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TCNICAS

COLETA DE ADULTOS COM CAPTURADORES BASE DE SUCO

Este um dos mtodos mais frequentemente utilizados por sua simplicidade e economia. Existem vrios modelos de capturadores, baseados no dispositivo inicialmente descrito por Buxton (1928). A Figura 31 mostra alguns dos tipos mais utilizados. Os insetos so sugados individualmente para um tubo ou recipiente de vidro ou outro material transparente, provido de uma tela fina em uma extremidade, a qual se liga uma mangueira para suco ou bomba que gera uma presso negativa. Os mosquitos assim capturados podem ser transferidos diretamente para recipientes mortferos (contendo ter, clorofrmio, cianetos etc.) ou para gaiolas de transporte (Fig. 38), caso haja interesse de mant-los vivos.

Em levantamentos entomolgicos de mosquitos de importncia mdica usa-se frequentemente, como medida de densidade populacional, a expresso "coleta/homem/hora", correspondente ao nmero mdio de insetos capturados por um indivduo treinado durante uma hora. Embora essa medida seja inevitavelmente influenciada pelas diferenas individuais, considerada vlida quando empregada com uma amostra de tamanho adequado. Com esse tipo de capturadores pode-se fazer capturas intra e extradomiciliares de mosquitos pousados sobre paredes, tetos, mveis, plantas, ou iscas humanas e de outros animais. A isca humana pode ser o prprio indivduo que captura ou outra pessoa. O mtodo de coleta com utilizao de iscas pode ser associado ao uso de armadilha de Shannon e similares.

COLETA DE ADULTOS COM ARMADILHA DE SHANNON E CORRELATAS

Esta armadilha, descrita inicialmente por Shannon (1939), foi adaptada em suas medidas por diversos autores. Consiste originalmente de uma estrutura de tecido branco e tela apropriada para a captura de mosquitos ao ar livre (Fig. 32). Pode-se utilizar, para atrair os insetos, uma fonte luminosa em seu interior, associada ou no a uma isca humana ou animal. Os mosquitos que voam para o seu interior so coletados com capturadores de suco. Como variante desse mtodo, podem ser montadas "tendas" de tecido fino, tipo fil, de vrios formatos e tamanhos a cerca de 20 cm de altura do solo, providos de isca humana ou animal (Fig. 33) (WHO, 1962).

COLETA DE ADULTOS COM ARMADILHAS LUMINOSAS AUTOMTICAS

Existem vrios tipos e marcas de armadilhas automticas baseadas na atrao exercida por uma fonte luminosa comum ou de luz ultravioleta, junto a qual est instalada uma hlice cujo movimento aspira os mosquitos para um recipiente. Podem conter ou no substncias txicas, tais como inseticidas, gs carbnico, ou diversas substncias atrativas (Mulhern, 1953; Morris & De Foliart, 1969; Jewel, 1981). Os tipos "New Jersey" (New Jersey Agricultural Experiment Station, New Jersey, U.S.A.) e o "CDC" (Communicable Disease Center, Atlanta, U.S.A.) esto entre os mais utilizados (Fig. 34), existindo descritas numerosas variantes, inclusive verses bastante leves e prticas como a de Collier et al. (1992). O fato de nem todas as espcies de mosquitos serem atradas uniformemente pela luz, deve ser levado em conta ao se recorrer a esses dispositivos para levantamentos faunsticos (WHO, 1962; Sudia & Chamberlain, 1962).

COLETA DE ADULTOS COM ARMADILHAS DE OVIPOSIO OU DE FMEAS GRVIDAS

Diversas armadilhas tm sido desenvolvidas e produzidas comercialmente, baseadas na atrao exercida por fatores fsicos e qumicos sobre as fmeas grvidas que buscam um local para a oviposio. Tais armadilhas podem com

parar-se favoravelmente s armadilhas luminosas (Leiser & Beier, 1982), sendo ou no especficas quanto espcie de mosquitos capturados (Tanner, 1969; Clark et al., 1982; Klooter et al., 1983). Nos estudos epidemiolgicos, possuem a vantagem de, ao capturarem seletivamente fmeas grvidas, inclurem naturalmente tambm um maior percentual de mosquitos infectados. Reiter (1983) descreveu um tipo eficiente e bastante utilizado, baseado na armadilha luminosa "CDC" miniatura, na qual a fonte luminosa substituda por um recipiente de material plstico preto, contendo gua qual podem ser adicionados diversos produtos atraentes (Tikasingh & Laurent, 1981; Benzon & Apperson, 1988; Ben tley & Day, 1989; Millar et al., 1992). Ao aproximar-se da superfcie da gua, a fmea atrada sugada para o recipiente superior da armadilha. Existem diversos modelos variantes, baseados nesse mtodo, produzidos comercialmente.

