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ILPROCESSOEMOSTATICO

DefinizionediEMOSTASI: seriedireazionibiochimiche,sequenzialiesinergiche, finalizzateaimpedirelaperditadisanguedaivasi.Eciounmeccanismodidifesadeputato almantenimentodellintegritdeivasisanguigniedellafluiditdelsangue.

Tappedelnormaleprocessoemostatico

Quandosiverificaunalesionevascolare,vieneattivatoilmeccanismodellemostasi,cheun meccanismoautoregolato. Isistemicoinvoltinelprocessoemostaticosono4: 1vasiecostituentidellaparetevascolare 2piastrine 3cascataenzimaticadellacoagulazione1 4sistemafibrinolitico Ilprocessoemostaticopu esseresuddivisoin4fasi,tenendoper semprepresentechei varisistemicoinvoltisiinfluenzanovicendevolmenteesonointimamenteinterconnessi.Le4 fasisono: 1Fasevascolare 2Fasepiastrinica 3Fasecoagulativa 4Fasefibrinolitica 1Alliniziocunbreveperiododivasocostrizione(dovutoameccanismineurogeniriflessi eafattoriumoralicomelendotelina,cheunpotentevasocostrittorediorigineendoteliale). Lacontrazionevascolare pievidenteneivasiconparetemuscolarebendefinitae servea ridurremomentaneamentelaperditadisangue. 2Lalesionedellecelluleendotelialiesponeiltessutoconnettivosottoendotelialealtamente trombogenico,alqualelepiastrineaderisconoentrandoinunostatodiattivazione,che comportauncambiamentonellaformapiastrinicaeunareazionediesocitosi. Ifattorichesiliberanodaigranulipiastrinici(ADP,TXA2,serotoninaedaltri)reclutano ulterioripiastrinecheaggreganosopraleprime,cos daformareiltappopiastrinico.Tale reazionepiastrinicaavvieneentropochiminutidallalesionee,insiemeallavasocostrizione, costituiscelacosidettaemostasiprimaria Sesitrattadilesionicapillarilemostasiprimariasufficienteariparareildanno. 3Sesitrattadilesionidivasidicalibromaggiore,lesposizionediunasuperficienegativae difattoretessutalenelsitodilesione,insiemeaifattoripiastrinici,attivail sistemadella coagulazione,cheportaallaformazioneditrombina.Latrombinaconverteilfibrinogenoa fibrina,formandoilcoagulodifibrinaestimolandounulteriorereclutamentodipiastrine.

Tuttocirichiedepitempoedilprocessovienedefinitoemostasisecondaria.Vienequindi prodotto il tappo emostatico secondario o permanente. La fibrina polimerizzata e le piastrineformanounamassasolidachetamponalemorragianelsitodellalesione. Lemostasi un processo di emergenza volto ad arrestare le perdite di sangue. E un meccanismofinementecontrollatochetendealocalizzareilcoagulonelsitodellalesione, prevenendocosunareazioneacatena(questapotrebbeprovocareunestesacoagulazione:la coagulazionedi1mldisangueproducetrombinaingradodifarcoagulareilfibrinogeno presentein3litridisangue). 4Unavoltachelalesionevascolare statariparatasiverificaladissoluzionedelcoagulo stessomedianteilprocessodellafibrinolisi Tutti i meccanismi deputati al mantenimento della fluidit del sangue e dellintegrit dellapparatovascolare,peressereefficacidevonointervenirerapidamenteedevonorimanere ilpipossibileconfinatialivellodellalesione.Questoobiettivovieneraggiuntomedianteun complesso sistema di controllo ad opera di inibitori specifici sia dei fattori della coagulazionechedellafibrinolisi.Talesistemadicontrollo complessoedestremanente efficaceeleconcentrazioniplasmatichedellemolecoledicontrollosonomoltopielevatedi quelledeifattorisuiqualiagiscono. Nellorganismo integro vi sempre una certa attivazione del sistema emostatico. Infatti, anche in condizioni fisiologiche, non esiste unassoluta integrit vascolare: continui microtraumideterminanominimelesioniendotelialipercuiunapartedelfibrinogenoviene continuamenteconvertitoinfibrina,vienecioinnescatalacosidetta emostasifisiologica. Inuno statodi equilibrioemostaticofunzionale lafibrinavienecontinuamenterimossa mediante ilprocessodellafibrinolisi.Lemostasifisiologicarisultadaunequilibriofra i meccanismi favorenti il processo emostatico nella sua generalit ed i sistemi ad esso antagonisti. Lospostamentodellequilibrionelsensodiunaumentoodiunadiminuzionedellattivit emostaticahaimportanticonseguenzepatologiche.Nonostantelealterazionidellemostasi possanoesseredovuteanumerosecauseeseguiremolteviepatogenetiche,lemanifestazioni clinichefinalisipossonoricondurreaduequadrifondamentali: una incontrollataattivazioneintravasaledellemostasi,ched luogoamanifestazioni trombotiche:MALATTIETROMBOTICHE un deficit del sistema emostatico, che d luogo a manifestazioni emorragiche: MALATTIEESINDROMIEMORRAGICHE

MECCANISMIFISIOLOGICIDELLEMOSTASI 1Fasevascolare
Ilprimoeventochesiverificanellemostasiunacontrazionevascolarealivellodellazona lesa.Imeccanismidivasocostrizionesonopiefficientineivasidotatidiunaspessatunica

vascolare con presenza di cellule muscolari lisce (tunica media), ma avvengono anche a livello dei capillari ad opera di proteine contrattili presenti nelle cellule endoteliali. La vasocostrizione dovuta a vari fattori: risposta diretta delle fibrocellule muscolari allo stiramento provocato dal trauma, riflesso neurovegetativo vasomotore (stimolazione dei nervavasorum),liberazionelocaledisostanzevasocostrittriciadoperaprimadellecellule endoteliali(endotelina,polipeptidedi21animoacidi,lacuisecrezione inibitadalflusso turbolento del sangue, in condizioni fisiologiche) e, in fase pi tardiva, dalle piastrine (liberazionedellaserotoninacontenutaneigranulidelta).Questoprocessosarebbediscarsa utilit se non intervenissero le piastrine, con i processi di adesione, aggregazione e liberazionedivarifattoridaigranulie,incasodilesioniestese,ilsistemadellacoagulazione. Lafasevascolare comunqueestremamenteimportante(soprattuttoincasodilesionedei grossivasi)perch:a)permettediridurreildeflussodisangueattraversoilvasodanneggiato, riducendointalmodolentitdellemorragia;b)favorisceifenomenidimarginazionedelle piastrine, con conseguente loro attivazione (fase piastrinica dellemostasi); c) favorisce laccumulolocaledeifattoridellacoagulazioneattivatiinseguitoallaesposizionedeltessuto sottoendoteliale o in seguito alla liberazione della tromboplastina tessutale (fase della coagulazione).

Lendotelio veniva in passatoconsideratocome una semplice barriera non trombogenica, negliultimianniinvecesidimostratochelendoteliountessutometabolicamenteattivo, che, a seconda del suo stato funzionale, pu o favorire o inibire lemostasi. In stato di quiescenzalendotelio ingradodiassicurarelafluiditdelsanguemedianteuncomplesso meccanismo anticoagulante mentre, in seguito ad una lesione, la perdita della cellula endoteliale costituisce il punto di avvio del processo di emostasi localizzata, attraverso linduzionecoordinatadiattivitproemostatichecheinizianoconladesionepiastrinica. Le piastrine o trombociti sono cellule secretrici senza nucleo, a forma discoidale, di dimensionicompresefra1e4mdidiametroedi1mdispessore,checircolanoneivasi senzaaderireallaparetevascolare.Nelsoggettonormaleilnumerodellepiastrinevariada 150.000a400.000/mm3.Siparladi piastrinopeniaotrombocitopenia quandoilnumero dellepiastrineinferiorea100.000/mm3 edipiastrinosiotrombocitosipervalorisuperiori a 500.000/mm3. Le piastrine sono frammenti citoplasmatici di una cellula progenitrice midollaremultinucleata,ilmegacariocita.Latrombopoiesiopiastrinopoiesiregolatadaun fattore presente nel siero, la trombopoietina, che in grado di aumentare non solo la produzionedipiastrine,maanchelaproliferazionedeimegacariociti.Anchelinterleuchina 11(IL11)haattivittrombopoietica.Laproduzionedipiastrinepuaumentarenotevolmente (78volte)inseguitoadattivazionedellemostasioastimolazionedelmidollo.Lepiastrine appenaimmesseincircolosonopigrandiedhannounattivitemostaticamaggiorerispetto allepiastrinecircolantimature.Lepiastrinesopravvivonoincircolopercirca1012giorni (emivita 56 giorni) e successivamente vengono sequestrate dagli organi emocateretici (principalmentedallamilzaedalfegato),dovevengonofagocitatedallecelluledelsistema deifagocitimononucleati.Laloroformacontrollatadalcitoscheletroeinparticolaredaun fasciocirconferenzialedimicrotubuli, situatoallequatoredeldisco,edamicrofilamenti contrattiliancoratiallemembranecellulari.Apartelassenzadelnucleo,sonopresentituttii principalicomponentisubcellulari,mitocondri,granulidiglicogeno,lisosomi.Lamembrana plasmatica rivestita allesterno da un caratteristico strato di polisaccaridi e

2Fasepiastrinica

lipo/glicoproteine,detto glicocalice.Delglicocalicefannoparteirecettori,chemedianole pi importanti funzioni piastriniche e tutte le glicoproteine coinvolte nelladesione e nellaggregazione. Alla membrana piastrinica associata una attivit procoagulante, il cosiddettofattorepiastrinico3(sitrattadeifosfolipididellamembranapiastrinica,iquali forniscono la fase solida sulla quale avvengono le interazioni fra i vari fattori della coagulazione, quando la cascata coagulativa viene attivata). Nelle piastrine la membrana plasmaticasiintrofletteaformareunsistemadiinvaginazioni,checostituisconoil sistema canalicolareaperto,chedeterminaunaumentodisuperficiepergliscambiconlesternoe, quindi,unarapidaviadisecrezionedeigranulialmomentodellattivazionepiastrinica.Trale membraneinterne moltoimportanteilreticoloendoplasmaticoliscio,dettoanche sistema tubularedenso,cherappresentalaprincipaleriservadicalciononmitocondrialecoinvolto nellarispostapiastrinica. Lepiastrinecontengonotretipidigranuli: lisosomi, granulidensi(dettianchegranuli delta)edalfagranuli. Ilcontenutodiquestiultimiduevienesecretodurantelarisposta piastrinica, attraverso il sistema canalicolare apertoo attraversola membrana plasmatica, direttamente nel microambiente sede dellaggregazione piastrinica. I granuli densi rappresentanoilsitodidepositodeinucleotidiadenilici,contengonoancheserotoninaesono menonumerosidegligranuli.Questiultimicontengonoproteinespecifichedellepiastrine, chepossonoesseresuddiviseinproteineadesive,modulatoripositivienegatividellacrescita cellulareefattoridellacoagulazioneedellafibrinolisi.Gli granulicontengonoanchela betatromboglobulina,cheuninibitoredellasintesidiprostaciclinaendoteliale,rilasciatain fasediattivazione.

Fasidellarispostapiastrinica

In seguito aldannovascolare,lepiastrinesonoespostealsottoendotelio,cio collageno, proteoglicani, fibronectina ed altre glicoproteine e questo ne determina lattivazione. La risposta piastrinica comportamutamenti diordinebiochimico, strutturale emorfologico dellepiastrinestesse. Larispostadellepiastrineadunostimolodovutaallinterventocoordinatodellamembrana, deigranuliedelcitoscheletroepuesseresuddivisainvariefasichetendonoasovrapporsi: adesioneeattivazione cambiamentodiforma(shapechange) secrezionedeigranuli(releasereaction) aggregazione

Adesioneedattivazionepiastrinica

Per adesione si intende la capacit delle piastrine di legarsi al sottoendotelio esposto in seguito al danno endoteliale, essenzialmente al collageno. Ci determina lattivazione piastrinicaconinnescodellevieditrasduzionedelsegnale(vedirispostabiochimica). Lepiastrinecircolanti,inconseguenzaallariduzionedellavelocit delflussosanguigno, secondariaaifenomenidivasocostrizionedellafasevascolaredellemostasi,sispostanodal centro alla periferia del vaso (marginazione delle piastrine) e possono quindi con pi facilitaderireallestruttureesposteinseguitoallalesionevasale. Il processo di adesione, come pure laggregazione piastrinica, dipende dalla presenza di molecole di adesione presenti sulla superficie delle piastrine, che, per la maggior parte,

appartengonoallasuperfamigliadelle INTEGRINE.Leintegrinesonomolecolecomposte daduecatenepeptidicheunitedaunlegamenoncovalente,denominatealfaebeta.Esistono varitipisiadicatenealfachedicatenebeta:ladiversit fraleintegrine datadallevarie combinazioni delle differenti isoforme delledue catene. Alcune di queste molecole sono presentiinformafunzionalesullepiastrinecircolanti: ilcaso dellintegrinaGPIa/GPIIa (dettaancheVLA2:verylateantigen)chehalacapacit dilegarsialcollageno.Equindi funzionalmente inerte quando lendotelio integro, ma inizia ladesione piastrinica al sottoendotelioquandoilcollageno espostocomeconseguenzadiunalesioneendoteliale. Anchealtremolecolediadesionepartecipanoaquestoprocessolegandosiadaltremolecole presentinelsottoendotelio,comelafibronectinaelalaminina(GPIc/IIaoVLA6,chesilega allalamininaeGPIc*/IIaoVLA5,chesilegaallafibronectina).Questoinizialeprocessodi adesionenon per sufficienteaimpedirelarimozionedellepiastrineadesedapartedella correntesanguigna.Perch siabbia unaadesionepi stabile necessariolinterventodi unaltramolecoladiadesione,chenon unintegrinamaunaglicoproteinariccadileucina, denominataGPIb.Questahalacapacitdilegareunfattoresolubilechiamato,dalnomedel suo scopritore, fattoredivon Willebrand. Questofattore normalmente presente nel plasmasanguigno(doveassolvelafunzionediveicolareilfattoreVIIIdellacoagulazione sanguigna:perquestasuaproprietchiamatoanchefattoreVIIIR(dovelaletteraRstaper related, cio correlato), ma anche molto abbondante a livello della zona di lesione endoteliale,dalmomentoche prodottodallecelluleendoteliali(nellequali normalmente presenteallinternodeicorpidiWeibelPalade),ecostituisce,interagendoconilcollageno esposto,unpontefralamolecolaGPIbdellepiastrineedilsottoendotelio.Rappresentaperci unaspeciedicollante.Talefattoresecretoinformadimultimero(pesomolecolaresuperiore a1x106Da). Eovvioquindicheesistonodiversirecettoripiastriniciche,direttamenteoindirettamente, mediano ladesione piastrinica al collageno e ad altre molecole delle membrane basali. Alcunidatidimostranocheanchelaproteinaadesivatrombospondina(TSP) importante nellaadesionepiastrinica,inquantoservedacollanteperlainterazionetrailcollagenoela GPIV(precedentementeidentificatacomeGPIIIb),presentesullasuperficiedellepiastrine. E importante sottolineare che le interazioni tra collageno, proteine adesive (vWF, TSP, fibrinogeno)esuperficiepiastrinica,vengonostabilizzatedalcrosslinkingoperatodal fattoreXIIIdellacoagulazione.

Cambiamentodiformadellepiastrine
Con ladesione delle piastrine al sotteoendotelio nel puntodi lesione viene generata una cascatadisegnalicheportaalcambiamentodiformadellepiastrinestesseedallareazionedi rilasciodelcontenutodeigranulipiastrinici. Il cambiamento di forma consiste in una veloce trasformazione dalla classica forma discoidale della piastrina circolante a riposo ad una forma irregolarmente sferica, con pseudopodi,dapprimacorti,poisemprepi lunghi,finoarenderepossibileilcontattotra piastrinevicine,assumendounaspettoasferaspinosa(spinysphere).Inquestofenomeno coinvoltalamaggiorpartedellemolecoledelcitoscheletro:sihaladestrutturazionedelfascio equatorialedeimicrotubulielaloroparzialedepolimerizzazione,seguitadapolimerizzazione econtrazionedeifilamentidiactinaassociatiallemembrane.Ilcambiamentodiforma strettamentedipendentedallATP(alterazionidellafunzionepiastrinicasonoinfattipresenti neisoggetticonmalattiegenetichechealteranolafosforilazioneossidativa). Selostimolochehaattivatolapiastrina statodeboleodibrevedurata,questariacquista rapidamente la morfologia iniziale ed del tutto indistinguibile morfologicamente dalla

piastrina che non stata mai attivata. Le piastrine che ritornano allo stato morfologico inizialepossonononrispondere,peruncertoperiododitempo,adunasecondastimolazione, nemmenosequesta dimaggioreintensit rispettoallaprima(refrattariet piastrinica: probabile meccanismo di controllo, che tende ad autolimitare il processo di attivazione piastrinica).Seinvecelostimolodiattivazionepiforte,alcambiamentodiformaseguono altrifenomeni,comelareazionedirilasciodelcontenutodeigranulielaggregazione.Dal puntodivistafunzionaleilcambiamentodiformahaunaconseguenzaimportante:rende disponibilealivellodellamembranapiastrinicailFattorePiastrinico3(F.P.3).IlF.P.3un fosfolipide(fosfatidilserina)che,nellapiastrinaariposo,situatoprincipalmentenelversante interno della membrana plasmatica ed quindi inaccessibile: il cambiamento di forma comportaunriassettodellamembranaplasmaticacheesponeallesternoilF.P.3(flipflop delle fosfatidilserine), che implicato in alcune reazioni della coagulazione: infatti, la membranapiastrinicaparticolarmentearricchitadifosfatidilserinacostituisceunasuperficie ottimale per lassemblaggio dei complessi multimolecolari critici per lavvio ed il mantenimento del processo di coagulazione (complesso tenasico e complesso pro trombinasico).

Secrezionedeigranuli(releasereaction)
La secrezione delle piastrine avviene subito dopo ladesione ed un fenomeno attivo (legato anche allaumento della concentrazione di calcio nelle cellule) che determina il rilasciodelcontenutodeigranulipiastriniciallesterno. Associatoaifenomenicontrattilichedannoluogoalcambiamentodiformadellepiastrinevi ,infatti,iltrasportodeigranulivicinoalsistemacanalicolareaperto(centralizzazionedei granuli),fusionedellamembranadelgranuloconquelladelcanalicoloequindisecrezione delcontenuto.Ilmeccanismodellasecrezionedeigranuli dipendentedallenergia(ATP)e dalcitoscheletro. Neigranulisonopresentiinaltaconcentrazionemolecolecapacidimantenereedamplificare la risposta fin qui limitata a poche piastrine. ADP, Ca++, serotonina, fibrinogeno, trombospondinaelatrombinageneratadallacontemporaneaattivazionedellacoagulazione costituisconotuttideipotenti agonisti dellaggregazione:lasuperficiepiastrinica infatti dotata di recettori per tali molecole, le quali inducono una potente risposta biochimica (trasduzionedelsegnale).

Trasduzionedelsegnale(Rispostabiochimica):
Sinteticamente,durantelattivazionepiastrinicavengonoattivatisequenzialmenteglienzimi fosfolipasiCefosfolipasiA2,chesonosituatisulversanteinternodellamembranapiastrinica ( Linterazione del collageno con i recettori della superficie piastrinica attiva lenzima fosfolipasiC(PLC),accoppiatoatalirecettorimedianteunaproteinaGditrasduzione.La stimolazione recettoredipendente di tale proteina G regola positivamente lattivit della fosfolipasi C, enzima chiave delle vie di trasduzione, a sua volta in contatto con il lato citoplasmaticodellamembranapiastrinica. Lattivit della Fosfolipasi C sul fosfatidilinositolo (PIP2) genera due mediatori, il diacilglicerolo(DAG)elinositolotrifosfato(IP3).IlDAGattivalaproteinchinasiC(PKC), responsabile della fosforilazione di una proteina di PM 47KD, chiamata plekstrina, che regolaasuavoltalasecrezionedeigranulipiastrinici.Sembrainoltrechelattivazionedella PKC sia associata al meccanismo di fusione delle integrine GPIIb e GPIIIa , le quali formanosullasuperficiepiastrinicaunasolamolecola,chiamatacomplessoglicoproteico

IIbIIIa,fondamentaleperlaggregazionepiastrinica.IP3,perilqualeesistonorecettorisulle membrane di vescicole, che contengono i depositi intrapiastrinici di calcio non mitocondriale,induceilrilasciodegliionicalcionelcitosol,conattivazionedellacosiddetta myosinlightchainkinase(MLCK).Neconseguelafosforilazionedellecateneleggeredi miosina che, interagendo con lactina, provocano un accorciamento di queste strutture fibrillari e, conseguentemente, la modificazione di forma delle piastrine e la liberazione allesternodellesostanzecontenuteneigranuli. TraquestesonocompreselADPelaserotonina,cheattivanoalorovoltaaltrepiastrine ed accrescono il numero degli elementi coinvolti nellaggregazione (meccanismo di autoamplificazionedellarispostapiastrinica). Infatti, lADP rilasciato dai granuli delta interagisce con propri recettori per autocrinia e paracrinia,innescandoalcontempoduevieditraduzione:unaaccoppiataallaattivazionedel ciclodelfosfatidilinositolo(comequellaattivatadairecettoridelcollageno),edunaseconda checonsistenellaattivazionedirettadellafosfolipasiA2.Eimportantesottolinearechela attivazionedellafosfolipasiA2,enzimachiaveperilproseguimentodellarispostapiastrinica, avviene,oltrecheperaccoppiamentoalrecettoredellADP,anchegrazieallaumentodelCa intracitoplasmaticocheavevadeterminatofosforilazionedellaMLCK.Aquestopuntocisono due alternative: se lo stimolo che ha condotto al rilascio di ADP quantitativamente insufficiente e/o limitato nel tempo, linizio della aggregazione piastrinica (ponti di fibrinogeno tra complessi glicoproteici IIb/IIIa delle piastrine attivate) reversibile e linizialeaggregatovaincontroadissoluzione.Selostimolo dimaggioreentit determina liberazionedigrandiquantit diADPedalloralapotenteattivazionedellafosfolipasiA2 portaallaproduzionedigrandiquantit ditrombossanoA2,cheinnescacicliditrasduzione cherendonolaggregazioneirreversibile. Lattivazionedella FosfolipasiA2 (PLA2), che unenzimacalciodipendente unevento criticonellaattivazionepiastrinicaeconseguesiaallaumentodelcalciocitosolicoindottoda IP3,siaalsuoaccoppiamentodirettoconilrecettoreperADP.Lattivazionedellafosfolipasi A2 porta allaliberazionediacidoarachidonico(AA) dallaposizione2deifosfolipidi di membrana, dal qualenellepiastrine,perazionesequenzialedeglienzimiciclossigenasi e trombossanosintetasi,haorigineiltrombossanoA2(TXA2)(poichnellepiastrineilsistema cicloossigenasico fondamentalmente una trombossanosintetasi, il solo prostanoide prodotto il TXA2; qualunque altro prostanoide non pu essere prodotto, compresa la prostaciclina,inquantolepiastrinenonpossiedonolenzimaprostaciclinasintetasi,presente invece nelle cellule endoteliali, che producono cos prostacicline, con attivit biologiche opposte a quelle del trombossano). Con la produzione di trombossano le piastrine rilascianoilpi potenteagonistadellaaggregazionepiastrinica,innescandounpotente circuitoautocrino/paracrinodiamplificazionedellaaggregazionepiastrinica. Infatti,ilTXA2interagisceconiproprirecettoriagonistisullasuperficiepiastrinicaeinnesca la propria viadi trasduzione stimolandolafosfolipasiC (comelADP),equindi tutta la cascatadireazionidaessadipendenti:grazieallinterazioneconilrecettorespecificosiha unareplicapotenziatadellattivit dellADPconattivazionediPKCequindilesposizione quantitativamente rilevante sulla superficie delle piastrine del complesso glicoproteico GPIIb/GPIIIainformaattiva,che haaffinit convariemolecolecircolanti,fracuilapi importanteilfibrinogeno. Inoltre,ilTXA2,unavoltaliberatoincircolo,determinavasocostrizionelocaleinsinergismo conADP,adrenalinaedaltrivasocostrittori.

Aggregazionepiastrinica

Con questo termine si indica ladesione fra piastrine attivate e segue immediatamente ladesione e la secrezione. ( necessario sottolineare la differenza con lagglutinazione piastrinica,incuilepiastrineaderisconolunaallaltranoninseguitoadattivazione,maper intervento di agenti che le fanno agglomerare passivamente, quali anticorpi, virus e, soprattutto, la ristocetina). Le piastrine attivate possono legarsi fra loro grazie alla esposizionedeicomplessiglicoproteiciGPIIbIIIa,recettoridelfibrinogeno.Ilfibrinogenosi legaairecettoridipiastrineadiacentiformandodeiveriepropri ponti trapiastrinae piastrinaeportaquindiallaformazionediaggregatipiastrinici.Nellepiastrineincondizione diriposoilcomplessoglicoproteicoGPIIb/GPIIIa presenteinformainattivainquantole due glicoproteine IIb e IIIa sono separate. In seguito alla stimolazione da parte di vari agonisti, inpresenzadiionicalcio,siformaleterodimeroGPIIb/IIIa,cherappresenta la forma attiva del complesso. Quindi le piastrine attivate espongono questo complesso glicoproteicoinformaattivaingradodilegareilfibrinogeno,ilqualeasuavoltasilegaai recettori glicoproteici di piastrine adiacenti in una reazione a catena che amplifica il fenomenodellaggregazionepiastrinica.La trombospondina aumentaledimensionidegli aggregatipiastrinici,edstatopropostocheessaagiscaoperandouncrosslinkingequindi unastabilizzazionedegliaggregatidipiastrineefibrinogeno,oppurecheagiscainsinergia con ilfibrinogenonelposizionarsiapontetraicomplessiglicoproteici GPIIbIIIasulla superficiepiastrinica. Laggregazione piastrinica un fenomeno bifasico e si pu distinguere in primaria e secondaria. Laggregazione primaria (prima onda di aggregazione), unaggregazione reversibile, indottadapiccolequantit diagonisticheinteragisconoconilororecettorisullamembrana piastrinica(ADP,collageno,trombina,PAF,ecc.)(a). Laggregazione secondaria (seconda onda di aggregazione) dovuta invece sia allinterazionedigrossequantit di agonisticoni lororecettori,siaalrilasciodigrosse quantit diADPequindidiTXA2dapartedellepiastrineattivatedapiccolequantit di agonisti (a). Laggregazione primaria pu mancare e possiamo avere direttamente unaggregazioneirreversibilequandolagonistapresenteinvivooaggiuntoallasospensione piastrinicainvitro(b). LattivazionedellafosfolipasiC,che allabasedeimeccanismiditrasduzioneassociatialla aggregazionepiastrinica, condivisodatuttiicosiddettiagonistidellaaggregazione,i quali possiedono recettori associati alla fosfolipasi C. Esiste comunque unaltra classe di recettoriagonistidellaggregazione,iqualisonoassociatiaproteineditraduzioneGiingrado diinibirelaattivazionedellaadenilatociclasi.IlbloccodellaformazionedicAMPfavorisce laaggregazionepiastrinica.Questomeccanismoproaggregantecomunquemenoricorrente rispettoaquellocorrelatoadattivazionedelciclodelfosfatidilinositolo.Alcuniagonistidella aggregazionepiastrinica(peres.latrombina)hannorecettoriassociatisimultaneamentealla attivazionedellafosfolipasiCedallainibizionedellaadenilatociclasi. Tutti gli antagonisti della aggregazione piastrinica possiedono recettori sulla superficie piastrinica associati a proteinedi traduzione Gs, con attivit stimolatoria sullaadenilato ciclasi (prostaciclina, prostaglandina D2, adenosina, adrenalina [recettori ]) o sulla guanilatociclasi(ossidonitrico,NO).Ilpi importantesecondomessaggeroinibitorioper laggregazionepiastrinica quindiilcAMP,ilcuilivellointracellularesiinnalzaquandola adenilatociclasiattivatainrispostaasegnaliextracellulariinibitori.IlcAMPesercitaeffetti inibitori pleiotropici sulle piastrine, bloccando sia liniziazione sia il mantenimento delle rispostestimolatorie.Essoinfattibloccaillegamedegliagonistiailororecettori,inibiscela

fosfolipasiCelaconseguenteformazionediDAGeIP3,inibiscelaproteinochinasiCed antagonizza le risposte mediate dal calcio, inclusa la idrolisi dellacido arachidonico dei fosfolipididapartedellafosfolipasiA2.Ilruolodellaattivit inibitoriadelcGMP(chesi forma,peresempio,dallastimolazioneconlantagonistaNO),non statobenstabilito,ma sembrachevengainibitalaattivazionedellafosfolipasiC. SiformadapprimaunaggregatopiastrinicocheprendeilnomediTAPPOEMOSTATICO TEMPORANEO O PRIMARIO, che reversibile. Successivamente, dove vi stata adesione e aggregazione primaria si ha la formazione di un aggregato impermeabile e irreversibile,dettoTAPPOEMOSTATICOSECONDARIO. Ruolo dei complessi immuni e del complemento nella adesione e aggregazione piastrinica.IcomplessiimmuniegliaggregatidiIgGinduconoadesione,cambiamentodi forma,reazionedirilascioedaggregazionepiastrinica.Inoltre,icomplessiimmuniattivanoil complementointeragendoconlacomponenteC1q.Lepiastrinepossiedonorecettoriperil frammentoFcdelleIgGerecettoriperilframmentoC1qdelcomplemento,entrambicapaci ditrasdurresegnaliallinternodellepiastrine.Inoltre,ilrecettoreperilC1qcomplementare ancheunrecettoreperilcollageno.Questeproprietspieganoiseguentifatti:1)icomplessi immuni mediano ladesione piastrinica; 2) i complessi immuni inducono aggregazione piastrinica in seguito alla reazione di rilascio dei granuli piastrinici; 3) il C1q media ulteriormente ladesione piastrinica ai complessi immuni e laggregazione piastrinica, stimolando la reazione di rilascio dei granuli; 4) poich il C1q non interagisce con il collageno, esso in grado di inibire ladesione delle piastrine al collageno stesso e laggregazione indotta da collageno, mediante un legame competitivo ai recettori per il collageno, e pu quindi essere considerato come un modulatore dell aggregazione piastrinica. La capacit dei complessi immuni e del C1q complementare di indurre adesione e aggregazione piastrinica senza dubbio un momento patogenetico fondamentalenellelesionivascolaridadeposizionedeicomplessiantigeneanticorpoa livellodegliendotelivascolari(reazionidiipersensibilitdelIIItipo). Normalmente laggregazione piastrinica viene inibita da alcune sostanze come la prostaciclina (PGI2) e lossido di azoto (NO), di derivazione endoteliale (come tutti gli antagonistidellaggregazionepiastrinica,ancheprostaciclinaedNOagisconoinnalzandoi livellidicAMPintrapiastrinico).PGI2(diderivazioneendoteliale)eTXA2(diderivazione piastrinica), entrambi derivati dallacido arachidonico, hanno azioni opposte: il primo inibiscelaggregazionepiastrinicaedvasodilatatore,ilsecondofavoriscelaggregazioneed vasocostrittore. Lequilibrio fra PGI2 endoteliale e TXA2 piastrinico costituisce un sofisticato meccanismo che, in condizioni normali, previene laggregazione piastrinica intravascolareelacoagulazione,ma,inseguitoaldannoendoteliale,prevalendolattivit di TxA2,favoriscelaformazionedeltappoemostatico.Ifarmaciinibitoridellaaggregazione piastrinicasonotaliinquantoinibisconolaformazionedelTXA2,inibendolatrombossano sintetasipiastrinica(laspirina,oacidoacetilsalicilico,operaunaacetilazioneirreversibile dellacicloossigenasi,mentrealtrifarmaciantiinfiammatorinonsteroidei[FANS]inibiscono lecicloossigenasiinmanierareversibile).

3Fasedellacoagulazione

Il sistema dellacoagulazione il terzocomponente delprocessoemostaticoe portaalla formazionedelcoaguloinsolubiledifibrina,derivantedallatrasformazionedelprecursore plasmatico solubile fibrinogeno. A questo risultato si giunge grazie allattivazione sequenzialediunaseriedifattoriplasmatici(fattoridellacoagulazione).Ifattoriplasmatici, ad eccezione della precallicreina (PK) e del chininogeno ad alto peso molecolare (high molecularweightkininogen,HMWK),sononumeratiprogressivamentedall1al13,secondo unanomenclaturainternazionale.Tuttiifattoridellacoagulazione,adeccezionedelfattoreIII (fattoretessutale),sononormalmentepresentinelplasmainformainattiva.Questifattori, quando vengono attivati, vengono designati con lo stesso numero e laggiunta di un a piccoloinbassoadestra. I fattori della coagulazione sono di varia natura. Per la maggioranza sono proenzimi (zimogeni)che,quandosonoattivati,sonoingradodiesplicareattivitproteasica.Sitrattadi serinoproteasi,cio dienzimichepresentanonelsitocataliticolaminoacidoserina,lacui presenza criticaperlaattivit enzimatica.Moltideisistemimultiproteasiciattivabilia cascatasonocompostidazimogenidiserinoproteasi(ilsistemaplasmaticoattivabileda contatto,ilsistemadellacoagulazione,ilsistemadelcomplemento,ilsistemafibrinolitico). Tuttelemolecolediquestisistemisonopresentiinformadiprecursore:sitrattadimolecolea catena singola (zimogeno), che vengono attivate in forma cataliticamente attiva da un singolotaglioproteasico,cheletrasformainmolecolecompostedaduecatene(catenaAe catenaB),tenuteassiemedaunpontedisolfuro.LacatenaBesprimeilsitocataliticoed altamente conservata nelle serinoproteasi di origine pi disparata (dalla grossolana pepsinagastricaairaffinatiattivatoridelplasminogeno).LacatenaApresentainveceun gradodivariabilitcontrollata,inquantoformatadallaunioneodallaripetizionediunoo pimodulimolecolaricaratterizzatidaaltaconservazioneevolutivaLavariaassociazionedi talimodulideterminalaspecificitdellacatenaAdiogniserinoproteasi.Comesinotanello schema 16, la giustapposizione di vari moduli molecolari crea singolari conformazioni sterichediognicatenaA.Sembrachetalevariabilitcontrollataservaperpermetterealle varieserinoproteasidiinteragireconspecificirecettorioconsequenzedelsubstratodiverse daquellachecontienelasequenzachedeveessereidrolizzata,inmodocheilsitocatalitico venga orientatosullesequenzedi consensosecondolaposizione elaconformazionepi opportune.Agendoacascataquesteproteasipossononotevolmenteamplificareilprocesso catalitico a ventaglio. Altri fattori, come lVIII ed il V, sono cofattori di natura non enzimatica, che servono a adattare complessi multiproteasici sulle fasi solide delle superficicellulariequindiamantenereinadeguatocontattounenzimaconilsubstrato.Altri componentifondamentalinellacoagulazionesonoifosfolipidi,checostituisconounaadatta superficie di reazione, e infine gli ioni calcio, che favoriscono le interazioni fra enzimi, cofattoriefosfolipidi.Lepiastrine,unavolteattivate,offronounasuperficiefosfolipidica particolarmenteadattaaprocessidiquestotipo(FattorePiastrinico3,F.P.3). La sintesi dei fattori della coagulazione avviene nel fegato, mentre le cellule endoteliali sintetizzanoilfattoredivonWillebrand(vWF).LavitaminaK essenzialenontantoperla sintesiepaticadialcunifattoridellacoagulazione(II,VII,IXeX)edidueglicoproteine,le proteine C ed S, quanto per completare la loro struttura mediante laggiunta di un carbossile,dopochelasintesiepaticadellaproteinagistatacompletata.Infatti,lavitamina Kinterferiscenellaviasinteticadiquestifattorialivellodellacarbossilazionedeilororesidui di acido glutammico ad acido carbossiglutammico, che avviene ad opera di una carbossilasivitaminaKdipendente. Inassenzadi questavitaminai fattoricontinuano ad esseresintetizzatieconservanoleloropropriet immunologiche,masonobiologicamente inattiviesonodenominatiPIVKA(ProteinInducedbyVitaminKAbsence).Lapresenzadei

residui carbossiglutammici,infatti, necessariaperillegamediquesteproteineagliioni calcioedaifosfolipididimembrana,condizionefondamentaleperlaloroattivitproteolitica. VECCHIAVISIONEDELPROCESSODELLACOAGULAZIONE Il processo della coagulazione veniva inteso, fino a qualche anno fa, come un semplice meccanismo a cascata enzimatica che interessava, in modo ordinato e sequenziale, lattivazione dei vari fattori della coagulazione da una forma inattiva a una forma enzimaticamenteattiva(teoriadellacascataenzimatica,met anni60).Secondoquesta teoria,esistonoduevie(intrinsecaedestrinseca)checonvergonoinunaviacomunequando vieneattivatoilfattoreX. Critiche: nontuttiifattoridellacoagulazionesicomportanocomeenzimiunavoltaattivati moltereazionidelprocessodellacoagulazioneimplicanolaformazionedicomplessi multimolecolaripiuttostochelinterazionedisingolifattoriplasmatici ivarifattoriattivatipossonoesercitarelaloroazioneenzimaticaanchesusubstrati diversidaquelliconsideraticomelorosubstratitradizionali sonoattivimeccanismidifeedbackeinterazionifralevariefasiedivarifattori delprocessoemostatico. NUOVAVISIONEDELPROCESSODELLACOAGULAZIONE Attualmentesiritienecheledueviediattivazionedellacoagulazionenonsianoseparate,ma interconnesse. Infatti, fattori generati nella via estrinseca vanno poi ad attivare fattori e complessidellaviaintrinseca.Siritienechefisiologicamentelacoagulazioneallinternodel vasononiniziconlattivazionedelsistemaplasmaticoattivabiledacontatto,cio attraverso quellacheeradefinitalaviaintrinseca(questounartificiocheavverrebbeinvitro),madal fattore tessutale (TF), cio attraverso quella che era definita la classica via estrinseca. Secondoquestamodernateoria ilfattoretessutale,normalmenteespressosullamembrana deifibroblastiedespostoaifattoridellacoagulazioneinseguitoaldannoendoteliale,ad attivareinvivolacascatacoagulativa.IlTFhaaffinitperunaproteinaplasmatica,ilfattore VII,equestoportaallaformazionediuncomplessoTFF.VIIa,chehalacapacitnonsolodi attivaredirettamenteilF.XaF.Xaequindiproseguirenellaviacomune(questarappresentala classicaviaestrinseca),maancheilF.IXdellaviaintrinseca(crossover).Risultaquindi chiarocomeilcomplessoTFF.VIIasvolgaunruolochiavenelprocessodicoagulazionein vivo. Si continuano comunque ancora a distinguere due vie di attivazione della coagulazione, intrinsecaedestrinseca,tenendoperbenpresentecheesistonomeccanismidicrossoverfra leduevie. Icomponentidel sistemaintrinseco sonotuttipresentinelsangueeleventoprincipale lattivazionedelfattoreXIIdiHageman,laprimaserinoproteasidellacascata.Al sistema estrinseco,invece,partecipaunacomponentediderivazioneesternaalsangue,proveniente daltessutodanneggiato(fattoretessutale)edleventoprincipalelattivazionedelfattoreVII. Leduevieconvergononellafasefinale,cionellattivazionedelfattoreX(viacomune),fino allatrasformazionedelfibrinogenoinfibrina. VIAINTRINSECADELLACOAGULAZIONE

Laviaintrinsecadellacogulazioneiniziaquandoilsanguevieneacontattoconsuperfici carichenegativamente,comeinseguitoadannodellecelluleendotelialiconconseguente esposizionedellemolecoletrombogenichedelsottoendotelio. La prima tappa di questa via rappresentata dalla attivazione del cosiddetto sistema plasmaticoattivabiledacontatto,costituitoda4proteine. 1FATTOREDIHAGEMAN(HF,FATTOREXII).Eunaglobulina,presenteinforma di zimogeno nel sangue, a singola catena di 80.000 Da. Viene attivata mediante taglio proteolitico nella sequenza aminoacidica allinterno di un ponte SS, ad opera della callicreina,conformazionediunamolecolaformatadaunacatenapesanteA(52.000Da)ed unaleggeraB(28.000Da),tenuteassiemedalpontedisolfuro,cheprendeilnomedifattore diHagemanattivatoditipo (HFao FXIIa).Iltaglioproteoliticoaldifuoridelponte disolfurod origineaduemolecoledistinte,chenonsonolegatedalpontedisolfuro.La catenaA,chenoncontieneilsitocatalitico,nonutilizzabile,mentrelacatenaB,contenente ilsitocatalitico,prendeilnomediHFa,dettoancheFXIIaoHFf..SoloilFXIIcometale ed FXIIa si possono legare al sottoendotelio, innescando cos la via intrinseca della coagulazione.Il FXIIa presenteinquantit elevataneifocolaiinfiammatori,dovesono presentivariealtreproteasididerivazioneleucocitariaerappresentaunimportantemediatore chimico dellinfiammazione di derivazione plasmatica. Infatti, esso presenta attivit di vasodilatazione e attiva il fattore C1 del complemento, con la produzione dei fattori del complementoadattivitchemiotatticaedanafilotossica. 2 PRECALLICREINA PLASMATICA (PK O FATTORE FLETCHER). E una globulinapresenteinformadizimogenochevieneattivatoacallicreina(enzimaattivo)dal fattorediHagemanattivato.LacallicreinacostituitadaduecateneunitedaunponteSS.I substratidellacallicreinasonoFXII,HMWKeprourochinasi(prouPA) 3 CHININOGENO AD ALTO PESO MOLECOLARE (HMWK) O FATTORE FITZGERALD. E una globulina presente in forma di zimogeno, di 110.000 Da. Allinterno della molecola presente la sequenza aminoacidica della bradichinina (altro importantemediatorechimicodellinfiammazione,diorigineplasmatica),chevieneliberata dalHMWKmedianteduetagliproteolitici.Nellapartecarbossiterminalecontienecircail 30%diresiduidiistidina,checonferisconoallamolecolaunacaricapositivachefavorisceil legameallasuperficienegativadelsottoendotelio. 4FATTOREXIoPTA(antecedenteplasmaticodellatromboplastina).Eunaserino proteasi globulinica(160.000Da),presenteinformainattiva,chevieneattivatamediante taglioproteasicodaFXIIa.Cideterminalaformazionedi2cateneleggeree2pesantiche contengonolasequenzadilegameaHMWK.LafunzionedelfattoreXIaquelladiattivare ilfattoreIXdellacoagulazione. In presenza di una superficie carica negativamente le proteine del sistema plasmatico attivabiledacontattosiadsorbonosullasuperficiestessaesiattivanoavicendainquanto tuttelecomponentisitrovanogiustappostenelladattaconfigurazionegeometrica.Infatti,il FXIIinteragisceconlasuperficiecaricanegativamentemedianteresiduiaminoacidicicarichi positivamenteedilchininogenoadaltopesomolecolare(HMWK)sicomportanellastessa maniera,posizionandosiinvicinanzadelFXII.SullasuperficienonadesivadelHMWKsono legatisiaPKcheFXI,checos vengonopresentatialFXII.Finoaquestopuntonessuna dellemolecoledelSistemaPlasmaticoAttivabiledaContatto(SPAC)sitrovanellaforma attiva. Si ritiene che quando lo zimogeno FXII si lega al sottoendotelio avvenga una attivazionedellozimogenoaformare FXIIaalivellodellazonadidannoendotelialecon meccanismo tuttora ignoto (si ipotizzata una autoattivazione del FXII, come pure una

attivazionereciprocatraFXIIezimogenidiPKoFXIlegatiallHMWK,dalmomentoche anche gli zimogeni di serinoproteasi possono essere dotati di una leggera attivit enzimatica). Indipendentemente dallevento scatenante iniziale, nelle fasi successive lo zimogenoFXII attivatodallacallicreinachesiformanellazonadilesioneapartiredalla PK.LaPKvieneattivatadal FXIIaacallicreinaattiva,laqualeasuavolta ingradodi attivarealtremolecolediFXIIecosvia,amplificandolattivazionedelsistema. IlfattoreXIfungedasubstratodelfattoreXIIa,diventandoFXIa. Nelprocessodiattivazionedelsistemadacontattosipossonodistinguere4fasi: 1 iniziazione:leproteinedelsistemaplasmaticoattivabiledacontattosileganoalla superficiecaricanegativamentedelsottoendotelioesiattivano 2 amplificazione: lattivazione reciproca dei componenti del sistema plasmatico attivabiledacontattoamplificailsistemastesso.Inoltre,sihaliberazionedisostanze attiveinsensoinfiammatorio,come FXIIa,callicreinaechinine. Sialacallicreina cheilfattoreXIapossonoliberarechininedaHMWK.Illegameallasuperficiecarica negativamente dei componenti del sistema serve a mantenere un orientamento spazialeottimaleperPK,fattoreXIIefattoreXI. 3 disseminazione: rilascio il fase fluida dei componenti attivi che si liberano nella reazionediattivazionedacontatto,adazioneproinfiammatoria FXIIa:aumentodellapermeabilitvascolare;attivazionedelcomplemento callicreina:chemiotassievasodilatazioneperazionesullafrazioneC5del complemento,conformazionedelframmentoC5a; attivazionedellaprourochinasiadurochinasiattiva; chinine:aumentodellapermeabilitvascolare;vasodilatazione;dolore 4 regolazione:ilsistemaattivabiledacontattovienetenutosottocontrollodaunaserie diinibitorispecificideisingolicomponenti. FXIIa(HFa):C1inibitore(oltreil90%)edantitrombinaIII(ATIII) Callicreina:C1inibitore(circail50%)ed2macroglobulina(circail50%) FattoreXIa:1antitripsina(70%)edATIII IlF.XIahalafunzionediattivareil fattoreIX(odiChristmas) dellacoagulazione.Tale attivazionederivadallascissioneinduepuntidellamolecoladelFIX,insequenza.Siforma primaunamolecolacompostadaduecatene,dallaqualevienerimosso,medianteunaltro taglioproteolitico,unpiccolopeptidediattivazionedallapi lungadelleduecatene:a questopuntoilFIXhaacquisitoattivitenzimaticaserinoproteasica. Il FIX attivato anchedalcomplesso fattoretessutalefattoreVIIa (complesso TF FVIIa) della via estrinseca (crossover tra via estrinseca e via intrinseca, che attualmenteritenutoilprincipalemeccanismodiattivazionedelfattoreIXcheentrera farpartedelcomplessotenasico). IlruolodelFIXaconsistenellaconversionedel fattoreX(odiStuart) nellasuaforma enzimaticamenteattiva,FXa. IlFX unaproteinaplasmaticalacuisintesi vitaminaKdipendente.Lasuaattivazione, mediante due scissioni proteolitiche, si ottiene ad opera di un complesso, detto COMPLESSO TENASICO, costituito da: FIXa, fattore antiemofilico attivato (FVIIIa), ionicalcioefosfolipididellamembranacellulare(principalmentequelladellepiastrine,ma anchequelladegliendoteliocitiedeileucociti,soprattuttoimacrofagi).Il fattoreVIII attivatodallatrombina:poich laviaestrinsecaoperainizialmenteinmodopi velocedella viaintrinseca,unacertaquotaditrombinasemprepresenteperlattivazionedelFVIII.

LaproteasiresponsabiledellaattivazioneproteoliticadelFX ilFIXa,ilqualeinteragisce conifosfolipididellesuperficicellularimedianteunponteionicotralecarichepositivedello ionecalcioequellenegativedelsuoacidogammacarbossiglutammico.IlFVIIIaagisce comecofattorenonenzimatico,indispensabileperdirigerelassemblaggiosullesuperficidi tuttiglialtrifattoridelcomplessotenasico.Lasuaindispensabilitindicatadallainsorgenza diemorragielegataallasuamancanza,comenelcasodellaemofiliaA. Il fattore X attivato lenzima direttamente responsabile della formazione della trombinadallaprotrombina.

VIAESTRINSECADELLACOAGULAZIONE Quandoilsanguevienedirettamenteacontattoconiltessutodanneggiatovieneattivatalavia estrinseca della coagulazione, ad opera di un fattore tessutale, TF (la cosiddetta tromboplastinatessutaleofattoreIII)presenteneitessutiedaquestiespostoinseguitoad undannocellulare.IlTFunaproteinaintegraledimembrana,espressadaifibroblastidelle matrici sottoendoteliali ed quindi ubiquitario nei tessuti dellorganismo. Pu essere rilasciatoinseguitoallaframmentazionedellemembranedeifibroblasti,ed presentesia nellamembranabasaledeivasi,sianellaavventiziavascolaredeivasidicalibromaggiore.Le cellule endotelialinonespongononormalmenteilTFsullatoluminaledeivasi,bens lo contengonocomeproteinaintegralesullamembranadivescicoleintracellularichevengono normalmente rilasciate sul lato abluminale dellendoteliocita. In seguito a lesione dellendoteliolapolarit secretivaditalivescicolesiinverteedilTFvieneespostosulla superficieluminaledellendotelio:questosiverificasiaperlesionebiochimica(adoperadel TNF e dellIL1), sia per lesione meccanica, dove lendotelio perilesionale, che cio circondaunareadidenudazionedelvaso,esprimeTFsullasuperficieendovascolare.Anchei macrofagi,dopoaverlegatoendotossinaprodottadaibatterigramnegativi,esprimonosulla loro membrana TF: tale esposizione viene ulteriormente potenziata dallinnesco della cascata citochinica (endotossina>TNF>IL1>IL6), in quantotutte le citochine prodotte hanno recettori sulla superficie macrofagica ed endoteliale e la loro interazione con tali recettori porta ad un potenziamento della espressione di TF di membrana. Il TF lega speficicamente una proteina plasmatica, il fattore VII e gli ioni calcio, formando un complesso dotato di attivit enzimatica. Il fattore VII o proconvertina una proteina plasmaticaasingolacatena,vitaminaKdipendente,sintetizzatadalfegato.Dipers ilFVII nonhaattivit enzimatica,masilegaalTFinpresenzadiionicalciochefannodaponte.Il complesso cherisulta(COMPLESSOTFFVIICa2+) enzimaticamenteattivo,possiede unalta affinit per il FX e ne catalizza lattivazione a FXa. Sembra che, allinterno del complesso,lattivitenzimaticasialegataalFVIIa,mentreilTFagirebbedacofattore.IlFXa a sua volta in grado di attivare ulteriormente il FVII e quindi di amplificare la via estrinsecadellacoagulazione. Il complesso TFFVII attiva anche il FIX, anzi questo sembra essere il meccanismo fondamentale che porta alla attivazione del fattore IX: le reazioni del meccanismo estrinsecoinfluisconosulmeccanismointrinseco. VIACOMUNEDELLACOAGULAZIONE Comprendeduefasi:laformazioneditrombinaelaformazionedifibrina,chesiverificanoin seguitoallattivazionedelfattoreX. a)formazioneditrombina

IlfattoreXa,interagendoconilfattoreVa,ifosfolipidi(dellamembranapiastrinicaFP3, endoteliale,leucocitaria)egliionicalcio,formauncomplessomultimolecolarecheprendeil nomediPROTROMBINASIoCOMPLESSOPROTROMBINASICO,ingradodiagire proteoliticamentesullaprotrombina(fattoreII)trasformandolaintrombina. IlFV unaglicoproteinaadaltopesomolecolare,sintetizzatadalfegato,presentesianelle piastrinechenelplasma:silegaaifosfolipidievieneattivatoprimariamentedallatrombinaa FVacheingradodiagiredacofattoreperlattivazionedellaprotombinaatrombina. Nelprocessodicoagulazionelatrombina unenzimachepotremmodefiniremulti purpose: infatti, oltre a determinare la fase successiva di fibrinoformazione per attivazionedelfibrinogenoamonomerodifibrina, ingradodiattivareilfattoreV,il fattoreVIIIedilfattoreXIIIdellacoagulazione. Latrombina(FIIa)vieneformataapartiredallozimogenoprotrombina(FII)attraversodue tagli proteolitici operati dal FXa. La protrombina una glicoproteina plasmatica di 582 aminoacidi,lacuisintesi vit.Kdipendente,econtienenellasuaregioneaminoterminale residuidiacidogammacarbossiglutammicoattraversoiqualisilega,inpresenzadiioni calciochefannodaponte,alfosfolipidepiastrinico.Dopoilprimotagliosiformanodue frammenti, uno aminoterminale e laltro carbossiterminale (pretrombina 2), a singola catena,contenenteunpontedisolfuro.Unsecondotaglioallinternodellapretrombina2 portaallaformazioneditrombinaattiva(alfatrombina)costituitadaduecateneunitedal ponteSS.

b)formazionedellafibrina Laformazionedifibrinaavvieneattraverso3tappesequenziali: scissioneproteoliticadellemolecoledifibrinogenoinmonomeridifibrinaefibrinopeptidi (FPA,FPB)dapartedellatrombina polimerizzazionespontaneadeimonomeridifibrinainungeldifibrina stabilizzazionedellafibrinaadoperadelfattoreXIIIa. Ilfibrinogeno(fattoreI) unaglicoproteinasolubileadaltopesomolecolare(340.000Da) formatada dueunit,ognunacostituitadatrecatenepeptidiche .Nellospazio,la strutturadelfibrinogenopu essereimmaginatacomecostituitadatrecatene poste sulladestraetrecateneugualipostesullasinistra;ciascuntrimetrounitoallaltroaformare un nodo centrale che vede impegnate le catene alfa, beta e gamma, nella parte amino terminale (ponti disolfuro). Le regioni aminoterminali delle catene alfa e beta sono responsabilidellasolubilit delfibrinogeno,inquanto,acausadellarepulsionedicariche elettriche, tengono separate le singole molecole di fibrinogeno. Evidenze di microscopia elettronicaadaltissimarisoluzione,hannodimostratochelastrutturatridimensionaledella molecola di fibrinogeno costituita da tre domini globulari, due terminali (domini D, corrispondentialleregionicarbossiterminalidiognimolecola)edunocentrale(dominioE, doveconvergonoleporzioniaminoterminalideidueomotrimeri)unitidaunaregionedi connessioneabastoncino.AlivellodeidominiEsporgonobrevisequenzepolipeptidiche appartenenti alle catene alfa e beta (le porzioni aminoterminali descritte sopra). La trombina taglia questi gruppi terminali liberando cos 4 fibrinopeptidi a basso PM (2 fibrinopeptidiA,FPAedueB,FPB)edunmonomerodifibrina. Imonomeridifibrinacos formatihannounastrutturamoltosimileaquelladelprecursore nativofibrinogeno,maavendopersolecarichenegativepresentisulleterminazionitagliate

dalla trombina, interagiscono fra loro con legami non covalenti (legami idrogeno, ionici, interazioniidrofobiche,forzediVanderVaals).Lapolimerizzazionedeimonomeridifibrina quindi una reazione spontanea che avviene per tappe intermedie: inizialmente, con il distaccodelFPA, sihalaformazionedistrutturelinearidovuteallaformazionedilegami terminoterminalifradominiDdivariemolecole;successivamente,conildistaccodelFPB, si formano anche legami laterolaterali fra domini D e domini E delle molecole lineari, producendocosunaumentodispessoredeifascidifibrina. Questoprocessodoriginealcoagulomorbidodifibrina,ancorafragile,nonstabilizzatoda interazioniintermolecolaricovalenti. Ilcoagulomorbidosolubilevienequindistabilizzatoeresoinsolubile(coagulostabilizzatoo definitivo)perazionediunaltrofattoreplasmatico,ilfattoreXIIIa.Il fattoreXIII una transglutaminasi,presenteinformainattivanelsangue,chevieneattivatadallatrombina.Il FXIIIadeterminalaformazionedilegamipeptidiciinternifralecatenedeimonomeridi fibrina(legamideltipoglutamillisina),rendendostabileilpolimero.

CONTROLLODELLACOAGULAZIONE
Affinch nonsiabbialestensionedelcoagulonelsistemavascolare, necessariocheil processodellacoagulazionesiafinementecontrollatoecircoscrittonelpuntodilesione. Esistonovarimeccanismidicontrollo: 1)flussosanguignoeclearancedeifattoriattivati Il flusso sanguigno fondamentale nel controllo dellemostasi in quanto responsabile dellallontanamentoedelladiluizionedeifattoridellacoagulazioneattivati,chevengonopoi rimossidalcircolo.Laclearancedeifattoridellacoagulazioneattivatiavvieneavarilivelli: fegato(unodegliorganimaggiormenteimplicati),ilsistemadeifagocitimononucleati(o sistema monocitico/macrofagico) ed il sistema reticoloendoteliale largamente diffuso nellorganismo. 2)inattivazionedelleproteasiattivecheviaviasiformano,unavoltautilizzate.Questotipo dicontrolloavvienemediantelazionedegliinibitorifisiologici,chesonoingradodiinibire ivarifattoridellacoagulazioneedancheicofattoriattivati.Questiinibitoriplasmaticihanno, ingenere,unospettrodiazionemoltoampioe,inalcunicasi,possonoinibiresiaglienzimi del sistema della coagulazione che quelli del sistema fibrinolitico. Si ricorda, a questo proposito, che la catena B di tutte le serinoproteasi presenta una struttura altamente conservata. Si tratta quindidiunsistemadi controlloche in gradodiregolaresia la coagulazione(impedendo unaeccessiva amplificazioneepropagazionedelfenomeno:la coagulazione viene circoscritta) sia la fibrinolisi (impedendo uneccessiva attivazione del sistemafibrinolitico,chepuassumereconnotatipatologiciportandoamanifestazioniditipo emorraggico). Gli inibitori fisiologici pi importanti sono la AntitrombinaIII (ATIII), il Cofattore eparinicoII(HCII), le proteineCedS edil TFPI(TissueFactorPathwayInhibitor). Oltre a questi sono importanti la alfa1antitripsina, C1 inattivatore ed alfa2 macroglobulina. 3)inattivazionee/odemolizioneproteoliticadeiprodottidellacoagulazione.Ilprincipale effettorediquestotipodimeccanismodicontrollorappresentatodalsistemafibrinolitico.

INIBITORIFISIOLOGICIDELLACOAGULAZIONE AntitrombinaIII(ATIII)
Glicoproteina(alfaglobulina),pesomolecolare58.000Da,sintetizzataalivelloepatico.La ATIIIappartieneallafamigliadellecosiddetteserpine(serineproteaseinhibitors)eforma uncomplessostechiometrico,equimolecolareedirreversibileconlatrombinaedalcunealtre esterasi seriniche, rendendole inattive. Linterazione fra trombina e ATIII pu avvenire spontaneamente,mainpresenzadieparinaodimolecoleeparinosimili,comelecatene lateralidieparansolfatodeiproteoglicanidellecelluleendoteliali,lavelocit dellareazione aumentadioltretreordinidigrandezza(10003000volte).Leparina(HP)interagiscecon regioniricchediaminoacidicarichipositivamentedellATIII(sitilisinici).Questainterazione determina una modificazione allosterica dellantitrombina, che viene resa pi affine alla trombina:siformauncomplessostabilemedianteillegametraunaargininadellantitrombina elaserinadelsitoattivodellatrombina.LATIII ingradodireagireancheconaltrifattori dellacoagulazione,inibendoli,comeilXa,XIa,XIIaeIXa,callicreinaeplasmina.Inordinedi importanza,linibizionedelfattoreXavienesubitodopolinibizionedellatrombina.Dopola costituzionedelcomplessoirreversibileATIIIenzimaserinico,leparinapu dissociarsida essoerendersicos disponibilepercatalizzareunanuovareazione.Nelplasmasiritrova anche una glicoproteina, la glicoproteina ricca di istidina, che, legando lHP, pu limitarnelaquotadisponibileperlinterazioneATIIItrombina. IldeficitereditariodiATIIIpredisponeamanifestazionitromboemboliche.

CofattoreeparinicoII(HCII)
InibitoredellatrombinadistintodallaATIII.Eunaglicoproteinamonocatenaria(66.000Da), cheinibisceselettivamentelatrombina,mentrehascarsaazione sullealtreserinoproteasi della coagulazione. Come lATIII, forma complessi equimolecolari con la trombina, inattivandola.LaggiuntadiHPacceleralareazione,maunaltropolisaccaride,ildermatan solfato(DS),chenonhaeffettosullATIII,acceleraancoradipi lavelocit diinterazione HCIItrombina.Laglicoproteinariccadiistidina,chelegaspecificamentelHP,ingrado diinibirelinterazionefraHCIIedHPequindidiridurreleffettoinibitoriodelcofattore eparinicoII,manonlinterazionefraDSeHCII,chequindiconservalasuaattivitinibitoria. E importante anche a livello tessutale in quanto, interagendo con il DS della matrice extracellulare(ECM),limitalereazioniprocoagulantidellatrombinaalivellodeitessuti.

ProteinaCeproteinaS
Questi inibitori fisiologici della coagulazione mettono in luce un ruolo fondamentale dellendotelionelcontrollodellemostasi. La proteinaC(PC),glicoproteinadi62.000Da,compostadaunacatenaleggeraeduna pesante, uno zimogeno di serinoproteasi la cui sintesi vitamina Kdipendente (concentrazioneematica4g/ml).Per svolgerelasuaazioneinibitorialaproteinaCdeve essereattivata.InformaattivatalaproteinaC(APC) unaserinoproteasiedesercitalesue proprietanticoagulantidistruggendoproteoliticamenteifattoriVeVIIIdellacoagulazione;i

fattoriattivati(VaeVIIIa)vengonodistruttipi rapidamentedeiprofattoriinattivi.Lunico attivatorefisiologicodellaproteinaClatrombina.QuestultimaattivalaproteinaCsoltanto dopoessersilegataaduncofattoreproteicoassociatoallamembranaplasmaticadellecellule endoteliali,la trombomodulina, glicoproteinatransmembrana(75100.000Da). Illegame della trombina con la trombomodulina determina un cambiamento conformazionale della trombinastessatalechelenzimanonpiingradodisvolgerelasuaattivitprocoagulante. Questicambiamentimolecolari,infatti,lefannoperderelacapacitdiattivareifattoriV,VIII eXIIIdellacoagulazione,diinteragireconlasuperficiepiastrinica,formandoilcomplesso protrombinasico,ditrasformareilfibrinogenoinfibrina: latrombina,quindi, inseguitoallasua interazioneconlatrombomodulina presente sulle superfici endoteliali, cambia specificit di substrato e, da potente enzima procoagulante,diventaunamolecolaadattivitanticoagulante,inquanto ingradodi generare APC. In questo cambiamento determinante il ruolo dellendotelio per la presenzasullamembranaplasmaticadellecelluleendotelialidellatrombomodulina,la qualehaancheilruolodilocalizzarelazioneanticoagulantedellAPC. LaproteinaCattivatavieneasuavoltainibitadaunospecificoinibitore (inibitoredella proteinaC).LacarenzadiproteinaCcollegataadunaumentatorischioditrombosi. LazionedellaproteinaC potenziatadallinterazioneconunaltraproteina,lacuisintesi vitaminaKdipendente,laproteinaS.Questaproteinaplasmaticanon unaserinoproteasi e, oltre che dal fegato, pu essere sintetizzata in piccole quantit anche dalle cellule endoteliali e dai megacariociti midollari. Essa agisce come cofattore nellattivit anticoagulantedellaproteinaC.LaproteinaShaunaltaaffinit conifosfolipidi(invirt dellabbondanzadiacidogammacarbossiglutammico),inpresenzadiionicalcio,favorendo quindi linterazione fra APC e superfici cellulari. Il complesso APCproteina S degrada specificamente edestensivamenteifattoriVaeVIIIalegatiaifosfolipidisullemembrane dellecelluleendotelialiedellepiastrine. LAPC ha una duplice azione: infatti, oltre ad inattivare i fattori Va e VIIIa, stimola la fibrinolisi,agendosugliinibitoridellafibrinolisi.InparticolrelAPCproteggelattivatore tessutale del plasminogeno (tPA) dallinibizione da parte del suo inibitore, il PAI (plasminogenactivatorinhibitor).LAPC,quindi,inquestocasouninibitorediuninibitore.

TFPI:tissuefactorpathwayinhibitor.IlTFPIunaglicoproteinadi33.000Da,che
circolanelplasmacomplessataallelipoproteine.Euninibitoredellaviaestrinsecadella coagulazione, statoindividuatodirecenteesitrovalegato,sullasuperficiedellecellule endoteliali, ai terminali carichi negativamente dei glicosaminoglicani eparinosimili che rivestonolendoteliostesso.Taleinibitoreingradodiinibirelattivazionedirettadelfattore XafattoreXadapartedelcomplessoTF/fattoreVIIa.Perchlasuaazionesipossaesplicare pernecessariocheessoformiuncomplessoconilfattoreXa.Siformaciouncomplesso quaternariocompostodaTFPIFXaTFFVIIa,nelqualeisitiattivideifattoriXaeVIIasono legatialTFPIequindiinattivati.IlTFPIpu,comunque,bloccaredirettamenteilcomplesso TFFVIIaancheinassenzadiFXa.Lasuaimportanzainvivo limitatadalfattocheil complessoTFPI/fattoreXanoningradodiinattivarelattivazionedelfattoreXafattoreXa dapartedelcomplessotenasicodellaviaintrinseca.Attualmentenonsiconosconopatologie umanecorrelateadunacarenzadiTFPI.

Alfa1antitripsina

Glicoproteina monocatenaria (55.000 Da) plasmatica in grado di inibire diverse proteasi, particolarmentelatripsinaelelastasi,maancheilFXIae,inminormisura,altrienzimi, comelaplasminaelatrombina.Ilsuoruolonelmodularelereazioniemostaticheapparedi minoreimportanzaelasuacarenzanonsiassociaadunaparticolarepredisposizionetrombo embolica.Lasuaazionefisiologicaconsistenellinibizionedeglienzimiproteoliticiliberati daileucocitiduranteilprocessoinfiammatorio.Lalfa1antitripsina unodeipi importanti inibitorinaturalidiquesteattivit proteasiche,che,senonfosseroinibite,provocherebbero danniestesineitessuti.Ildeficitdiquestoinibitoreassociatoadunacondizionepatologica caratterizzatadallinsorgenzaprecocedienfisemapolmonareedicirrosiepatica,dovutialla distruzionedeltessutopolmonareedepaticoacausadellincontrollataazionedeglienzimi leucocitariesuccessivasostituzionecontessutoconnettivo.

C1inattivatore

Glicoproteinamonocatenaria(105.000Da)ingradodiinattivarenonsololacomponenteC1 del complemento,maanchenumeroseproteasi,comeplasmina,callicreina,FXIIa,FXIa. Linibizioneavvieneattraversolaformazionediuncomplessostechiometrico,equimolecolare conlenzima,conconseguenteinattivazionedelsitoattivoenzimaticoserinico.Nonostante siacapacediinibirelefasiprecocidellacoagulazioneelafibrinolisi,ildeficitdiquesto inibitorenonprovocadiatesiemorragichee/otromboemboliche.Ildeficitcongenitoisolato determinaneipazientiilcosiddettoedemaangioneuroticoereditario,malattiacaratterizzata dallaccumulodiliquidialivellodellacuteedellemucose,soprattuttolaringea(morteper asfissia). Questo dovutoadunattivazioneeccessivadelcomplemento,conconseguente comparsadisostanzeflogogene(C3a,C5a)cheinduconoledema.Inoltre,essendoancheun inibitore della callicreina, la sua mancanza pu portare ad un aumento di produzione di chinine,chesonopotentimediatoridellinfiammazione.

Alfa2macroglobulina(2M)

Glicoproteinatetramerica(750.000Da),costituitada4identichesubunitpolipeptidiche.Pu interagirecondiverseproteasi,nonsoloseriniche.Fraglienzimidellacoagulazioneinibisce soprattutto trombina e callicreina plasmatica. Interagisce anche con la plasmina. La sua carenzadeterminaunapredisposizionetromboembolica. Questoinibitorepossiedenumerosesequenzeescaperunampiagammadiserinoproteasi. Quando la serinoproteasi morde tali sequenze, avviene un cambiamento allosterico di ciascunmonomerodellomotetrameroelecatenesiavvolgonointornoallaserinoproteasi, escludendoladallambiente.

4Sistemafibrinolitico
Laformazionedellafibrinasiverificanelcorsodivariprocessi,comelinfiammazione,la riparazionedelleferitee,soprattutto,lemostasiedeveesserelimitatanellospazioenel tempounavoltachelostimoloscatenanteabbiaterminatodiagire. Lafibrinolisirappresentailmeccanismofondamentaleattraversoilqualesidissolveil coagulodifibrina,dopochehasvoltolasuafunzione. Nelprocessoemostatico,unavoltacheilvasodanneggiato statoriparato,ilcoagulodeve essere dissolto al fine di evitare ostacoli alla circolazione del sangue. Esistono vari meccanismidicontrolloattialimitarelacascatacoagulativa:deplezionedeifattoridella

coagulazione;clearancedeglistessifattori;inibitoriplasmatici;mailsistemafibrinolitico rappresentailmeccanismofondamentale. Ilsistemafibrinolitico unSISTEMAMULTIENZIMATICO,chepresentaanalogiecon ilsistemadellacoagulazione.Einfatticostituitodaserinoproteasi(sitoattivocompostoda serinaacidoasparticoistidina).Ilsitocataliticositrovanellaregione Cterminale(catena B), mentre la regione Nterminale (catena A) contiene uno o pi domini funzionali, responsabili delle diverse funzioni di queste molecole, come ad es. legame alla fibrina, legame a recettori sulle superfici cellulari, legame al plasminogeno, ecc. Sono enzimi tripsinosimili, cio agiscono a livello del legame specifico argininalisina. Si trovano in formadizimogeni,chevengonotrasformatiinenzimiattivimedianteuntaglioproteolitico. Lareazionecentraledellafibrinolisirappresentatadallaconversionedelplasminogeno (proenzimaplasmatico,inattivo)nellenzimaproteoliticoattivoplasmina, mediantela scissionediunsingololegamepeptidico.Laplasminacos prodotta degrada la fibrina, dandoorigineaprodottididegradazionesolubiliequindiallalisidelcoagulodifibrina. Componentidelsistemafibrinolitico: attivatoridelplasminogeno(attivatoretessutaleotPA;attivatoreditipourochinasicoo uPA) plasminogeno plasmina inibitori ATTIVATORIDELPLASMINOGENO(PAs) Questoterminesiriferisceamolecoleingradodiconvertireilplasminogenoaplasmina;in formaattivasonoentrambidelleserinoproteasi. Seneconosconoduetipidiversisiadaunpuntodivistaimmunologicochefunzionale: Attivatore tessutale del plasminogeno (tPA). E sintetizzato e secreto dalle cellule endotelialiinformadicatenasingola.Concentrazioneplasmaticadibase:510ng/ml.La forzaditrascinamento(shearstress)esercitatadalloscorrimentodelsanguesulrivestimento endoteliale vascolare sembra il pi importante stimolo alla sua produzione (aumenta in condizioni di stress, dopo losforzo fisico: attivit pi alta negli atleti). Peso molecolare 70.000 Da. Nella sua forma attiva costituito da due catene: catena A (regione NH 2 terminale)ecatenaB(regioneCOOHterminale),contenenteilsitocatalitico.Laformaa singola catena convertita nella forma attiva a due catene, tenute insieme da un ponte disolfuro,medianteuntaglioproteolitico(argininaisoleucina)operatodallaplasmina. IltPApresentaaltaaffinit perlafibrina.Infatti,sullafibrinaesisteunsitodilegameper particolaristruttureadansapresentinellacatenaAdeltPA(attivitfibrinoliticalocalizzata alivellodelcoagulodifibrina). IltPA,oltreadinteragireconlafibrina, ingradodilegarsiancheaspecificisitidilegame presenti sulla superficie delle cellule, annexin II. Esiste quindi anche unattivazione del plasminogenodapartedeltPAassociatoallecellule.Questibindingsitessonostatitrovati sulla superficie delle cellule endoteliali, che sono quindi in grado di concentrare la formazionediplasminaalivellodelcoagulopresentesullasuperficiedelvasoleso. Estatodimostratoanchechelepiastrinesonoingradodilegareilplasminogenoequesto plasminogenolegatoallacellula moltopi suscettibileallattivazionedapartedeltPA:le piastrinerappresentanounasuperficieidoneaperlattivazionedelplasminogenoalivellodel coagulo,dovesonoimbrigliate.

Attivatoredelplasminogenoditipourochinasicoourochinasi(uPA). Serinoproteasi, isolataperlaprimavoltanelleurine,dovevieneprodottadallecelluledeitubulirenaliedove halafunzionedisciogliereicoagulidifibrinachepotrebberointasareleviedideflusso renali. Viene sintetizzata dalle cellule del tessuto connettivo, sopratutto fibroblasti, e da cellule epiteliali e macrofagi. E secretainforma inattiva (prouPA) nel sangue ela sua concentrazioneematica dicirca8ng/ml.Pesomolecolare:54.000Da.LaprouPA a singolacatena(scuPA,singlechainuPA),conscarsaattivitenzimatica.Inseguitoalimitata idrolisidapartedellaplasminaodellacallicreina(lys158ile159)siformaunamolecolaa doppiacatena(tcuPA,twochainuPA)cherappresentalaformaenzimaticamenteattiva.A differenzadeltPA,lurochinasinonpossiedesitidilegamesullafibrina,ma ingradodi legarsiarecettorispecificipresentisututtelecellule(uPAR).Sullamembranaplasmatica, inoltre, sono presenti anche recettori per il plasminogeno. uPAR presente anche su macrofagi e monociti ed il legame con uPA aumenta notevolmente lattivit catalitica dellenzima:quandoimonocitipenetranonelcoagulo,uPAsilegaaduPARedattiva il plasminogenoaplasmina,contribuendoallalisidelcoagulo. Lattivit dientrambigliattivatoridelplasminogeno inibitadainibitorispecifici,comeil PAI1,che largamentediffusonelplasmaed presenteancheneitessutiassociatoaduna proteinadiadesionecellulare,lavitronectina. PLASMINOGENO Glicoproteina a singola catena di peso molecolare 88.000 Da, sintetizzata nel fegato. La formanativahacomeaminoacidoNH2terminalelacidoglutammico(Gluplasminogeno),e vienefacilmenteconvertita(mediantelimitatadigestioneplasminica)inLysplasminogeno (peso molecolare 83.000 Da), in cui lultimo aminoacido rappresentato dalla lisina. Contiene numerosi siti di legame per la lisina, che gli permettono di interagire con il fibrinogenoelafibrina,percui,quandosiformailcoagulo,moltodiquestoproenzima rimaneallinternodellammassodifibrina. Incondizioninormali,solocircail60%delplasminogenocircolantedisponibileperessere attivato.Ilrimanentelegato,seppurereversibilmente,adunaglicoproteinacircolantericca diistidina(PM60.000Da),lacosidettaglicoproteinariccadiistidina,cheimpedisceil legameallafibrina. PLASMINA Il plasminogeno viene convertito nellenzima attivo, chiamato plasmina, da tPA e uPA. Questoavvienemediantetaglioproteoliticodiunsingololegamepeptidicocorrispondentead Arg560Val561:siformacos unamolecolacostituitadaduecatene,lacatenaA (NH 2 terminale)equellaB(COOHterminale,contenenteilsitocatalitico).Illysplasminogeno vieneattivatopirapidamenterispettoalgluplasminogeno. LacatenaAcontiene5struttureadansa,dettikringle,identificabiliconicosidettisitidi legame per la lisina, che conferiscono alla plasmina, come pure al plasminogeno, una notevoleaffinitconlafibrina. Laplasminapudegradaresiailfibrinogeno,sialafibrinasolubile,sialafibrinastabilizzata qualeprodottofinaledellacoagulazione,formandoprodottididegradazionecaratteristiciper ogniformadifibrina,chesonoimportantinelladiagnosidivariecondizionipatologiche. MECCANISMODIATTIVAZIONEDELLAFIBRINOLISI

Sidistinguonotredifferentiviediattivazionedellafibrinolisi: 1fibrinolisidatPA.Elapiimportanteequellameglioconosciuta. Il tPA circolante plasmatico ha una bassa affinit per il suo substrato fisiologico, il plasminogeno(Kd65M)[Kd=corrispondeallaconcentrazionedienzimanecessariaasaturare
met deisitidilegame(plasminogeno);rappresentaquindiunamisuradellaforzadelcomplesso enzimasubstrato : un valore elevato indica quindi un debole legame, viceversa un valore basso indicaunlegameforte]equindisihascarsaattivazionediplasminogenoinfaseliquida;ilt

PA,tuttavia,haunlegamespecificoforteconlafibrina(Kd0.14M)eformauncomplesso bimolecolaretPA/fibrina,chehaunaltaaffinitperilplasminogeno(Kd0.16M),ilquale invecehaunabassaaffinit perlafibrinainassenzaditPA(Kd4M).Ilplasminogenosi lega quindipreferenzialmenteal complessotPA/fibrinae viene attivatoaplasminasulla superficiedelcoagulodifibrina. 2 via intrinseca, detta anche fluid phase plasminogen activation. Questa via dipende dallazionedelfattoreXIIadellacoagulazioneeanchedaunaseriediproteasicheoriginano dalsistemaplasmaticoattivabiledacontatto(coagulazioneintrinseca).IfattoriXIIa,XIaela callicreinapossonoattivaredirettamenteilplasminogenoaplasmina,laqualeoperalafase finaledellafibrinolisi. 3 viacorrelataallazionedellurochinasi,chederivadallattivazionedellaprourochinasi ad opera dellacallicreina.LaprouPApu essereconvertitaauPAanchedallaplasmina allinternodelcoagulo,dovelaplasmina,legataallafibrina, protettadalleantiplasminee puesercitarelasuaazionesullaprouPA.

DEGRADAZIONEDIFIBRINOGENOEFIBRINADAPARTEDELLAPLASMINA Laplasminaingradoditagliarepontipeptidiciargininalisinadimolteproteine,compreso ilfibrinogeno,lafibrinanonstabilizzataelafibrinainsolubile,stabilizzatadalfattoreXIII della coagulazione. La sua azione su fibrinogeno e fibrina porta alla formazione dei cosiddetti prodotti di degradazione del fibrinogeno e della fibrina o F.D.P (fibrinogen (fibrin)degradationproducts) Il fibrinogeno una proteina con peso molecolare di 340.000 Da, formata da 3 catene peptidicheche,tridimensionalmente,formano3dominiglobulari(2terminalied1centrale) unitidaregionidiconnessione(abastoncino).Alivellodeidominilateralifuoriesconodelle catenelateralipolipeptidiche,conterminazioneCOOH. Ladegradazionedelfibrinogenoedellafibrinaavvieneatappe. Degradazionedelfibrinogeno 1rimozionedipartedellecatenelaterali,conformazioneditreframmenti(frammenti,e unframmentograndeX) 2degradazioneasimmetricadelframmentoX,alivellodiunaregionediconnessionecon formazionediunframmentoD(100.000Da)edunframmentoY(150.000Da) 3ilframmentoY unprodottointermedioevienesuccessivamentedegradato:formazione diun frammentoD(100.000Da)eframmentoE(50.000Da),entrambiespressionedelle singoleregioniglobularidelfibrinogeno. La degradazione dellafibrina nonstabilizzata pressoch identica alla degradazione del fibrinogeno, i frammenti differiscono solo perch i monomeri di fibrina, rispetto al fibrinogeno,hannoperdutoiframmentiAeB(FPAedFPB)adoperadellatrombina. DegradazionedellafibrinastabilizzatadalF.XIIIa pi lentaedifficileenonproduce frammentiXedY.Sihaunainizialerimozionedellecatenelateraliconlaformazionedi polimeriadaltopesomolecolare.Quindi,inseguitoadigestionepi prolungata,siformano

deipolimeriintermedi,contenentipi dominiglobulari.Infine,inseguitoatagliproteolitici successivialivellodelleregionidiconnessione,siformanoframmentisolubiliDD/E,nonpi scindibilidallaplasmina. INIBITORIDELLAFIBRINOLISI Linibizionedelsistemafibrinoliticosiverificaavarilivelli:inibizionedegliattivatoridel plasminogenoedellaplasmina.Alcuniinibitorifisiologicidellafibrinolisisonoglistessiche sonoingradodiinibirealcunicomponentidelsistemadellacoagulazione.

PAI1(plasminogenactivatorinhibitor1)Estatoidentificatoperlaprimavoltanel
terrenodicolturadicelluleendotelialiumane,successivamentestatoritrovatonellamatrice extracellulare,nelplasma,nellepiastrine,eneiterrenidicolturadivarielineecellulariin vitro.Invivoprodottosoprattuttodallecelluleendotelialiattivate.Eunaglicoproteinaa singola catena con peso molecolare di circa 52.000 Da. Appartiene alla famiglia delle serpine.FormacomplessicovalenticontPAasingolaeadoppiacatenaeconuPAadoppia catena(tcuPA),manonconlaformaasingolacatena(scuPA).LaproduzionediPAI1 modulatadavarifattoridicrescita:trombina,IL1,TNF,TGFbetaneaumentanolasintesi.

PAI2(plasminogenactivatorinhibitor2) Isolatodaimacrofagiedallaplacenta,
esiste in due differenti forme: una forma intracellulare, non glicosilata, con un peso molecolaredicirca47.000Daedunaformasecreta,glicosilata,conunpesomolecolaredi circa70.000Da.Nonpresentenormalmentenelplasma,macomparedurantelagravidanza ed diderivazioneplacentare.FapartedellafamigliadelleserpineedinibisceiltPAelu PAadoppiacatena,mentrereagiscemenoconleformeasingolacatenadientrambigli attivatori. Entrambi gli inibitori degli attivatori del plasminogeno presentano nella loro molecola sequenze esca simili alle sequenze di consenso per lattivit enzimatica presenti nelle molecolesubstratodegliattivatoridelplasminogeno.Inseguitoalmorsoenzimaticoscatta un meccanismo che porta alla formazione di un legame covalente tra linibitore ed un aminoacido del sito catalitico dellenzima, con conseguente inibizione irreversibile dellattivitenzimatica.

alfa2 antiplasmina.Eunaglicoproteinaasingolacatena,sintetizzatadalfegato,conun
pesomolecolaredicirca70.000Da,contenenteil13%dicarboidrati.Lasuaconcentrazione plasmatica di70g/ml,edeccede dicirca10voltelaquantit diplasmina presentein condizioninormali.Appartieneallafamigliadelleserpine(inibitoridelleserinoproteasi). Esisteindueforme,unaattiva(70%)edunainattiva(30%). Comeglialtriinibitoridelleproteasi,haunampiospettrodiinibizioneinvitro,mailsuo ruolobiologicoinvivoquellodiinibirelaplasmina. Forma un complesso stechiometrico 1:1 con la plasmina, legandosi dapprima in modo reversibile ai siti leganti lisina della plasmina stessa e formando successivamente un complessostabile,cheinibisceinmodoirreversibilelenzima.Inoltrelalfa2antiplasmina inibisce il legame delplasminogenoallafibrina,inquantocompeteconil plasminogeno stesso per i siti di legame per la lisina, impedendone lattacco alla fibrina. Lo stesso meccanismo dazione utilizzato da un analogo della lisina, lacido aminocaproico, utilizzato come inibitore della fibrinolisi. Lalfa2antiplasmina pu inibire anche altre proteasi,comeluPA,ilF.XIIa,XIa,Xa,lacallicreinaelatrombina.

alfa2 macroglobulina.Euninibitoredellaplasminacheagiscepi lentamenteedin

tempisuccessivirispettoall 2antiplasmina.Laplasminanonreagisceconquestoinibitore finchnonsonostatesaturatetuttelemolecoledell2antiplasmina. Eunaglicoproteinadipesomolecolare725.000Da,contenentel8%dicarboidrati,non appartieneallafamigliadelleserpine. Ecostituitadadueunit tenuteinsiemedalegaminoncovalenti;ogniunit compostada duecatenetenuteinsiemedapontiSS.Lasuaconcentrazioneplasmaticacorrelataallet: laconcentrazionemassimasihafra0a3anni(4.5g/L),poidiminuisce(adulto 22.5g/L). Formacomplessiancheconaltreproteasi,serino,cisteinoemetalloproteasi. Il legame dell 2macroglobulina alla proteasi si accompagna ad un taglio proteolitico dellinibitoreadoperadellaproteasistessa,coneliminazionediunframmentodi85.000Da. Questodeterminauncambiamentoconformazionaledellinibitoretalechelenzimarimane intrappolatoallinternodellamolecoladellinibitore.Linibizionedellattivitenzimatica dovutaquindiadunimpedimentosterico.

LABILANCIAEMOSTATICAENDOTELIALE
ACCENNIALLASTRUTTURADEIVASI

1. ARTERIE. Le arterie sono vasi che si dipartono dal cuore e, ramificandosi, raggiungono tutti gli organi in direzione centrifuga. Le arterie diminuiscono progressivamentedicalibroesidistinguonoarteriedigrossocalibro(condiametro superiorea7mm),dimediocalibro(condiametrotra7mme2.5mm)edipiccolo calibro (con diametro inferiore a 2.5 mm). Le ultime diramazioni, le arteriole, presentanoundiametrospessoinferioreai100 m.SecondolaleggediBichat, quando unarteria si divide la somma delle superfici di sezione delle branche di divisione sempresuperioreallasuperficiedisezionedeltroncooriginario.Quindi, lacapacitdellettoarteriosoaumentaamanoamanochecisiallontanadalcuore.La parete delle arterie costituita da tre strati concentrici, con struttura e spessore variabilisecondoledimensionidelvaso.Sidistinguono:a)latonacaintima,rivestita daendotelio,checomprendeanchelamembranabasaleendotelialeelamembrana elastica limitante interna; b) la tonaca media, costituita prevalentemente da fibre elastiche(arteriedigrossocalibro)odacellulemuscolarilisce(arteriedimedioedi piccolo calibro). Essa limitata esternamente dalla membrana elastica limitante esterna; c) la tonaca avventizia, di natura connettivale e contenente sottili vasi sanguigni(vasavasorum)efilamentinervosi(nervavasorum). 2. VENE.Leveneprovengonodallaperiferiadellorganismoearrivanoalcuoredestro, quindiinesselacircolazionedisvolgeindirezionecentripeta.Inizialmentesonodi piccolocalibro(venule),quindisiriunisconointronchisemprepi voluminosi(vene dimedioedigrossocalibro),ricalcandopiomenofedelmentelorganizzazionedelle arterie.Letretonachedescrittenellearteriesonopresentianchenelleveneelaloro strutturavariainrapportoalladimensionedelvaso.Ingenereleparetivenosesono pi sottilidiquellearteriose.Nellatonacamediaprevalelacomponentemuscolare nelleveneditipopropulsivo,presentinellezonedeclividelcorpoedoveilsangue defluisce in senso contrario alla forza di gravit; il tessuto fibroelastico prevale

invecenellatonacamediadelleveneditiporicettivo,caratteristichedellepartipi alte del corpo. Nelle vene di tipo propulsivo le tonaca intima pu estroflettersi a formarepiegheconfunzionedivalvole,chehannolafunzionediimpedireilreflusso delsangue,facilitandoneilritornoalcuore.Inparticolare,levenedegliartiinferiori presentanovalvoledislocateadintervalliregolari,mentrelevenericettivenesono completamenteprive(venepolmonari,venacavasuperiore). 3. CAPILLARI.Rappresentanounaretedisottilivasisanguigni,scopertanel1661da Malpighi.Sonointerpostitraarterioleevenule,garantendolacontinuit dellalbero circolatorio.Sivalutachenellorganismosianopresenticirca10miliardidicapillari, chepresentanoundiametromediodicirca810m,conunasuperficietotaledicirca 700 m2; in certi organi (fegato, surrene, ipofisi, ecc.) hanno calibro irregolare, adattandosialladisposizionedellelamineocordonicellulariepiteliali;inquesticasii capillari prendono il nome di sinusoidi. La parete dei capillari costituita da endotelio,cheriposasuunasottilemembranabasale,rinforzataspessodaunadelicata guaina di fibre reticolari, nel cui spessore sono situati i periciti, o cellule avventiziali,lacuifunzionenonbendefinita(probabileregolazionedelcalibrodei capillariperunmeccanismocontrattileoperliberazionedisostanzevasomotrici). 4. ANASTOMOSIARTEROVENOSE.Inmoltidistrettidellorganismolearterieele venesonocollegate,oltrechedallereticapillari,chesostengonoilcosiddettoflusso nutrizionale,anchedaparticolaricanalivascolaridiretti(anastomosiarterovenose), i quali rappresentanoquindi uncortocircuitofracircolazionearteriosa evenosa e sostengono il cosiddetto flusso non nutrizionale. Questi canali sono forniti di particolaricuscinetticellularisottoendotelialichepossonoregolarelampiezzadel lumevasale,variandocos ilflussosanguigno.Incerticasi,comeneipolpastrelli delleditadellemaniedeipiedi,lanastomosi lungaeconvoluta,avvolgendosicon unaspettoglomerulare. 5. LENDOTELIO. E rappresentato da un singolo strato di cellule che rivestono omogeneamentelapartepi internadellettovascolare.Lecelluleendotelialihanno formaallungataopoligonaleepresentanovescicolepinocitotichecherappresentano la principale modalit di trasferimento di nutrienti dal lato luminale a quello abluminale (transcitosi). Contengono nel loro interno i granuli di WeibelPalade, strutturecircondatedamembranacherappresentanoorganellididepositodelfattore di von Willebrand (vWF). Tale molecola importante (oltre che per la funzione dellendotelio)ancheperch anticorpicontroilvWFpermettonodiidentificaredal punto di vista citochimico le cellule endoteliali. Un altro antigene specifico delle celluleendoteliali ilCD31. Lendoteliovascolareeraconsideratounaspecie di barrierapassiva,lacuiunicafunzioneconsistevaneltrasferimentodinutrientienel regolaregliscambidiossigenoeanidridecarbonicatrasangueetessuti.Attualmente esso consideratounorganoveroeproprio,conunasuperficietotaleparagonabilea quelladiuncampodacalcioedunpesodicirca250grammi,dotatodimolteplici attivit: 1) membrana che regola il passaggio di molecole di piccole e grandi dimensioni attraverso la parete vascolare; 2) modulatore del tono vascolare e del flusso sanguigno; 3) sede di metabolizzazione di alcuni ormoni; 4) controllore dellinterazione dei leucociti e dei linfociti con i vasi e quindi regolatore della rispostainfiammatoriaedimmunitaria;5)modificalelipoproteinedepositatenella parete delle arterie, rilasciando radicali tossici dellossigeno; 6) rilascia fattori di crescitacheregolanolaproliferazioneedifferenziazionedellecellulemuscolarilisce dellatunicamedia;7)costituisceunasuperficiecheregolaimeccanismiemostatici, mantenendoilsangueinstatodifluidit.Questultimapropriet,checiinteressa

direttamenteperlacomprensionedellafisiopatologiadelprocessoemostatico,sibasa su numerose attivit presenti sullendotelio o secrete in circolo in condizioni di normalit, che nel loro insieme definiscono la cosiddetta bilancia emostatica endoteliale. LABILANCIAEMOSTATICAENDOTELIALE Lacellulaendotelialepresentasiaattivitantitrombotiche,siaattivitprotrombotiche. ATTIVITAANTITROMBOTICHE: 1) Inibizione della aggregazione piastrinica. La carica elettronegativa della superficie dellendotelio previene la deposizione e ladesione spontanea delle piastrine. Lendotelio rilascia un particolare prodotto di elaborazione dellacido arachidonico,cio laprostaglandinaI2 (PGI2),detta prostaciclina,che unpotente antagonistadellaaggregazionepiastrinicaedhaunaforteattivit divasodilatazione. Inoltre esso rilascia NO (ossido nitrico), precedentemente chiamato EDRF (endotheliumderivedrelaxingfactor),conattivit divasodilatazioneedantagonista dellaaggregazionepiastrinica.Sullasuperficieluminaledellacellulaendoteliale presente lenzima ectoADPasi, il quale idrolizza lADP rilasciato dalle piastrine durantelacosiddettareleasereaction,impedendoataleagonistadiinnescarelevie ditrasduzionedelsegnalenecessarieperlaaggregazionepiastrinica. 2) Inibizionedellacoagulazionesanguigna.Sullasuperficieendoteliale espressala trombomodulina, recettore della trombina: quando la trombina si lega a tale recettore, essa modifica lasua affinit di substrato (normalmente rappresentati da fibrinogeno,fattoreXIII,fattoreVIII,fattoreV)edattivalaproteinaC,innescandola viadellaanticoagulazionecontrollatadataleserinoproteasi.Inoltre,lasuperficie endoluminaledellendotelioesprimegrandiquantit diunproteoglicanoconcatene laterali glicosaminoglicaniche che hanno sequenze simili a quelle anticoagulanti delleparina. Si tratta delle catene di eparansolfato, le quali, oltre a catalizzare linterazione tra ATIII e trombina, legano anche il TFPI (tissue factor pathway inhibitor),rendendolodisponibilealcontrollodellaattivazionedellaviaestrinseca dellacoagulazione. 3) Promozione della fibrinolisi. La forza di trascinamento della corrente sanguigna sullendoteliostimolailrilasciodiattivatoretessutaledelplasminogeno(tPA),tanto cheilcosiddettopostexerciseplasma(PEP),cio ilplasmadiunindividuoche stato sottoposto ad un esercizio fisico intenso (corsa, bicicletta), enormemente arricchitoditPA, utilizzatocomematerialedipartenzaperisolaretPAnativo.Le celluleendotelialiproduconoancheattivatoredelplasminogenoditipourochinasico (uPA). ATTIVITAPROTROMBOTICHE: 1) Induzione della adesione ed aggregazione piastrinica. Le cellule endoteliali costituiscono una delle principali fonti di produzione (ma non lunica) di fattore attivante le piastrine (PAF, Platelet Activating Factor), fondamentale mediatore infiammatorio dalle molteplici funzioni, il quale anche un potente agonista

dellaggregazione piastrinica. Inoltre, lendotelio produce il fattore di von Willebrand(vWF),ilprincipalecollantedellaadesionepiastrinica. 2) Attivazione della coagulazione sanguigna. Endotossine batteriche o citochine (TNF,IL1)oildannomeccanicosubitodacelluleendotelialiadiacenti,induconole celluleendotelialiedesporreil fattoretessutale,cheinnescalaviaestrinsecadella coagulazione, sulla superficie luminale dellendotelio. Inoltre, la superficie fosfolipidica dellendotelio viene utilizzata (al pari di quella delle piastrine e dei leucociti) per lassemblaggio del complesso tenasico della via intrinseca della coagulazioneediquelloprotrombinasicodellaviacomune. 3) Inibizionedellafibrinolisi.Lecelluleendotelialirilascianoinibitoridegliattivatori delplasminogeno (PAIs,plasminogenactivatorinhibitors),siainseguitoadanno meccanico della cellula endoteliale, sia in seguito ad un rallentamento del flusso sanguigno,comepuverificarsisoprattuttonelcompartimentovenoso,siainrisposta acitochineinfiammatorie(dannobiochimico). Le cellule endoteliali integre servono, in primo luogo, ad inibire ladesione piastrinica e la coagulazione del sangue. Il danno e lattivazione delle cellule endoteliali stimola lespressione di un fenotipo protrombotico, che sbilancia lassettoemostaticodellendotelioalivellolocale.