Rev. Salud Anim. Vol. 24 No.

3 (2002): 151-155

Artculo resea

UN COMENTARIO ACERCA DE LOS MOTIVOS CpG

Miriam Pedroso
Laboratorio de Immunologa, Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), Apartado 10, San Jos de las Lajas, La Habana, Cuba RESUMEN: En los ltimos aos se han logrado resultados relevantes en el esclarecimiento de muchos de los mecanismos involucrados en la respuesta inmune, los motivos CpG son un ejemplo. Se trata de secuencias no especficas de ADN que contienen los dinucletidos citosina y guanina de forma no metilada, as, estn presentes en el ADN de microorganismos y no en los vertebrados y son potentes estimuladores de las clulas dendrticas, clulas B, macrfagos, clulas NK, inducen interfern, y respuesta Th1, entre otras importantes propiedades estimulatorias de la inmunidad. Debido a esta capacidad, se han empleado como adyuvantes de vacunas virales y bacterianas e inducen respuesta a nivel mucosal. Los trabajos desarrollados hasta el momento no demuestran efectos txicos y se plantea la necesidad de aplicar altas dosis para que aparezca un efecto txico. Los resultados que se plantean constituyen una atractiva opcin en la vaccinologa, no solo para uso humano sino tambin en veterinaria.
(Palabras clave: motivos CpG; inmunidad innata; adyuvantes)

A COMMENT ABOUT CpG MOTIFS

ABSTRACT: In the last years, relevant results in the elucidation of mechanisms related to the immune response, such as CpG motifs, have been obtained. There are non specific sequences of DNA containing cytosine and guanine dinucleotides in no metilated form in the DNA of microorganisms and not in vertebrates. There are potent stimulators of dendritic cells, B cells, macrophages and NK cells. They induce interferon and Th1 response among other important stimulating properties. Due to their capacity, they are used as viral and bacterial vaccine adjuvants and also they induce response at mucosal level. Developed works do not show toxic effects. It is necessary to use very high doses to obtain the toxic effect. The results are an atractive option in vaccinology, not only for human use, but also for veterinary one.
(Key words: CpG motifs; innate immunity; adjuvants)

Los avances en el conocimiento de los mecanismos involucrados en la respuesta inmune no solo contribuyen a esclarecerla, sino que adems constituyen la base fundamental en la bsqueda de nuevos elementos que puedan estimularla de forma adecuada. Los factores que influyen en la respuesta pueden ser la clave para el desarrollo y aplicacin de ellos a favor de una respuesta protectora. El descubrimiento por Tokunaga (21), en el que demostr que el ADN bacteriano y no el de vertebrados activa las clulas NK, e induce IFN as como regresin

en modelos de tumores murinos, y de otros investigadores que encontraron que el ADN bacteriano, pero no el de vertebrados, activa las clulas B y la secrecin de inmunoglobulinas, constituyeron las bases de un conjunto de investigaciones que culminaron con la definicin del papel de los motivos CpG en la inmunidad, adems de la posibilidad de su empleo con fines teraputicos y/o profilcticos. De forma general, puede decirse que los motivos CpG son secuencias especficas de ADN que contienen los dinucletidos citosina-guanina de forma no