COLETA INTRADOMICILIAR DE ADULTOS COM AUXLIO DE INSETICIDAS

Esse mtodo presta-se para avaliar a densidade populacional e composio da fauna de mosquitos intradomiciliares de maneira rpida e eficiente. Se forem utilizados inseticidas residuais nos locais de captura, eventuais repeties podero ficar inviabilizadas por tempo varivel. Tal inconveniente poder ser evitado empregando-se um produto no residual, como o piretro. Na casa ou cmodo escolhido, fecham-se todas as portas e janelas e recobrem-se o assoalho e mveis com pedaos de tecido branco, de forma contnua. Com uma bomba

manual ou aspersor ULV (aerosol), aplica-se prodigamente o inseticida no cmodo, comeando por eventuais aberturas que possam permitir a fuga. Caso o nmero de aberturas seja grande, aconselhvel fazer simultaneamente a aplicao nas paredes externas, para formar uma barreira de inseticida contra escapes. Fecha-se o cmodo por cerca de 10 minutos, e decorrido esse prazo reco lhem-se os mosquitos mortos sobre as superfcies brancas com auxlio de pinas. Em casas pequenas, ocupadas por muitas pessoas, os quartos de dormir costumam ser os mais produtivos. Esse mtodo tem sido extensivamente utilizado nos levantamentos entomolgicos relacionados malria na frica (WHO, 1962).

COLETA DE LARVAS COM CONCHAS

o mtodo mais simples. Existem conchas de variados tamanhos e materiais: metlicos ou de materiais plsticos diversos, providos ou no com uma tela lateral para a eliminao do excesso de gua. Podem possuir ainda uma escala volumtrica. Esse dispositivo til principalmente para coletas em criadou ros maiores, devendo a sua forma e cabo serem adaptados a cada finalidade (Fig. 35). Campos & Garcia (1993) descreveram um dispositivo que facilita a separao das larvas coletadas dos detritos e impurezas que possam estar presentes nas amostras.

COLETA DE LARVAS COM REDES

Redes com malhas finas (cerca de 0,3 mm), com cerca de 20 a 30 cm de dimetro, providas de um cabo de tamanho adequado ao local podem ser utilizadas para "varrer" a gua logo abaixo da superfcie (Fig. 35). As larvas, ento, so lavadas da rede para outro recipiente. Este mtodo permite coletar grande nmero de larvas em pouco tempo, e um cabo comprido permite o acesso a locais de outra forma difceis. Zhen & Kay (1993) descreveram uma rede apropriada para a coleta de larvas em pneus.

COLETA DE LARVAS POR PIPETAGEM

Para criadouros pequenos e/ou de difcil acesso, tais como bromlias, buracos de rvores, interndios de bambu etc, a pipetagem o mtodo mais indicado. Pode ser feita diretamente, com um dispositivo tipo "conta-gotas" ou indi retamente com utilizao de um sifo (Fig. 35.3), ao qual pode ser adaptado uma pequena bomba de vcuo que substitui o processo de suco bucal. Uma armadilha para coleta de larvas, utilizada com sucesso em Fortaleza, foi descrita por Kay et al. (1992).

MEDIDAS QUANTITATIVAS DE LARVAS Medidas por rea de superfcie

Coloca-se uma armao em forma de "moldura", medindo por exemplo 1 metro quadrado, em um criadouro e recolhem-se todas as larvas encontradas dentro da mesma. Se o fundo do criadouro no for plano ou se houver vegetao irregular isso poder interferir na preciso da medida.

Medidas por volume da gua

a. Por conchada possvel fazer um clculo aproximado da quantidade de larvas, pr-es tabelecendo um nmero de conchadas, correspondentes a um determinado volume de gua, por criadouro e intervalo de tempo. b. Por bombeamento Pode-se bombear um determinado volume de gua, contando-se ou esti mando-se o nmero de larvas encontradas. Se a amostra de larvas capturadas for razoavelmente homognea, pode-se estimar o seu nmero, ainda que relati

vamente grande, concentrando-as em uma proveta fina e previamente perfurada para permitir o escoamento da gua e a reteno das larvas. Tendo-se apurado previamente o nmero mdio de larvas que se acumulam por ml, pode-se fazer uma estimativa do nmero de larvas capturadas. Para cada amostra de larvas com caractersticas diferentes, os clculos do nmero acumulado que ocupa o volume de 1 ml devem ser refeitos (Fig. 36). Nenhum desses mtodos, exceto a contagem individual, fornece dados com valor absoluto, o que deve ser levado em conta ao serem analisados os resultados (WHO, 1962).

TCNICAS DE TRANSPORTE
Dependendo da finalidade a que se destinam, os mosquitos podem ser transportados vivos ou mortos para o laboratrio.

Mosquitos mortos
Adultos Por ocasio da captura so introduzidos imediatamente em tubos mortferos que podem conter diversas substncias letais: o cianeto de sdio misturado em gesso muito eficiente, porm perigoso; ter, clorofrmio, acetato de etila ou tetracloreto de carbono, embora menos eficazes so mais seguros, e portanto mais recomendveis (WHO, 1962). Para distncias no muito grandes, podem-se transportar os mosquitos vivos para o laboratrio e mat-los a, colocando-os no

"freezer" ou congelador. Aps a morte, os adultos devem ser montados to rapidamente quanto possvel. A exposio de mosquitos recentemente mortos a vapores de acetona por algumas horas, antes da montagem, evita o colapso do abdome, cabea e trax, obtendo-se assim exemplares mais fceis para estudar (Truman, 1968). Quando necessrio transportar mosquitos mortos e secos, no montados em alfinetes, melhor faz-lo em pequenos frascos individuais ou em tubos de ensaio estreitos nos quais se alternam os mosquitos com algodo e papel de filtro, adicionando-se um pouco de naftalina para melhor conservao. Caso se pretenda a utilizao posterior desse material em testes envolvendo r dioimunensaio, deve-se substituir a naftalina por slica-gel (Fig. 37).

Formas Imaturas As larvas usualmente so preservadas em lcool 70% ou formol a 4% (Fo rattini, 1962). Para que no fiquem retorcidas, pode-se mat-las, mergulhando-as rapidamente em gua quente, com auxlio de uma peneira.

Mosquitos vivos
Adultos Seja com o objetivo de estudos de biologia, testes de susceptibilidade a in seticidas ou para posterior disseco, os mosquitos vivos devem ser transportados com todo cuidado. As gaiolas de transporte (Fig. 38) devem ser colocadas em um recipiente tampado, de material isolante, como por exemplo "isopor" e cujo fundo esteja forrado com gaze e/ou algodo mido, de maneira firme para evitar, ao mximo, as trepidaes. Sobre a tela de cada gaiola coloca-se um chumao de algodo embebido em uma soluo de glicose, frutose, sacarose ou mel para a alimentao dos mosquitos.

Quando existe o interesse de se obter desovas de fmeas capturadas, as gaiolinhas podem ser encaixadas sobre um recipiente com gua (Fig. 38) possuindo, acopladas lateralmente, um tubo de ensaio contendo uma soluo aucarada em contato com uma tira de papel de filtro, cuja ponta seja acessvel aos mosquitos. No laboratrio, esse conjunto deve ser colocado em local com temperatura e umidade compatveis com a sobrevida das fmeas e a salvo de formigas. Atravs da tela pode-se oferecer repasto sanguneo em sangue humano (en costa-se a mo na tela), outros hospedeiros ou mesmo sangue citratado oferecido atravs de uma membrana (Consoli et al., 1983). No recipiente para a oviposi o deve-se colocar preferencialmente a gua colhida no campo, do criadouro (ou suposto criadouro) da espcie em questo. Na falta desta, deve-se usar gua desclorada do local mais prximo possvel daquele no qual foi feita a captura. Nem todos os mosquitos desovam facilmente em gua destilada, devendo-se evit-la por isso, sempre que possvel. Formas Imaturas As larvas e pupas devem ser transportadas na prpria gua na qual foram coletadas, tendo-se o cuidado de deixar um espao com ar nos frascos. Por perodos no muito longos, pode-se transport-las em papel de filtro mido. Esse tambm o processo habitual para o transporte de ovos vivos, havendo diversas tcnicas adicionais descritas (Deane & Causey, 1943; Sayer & Davidson, 1981).

TCNICAS DE MONTAGEM Montagem em alfinetes entomolgicos

Esse o processo habitual para montagem de adultos: Montagem com Tringulos de Cartolina Um pequeno tringulo de cartolina branca colocado em um alfinete entomolgico com auxlio de um suporte de madeira ou cortia perfurado, o que garantir a altura padronizada do mesmo (Fig. 39.a). Coloca-se ento uma pequena gota de cola transparente ou esmalte de unhas incolor sobre uma superfcie clara e embebe-se a ponta livre do tringulo em uma pequena quantidade da mesma. A seguir encosta-se com cuidado essa ponta na pleura torcica do mosquito que vai ser montado, de maneira que a maior parte das pernas fique posicionada na direo do alfinete. Levanta-se o alfinete j com o mosquito aderido, e com um estilete fino faz-se as correes na sua posio antes que a cola seque. O mosquito deve ficar deitado lateralmente sobre o tringulo, apresentando a pleura torcica superior livre para a observao (Fig. 39.b, c). As etiquetas (uma com os dados da coleta - quem coletou, local e data e outra com o nome da espcie, quem determinou e data) somente devem ser colocadas aps a total secagem da cola, devendo ser tambm colocadas em alturas padronizadas. Podese ainda proceder montagens duplas, com utilizao de microalfinetes (WHO, 1962; Forattini, 1962). Os exemplares montados devem ser conservados em caixas ou gavetas entomolgicas adequadas, em locais arejados. A pintura interna das caixas com uma soluo de naftalina em creosoto de faia ajuda a impedir o ataque de pragas.

Montagem em lminas
As genitlias masculinas, larvas, ovos e exvias larvais e pupais so habitualmente montadas em lminas. A montagem de adultos completos em lminas no adequada a um estudo minucioso. Entretanto, devido a sua maior resistncia, tais montagens podem ser muito teis como material didtico em cursos de nvel mais elementar, onde apenas as caractersticas gerais de algumas subfamlias so abordadas. Existem numerosas tcnicas de montagem descritas (Christophers, 1960; Forattini, 1962; WHO, 1962), por vezes, diferenciadas para as diversas estruturas. A tcnica descrita a seguir bastante abrangente, prestando-se para a montagem das vrias formas mencionadas. Os tempos apresentados so mdios e devem ser flexibilizados de acordo com o material a ser montado, e depois transferido de um recipiente para outro com auxlio de um pincel fino ou pedao de papel de filtro. Quanto mais quitinizado for o material tanto maior deve ser a sua permanncia em cada um dos vrios meios. Detalhes para a montagem de genitlia masculina so dados por Causey et al. (1946). 1. Clarificao A - soluo de KOH a 10%, fria, durante 12 horas (apenas para materiais fortemente quitinizados como larvas e genitlia masculina); no usar pincel. - lcool 70% 15 minutos - lcool 80% 15 minutos - lcool 90% 15 minutos - lcool 95% 10 minutos - lcool absoluto 10 minutos 3. 4. 5. Clarificao B Montagem Secagem - creosoto de faia 24 horas. - com blsamo do Canad, entre lmina e lamnula.

2.

Desidratao

- preferencialmente em estufa, a 40 - 45C, o que favorece a eliminao de eventuais pequenas bolhas de ar. As exvias de larva e de pupa devem ser processadas a partir da etapa 2 (desidratao).

TCNICAS DE DISSECO
As tcnicas de disseco do sistema digestivo e glndulas salivares de fmeas so utilizadas rotineiramente na avaliao da taxa de infeco malrica em populaes de mosquitos. A disseco de ovrios e ovarolos serve para a determinao da paridade, sendo portanto essencial a avaliao da idade fisiolgica em nvel populacional, o que por sua vez constitui um dado importante na de

terminao do potencial vetorial de uma populao de mosquitos. Tais tcnicas tm sido descritas por numerosos autores, em diferentes espcies e mosquitos, com pequenas variaes (WHO, 1962; Detinova, 1962).

Disseco do sistema digestivo

1. Mata-se a fmea colocando-a por 10 a 15 minutos no "freezer" (-18C); na falta deste pode-se recorrer a um jato de gs carbnico ou coloc-la em tubo mortfero, como descrito anteriormente. Coloca-se o mosquito, com o ventre para cima, sobre uma lmina limpa, em uma pequena gota de soluo de NaCl a 0,9%. Na lupa, e com auxlio de pinas finas ou estiletes, removem-se asas e pernas, para faciliar o trabalho. Com um estilete faz-se um pequeno corte no tegumento do 7 segmento. Segurando o trax com um estilete na mo esquerda, sem apertar em excesso, traciona-se lenta e gradativamente a extremidade do abdome com o estilete na mo direita, extraindo assim o sistema digestivo at o estmago. Isola-se o estmago, removendo as demais estruturas com os estiletes, acrescentando-se u m pouco mais da soluo salina, se necessrio. Monta-se o estmago, cobrindo-o com uma lamnula, e observa-se ao microscpio.

2. 3.

4.

5. 6.

Disseco das glndulas salivares e deteco de esporozotos

1. 2. Segue-se a tcnica anterior at o o item 2, sendo opcional a remoo de asas e pernas. Observando na lupa, com um estilete na mo esquerda segura-se o mosquito pelo trax, no muito prximo cabea e com um estilete na mo direita puxa-se lentamente a cabea, extraindo assim as glndulas salivares. Caso a cabea se separe sem a extruso das glndulas, pode-se ainda enxugar a rea usando um pedao de papel de filtro e, a seguir, pressiona-se suavemente o trax com o estilete da mo esquerda, procurando simultaneamente alargar com o estilete da mo direita a abertura do cerviz, onde estava ligada a cabea. Obtida a extruso, acrescenta-se novamente uma gota da soluo salina. Aps a remoo das demais estruturas, monta-se com lamnula e uma gota de soluo salina e observa-se ao microscpio.

3.

4.

possvel tambm extrair as glndulas salivares por compresso do mosquito decapitado e desprovido de asas e pernas em soluo salina (Barber & Rice, 1936), embora alguma prtica seja necessria para separ-las das demais estruturas. Pode-se ainda extrair esporozotos das glndulas salivares recorrendo centrifugao em vez de disseco (Ozaki et al., 1984).

Conforme mencionado no item Anofelinos relacionados com a transmisso da malria, p.(83), no possvel, atravs desta tcnica, identificar a espcie dos esporozotos que estejam infectando as glndulas salivares. Contudo, isto se tornou possvel a partir do emprego das tcnicas imunolgicas propostas por Zavala et al. (1982), Burkot et al. (1984) e Beier et al. (1991), com as quais torna-se desnecessrio recorrer a esta disseco ou pode-se identificar os esporozotos removidos em disseco.

Disseco de ovrios e ovarolos

A tcnica aqui resumida encontra-se minuciosamente descrita por Deti nova (1962). OVRIOS 1. Coloca-se a fmea anestesiada ou recentemente morta sobre uma lmina limpa, com o ventre virado para cima, perto de uma pequena gota de soluo fisiolgica. A ponta de u m estilete fino colocado firmemente sobre o 7 ou 8 segmento, e um segundo estilete colocado sobre o trax do mosquito exercer uma contnua trao para cima. medida que as vsceras forem surgindo, ficaro aderidas superfcie seca do vidro, facilitando a extrao do trato genital intacto. A gota de salina levada at os ovrios, logo aps a sua extrao. Os ovrios devem ser lavados em gua destilada para se evitar a posterior cristalizao do NaCl. Deixam-se secar os ovrios, temperatura ambiente, de forma que fiquem inflados com ar, o que necessrio para se visualizar bem as terminaes das traquolas. Para uma boa visualizao, os ovrios devem estar no mximo no estgio II de desenvolvimento. O material assim preparado no necessita ser examinado imediatamente, podendo ser guardado por muito tempo. Examinar ao microscpio com aumento mdio. As fmeas nulparas tero as extremidades das traquolas ovarianas enoveladas, enquanto que aquelas que j realizaram uma ou mais posturas onparas (Forattini, 1962) apresentaro as mesmas traquolas distendidas (Fig. 40).

2.

3. 4. 5. 6.

7.

OVAROLOS O nmero de dilataes (relquias ovariolares) encontradas nos pedculos terminais dos ovarolos corresponde ao nmero de ovos anteriormente produzidos por este ovarolo (Fig. 13.b). Como nem todos os ovarolos entram em ativi dade a cada ciclo gonotrfico, deve-se examinar o maior nmero possvel de ovarolos (n mnimo de 6), correspondendo o maior nmero de dilataes encontradas idade fisiolgica da fmea dissecada. necessrio cuidado para no

confundir pores do clice ovariolar, que podem desprender-se do oviduto, com verdadeiras relquias. 1. 2. 3. 4. Segue-se a tcnica anterior at o item 4, removendo-se da lmina todas as estruturas, exceto os ovrios. Com auxlio de estiletes muito finos remove-se gradativamente a membrana que envolve o ovrio, o que promove a separao dos ovarolos. Segurando o ovrio pelo oviduto interno, traciona-se levemente um ova rolo, com o outro estilete, esticando o seu pedculo. Faz-se a contagem do nmero de dilataes encontradas (Fig. 13.c).

TCNICAS IMUNOLGICAS PARA A DETECO DE INFECO PLASMODIAL EM ANOFELINOS

Esses imunensaios foram desenvolvidos na dcada de 1980, primeiramente por Zavala et al. (1982), com a finalidade de permitir a identificao da espcie de plasmdio que est infectando anofelinos capturados em reas endmicas e testados, distncia, tempos depois de sua coleta.

As tcnicas utilizadas se baseiam na deteco de antgeno correspondente ao epitopo repetitivo da protena CS (circunsporozoto) por anticorpos mono clonais. A protena CS especfica de estgio (esporozoto) e de espcie de plas mdio e, quando presente no extrato do anofelino testado, reage com o anticorpo monoclonal correspondente. Essa reao revelada pelo mesmo anticorpo monoclonal marcado com Iodo125, no caso de radioimunensaio (IRMA), ou por uma enzima, como a peroxidase, no caso de teste imunenzimtico (ELISA). Os anofelinos coletados no campo e destinados aos imunensaios podem ser mortos com vapores de clorofrmio, ter, acetato de etila ou a baixa temperatura e mantidos bem desidratados at a realizao dos testes. Isso pode ser conseguido transferindo-se os mosquitos mortos para frascos contendo camadas sobrepostas de papel filtro, algodo hidrfilo e slica-gel. Pode-se manter os in setos mais protegidos da hidratao, acondicionando esses frascos em desseca dor, bem vedado, contendo slica-gel. H no mercado slica-gel com indicador de umidade, isto , a slica tem cor azul escura quando bem desidratada, tornan do-se rsea ou menos colorida, quando j absorveu muita umidade. Neste caso, melhor trocar a slica ou reaproveit-la, desidratando-a atravs de aquecimento. No se devem colocar muitos mosquitos por frasco (usam-se at 50 exemplares em frasco do tamanho dos empregados para proteger filmes fotogrficos 135 mm). Os anticorpos monoclonais utilizados nos imunensaios aqui descritos so produzidos em hibridomas e os detalhes da sua obteno podem ser conseguidos, por exemplo, em Zavala et al., (1982) e Cochrane et al, (1984). Anticorpos monoclonais contra a protena CS dos plasmdios humanos, e suas variantes, que ocorrem no Brasil, podem ser obtidos no mercado. prefervel submeter aos imunensaios apenas a cabea e a poro anterior do trax do anofelino. Teremos, assim, grande possibilidade de, no caso de um anofelino positivo, estarmos detectando protenas CS procedentes de espo rozotos que se achavam albergados nas suas glndulas salivares. Se incluirmos o abdome do anofelino, onde a maior parte do estmago do inseto est alojada, poderemos detectar protenas CS procedentes de oocistos maduros. E bom lembrar que um anofelino s pode ser incriminado como vetor de malria se for capaz de conduzir esporozotos viveis em suas glndulas salivares.

Radioimunensaio (IRMA)
A marcao dos anticorpos monoclonais pelo Iodo pode ser efetuada de acordo com a tcnica preconizada por Fraker & Speck (1978), ou modificada conforme a seguir: Os anticorpos monoclonais podem ser marcados pelo I125 em pequeno tubo de ensaio de vidro contendo 25|ig de iodogen slido (1,3,4,6-tetracloro-3a,6a-dife nilglicoril, Sigma), obtidos a partir da evaporao (em banho-maria a 37C) de 250]ul de uma soluo de 1 mg de iodogen/ml de clorofrmio, diluda 100 vezes. Cada tubo contendo o iodogen seco recebe 50mg de anticorpo monoclonal, 500mci

de NaI125 e 5ml de tampo fosfato 0,25 M. O tubo deve ser incubado em banho de gelo, no escuro, por 20 min, sofrendo leve agitao a cada 5 min. Essa soluo passada atravs de uma coluna de Sephadex G25, para a separao dos anticorpos marcados com I do radionucldeo livre. A coluna deve ser preparada com 6g/ml de gel, previamente hidratado por trs horas temperatura ambiente, tamizada, desgaseificada, empacotada com 8ml da resina supracitada, em uma pipeta plstica de 10 ml. Aps sua montagem, a coluna tratada com uma soluo de PBS (soluo salina tamponada) com 1% de soro albumina bovina (BSA). A eluio feita com PBS, colhendo-se 15 fraes de 1ml. Uma amostra de 1ml de cada uma das fraes eludas contada em um aferidor de radiao gama. As fraes referentes ao primeiro pico de radioatividade geralmente correspondem quelas contendo anticorpos marcados com I125 e, por isso, devem ser aproveitadas para os testes, ao passo que as demais, contendo quase somente radionucldeo livre, devem ser desprezadas.

PROCESSAMENTO DOS ANOFELINOS Preparao da placa para o teste As placas para o exame dos mosquitos devem ser preparadas de acordo com o protocolo a seguir: a. Adicionar 50ml de uma soluo contendo anticorpo monoclonal numa concentrao de 10mg/ml em PBS, em cada um dos 96 poos com fundo em "U" de uma placa flexvel de polivinil. Incubar a placa durante uma noite (por 12 a 16 horas) temperatura ambiente. Lavar cada poo da placa trs vezes com uma soluo de PBS com 5% de leite em p desnatado ou BSA e incubar na mesma soluo, porm contendo 5% de soro de cabra ou humano normal, por uma hora, temperatura ambiente, a fim de saturar os stios da placa no sensibilizados pelos anticorpos monoclonais na etapa (a). Remover esta soluo de bloqueio (PBS/leite/soro de cabra) exatamente antes da etapa (g) abaixo.

b. c.

d.

Processamento e teste dos mosquitos a. b. Colocar cada anofelino em um poo com fundo em "U" de uma placa rgida de poliestireno (ou em um tubo Eppendorf). Adicionar, em cada poo (ou tubo) contendo mosquito, 50m1 de uma soluo de PBS com 1% BSA, contendo 0,5% do detergente Nonidet P-40 e inibidores de protease [antipaina e leupeptina a uma concentrao final de

c. d.

e. f. g.

h. i. j.

1. m. n.

25mg/ml e aprotinina a uma concentrao final de 1,7 TIU/ml (unidades inibidoras de tripsina)]. Incubar os mosquitos nesta soluo, por uma noite, em freezer -20C, o que facilitar sua fragmentao na etapa (d). Triturar cada mosquito com pequeno pilo apropriado para as dimenses dos poos da placa (ou do fundo do tubo Eppendorf). Para isso, pode-se acoplar uma prola ao pice de um basto, ambos de vidro, ou dilatar a ponta de pipeta Pasteur com calor. Cada anofelino deve ser triturado com um pilo, o qual s deve ser reutilizado aps ser bem lavado e seco. Acrescentar ao extrato do mosquito 130m1 da soluo PBS com 1% de BSA (volume final do extrato de mosquito = 180ml). Misturar bem e deixar sedimentar. Adicionar 30m1 do extrato de cada mosquito em cada um dos poos da placa flexvel preparada no dia anterior. Os 150ml restantes de extrato do anofelino devem ser congelados. Incubar por duas horas temperatura ambiente. Lavar trs vezes com PBS/leite (ou PBS/BSA). Aspirar o PBS/leite e adicionar, imediatamente, 30ml de uma soluo do anticorpo monoclonal marcado com Iodo125 (1x105cpm por poo) em PBS contendo 10% de soro de cabra (ou soro humano normal). Incubar por uma hora temperatura ambiente. Lavar quatro vezes cada poo com PBS contendo 0,05% de Tween 20 (Sigma). Secar bem e contar em contador Gamma.

Em cada radioimunensaio se estar testando o anofelino para apenas uma espcie plasmodial, utilizando-se 30ml do seu extrato. Cada imunensaio requer alguns controles (4-6) negativos (anofelinos nascidos em laboratrio, sabidamente negativos, ou anofelinos infectados com espcie de plasmdio diferente daquela para qual o teste est sendo feito) e positivos (mosquitos com resultado fortemente positivo em ensaios anteriores, suspenso de esporozotos da espcie plasmodial que se pesquisa [obtidos por disseco de anofelinos infectados experimentalmente], ou soluo (at 10mg/ml) de um peptdeo sinttico, contendo quatro ou mais repeties da sequncia de aminocidos correspondente ao epitopo dominante da protena CS da espcie plasmodial que se pesquisa). H vrios critrios para considerarmos um anofelino como positivo em um radioimunensaio. Um deles considerar positivo o extrato do anofelino que apresente contagem maior que o dobro daquela mais alta dentre os controles negativos. Este critrio foi adotado por Cochrane et al., (1984), Arruda et al., (1986) e Subbarao et al, (1988). Contudo, h autores que preferem considerar positivo o anofelino que tiver contagem superior ao resultado da soma de dois ou trs desvios padres mdia dos controles negativos (Oliveira-Ferreira et al., 1990).

ELISA
O processamento dos anofelinos se d de modo muito semelhante ao exposto acima para o IRMA. Preparao da placa para o teste a. Adicionar 50ml de uma soluo contendo anticorpo monoclonal numa concentrao de 10mg/ml em PBS, em cada um dos 96 poos com fundo em "U", ou fundo chato, de uma placa rgida de poliestireno. Incubar a placa durante uma noite (por 12 a 16 horas) temperatura ambiente. Lavar cada poo da placa trs vezes com uma soluo de PBS com 0,5% Nonidet P-40 e incubar com 300ml da mesma soluo, porm contendo 35% de leite em p desnatado (ou BSA), por uma hora, temperatura ambiente, a fim de saturar os stios da placa no sensibilizados pelos anticorpos monoclonais na etapa (a). Remover esta soluo de bloqueio exatamente antes da etapa (g) abaixo.

b. c.

d.

Processamento e teste dos mosquitos a - f. Preparar os anofelinos do mesmo modo citado nas etapas (a) at (f) do item sobre processamento e teste dos mosquitos para o IRMA. Contudo, pode-se aumentar o volume final do extrato do anofelino [item (e) do IRMA] at 300ml utilizando-se PBS/leite, com 0,5% de Nonidet P-40. Adicionar 50ml do extrato de cada mosquito em cada um dos poos da placa preparada no dia anterior. Incubar por duas horas temperatura ambiente. Lavar trs vezes com PBS/0,5% Nonidet P-40. Aspirar o PBS/Nonidet e adicionar, imediatamente, 50ml do anticorpo monoclonal marcado com peroxidase (conjugado), diludo at 1Omg/ml de PBS contendo 3% de leite desnatado. Incubar por uma hora temperatura ambiente. Lavar trs vezes cada poo com PBS contendo 0,05% de Tween 20 (Sigma) ou 0,5% de Nonidet P-40. Adicionar 100ml da soluo substrato (10mg OPD + 25ml Tampo Citrato + lOml perxido de hidrognio) em cada poo). Incubar por uma hora em local bem protegido da luz. Proceder leitura em espectrofotmetro com filtro 405 NM.

g. h. i. j.

1. m. n. o. p.

N u m Elisa, a deciso se um anofelino positivo ou no segue critrios semelhantes aos citados para o IRMA. Dados sobre conjugados e variaes na tcnica podem ser obtidos na seguinte literatura: Burkot et al. (1984), Wirtz et al. (1987), Verhave et al. (1988), Rubio-Palis et al. (1992) e Branquinho et al. (1993).

Recentemente, descobriu-se que o sangue de bovinos e, s vezes de sunos, ingerido por um anofelino no infectado, pode interferir no teste Elisa para pesquisa de protena CS de plasmdios humanos, produzindo resultados falsopositivos (Somboon et al., 1993). Por esse e vrios outros motivos, aconselha-se lanar mo de ambas as tcnicas a tradicional disseco de glndulas salivares e imunensaios (IRMA ou ELISA) quando se planejarem ou levarem a efeito investigaes entomolgicas em reas onde no se conhecem bem os vetores.

TESTES PARA MEDIR A SUSCEPTIBILIDADE DE MOSQUITOS A SUBSTNCIAS INSETICIDAS

Existe uma metodologia padronizada pela Organizao Mundial da Sade (WHO, 1970) que empregada mundialmente para testar a eficcia de substncias inseticidas. utilizada para avaliar inseticidas j comercializados quanto ao aparecimento de resistncia aos mesmos em populaes de mosquitos. Pode ser adaptada para avaliar novos produtos qumicos e/ou biolgicos com eventuais propriedades inseticidas. Resumiremos a seguir a metodologia na sua forma mais clssica. Os testes devem ser realizados em locais abrigados, livres de inseticidas e de extremos de temperatura, umidade, luz e vento.

Adultos
Para os testes envolvendo adultos, so produzidos pela OMS "kits" contendo 20 dispositivos conforme os mostrados na Fig. 41. Um primeiro tubo de material plstico transparente marcado comum ponto verde, forrado com uma folha de papel de filtro (15 x 15 cm) limpa ou impregnada apenas com os solventes utilizados para as substncias a serem testadas, na mesma proporo. Esse conjunto encaixado sobre um dispositivo intermedirio de forma a deixar apenas uma abertura para a insero de um capturador de suco. So colocadas dentro desse tubo 15 a 25 fmeas da populao que se deseja testar, de preferncia recentemente alimentadas em sangue. aconselhvel, antes de prosseguir, aguardar durante uma hora e ento substituir insetos eventualmente danificados. Em outro tubo, similar ao anterior, porm marcado com um ponto vermelho, colocado o papel de filtro impregnado com o inseticida que se deseja testar. Este ltimo acoplado do outro lado do dispositivo intermedirio, abrin do-se totalmente a guilhotina entre eles. Soprando-se, os mosquitos so transferidos para o tubo que contm o inseticida ao qual ficaro expostos. A concentrao do inseticida e o tempo de exposio variam conforme a substncia empregada, devendo ser consultada a bibliografia especfica a cada caso (AMCA, 1976; WHO, 1970; WHO, 1976). Para cada concentrao ou tempo de exposio o teste dever ser repetido idealmente em 4 rplicas e contar com um igual nmero de controles. Aps o tempo de exposio, os mosquitos sobreviventes so novamente transferidos da mesma forma, soprando-se no sentido inverso para o tubo inicial.

A seguir, o tubo com o inseticida desconectado, mantendo-se os mosquitos por 24 horas em ambiente com temperatura no superior a 30C. Colocase sobre o tubo em observao um chumao de algodo mido. Decorrido esse prazo, contam-se os mosquitos mortos, considerando-se como tais todos aqueles incapazes de andar. