquele que apresenta o menor nmero de eventos mutacionais, os quais se encontram distribudos por todos os seus exes (ver figura 4). Os eventos mutacionais mais frequentes envolvem as mutaes do tipo nonsense (31,25%), missense (25%) e splice site (25%). As mutaes que ocorrem no gene SDHD afectam todos os exes que o constituem (ver figura 5), sendo os eventos mais comuns as mutaes do tipo frameshift (35,5%), missense (25,8%) e nonsense (17,4%). As mutaes nos genes SDHC e SDHD associam-se, principalmente, a paragangliomas parassimpticos localizados na cabea e pescoo, tendo os portadores de mutaes na subunidade SDHD um odds ratio de 24 e de 0,28 para o desenvolvimento de paragangliomas na cabea e
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pescoo, e paragangliomas abdominais, respectivamente, quando comparados com indivduos portadores de mutaes na subunidade SDHB. Quando o gene SDHD est envolvido, os paragangliomas tendem a ser, com frequncia, multifocais mas este padro fenotpico parece correlacionar-se melhor com alteraes no gene SDHC. 77-79
c.287G>A c.292T>C c.157G>A c.17_35del19 c.21delC c.24C>T c.45_46insCC c.166_170delCCTCA c.167C>T c.174_175delinsTT
c.293G>A c.296G>A c.298T>C
c.600G>T c.642G>C c.644delC c.653G>C
c.302G>A c.311delAinsGG c.312insCACTGCA c.343C>T c.380T>G c.380T>A c.520insC c.540G>A
c.660_661insT c.683_684delAG c.688C>T c.689G>A c.724C>T c.725G>A
c.194T>A c.194T>C
c.141G>A c.136C>G c.136C>T c. 137G>A
c.418G>T c.620_621delTG c.623G>A c.277T>C c.281G>A c.268C>T c.269G>A c.392C>G c.392delC c.395A>C c.587G>A c.590C>G c.591delC c.574T>C c.575G>A c.557G>A c.713delT c.713_716delTCTC c.717delT c.718_721delCTAT
c.747C>A
c.758G>A
c.127G>C c.118A>G c.88delC

c.87_89insCAG c.79delC
c.761C>T c.761insC
c.260T>C
Figura 3 Estrutura do gene SDHB e localizao das mutaes exnicas identificadas. As mutaes encontram-se distribudas por toda a sequncia codificadora deste gene, com excepo do exo 8. Por razes de clareza os intres e s UTR no se encontram representados.
c.1A>G c.3G>A c.183G>A c.39C>A c.126G>A c.43C>T c.244G>T c.214C>T c.397C>T c.439C>T c.473T>C
c.256_257insTTT
Figura 4 - Estrutura do gene SDHC e localizao das mutaes exnicas identificadas, as quais se encontram distribudas por toda a sua sequncia codificadora. Por motivos de clareza, os intres e UTR no foram representados.
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At 50% dos portadores de paragangliomas extra-adrenais malignos possuem mutaes germinais no gene SDHB. De facto, estas mutaes esto associadas a uma probabilidade seis vezes maior de doena extra-adrenal e a maior risco de degenerao maligna, no sendo claro se este efeito resultado do local da mutao e/ou do evento mutacional per se. Apesar de raros, os feocromocitomas malignos parecem ser mais comuns em indivduos portadores de mutaes germinais do gene SDHB do que naqueles com mutaes do gene SDHC ou SDHD ou em feocromocitomas espordicos. 77, 80, 81
c.1A>G c.3G>A c.3G>C c.14G>A c.21delG c.28_33delins12bp
c.191_192delTC
c.361C>T
c.202_203insA c.206_218del13 c.353T>G c.208A>G c.210G>T c.168_169delTT
c.416T>C
c.433C>A
c.33C>A c.34G>A c.36_37delTG
c.252T>G c.254T>A
c.242C>T
c.341A>G c.341_342delAT
c.366delA c.381delG
c.443delG c.443G>A c.433G>T
c.305A>T
c.49C>T c.50G>T c.90T>C
c.147_148insA c.148_149insA c.149A>G
c.337_338insT c.337_340delGACT c.296delT c.325C>T c.463delA
c.54_55dupC c.57delG
c.64C>T c.94_95delTC c.95C>A
c.120_127delCCCAGAAT c.125A>C c.129G>A

c.120_121insC c.112C>T c.106C>T c.268G>A c.271_282del12
c.284T>C
c.317G>A c.274G>T c.276_278delCTA c.277delT
Figura 5 - Estrutura do gene SDHD e localizao das mutaes exnicas identificadas, as quais se encontram distribudas por toda a sua sequncia codificadora. Por motivos de clareza, os intres e UTR no foram representados.
Cerca de 75% dos feocromocitomas e paragangliomas simpticos, em pessoas portadoras de mutaes do gene SDHD, ocorrem quando afectada a poro 5 deste gene, havendo, recentemente, relatos de uma possvel relao entre delees ocorridas no exo 1 do gene SDHB, e os paragangliomas abdominais. 69, 82 Os dados obtidos por estudos realizados por Baysal et al83 e Astrom e tal84 permitiram concluir que as baixas altitudes reduzem a penetrncia das mutaes associadas ao gene SDHD.
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Alm disto, verificou-se que os doentes portadores de tumores unifocais tinham uma tendncia para viverem em baixas altitudes e estavam expostos a elas durante mais tempo, quando comparados com os casos que se apresentavam como tumores mltiplos. Os indivduos portadores de mutaes do tipo nonsense/splice site tendem a desenvolver os sintomas da sua doena 8,5 anos mais cedo do que os indivduos portadores de mutaes do tipo missense. Os feocromocitomas esto relacionados com mutaes do tipo nonsense e ocorrem em doentes que, preferencialmente, vivem em altitudes mais elevadas ou que a elas estiveram expostos durante um maior perodo de tempo. Estes dados levaram, Astrom et al84, a conclurem que as altitudes elevadas e as mutaes do tipo nonsense/splice site esto associadas a um fentipo de maior gravidade clnica, suportando a evidncia de que as mutaes no gene SDHD alteram a capacidade de sensor de oxignio do complexo sucinato-desidrogenase.
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6 - VIA TUMORIGNICA COMUM

Os genes VHL, RET, SDHB, SDHC e SDHD tm sido implicados no processo tumorignico que culmina no desenvolvimento de feocromocitomas e paragangliomas. 14, 85 No entanto, o modo como diferentes mutaes em cinco genes funcionalmente e espacialmente distintos resultam no aparecimento do mesmo tipo de neoplasias carece de uma resposta definitiva, apesar dos avanos registados. 14, 85 Como j referido, os eventos mutacionais que afectam o gene VHL parecem resultar numa alterao da capacidade, deste gene, para regular as vias induzveis pela hipoxia, o que predispe para o desenvolvimento de feocromocitomas na sndrome de VHL. Do mesmo modo, tem sido descrita uma associao entre mutaes nos genes SDHB e SDHD e alteraes na capacidade de regular essas mesmas vias induzveis pela hipoxia.
14, 86
As mutaes no gene VHL resultam na
activao do HIF em condies de normxia, uma vez que alteram os fenmenos de ubiquitinizao e subsequente degradao da subunidade HIF , enquanto que as mutaes nos genes SDHB e SDHD parecem actuar sobre estas vias de um modo alternativo. A perda de funo do complexo sucinato-desidrogenase resulta na acumulao de sucinato no interior da clula, o qual tem um efeito inibitrio sobre a enzima prolil-hidroxilase, fundamental para a correcta degradao da subunidade HIF . Estes fenmenos tm como consequncia um aumento da actividade do HIF que, aps translocao para o interior do ncleo, desencadeia uma srie de eventos que culminam com a transcrio de vrios genes induzveis pela hipoxia. 14, 69, 85, 86 Estes dados apontam para a possibilidade da disfuno do HIF poder desempenhar um papel importante na gnese dos feocromocitomas/paragangliomas. No entanto, apesar de atractiva, esta hiptese no tem em considerao o papel de outros genes, como o gene RET, na gnese destas neoplasias.14, 86, 87
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Um modelo alternativo, que tenta unificar todos os genes envolvidos, foi recentemente proposto por Lee et al88 (ver figura 6). Este modelo baseia-se no facto das clulas precursoras simptico-adrenais competirem, pela sobrevivncia, por factores como GDNF durante o desenvolvimento embrionrio, com a consequncia de as clulas que perderem esta luta sofrerem apoptose. De facto, estimado que mais de 50% de todos os neuroblastos simpticos sejam submetidos a um processo apopttico durante o desenvolvimento normal. Este processo regressivo permite ajustar a magnitude de cada populao neuronal s necessidades e fundamental para a correcta maturao do sistema nervoso. 88, 89 A via de sinalizao desencadeada pelo GDNF, aps ligao ao NTRK 1, conduz inibio da actividade do factor c-Jun (ver figura 6). A perda desta via favorece os fenmenos apoptticos dependentes de c-Jun, pois a deprivao neuronal de GDNF resulta num aumento significativo
Figura 6 - Modelo unificador dos genes envolvidos na gnese das sndromes de feocromocitomas/paragangliomas familiares. As mutaes germinais nos genes RET, VHL e SDH esto na gnese de feocromocitomas/paragangliomas, os quais surgem de clulas precursoras simpticas. Muitas destas clulas sofrem processos apoptticos, mediados pela enzima EgLN 3, durante o desenvolvimento normal medida que o GDNF se torna limitado. As mutaes nos genes RET e VHL condicionam um aumento da actividade de mediadores como o NTRK 1 e JunB, respectivamente, que possuem um efeito inibitrio sobre os fenmenos apoptticos mediados por c-Jun e pela enzima EgLN 3. As mutaes que envovlvem os genes SDH traduzem-se numa diminuio da actividade do complexo sucinato desidrogenase, o que condiciona um aumento da concentrao intracelular de sucinato e consequente inibio da actividade da enzima EgLN 3. Adaptado de Lee et al (2005) 88
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dos valores de c-Jun, que ao mesmo tempo se torna fosforilado, favorecendo os fenmenos apoptticos. Estudos recentes sugerem a possibilidade de haver uma interligao molecular entre a protena tirosina-cinase NTRK 1 e o proto-oncogene RET, visto este ser um receptor tirosinacinase relacionado com a sobrevivncia neuronal. 89-91 O GDNF activa o receptor RET atravs de mecanismos independentes de ligandos GFL e de co-receptores GFR . A fosforilao resultante desta activao desencadeia vias de sinalizao que regulam o tamanho do corpo celular e metabolismo dos neurnios, mas no a sobrevivncia dos neurnios simpticos maturos. 90, 91 As mutaes no gene VHL associadas variante IIC desta sndrome tm, em comum, uma potenciao da actividade celular da aPKC, o que se traduz num aumento dos nveis intracelulares do factor JunB, tal como acontece com as mutaes activadoras do RET. O aumento dos nveis deste factor antagoniza os efeitos promovidos pelo c-Jun, entre os quais temos os fenmenos apoptticos mediados por c-Jun. A clusterin, um biomarcador aparentemente robusto da funo pVHL independente do HIF, tem sido usada para avaliar o estado da pVHL em carcinomas das clulas renais e feocromocitomas. Aparentemente no se encontra sob controlo pelos nveis de oxignio nem pelo HIF, e a ela so atribudas vrias funes, entre as quais se destaca um papel anti-apopttico e, paradoxalmente, um pr-apopttico, pois uma reduo dos seus valores intracelulares parece promover a sobrevivncia, em zonas hipxicas, de tumores slidos pVHL deficientes. Uma outra funo atribuda a esta protena a inibio do factor nuclear B, o que explica o porqu de tumores pVHL deficientes exibirem uma maior actividade deste factor nuclear e, como consequncia, uma maior resistncia ao TNF . 88, 92 Uma outra protena associada aos fenmenos apoptticos neuronais a EgLN 3. Esta considerada uma protena mitocondrial que expressa em neurnios simpticos aps a remoo do GDNF, onde parece promover o fenmeno apopttico por mecanismos dependentes de caspases. A sua transcrio activada pelo c-Jun e , por si s, necessria e suficiente para o correcto desenrolar da apoptose. A perda de funo do complexo mitocondrial tipo II favorece a
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acumulao de sucinato, o que conduz inibio da EgLN 3 e do processo apopttico. Deste modo, parece que todos estes genes envolvidos nos feocromocitomas/paragangliomas familiares condicionam uma via molecular que desempenha um importante papel na determinao do destino das clulas precursoras simptico-adrenais durante o desenvolvimento. So as clulas que escapam a este processo apopttico que, presumivelmente, possuem uma maior probabilidade de sofrer uma degenerao maligna. 88, 93-95
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7 - TESTES GENTICOS
Os testes genticos permitem uma avaliao do risco gentico de determinados indivduos e so uma pea fundamental no aconselhamento gentico, o qual consiste no processo de transmisso, aos indivduos e suas famlias, de informaes relacionadas com a natureza, modo de transmisso e implicaes de determinada patologia gentica, de forma a possibilitar melhores decises mdicas e pessoais. 96 Actualmente so realizados, por rotina, testes genticos a quatro dos cinco genes referidos nesta tese, nomeadamente: VHL, RET, SDHB e SDHD. Apesar da existncia de uma predisposio familiar, o uso massificado dos testes genticos em todos os casos de feocromocitomas e parangliomas, no apropriado nem tem uma boa relao custo-eficcia. Como tal, a deciso final sobre quando e que gene avaliar requer uma avaliao de vrios factores (ver figura 7). 96 Numa primeira abordagem importante uma adequada histria da doena actual e familiar de modo a salientar uma possvel condio hereditria subjacente. Na ausncia de histria familiar, episdios de morte sbita atribuveis a eventos cardiovasculares mal explicados so sugestivos de uma doena hereditria subjacente. As manifestaes clnicas do doente ou de um membro familiar podem sugerir uma doena especfica e orientar o estudo gentico (p. ex. mutaes no gene VHL sugeridas por leses vasculares da retina). 5, 97 Como os tumores familiares tendem a ocorrer em idades mais precoces, a idade da apresentao do quadro clnico um importante factor a considerar para a realizao dos referidos testes, mas a idade avanada no exclui a existncia de uma doena familiar. 5
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Consentimento informado
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Histria familiar Idade inferior a 50 anos
Tumores mltiplos
Doena maligna
Doena bilateral
VHL RET SDHB SDHD
SDHB SDHD VHL
SDHB VHL
RET VHL SDHD
Figura 7 Algoritmo para o diagnstico gentico dos feocromocitomas/paragangliomas. Este deve ser aplicado sempre que houver uma histria familiar, quando o doente tem menos de 50 anos ou quando os tumores so mltiplos, malignos ou bilaterais. Os genes a serem avaliados, em cada situao, encontram-se dispostos de acordo com uma importncia decrescente. Adaptado de Pacak et al (2007) 97
Excepto as manifestaes clnicas bvias que podem indicar sndromes especficas, a deciso sobre qual o gene a testar deve ser baseada em caractersticas como: (1) localizao do tumor, (2) presena de metstases e o (3) fentipo bioqumico. Apesar das mutaes nos genes SDHB e SDHD poderem estar presentes em tumores adrenais solitrios, estas so identificadas principalmente em paragangliomas com uma doena multifocal, pelo que a pesquisa destas na presena deste tipo de tumores pode ser importante. Como o gene SDHB est associado a uma maior probabilidade de doena maligna, indivduos portadores de doena metasttica, principalmente se relacionada com paragangliomas, podem beneficiar do estudo deste gene. Pelo contrrio, a doena maligna e extra-adrenal rara em mutaes do gene RET, pelo que o estudo deste gene pode no ser compensatrio. O perfil bioqumico importante, pois tumores hiper produtores de adrenalina esto associados a mutaes no gene RET ao passo que os que no hiper produzem esta substncia so encontrados em mutaes do gene VHL. 97 Deste modo, a orientao do diagnstico gentico em funo das caractersticas epidemiolgicas, clnicas e laboratoriais do doente permite uma monitorizao diferencial dos
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vrios doentes e um melhor aconselhamento gentico aos seus familiares, o que se pode traduzir numa melhoria da qualidade de vida e dos cuidados de sade prestados aos doentes portadores de feocromocitomas e paragangliomas.
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8 - CONCLUSES E PERSPECTIVAS FUTURAS

Como referido no incio desta tese, os feocromocitomas so, na sua grande maioria, de ocorrncia espordica, mas a agregao familiar de feocromocitomas e paragangliomas tem sido repetidamente descrita na literatura. Se classicamente uma percentagem de 10 a 15%, do total de casos, era atribuda a causas hereditrias, actualmente admite-se que esta percentagem ronda os 20 a 25%. A identificao de vrios genes como possvel base etiolgica para este tipo de neoplasias e a possibilidade de realizao de testes genticos permitiu uma melhor orientao clnica e teraputica dos doentes portadores de feocromocitomas/paragangliomas familiares e melhorou a nossa compreenso sobre esta forma particular de doena. 4 A compreenso da funo dos vrios genes, quer no seu papel fisiolgico, quer no seu papel patolgico, resultou numa nova janela de opes teraputicas. No entanto, as vias pelas quais apenas alguns tecidos desenvolvem o processo tumoral devem ser melhor esclarecidas, pois um melhor entendimento permitir-nos-: (1) ter uma melhor compreenso das correlaes gentipo-fentipo, o que se pode traduzir numa abordagem clnica e teraputica mais correcta; (2) perceber o modo como todos estes genes actuam e se correlacionam no processo de desenvolvimento e crescimento tumoral; (3) desenvolver testes genticos cada vez mais completos, que combinados com melhores modalidades teraputicas podero traduzir-se na melhoria dos cuidados de sade prestados; (4) identificar novos alvos teraputicos com base no conhecimento dos defeitos moleculares subjacentes. A disponibilidade de modelos animais oferece novas abordagens que podem ajudar a compreender o papel dos vrios genes no processo tumorignico. Os modelos animais podem constituir ferramentas importantes para o estudo da etiopatognese e para avaliar a eficcia de novas modalidades teraputicas. assim de extrema importncia continuar todo o trabalho realizado at agora sobre estas sndromes de feocromocitomas/paragangliomas familiares. Apesar de serem, no geral, neoplasias
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raras, representam uma importante fonte de morbilidade e mortalidade para as pessoas que delas padecem, pelo que, uma melhor compreenso do processo tumorignico e novas opes teraputicas podero traduzir-se numa melhoria substancial da sua qualidade de vida.
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Davide J S Severino
ANEXO 1 MUTAES IDENTIFICADAS NO GENE VHL

Exo 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Mutao(a) c.42insA c.52G>A c.74C>T c.136G>T c.154G>A c.162delG c.162_166delGGAGG c.163delG c.164insG c.165G>A c.167insA c.175delC c.179delG c.180delG c.181delC c.182_185delCCGT c.183C>G c.183delC c.184delG c.187delC c.188T>C c.189_192delGCGC c.191G>C c.192delC c.193T>C c.194C>A c.194C>G c.194C>T c.196delG c.203C>A c.203C>G c.205C>T c.206_208delGCG c.208G>A c.208G>T c.212insT c.214delT c.214T>C Tipo de mutao Frameshift Missense Missense Nonsense Missense Frameshift Frameshift Frameshift Frameshift Missense Frameshift Frameshift Frameshift Frameshift Frameshift Frameshift Missense Frameshift Frameshift Frameshift Missense Frameshift Missense Frameshift Missense Nonsense Missense Missense Frameshift Nonsense Missense Missense In-frame Missense Nonsense Frameshift Frameshift Missense Ser72Pro Glu70Lys Glu70Term Ser68Term Ser68Trp Arg69Cys Ser65Pro Ser65Term Ser65Trp Ser65Leu Arg64Pro Leu63Pro Pro61Pro Glu55Glu Alterao de aminocido Ala18Thr Pro25Leu Glu46Term Glu52Lys Fentipo(b) VHL VHL Feo VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL Feo VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL Referncia Suzuki et al 199798 Kishida et al 199599 van der Harst et al 1998100 Olschwang et al 199826 Olschwang et al 199826 Chen et al 199527 Shuin et al 1994101 Chen et al 199527 Ong et al 200780 Olschwang et al 199826 Crossey et al 1994102 Crossey et al 1994102 Olschwang et al 199826 Chen et al 199527 Bailly et al 1995103 Webster et al 19999 Bailly et al 1995103 Shuin et al 1994101 Brauch et al 1999104 Bailly et al 1995103 van der Harst et al 1998100 Whaley et al 1994105 van der Harst et al 1998100 Shuin et al 1994101 Ong et al 200780 Whaley et al 1994105 Crossey et al 1994102 Crossey et al 1994102 Crossey et al 1994102 Gnarra et al 1994106 Martin et al 1998107 Brauch et al 1999104 Gnarra et al 1994106 Olschwang et al 199826 Chen et al 199527 Olschwang et al 199826 Maher et al 1996108 Ong et al 200730 63

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 c.214_215delT c.214_218insGCCC c.215delC c.217C>T c.219delG c.221T>G c.221_223delTCA c.224T>G c.224_226delTCT c.226T>A c.226_228delTTC c.227T>C c.227insC c.227_229delTCT c.229_231delTGC c.230delG c.230_232delGCA c.232A>C c.233A>C c.233A>G c.233A>T c.233insTCT c.236G>C c.238A>C c.238A>G c.239delG c.239G>A c.239G>T c.240T>A c.240T>G c.241C>T c.242delC c.243_251delGCGCGTCGT c.244C>T c.244delC c.245G>C c.250G>T c.250G>A c.254T>C c.255insC c.256C>G Frameshift Frameshift Frameshift Nonsense Frameshift Missense In-frame Missense In-frame Missense In-frame Missense Frameshift In-frame In-frame Frameshift In-frame Missense Missense Missense Missense In-frame Missense Missense Missense Frameshift Missense Missense Missense Missense Missense Frameshift In-frame Missense Frameshift Missense Missense Missense Missense Frameshift Missense Pro86Ala Arg82Pro Val84Leu Val84Met Leu85Pro Arg82Cys Ser80Asn Ser80Ile Ser80Arg Ser80Arg Pro81Ser Arg79Pro Ser80Arg Ser80Gly Asn78His Asn78Thr Asn78Ser Asn78Ile Phe76Ser Phe76Ile Ile75Ser Val74Gly Gln73Term VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL Feo VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL Feo Feo VHL VHL VHL
Davide J S Severino
Ong et al 200780 Ong et al 200780 Foster et al 1994109 Chen et al 199527 Suzuki et al 199798 Glavac et al 1996110 Latif et al 199313 Ong et al 200730 Whaley et al 1994105 Chen et al 199527 Kishida et al 199599 Crossey et al 1994102 Ong et al 200780 Crossey et al 1994102 Webster et al 19999 Kishida et al 199599 Foster et al 1994109 Crossey et al 1994102 Chen et al 199527 Chen et al 199527 Neumann et al 1998111 Kishida et al 199599 Crossey et al 1994102 Olschwang et al 199826 Woodward et al 1997112 Kishida et al 199599 Zbar et al 199628 Chen et al 199527 Foster et al 1994109 Crossey et al 1994102 CRG113 Foster et al 1994109 Ong et al 200780 Whaley et al 1994105 Shuin et al 1994101 Gnarra et al 1994106 Crossey et al 1995114 Stanojevic et al 2007115 Bailly et al 1995103 Chen et al 199527 Chen et al 199527
64

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 c.256C>T c.257C>A c.257C>G c.257C>T c.258_259delCG c.260_262delTAT c.262T>A c.262T>C c.263G>A c.263G>C c.263G>T c.264G>A c.266T>A c.266T>C c.266T>G c.268A>T c.272T>A c.273C>A c.273C>G c.274G>A c.275delA c.277delG c.277G>A c.278G>A c.279delC c.280G>T c.286C>T c.286insT c.287A>C c.287_289delAGC c.288_290delGCC c.292T>A c.292T>C c.294delC c.296insCAAA c.298A>G c.302T>G c.305delC c.307_311delCCTGG c.309delT c.309_310delTG Missense Missense Missense Missense Frameshift In-frame Missense Missense Nonsense Missense Missense Nonsense Missense Missense Missense Missense Nonsense Nonsense Missense Missense Frameshift Frameshift Missense Missense Frameshift Nonsense Nonsense Frameshift Missense In-frame In-frame Missense Missense Frameshift Frameshift Missense Missense Frameshift Frameshift Frameshift Frameshift Thr98Ala Leu101Arg Tyr98Asn Tyr98His Gln96Pro Glu94Term Gln96Term Gly93Ser Gly93Asp Trp88Arg Trp88Arg Trp88Term Trp88Ser Trp88Leu Trp88Term Leu89His Leu89Pro Leu89Arg Asn90Tyr Phe91Term Phe91Term Phe91Leu Asp92Asn Pro86Ser Pro86His Pro86Arg Pro86Leu VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL
Davide J S Severino
Whaley et al 1994105 Gnarra et al 1994106 Stolle et al 1998116 Kishida et al 199599 Shuin et al 1994101 Brauch et al 1999104 Chen et al 199527 Rocha et al 2003117 Webster et al 19999 Kanno et al 1994118 Whaley et al 1994105 Ong et al 200780 Gnarra et al 1994106 Crossey et al 1994102 Gnarra et al 1994106 Foster et al 1994109 Ong et al 200780 Ong et al 200780 Olschwang et al 199826 Suzuki et al 199798 Gallou et al 199931 Whaley et al 1994105 Glavac et al 1996110 Chen et al 199527 Moore et al 2000119 Crossey et al 1994102 Stolle et al 1998116 Bailly et al 1995103 Maher et al 1996108 Kishida et al 199599 Kishida et al 199599 Gnarra et al 1994106 Crossey et al 1994102 Gallou et al 199931 Shuin et al 1994101 Bailly et al 1995103 Zbar et al 199628 Rocha et al 2003117 Foster et al 1994109 Gnarra et al 1994106 Crossey et al 1994102 65

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1-2 1-2 1-2 1-2 1-2 2 2 2 2 2 2 2 2 c.310delG c.311G>C c.312C>G c.312delC c.313A>C c.316insAC c.317G>A c.317G>C c.320delG c.320G>C c.320C>G c.322delC c.323_324delGC c.327delC c.328insTT c.331A>G c.331delA c.332G>A c.333C>A c.333C>G c.334T>A c.334T>C c.336C>A c.337C>T c.337delC c.340G>A c.340G>C c.340G>T c.340+1G>A c.340+5G>C c.340+8C>T c.341-1G>C 341-2A>C c.342dupGGT c.343C>T c.344A>G c.344A>C c.344delA c.345C>A c.345C>G c.345delC Frameshift Missense Missense Frameshift Missense Frameshift Missense Missense Frameshift Missense Missense Frameshift Frameshift Frameshift Frameshift Missense Frameshift Missense Missense Missense Missense Missense Nonsense Nonsense Frameshift Missense Missense Missense Splice site Splice site Splice site Splice site Splice site In-frame Missense Missense Missense Frameshift Missense Missense Frameshift His115Gln His115Gln His115Tyr His115Arg His115Pro Gly114Ser Gly114Arg Gly114Cys Ser111Asn Ser111Arg Ser111Arg Tyr112Asn Tyr112His Tyr112Term Arg113Term Ser111Gly Arg107Pro Arg107Gly Gly106Asp Gly106Ala Thr105Pro Gly104Ala Gly104Gly VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL Feo VHL VHL e Feo VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL
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Whaley et al 1994105 Olschwang et al 199826 Olschwang et al 199826 Gnarra et al 1994106 Stolle et al 1998116 Olschwang et al 199826 Sekido et al 1994120 Suzuki et al 199798 Suzuki et al 199798 Stolle et al 1998116 Neumann et al 20023 Brauch et al 1999104 Kang et al 2005121 Gallou et al 199931 Kishida et al 199599 Whaley et al 1994105 Chen et al 199527 Chen et al 199527 Webster et al 19999 Chen et al 199527 Bradley et al 1999122 Chen et al 199527 Chen et al 199527 Crossey et al 1994102 Ong et al 200780 Gnarra et al 1994106 Chen et al 199527 Foster et al 1994109 Olschwang et al 199826 Ong et al 200780 Brauch et al 1999104 Olschwang et al 199826 Ong et al 200730 Onge et al 200780 Gnarra et al 1994106 Glavac et al 1996110 Ong et al 200730 Shuin et al 1994101 Chen et al 199527 Olschwang et al 199826 Brieger et al 1999123
66

2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 c.346C>G c.349T>A c.350delG c.350G>A c.351G>A c.351G>T c.352insA c.353T>C c.353T>G c.355T>C c.356T>C c.357C>G c.358_361delAGAG c.359delG c.361delG c.361G>A c.362A>G c.363T>C c.363T>G c.367delG c.369_375delGACA c.371C>T c.374dupA c.377A>G c.378delT c.381delG c.381G>T c.382C>T c.382delC c.383T>G c.384delT c.386insAGA c.388G>C c.388G>T c.390_391delTA c.392A>C c.393C>A c.394C>T c.395delA c.395A>C c.395_396delAA Missense Missense Frameshift Nonsense Nonsense Missense Frameshift Missense Missense Missense Missense Missense Frameshift Frameshift Frameshift Missense Missense Missense Missense Frameshift Frameshift Missense Frameshift Missense Frameshift Frameshift Missense Missense Frameshift Missense Frameshift Frameshift Missense Missense Frameshift Missense Missense Nonsense Frameshift Missense Frameshift Gln132Pro Asn131Thr Asn131Lys Gln132Term Val130Leu Val130Phe Leu128Arg Gly127Gly Leu128Phe Asp126Gly Thr124Ile Asp121Asn Asp121Gly Asp121Asp Asp121Glu Leu118Pro Leu118Arg Phe119Leu Phe119Ser Phe119Leu Trp117Term Trp117Term Trp117Cys Leu116Val Trp117Arg VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL e Feo Feo VHL VHL VHL VHL VHL e Feo VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL
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Maher et al 1996108 Gnarra et al 1994106 Brieger et al 1999123 Bailly et al 1995103 Gnarra et al 1994106 Stolle et al 1998116 Chen et al 199527 Gnarra et al 1994106 Maher et al 1996108 Kang et al 2005121 Eng et al 1995124 Chen et al 199527 Shuin et al 1994101 Gnarra et al 1994106 Maher et al 1996108 Kang et al 2005121 Whaley et al 1994105 Vortmeyer et al 1997125 Foster et al 1994109 Webster et al 19999 Ong et al 200780 Rocha et al 2003117 Ong et al 200780 Gnarra et al 1994106 Brieger et al 1999123 Gnarra et al 1994106 Zbar et al 199628 Zbar et al 199628 Brauch et al 1999104 Ong et al 200780 Zbar et al 199628 Chen et al 199527 Gnarra et al 1994106 Rocha et al 2003117 Crossey et al 1994102 Stolle et al 1998116 Olschwang et al 199826 Zbar et al 199628 Bailly et al 1995103 Ong et al 200780 Whaley et al 1994105
67

2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 c.396A>C c.397A>T c.397_400delACTG c.400G>T c.402insT c.404T>A c.404delT c.405A>C c.405delA c.406delT c.406T>A c.407T>C c.407T>G c.413C>G c.414delA c.417_418delTC c.418delC c.419delT c.421delA c.421_422delAA c.423delT c.426_429delTGAC c.429C>G c.429delC c.430_433delGGAC c.431delG c.431G>A c.431G>C c.433C>T c.435_436delGC c.436delC c.440T>C c.442delT c.445G>A c.445G>C c.446delC c.448delA c.450delT c.450T>A c.452T>G c.452T>C Missense Missense Frameshift Nonsense Frameshift Nonsense Frameshift Missense Frameshift Frameshift Missense Missense Missense Missense Frameshift Frameshift Frameshift Frameshift Frameshift Frameshift Frameshift Frameshift Missense Frameshift Frameshift Frameshift Missense Missense Nonsense Frameshift Frameshift Missense Frameshift Missense Missense Frameshift Frameshift Frameshift Missense Missense Missense Asn150Lys Ile151Ser Ile151Thr Ala149Thr Ala149Pro Ile147Thr Gly144Glu Gly144Ala Gln45Term Asp143Glu Phe136Ile Phe136Ser Phe136Cys Pro138Arg Leu135Phe Leu135Term Glu134Term Gln132His Thr133Ser VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL Feo VHL VHL VHL VHL Feo VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL
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Lee et al 1998126 Foster et al 1994109 Gnarra et al 1994106 Lemm et al 1999127 Foster et al 1994109 Whaley et al 1994105 Ong et al 200780 Kanno et al 1994118 Gnarra et al 1994106 Brauch et al 1999104 Shuin et al 1994101 Crossey et al 1994102 Whaley et al 1994105 Gnarra et al 1994106 Foster et al 1994109 Olschwang et al 199826 Zhuang et al 1996128 Gnarra et al 1994106 Maher et al 1996108 Oberstrass et al 1996129 Foster et al 1994109 Gnarra et al 1994106 Eng et al 1995124 Gnarra et al 1994106 Oberstrass et al 1996129 Gnarra et al 1994106 van der Harst et al 1998100 Lee et al 1998126 Ong et al 200780 Whaley et al 1994105 Foster et al 1994109 van der Harst et al 1998100 Brauch et al 1999104 Chen et al 199527 Foster et al 1994109 Gnarra et al 1994106 Chen et al 199527 Kanno et al 1994118 Brieger et al 1999123 Gnarra et al 1994106 Ong et al 200780
68

2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2-3 2-3 2-3 2-3 2-3 2-3 2-3 2-3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 c.453C>G c.455insA c.457delC c.458T>C c.461C>T c.462A>C c.462delA c.463G>A c.463G>T c.464T>A c.463+1G>C c.463+3A>T c.463+7A>T c.464-1G>C c.464-1G>T c.464-1G>C c.464-2A>G c.464-2A>T c.466T>G c.466_467delTA c.467A>G c.468T>G c.468_471delTACT c.469delA c.470C>T c.472C>G c.472insTTT c.472_473delCT c.473T>A c.473T>C c.474_476delGAAinsC c.475A>G c.477delA c.478G>T c.481C>G c.481C>T c.482G>A c.482G>C c.484T>C c.485G>A c.485G>T Missense Frameshift Frameshift Missense Missense Missense Frameshift Missense Missense Missense Splice site Splice site Splice site Splice site Splice site Splice site Splice site Splice site Missense Frameshift Missense Nonsense Frameshift Frameshift Missense Missense In-frame Frameshift Missense Missense Frameshift Missense Frameshift Nonsense Missense Nonsense Missense Missense Missense Missense Missense Glu160Term Arg161Gly Arg161Term Arg161Gln Arg161Pro Cys162Arg Cys162Tyr Cys162Phe Lys159Glu Leu158Gln Leu158Pro Thr157Ile Leu158Val Tyr156Cys Tyr156Term Tyr156Asp Val155Met Val155Leu Val155Glu Leu153Pro Pro154Leu Pro154Pro Ile151Met VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL
Davide J S Severino
Whaley et al 1994105 Ong et al 200780 Crossey et al 1994102 Gnarra et al 1994106 Crossey et al 1994102 Olschwang et al 199826 Chen et al 199527 Gnarra et al 1994106 Neumann et al 1998111 Ong et al 200730 Glavac et al 1996110 Ong et al 200780 van der Harst et al 1998100 Oberstrass et al 1996129 Crossey et al 1994102 Ong et al 200730 Glavac et al 1996110 Glavac et al 1996110 Olschwang et al 199826 Suzuki et al 199798 Olschwang et al 199826 Kishida et al 199599 Suzuki et al 199798 Gnarra et al 1994106 Kishida et al 199599 Crossey et al 1994102 Zbar et al 199628 Brauch et al 1999104 Suzuki et al 199798 Gnarra et al 1994106 Ong et al 200730 Zbar et al 199628 Stolle et al 1998116 Whaley et al 1994105 Kishida et al 199599 Crossey et al 1994102 Chen et al 199527 Zbar et al 199628 Chen et al 199527 Gnarra et al 1994106 Chen et al 199527
69

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 c.486C>G c.488delT c.490C>T c.491A>G c.496G>T c.497T>A c.497_501delTCCGG c.498delC c.498A>G c.499C>G c.499C>T c.500G>A c.502insTTGTTCGT c.506T>C c.508G>T c.509delT c.509T>A c.509T>G c.509T>C c.510insA c.513G>C c.514delC c.520delA c.523delT c.523T>G c.524delA c.525C>G c.525delC c.526delA c.528delG c.529A>T c.532ins18 c.533T>A c.533T>C c.533T>G c.535delG c.536delA c.538A>G c.539T>A c.540delC c.540_543delCGTC Missense Frameshift Nonsense Missense Missense Missense Frameshift Frameshift Missense Missense Missense Missense Frameshift Missense Missense Frameshift Missense Missense Missense Frameshift Missense Frameshift Frameshift Frameshift Missense Frameshift Nonsense Frameshift Frameshift Frameshift Nonsense In-frame Missense Missense Missense Frameshift Frameshift Missense Missense Frameshift Frameshift Ile180Val Ile180Asn Leu178Gln Leu178Pro Leu178Arg Arg177Term Tyr175Term Tyr175Asp Lys171Asn Val170Asp Val170Gly Val170Gly Leu169Pro Val170Phe Val166Phe Arg167Gly Arg197Trp Arg197Gln Gln164Term Gln164Arg Val166Phe Val166Asp Cys162Trp VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL
Davide J S Severino
Chen et al 199527 Gnarra et al 1994106 Gnarra et al 1994106 Chen et al 199527 Chen et al 199527 Chen et al 199527 Foster et al 1994109 Shuin et al 1994101 Ong et al 200780 Crossey et al 1994102 Gnarra et al 1994106 Crossey et al 1994102 Chen et al 199527 Suzuki et al 199798 Crossey et al 1994102 Shuin et al 1994101 Kishida et al 199599 Kishida et al 199599 Ong et al 200780 Foster et al 1994109 Lemm et al 1999127 Oberstrass et al 1996129 Bailly et al 1995103 Gnarra et al 1994106 Stolle et al 1998116 Latif et al 199313 Kishida et al 199599 Ong et al 200780 Chen et al 199527 Crossey et al 1994102 Whaley et al 1994105 Olschwang et al 199826 Zbar et al 199628 Crossey et al 1994102 Webster et al 19999 Suzuki et al 199798 Foster et al 1994109 Crossey et al 1994102 Whaley et al 1994105 Gnarra et al 1994106 Stolle et al 1998116
70

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 c.548C>A c.551T>C c.551T>G c.553delT c.554delA c.555C>G c.556G>A c.556G>T c.558_560delAGA c.559insC c.562C>G c.562delC c.563delT c.563T>A c.563T>C c.565delG c.571delC c.573delC c.578delA c.579_580delTG c.581_582delTG c.582G>T c.583C>T c.584_585delAG c.589delG c.593T>G c.598C>T c.606dupA c.607delC c.620C>T c.628C>T Nonsense Missense Missense Frameshift Frameshift Nonsense Missense Nonsense In-frame Frameshift Missense Frameshift Frameshift Missense Missense Frameshift Frameshift Frameshift Frameshift Frameshift Frameshift Missense Nonsense Frameshift Frameshift Missense Missense Frameshift Frameshift Missense Missense Ala207Val Arg210Trp Leu198Arg Arg200Trp Val194Val Gln195Term Leu188Gln Leu188Pro Leu188Val Tyr185Term Glu186Lys Glu186Term Ser183Term Leu184Pro Leu184Arg VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL Feo VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL VHL
Davide J S Severino
Gnarra et al 1994106 Bailly et al 1995103 Crossey et al 1994102 Shuin et al 1994101 Suzuki et al 199798 Crossey et al 1994102 Chen et al 199527 Chen et al 199527 Maher et al 1996108 Shuin et al 1994101 Kishida et al 199599 Ong et al 200780 Maher et al 1996108 Chen et al 199527 Stolle et al 1998116 Suzuki et al 199798 Kishida et al 199599 Zbar et al 199628 Foster et al 1994109 Whaley et al 1994105 Foster et al 1994109 Brauch et al 1999104 Crossey et al 1994102 Ong et al 200780 Ong et al 200780 Whaley et al 1994105 Kishida et al 199599 Ong et al 200780 Gnarra et al 1994106 Kanno et al 1997130 Kanno et al 1997130
(a) - Nmero dos nucleotidos baseado na sequncia de cDNA, de acordo com den Dunnen et al (2001)131 (b) - VHL: sndrome von Hippel-Lindau; Feo: feocromocitoma; Feo: feocromocitoma A negrito encontram-se representadas as mutaes referidas como germinais.
71
Davide J S Severino
ANEXO 2 - MUTAES IDENTIFICADAS NO GENE RET

Exo 5 8 8 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 11 11 11 11 11 Mutao(a) c.961G>A c.1585_1593dupGAGGAGTGT c.1597G>T c.1807A>C c.1825T>C c.1825T>G c.1826G>A c.1826G>C c.1831T>A c.1831T>C c.1831T>G c.1832G>A c.1832G>T c.1833C>G c.1852T>A c.1852T>C c.1852T>G c.1853G>A c.1853G>C c.1853G>T c.1858T>A c.1858T>C c.1858T>G c.1859G>A c.1859G>C c.1859G>T c.1860C>G c.1888T>C c.1889G>A c.1889G>T c.1891G>T c.1896_1900delinsCGTGC Tipo de mutao Missense In-frame Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Nonsense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense In-frame Gly533Cys Lys603Gln Cys609Arg Cys609Gly Cys609Tyr Cys609Ser Cys611Ser Cys611Arg Cys611Gly Cys611Tyr Cys611Phe Cys611Trp Cys618Ser Cys618Arg Cys618Gly Cys618Tyr Cys618Term Cys618Phe Cys620Ser Cys620Arg Cys620Gly Cys620Tyr Cys620Ser Cys620Phe Cys620Trp Cys630Arg Cys630Tyr Cys630Phe Asp631Tyr Alterao de aminocido Gly321Arg Fentipo(b) CMT CMT MEN2A e CMT CMT MEN2A e CMT MEN2A MEN2A e CMT MEN2A MEN2A MEN2A CMT MEN2A e CMT CMT MEN2A e CMT MEN2A e CMT MEN2A e CMT MEN2A MEN2A e CMT MEN2A e CMT MEN2A e CMT MEN2A MEN2A e CMT MEN2A MEN2A e CMT MEN2A e CMT MEN2A e CMT MEN2A MEN2A e CMT MEN2A CMT MEN2A MEN2A Referncia Dvorakova et al 2005132 Pigny et al 1999133 da Silva et al 2003134 Rey et al 2001135 Kambouris et al 1996136 Frank-Raue et al 1996137 Mulligan et al 1994138 Klein et al 2001139 Kambouris et al 1996136 Kambouris et al 1996136 Oriola et al 1998140 Mulligan et al 1994138 Frank-Raue et al 1996137 Donis-Keller et al 1993141 Donis-Keller et al 1993141 Donis-Keller et al 1993141 Mulligan et al 1993142 Donis-Keller et al 1993141 Xue et al 1994143 Wells et al 1994144 Blaugrund et al 1994145 Donis-Keller et al 1993141 Kitamura et al 1997146 Donis-Keller et al 1993141 Schuffenecker et al 1994147 Dvorakova et al 2006148 Siegelman et al 1997149 Machens et al 2003150 Kitamura et al 1997146 Komminoth et al 1995151 Beldjord et al 1995152 Mulligan et al 1993142
72

11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 13 13 13 13 14 14 15 15 16 c.1900T>A c.1900T>C c.1900T>G c.1901G>A c.1901G>C c.1901G>T c.1901_1902delinsTG c.1902C>G c.1892_1903dupACGAGCTGT GCC c.1900_1908dupTGCCGCACG c.1996A>G c.1998delinsTTCT c.2304G>C c.2370G>C c.2370G>T c.2372A>T c.2410G>A c.2410G>T c.2647_2648delinsTT c.2671T>G c.2753T>C Missense Missense Missense Missense Missense Missense In-frame Missense In-frame In-frame Missense In-frame Missense Missense Missense Missense Missense Missense In-frame Missense Missense Ser891Ala Met918Thr Glu768Asp Leu790Phe Leu790Phe Tyr791Phe Val804Met Val804Leu Ly666Glu Cys634Trp Cys634Ser Cys634Arg Cys634Gly Cys634Tyr Cys634Ser Cys634Phe MEN2A MEN2A e CMT MEN2A MEN2A e CMT MEN2A e CMT MEN2A e CMT MEN2A MEN2A e CMT MEN2A MEN2A MEN2A MEN2A MEN2A e CMT MEN2A e CMT MEN2A e CMT MEN2A e CMT MEN2A e CMT MEN2A e CMT MEN2B MEN2A e CMT MEN2B
Davide J S Severino
Mulligan et al 1994138 Donis-Keller et al 1993141 Mulligan et al 1993142 Mulligan et al 1993142 Mulligan et al 1993142 Mulligan et al 1993142 Amar et al 2005153 Mulligan et al 1994138 Hoeppner et al 1997154 Hoeppner et al 1998155 Ahmed et al 2005156 VandenBosch et al 2005157 Eng et al 1995158 Berndt et al 1998159 Berndt et al 1998159 Berndt et al 1998159 Fink et al 1996160 Bolino et al 1995161 Smith et al 199754 Hofstra et al 1997162 Hofstra et al 1994163
(a) - Nmero do nucleotido baseado na sequncia de cDNA, de acordo com den Dunnen et al (2001)131 (b) - MEN2A: neoplasia endcrina mltipla tipo 2A; MEN2B: neoplasia endcrina mltipla tipo 2B; CMT: carcinoma medular da tiride familiar. As mutaes associadas ao carcinoma medular familiar da tiride foram includas nesta tabela devido possibilidade deste carcinoma poder representar a primeira manifestao da sndrome MEN2. A negrito encontram-se representadas as mutaes que ocorrem nos codes, descritos na literatura, como os que com mais frequncia esto envolvidos na sndrome MEN 2.
73
Davide J S Severino
ANEXO 3 - MUTAES IDENTIFICADAS NO GENE SDHB

Exo 1 1 1 1 1 1 1-2 1-2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2-3 2-3 2-3 3 3 3 3 3 3-4 3-4 3-4 3-4 4 4 4 Mutao(a) c.1-10413_73-3866del c.1-16418_73-5173del c.17_35del19 c.21delC c.24C>T c.45_46insCC c.72+1G>T c.73-29delT c.79delC c.87_88insCAG c.88delC c.118A>G c.127G>C c.136C>G c.136C>T c.137G>A c.141G>A c.157G>A c.166_170delCCTCA c.167C>T c.174_175delinsTT c.194T>A c.194T>C c.200+3G>C c.201-5A>G c.201-4429_287-933del c.260T>C c.268C>T c.269G>A c.277T>C c.281G>A c.286+1G>A c.286+2T>A c.287-2A>G c.287-1G>C c.287G>A c.292T>C c.293G>A Tipo de mutao Deleo extensa Deleo extensa Frameshift Frameshift Missense Frameshift Splice site Splice site Frameshift In-frame Frameshift Missense Missense Missense Nonsense Missense Nonsense Missense Frameshift Missense In-frame Missense Missense Splice site Splice site Deleo extensa Missense Nonsense Missense Missense Missense Splice site Splice site Splice site Splice site Missense Missense Missense Gly96Asp Cys98Arg Cys98Tyr Leu87Ser Arg90Term Arg90Gln Cys93Arg Arg94Lys Leu65His Leu65Pro Pro56Leu Lys40Glu Ala43Pro Arg46Gly Arg46Term Arg46GLn Trp47Term Gly53Arg Ser8Ser Alterao de aminocido Fentipo(b) Para Para Feo e Para Feo Feo e Para Para Feo Feo Para Feo Feo Feo e Para Feo Feo Feo Feo Feo e Para Feo Feo Feo Para Feo Feo Feo Para Feo e Para Feo Feo e Para Feo e Para Para Feo e Para Para Para Para Feo e Para Feo e Para Feo e Para Feo e Para Referncia Cascon et al 2006164 Cascon et al 2008165 Amar et al 2007166 Neumann et al 2004167 Bayley et al 2006168 Pasini et al 2008169 Benn et al 200677 Benn et al 2003170 Badenhop et al 2004171 Neumann et al 20023 Benn et al 2003170 McDonnell et al 2004172 Gimenez-Roqueplo et al 200380 Neumann et al 20023 Benn et al 2003170 Gimenez-Roqueplo et al 2002173 Bayley et al 2006168 Neumann et al 200478 Neumann et al 2004167 Benn et al 200677 Baysal et al 200283 Benn et al 2003170 Neumann et al 2004167 Benn et al 2003170 Brouwers et al 2006174 Bayley et al 2009175 Astuti et al 200164 Astuti et al 200164 Castellano et al 2006176 Lima et al 2007177 Bayley et al 2006168 Mannelli et al 2006178 Brouwers et al 2006174 Neumann et al 2004167 Timmers et al 200765 Benn et al 200677 Benn et al 200677 Benn et al 200677
74

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4-5 4-5 4-5 4-5 5 5 5-6 5-6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 c.296G>A c.298T>C c.302G>A c.311delAinsGG c.312insCACTGCA c.343C>T c.380T>A c.380T>G c.392C>G c.392delC c.395A>C c.418G>T c.423+1G>C c.423+20T>A c.424-3C>G c.424-1G>A c.502insC c.540G>A c.541-3C>G c.541-2A>G c.557G>A c.574T>C c.575G>A c.587G>A c.590C>G c.591delC c.600G>T c.620_621delTG c.623G>A c.642G>C c.644delC c.653G>C c.660_661insT c.683_684delAG c.688C>T c.689G>A c.713delT c.713_716delTCTC c.717delT c.718_721delCTAT c.724C>T Missense Missense Missense Frameshift Frameshift Nonsense Missense Missense Missense Frameshift Missense Missense Splice site Splice site Splice site Splice site Frameshift Missense Splice site Splice site Missense Missense Missense Missense Missense Frameshift Missense Frameshift Missense Missense Frameshift Missense Frameshift Frameshift Missense Missense Frameshift Frameshift Frameshift Frameshift Missense Arg242Cys Arg230Cys Arg230His Trp218Ser Gly208Glu Gln214His Trp200Cys Cys186Tyr Cys192Arg Cys192Tyr Cys196Tyr Pro197Arg Cys180Tyr His132Pro Val140Phe Arg115Term Ile127Asn Ile127Ser Pro131Arg Gly99Asp Ser100Pro Cys101Tyr Feo e Para Para Feo Feo Para Feo e Para Feo Para Para Para Para Para Feo e Para Feo e Para Feo Feo Feo Para Feo Feo e Para Para Feo Feo e Para Feo Feo Feo Feo e Para Feo Feo e Para Para Para Feo e Para Feo Para Feo Feo e Para Feo Feo Feo e Para Feo Para
Davide J S Severino
Benn et al 200677 Pollard et al 2005177 Neumann et al 20023 Benn et al 200677 Lima et al 2007177 Bayley et al 2006168 Astuti et al 2003179 Pollard et al 2005180 Baysal et al 200283 Zantour et al 2004181 Maier-Woelfle et al 2004182 Brouwers et al 2006174 Amar et al 2005153 Srirangalingam et al 2008183 Neumann et al 2004167 Benn et al 2003170 Benn et al 200677 Lima et al 2007177 Neumann et al 2004167 Timmers et al 200765 Lima et al 2007177 Neumann et al 20023 Benn et al 200677 Neumann et al 20023 Astuti et al 200164 Astuti et al 200164 Drucker et al 2006184 Gimenez-Roqueplo et al 200380 Benn et al 200677 Brouwers et al 2006174 Mora et al 2005185 Bayley et al 2006168 Astuti et al 2003179 Brouwers et al 2006174 Gimenez-Roqueplo et al 200380 Amar et al 2005153 Amar et al 2005153 Neumann et al 20023 Amar et al 2005153 Amar et al 2005153 Badenhop et al 2004171 75

7 7 7 7 7 7-8 c.725G>A c.747C>A c.758G>A c.761C>T c.761insC c.765+1G>A Missense Nonsense Missense Missense Frameshift Splice site Arg242His Cys249Term Cys253Tyr Pro254Leu Feo Feo Feo e Para Para Feo Para
Davide J S Severino
Neumann et al 20023 Neumann et al 20023 Amar et al 2005153 Lima et al 2007177 Benn et al 200677 Neumann et al 2004167
(a) - Nmero do nucletido baseado na sequncia de cDNA, de acordo com den Dunnen et al (2001)131 (b) - Para: Paraganglioma; Feo: feocromocitoma
76
Davide J S Severino
ANEXO 4 - MUTAES IDENTIFICADAS NO GENE SDHC

Exo 1 1 1-2 2 2 2-3 3 4 4 4 5 5 5-6 5-6 6 6 Mutao(a) c.1A>G c.3G>A c.20+2A>C c.39C>A c.43C>T c.78-2A>G c.126G>A c.183G>A c.214C>T c.244G>T c. 256_257insTTT c.397C>T c.405+1G>A c.405+1G>T c.439C>T c.473T>C Tipo de mutao Codo de iniciao Codo de iniciao Splice site Missense Nonsense Splice site Nonsense Nonsense Missense Missense In-frame Nonsense Splice site Splice site Nonsense Missense Gln147Term Leu158Pro Arg133Term Trp42Term Trp61Term Arg72Cys Val82Phe Alterao de aminocido Fentipo(b) Para PGL 3 Para Met13Val Arg15Term Para Para Feo e Para PGL 3 Para Para Para Para Para Para PGL 3 Para Para Referncia Schiavi et al 2005186 Niemann & Muller 200063 Fakhry et al 2008187 Schiavi et al 2005186 Pasini et al 2008169 Peczkowska et al 2008188 Mannelli et al 2007189 Garrel et al 2009190 Schiavi et al 2005186 Lpez-Jimnez et al 2008191 Lpez-Jimnez et al 2008191 Zbuk et al 2007192 Pasini et al 2008169 Niemann et al 2003193 Schiavi et al 2005186 Bauters et al 2003194
(a) - Nmero do nucletido baseado na sequncia de cDNA, de acordo com den Dunnen et al (2001)131 (b) - Para: Paraganglioma; PGL 3: Paragangliomas familiares tipo 3; Feo: feocromocitoma
77
Davide J S Severino
ANEXO 5 - MUTAES IDENTIFICADAS NO GENE SDHD

Exo 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1-2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2-3 2-3 2-3 3 3 3 3 3 3 3 3 Mutao(a) c.1A>G c.3G>A c.3G>C c.14G>A c.21delG c.28_33delins12bp c.33C>A c.34G>A c.36_37delTG c.49C>T c.50G>T c.52+2T>G c.54_55dupC c.57delG c.64C>T c.94_95delTC c.106C>T c.112C>T c.120_121insC c.120_127delCCCAG AAT c.125A>C c.129G>A c.147_148insA c.148_149insA c.149A>G c.168_169delTT c.169+1G>T c.169+5G>A c.170-1G>T c.191_192delTC c.202_203insA c.206_218del13bp c.208A>G c.210G>T c.242C>T c.252T>G c.254T>A Tipo de mutao Codo de iniciao Codo de iniciao Codo de iniciao Nonsense Frameshift In-frame Nonsense Missense Frameshift Nonsense Missense Splice site Frameshift Frameshift Nonsense Frameshift Nonsense Nonsense Frameshift Frameshift Missense Nonsense Frameshift Frameshift Missense Frameshift Splice site Splice site Splice site Frameshift Frameshift Frameshift Missense Missense Missense Nonsense Nonsense Arg70Gly Arg70Ser Pro81Leu Tyr84Term Leu85Term His50Arg Glu42Ala Trp43Term Gln36Term Arg38Term Arg22Term Arg17Term Arg17Leu Cys11Term Gly12Ser Alterao de aminocido Fentipo(b) Para Feo e Para Para Trp5Term Feo Para Feo Feo Para Feo Para Para Para Para Para Para Feo Para Para Para Para Feo Para Para Para Para Para Para Para Para Para Para e Feo Feo Para Para Para Para Para e Feo Referncia Riemann et al 2004195 Cscon et al 2009196 Badenhop et al 2001197 Neumann et al 20023 Benn et al 200677 Neumayer et al 2007198 Neumann et al 20023 Gimm et al 2000199 Neumann et al 20023 Papaspyrou et al 2008200 Lima et al 2007177 Gimm et al 2000199 Taschner et al 2001201 Pasini et al 2008169 Taschner et al 2001201 Astuti et al 200164 Baysal et al 200061 Baysal et al 200061 Taschner et al 2001201 Lima et al 2007177 Cascon et al 2004202 Cascon et al 2002203 Astrom et al 200384 Amar et al 2005153 Perren et al 2002204 Velasco et al 2005205 Benn et al 200677 Timmers et al 2008206 Dannenberg et al 2002207 Badenhop et al 2001197 Amar et al 2005153 Neumann et al 2004167 Taschner et al 2001201 Cscon et al 2009196 Baysal et al 200061 Neumann et al 2004167 Amar et al 2005153
78

3 3 3 3 3 3 3 3 3-4 3-4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 c.268G>A c.271_282del12bp c.274G>T c.276_278delCTA c.277delT c.284T>C c.296delT c.305A>T c.314+1G>A c.315-32T>C c.317G>A c.325C>T c.337_340delGACT c.341A>G c.341_342delAT c.353T>G c.361C>T c.366delA c.381delG c.386_387insT c.416T>C c.443delG c.443G>A c.443G>T c.463delA Missense In-frame Missense In-frame Frameshift Missense Frameshift Missense Splice site Splice site Missense Nonsense Frameshift Missense Frameshift Missense Nonsense Frameshift Frameshift Frameshift Missense Frameshift Missense Missense Frameshift Gly148Asp Gly148Val Leu139Pro Asp118Glu Gln121Term Tyr114Gys Gly106Asp Gln109Term His102Leu Leu95Pro Asp92Tyr Ala90Tyr Feo Feo Para Para Para Para Feo Para Para Para Para Para Para e Feo Para Para e Feo Para Feo Para e Feo Para Para Para Para Para e Feo Para Para
Davide J S Severino
Cascon et al 2004202 Neumayer et al 2007198 Baysal et al 200061 Badenhop et al 2001197 Dannenberg et al 2002207 Taschner et al 2001201 Astuti et al 2003179 Baysal et al 200061 Benn et al 200677 Taschner et al 2001201 Ogawa et al 2006208 Baysal et al 200283 Cascon et al 2002203 Milunsky et al 2001209 Benn et al 200677 Takahashi et al 2005210 Neumann et al 20023 Amar et al 2005153 Baysal et al 200283 Lima et al 2007177 Taschner et al 2001201 Milunsky et al 2001209 Benn et al 200677 Neumann et al 2004167 Leube et al 2004211
(a) - Nmero do nucletido baseado na sequncia de cDNA, de acordo com den Dunnen et al (2001)131 (b) - Para: Paraganglioma; feo: feocromocitoma
79

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Faculdade de Cincias da Sade

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GENTICA DOS FEOCROMOCITOMAS

Por: Davide Jos da Silva Severino

Orientado por: Professor Doutor Manuel Carlos Lemos

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

ENQUADRAMENTO DO TEMA.................................................................................... 1 OBJECTIVOS ........................................................................................................ 2

2 - MTODOS .................................................................................................... 4 3 - SNDROME DE VHL ....................................................................................... 6

4- SNDROME MEN 2 ......................................................................................... 18

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

5 SNDROMES DE PARAGANGLIOMAS FAMILIARES ............................................ 27

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares (ii) O complexo pVHL-ubiquitina ligase

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares (iv) Hidroxilao do HIF

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

C) MECANISMOS FISIOPATOLGICOS DA SNDROME DE VHL

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

D) MODELOS ANIMAIS PARA A SNDROME DE VHL

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

E) CORRELAES GENTIPO-FENTIPO NA SNDROME DE VHL

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

c.232A>C c.233A>C c.233A>G c.233A>T c.233insTCT c.229_231delTGC c.230delG c.230_232delGCA

c.224T>G c.224_226delTCT c.226T>A c.226_228delTTC c.227T>C c.227insC c.227_229delTCT

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

D) PROTENA DO GENE RET

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

E) MECANISMOS FISIOPATOLGICOS DA SNDROME MEN 2

F) MODELOS ANIMAIS PARA A SNDROME MEN 2

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

G) CORRELAES GENTIPO FENTIPO NA SNDROME MEN 2

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

c.1831T>G c.1832G>A c.1832G>T c.1833C>G

c.1825T>C c.1825T>G c.1826G>A c.1826G>C

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

5 SNDROMES DE PARAGANGLIOMAS FAMILIARES

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

Gentica dos feocromocitomas e paragangliomas familiares

E) MECANISMOS FISIOPATOLGICOS DAS SNDROMES DE PARAGANGLIOMAS