152

metilada. Estos dinucletidos poseen una fuerte actividad de estimulacin de la respuesta inmune. En clulas B murinas y humanas inducen proliferacin, la aparicin de seales coestimulatorias y la produccin de inmunoglobulinas; las clulas dendrticas secretan una amplia gama de citoquinas, interferones y quimocinas, e incrementan la expresin de seales coestimulatorias. Un breve recuento de los elementos de la inmunidad natural contribuir a esclarecer nuestros planteamientos. Respuesta inmune innata La respuesta inmune innata no requiere una previa exposicin con el antgeno, es de corta duracin, ocurre en minutos u horas, aunque se requieren 1 a 2 semanas despus de la primera exposicin para ser completamente efectiva (4); en ella participan factores de naturaleza variada que incluyen tanto las barreras anatmicas, como las fisiolgicas. Dentro de estos ltimos, varios elementos celulares como macrfagos, polimorfonucleares, as como las clulas NK, juegan un papel relevante (por la fagocitosis, debida a las dos primeras y la vigilancia antiviral y antitumoral de las ltimas, respectivamente) y dentro de los elementos que caracterizan la respuesta innata, est la produccin de citoquinas que activan y reclutan las clulas efectoras de la inmunidad. Los mecanismos defensivos han evolucionado en millones de aos y nos permiten sobrevivir a pesar de la continua exposicin a millares de virus, bacterias, hongos y parsitos. Por ejemplo, la recombinacin gentica permite que las clulas B y T posean nuevos y especficos receptores para las molculas extraas (12). Los macrfagos, las clulas dendrticas y los linfocitos B son clulas presentadoras de antgenos y constituyen los principales linajes celulares involucrados en mediar y coordinar la inmunidad innata. Los macrfagos y las clulas dendrticas desarrollan un tipo primitivo de receptor que detecta patrones moleculares que estn presentes en los microbios, pero no en los vertebrados. Estos receptores de los patrones moleculares (PRR en ingls) se unen a molculas comunes en los microbios, pero no en los tejidos del hospedero. Por lo que la presencia de los patrones moleculares de los microbios, y su unin a los receptores, representan una seal que provoca una rpida induccin de la inmunidad innata.

Se ha demostrado que uno de los sistemas de reconocimiento se basa en sutiles diferencias estructurales entre el ADN de los hospederos y el de los patgenos invasores. El ADN de los microorganismos contiene los motivos CpG estructuralmente diferente al de los hospederos y estos directamente activan las clulas del sistema inmune como monocitos, macrfagos y clulas NK (3). Algunos antecedentes que llevaron a las consideraciones de los motivos CpG Tokunaga et al. (22) explicaron, de forma relativamente sencilla, algunas evidencias que llevaron a las ideas acerca de los motivos CpG y su implicacin en la estimulacin de la respuesta inmune. El concepto de la actividad inmunoestimuladora del ADN naci de una larga serie de estudios de resistencia a tumores por el uso del Bacilo Calmette Guerin BCG. El ADN purificado del BCG inhibe el crecimiento de tumores en varios animales singnicos, aumenta la actividad NK e induce IFN (22). Se encontraron adems tres resultados de gran inters: 1. La actividad biolgica sealada en el prrafo anterior es provocada por el ADN del BCG y el de los invertebrados y no por el ADN de vertebrados ni las plantas. 2. La actividad depende de secuencias de bases particulares que tienen dinucletidos ricos en Citocina y Guanina CG in a senless manner (22). 3. Se logr definir que, al menos en parte, la actividad immunoestimuladora del BCG Bacilo Calmette Guerin se debe a las secuencias genmicas del ADN rica en los dinucletidos CG (22). Otras evidencias con relacin a los CpG son que los procariotes presentan ms secuencias CpG que los vertebrados, adems, en los procariotes los CpG son no metilados a diferencia de los presentes en los vertebrados que s son metilados. Sobre la base de este hecho, Krieg (12) sugiere que el sistema inmune desarroll un mecanismo de defensa basado en el reconocimiento de la diferencia entre dinucletidos CpG metilados y los no metilados. Como confirmacin de esta hiptesis, se encontr que cuando se metil el CpG bacteriano se elimina el efecto mitognico, lo que confirma que el CpG no metilado es el que provoca la estimulacin (13).

Rev. Salud Anim. Vol. 24 No. 3 (2002)

153

Receptor de reconocimiento de patrones (PRR). Efecto de los motivos CpG sobre el sistema inmune Los receptores para los CpG son intracelulares y se encuentran, como ya se seal en las clulas presentadoras de antgenos como linfocitos B, macrfagos y clulas dendrticas. El ADN es tomado por las clulas en un compartimento endosomal donde es acidificado y digerido por nucleasas . La acidificacin se requiere para su actividad inmunoestimulatoria, puesto que la inhibicin de la acidificacin bloquea la seal inducida por CpG (14). A los 10-15 minutos de exposicin a secuencias CpG, las clulas presentan signos inequvocos de activacin, como son los elevados niveles de radicales de oxgeno (25), activacin de NFkB, e induccin de las vas de protena-kinasa (12). Efecto sobre clulas B, clulas dendrticas, macrfagos y NK. Sobre las clulas B provocan switch o cambio para la produccin de diferentes inmunoglobulinas, as como incremento de las molculas coestimulatorias MHC II, B7-1, B7-2, que son imprescindibles en el mecanismo de presentacin del antgeno (13). Los motivos CpG previenen la apoptosis de clulas B (24). Los motivos CpG activan directamente a monocitos, macrfagos y provoca que estos secreten IL12 , lo que induce a las clulas NK a la produccin de IFN (3). Sobre las clulas dendrticas (CD) tambin tienen un efecto relevante. Estas clulas presentadoras de antgenos representan uno de los puentes entre la inmunidad natural primitiva y la inmunidad adquirida o adaptativa. En respuesta a los motivos CpG no metilados, las (CD) inician una respuesta tipo Th1(10) que es particularmente efectiva en la inmunidad antiviral (7) adems de TNFa e IL6 , aunque no en la intensidad que lo provoca el LPS (9). La administracin sistmica de CpG puede aumentar la disponibilidad de CD maduras e inmaduras en la sangre y los tejidos. Los motivos CpG tambin incrementan la actividad ltica de las clulas NK y la secrecin de IFN, y por ellas (23). Las citoquinas que se producen como consecuencia de la estimulacin por los CpG son del tipo Th1 (patrn de inmunidad a mediacin celular) IL2, IL12 IFN (10).

Mecanismo de evasin de la inmunidad en virus relacionado con los motivos CpG Los virus han evolucionado para superar la presin que sobre ellos ejerce la respuesta inmune; puesto que el reconocimiento de los CpG es un efectivo mecanismo de defensa, pues estos agentes patgenos han evolucionado para evitar este mecanismo. Se pueden sealar dos ejemplos: prcticamente todos los virus ADN y retrovirus tienen un bajo contenido en CpG con menos de un 6%. Ciertos serotipos de adenovirus presentan genoma, en el que los motivos CpG estn alterados de forma que inhiben la actividad estimulatoria de la inmunidad de los CpG (12). Los resultados sealados acerca de la actividad de los motivos CpG sobre el sistema inmune, justifican la atencin que le han brindado los inmunlogos en el sentido de su empleo con fines profilcticos como adyuvante de vacunas, as como de forma teraputica. Aplicacin de los motivos CpG en la vacunacin y de forma teraputica La bsqueda de adyuvantes adecuados para las vacunas es un tema complejo y muy actual, una de las potencialidades de los adyuvantes es la posibilidad de orientar la respuesta inmune por la induccin de patrones adecuados de citoquinas Th1 , Th2 patrn de inmunidad humoral (19); estos patrones son un elemento central en dependencia de la naturaleza del microorganismo hacia el cual se desea inducir la respuesta protectora. De forma general se puede decir que el patrn Th1 es necesario en el mecanismo de defensa contra microorganismos parsitos intracelulares obligados y el Th2 para microorganismos productores de exotoxinas. Como se conoce, muchas enfermedades infecciosas se trasmiten a travs de las superficies mucosas de los tractos gastrointestinal, digestivo y respiratorio. Por lo que el uso de adyuvantes para empleo a nivel mucosal, representa un campo de amplias posibilidades en la vaccinologa. La inmunizacin mucosal con CpG se ha empleado como sealan McCluskie et al. (15) frente a antgenos virales y bacterianos: Virales: - Antgeno completo del virus influenza para uso intranasal y oral (18). - Antgeno de superficie de la hepatitis B para uso intranasal, oral y rectal (16).

Rev. Salud Anim. Vol. 24 No. 3 (2002)

154

Bacterianos: - Toxoide tetnico para uso intranasal, oral y rectal (17). - Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin (BCG) para uso intranasal (8). En orangutanes bajo respondedores, se encontr que la adicin de CpG en la vacuna de hepatitis provoca seroconversin y altos ttulos de anticuerpos (6). CpG y el asma El asma ha sido otro punto de atencin del empleo de los CpG, si se tiene en cuenta que en estos casos es deseada la respuesta de tipo Th1. Algunos estudios han demostrado que la administracin parenteral o intranasal de CpG en ratones puede prevenir el estado alrgico caracterstico de la respuesta de los asmticos, caracterizado por una respuesta de tipo Th2 e inducir respuesta Th1 (2) (11). Aspectos toxicolgicos relacionados con los motivos CpG. Uno de los efectos indeseados que se esperaba podan inducir los CpG, eran trastornos de autoinmunidad, pero esto no ha ocurrido, incluso se reduce la severidad de la respuesta autoinmune en ratones predispuestos a la misma (12). Otro efecto indeseado podra ser la excesiva activacin del sistema inmune, pues puede provocar una respuesta inflamatoria sistmica (5). Sin embargo, las evidencias indican que es necesario aplicar altas dosis de CpG para que aparezca efecto txico (12). Finalmente, se puede sealar que desde el punto de vista de su produccin, es fcil de sintetizar en grandes cantidades cumpliendo las buenas prcticas de produccin (12) . Los resultados encontrados evidencian que los motivos CpG, sin duda, constituyen una atractiva opcin en los campos de la vaccinologa y de la teraputica, no solo para su empleo en el hombre, sino tambin en veterinaria.

2. Broide, D.; Schwarze, J.; Tighe, H.; Gilford, T.; Nguyen, M.D.; Malek, S.; Van Uden, J.; Martin Orozco, E.; Gelfand, E.W.; Raz, E. (1998): Immunostimultory DNA sequences inhibit IL5 eosinophilic inflamation, and airway hyperresponsiveness in mice. J. Immunol. 161: 7054-7062. 3. Chace, J.H.; Hooker, N.A.; Mildenstein, K.L.; Krieg, A.M.; Cowdery, J.S. (1997): Bacterial DNA induced NK cell IFN is dependent on macrophage secretion of IL12. Clin. Immunol. Immunopathol. 84: 185-93. 4. Clough, N.C.; Roth, J. (1998): Introduction to the Immune System in Understanding Immunology , MosbyYear Book Inc. 3. 5. Cowdery, J.S.; Chace, J.H.; Krieg, A.M. (1996): Bacterial DNA induces NK cells to produce Interferon in vivo and increases the toxicity of lipopolysaccharides. J. Immunol. 156: 4570-5. 6. Davis, H.L.; Suparto, I.I.; Weeratna, R.R.; Jumintarto Iskandriati, D.D.; Chamzah, S.S.; Maruf, A.A.; Nente, C.C.; Pawitri, D.D.; Krieg, A.M.; Heriyanto, Smits W.; Sajuthi, D.D. ( 2000): CpG DNA overcomes hyporesponsiveness to hepatitis B vaccines in orangutans. Vaccine. 18: 1920-1924. 7. De Noon, D.J. (1999): Adjuvants CpG Motifs motivate human DCs. Aidsweekly Plus. 8. Freidag, B.L.; Melton, G.B.; Collins, F.; Klinman, D.M.; Cheever, A.; Stobie, L.; Suen, W.; Seder, R.A. (2000): CpG oligodeoxinucleotides and interleukin 12 improve the efficacy of Mycobacterium bovis BCG in mice challenged with M.tuberculosis. Infect. Immun. 64: 2948- 2953. 9. Hartmann, G.; Krieg, A.M. (1996): CpG DNA and LPS induce distinct patterns of activation in human monocytes. Gene Ther. 6: 893-903. 10.Jakob, T.; Walker, P.S.; Krieg, A.M.; Udey, M.C.; Vogel, J.C. (1998): Activation of cutaneus dendritic cells by CpG containing oligodeoxinucleotides: a role for dendritic cells in the augmentation of Th1 responses by immunostimulatory DNA. J. Immunol. 161: 3042-9.

REFERENCIAS
1. Ballas, Z.K.; Rasmussen, W.L.; Krieg, A.M. (1996): Induction of natural killer activity in murine and human cells by CpG motifs in oligodeoxinucleotides and bacterial DNA. J. Immunol. 157: 1840-5.

Rev. Salud Anim. Vol. 24 No. 3 (2002)

155

11.Kline, J.N.; Krieg, A.M.; Waldschmidt, T.J.; Ballas, Z.K.; Jain, V.; Businga, T.R. (1999): CpG oligodeoxinucleotides do not require Th1 cytokines to prevent eosinophilic airway inflamation in a murine model of asthma. J. Allergy Clin Immunol. 104: 1258-1264. 12. Krieg, A. (2001): Immune effects and mechanisms of action of CpG motifs. Vaccine. 19: 618-622. 13.Krieg, A.K.; Yi, A.K.; Malson, S. (1995): CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B cell activation. Nature. 374: 546-549. 14.MacFalane, D.E.; Manzel, L. (1998): Antagonism of immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotides by quinacrine, cloroquine, and structurally related compounds. J. Immunol. 160: 1123-31. 15.McCluskie, M.J.; Weeratna, R.D.; Payette, P.J.; Davis, H.L. (2001): The use of CpG DNA as mucosal vaccine adjuvant ,Current Opinion in investigational Drugs. 2(1): 35-39. 16.McCluskie, M.J.; Davis, H.L. (2000): Oral, intrarectal and intranasal immunization using CpG and non CpG oligodeoxinucleotides as adjuvant. Vaccine. 19: 413-422. 17.McCluskie, M.J.; Weeratna, R.D.; Krieg, A.M.; Davis, H.L. (2000): CpG DNA is an effective oral adjuvant to protein antigen in mice. Vaccine. 19: 950-957. 18.Moldoveanu, Z.; Love-Homan, L.; Huang, W.Q.; Krieg, A.M. (1998): CpG DNA a novel immune enhancer for systemic and mucosal immunization with influenza virus. Vaccine. 16: 1216-1224. 19.Mossman, T. (1986): Chapter 13 .Cytokines and immune regulation. In Rich, R.R. ed Clinical Immunology: Principles and Practice, Mosby Year Book.

20.Sun, S.; Kishimoto, H.; Sprent, J. (1998): DNA as an adjuvant: capacity of insect DNA and synthetic oligodeoxinucleotides to augment T cell reponse to specific antigen. J. Exp. Med. 187: 1145-50. 21.Tokunaga, T.; Yamamoto, H.; Shimada, S. (1984): Antitumor activity of deoxyribonucleic acid fraction from mycobacterium bovis GCG . Isolation, phisicochemical characterization and antitumor activity. JNCJ. 72: 955-62. 22.Tokunaga, T.; Yamamoto, T.; Yamamoto, S. (1999): How BCG led to the discovery of Immunostimulatory DNA. Jpn. J. Infect. Dis. 52: 1-11. 23.Yamamoto, S.; Kuramoto, E.; Shimada, S.; Tokunaga, T. (1988): In vitro augmentation of natural killer cell activity and production of interferon / and with deoxyribonucleic acid fraction from mycobacterium BCG. Jpn. J. Cancer Res. 79: 866-73. 24.Yi, A.K.; Chang, M.; Peckman, D.W.; Krieg, A.M.; Ashman, R.F. (1998): CpG oligodeoxyribonucleotides rescue mature spleen B cells from spontaneous apoptosis and promote cell cycle entry. J. Immunol. 160: 870-6. 25.Yi, A.K.; Tuelken, R.; Redford, T.; Kirsch, J.; Krieg, A.M. (1998): CpG motifs in bacterial DNA activate leukocytes through the pH dependent generation of reactive oxigen species. J . Immunol. 160: 475561.

(Recibido 18-7-2002; Aceptado 14-8-2002)

Rev. Salud Anim. Vol. 24 No. 3 (2002)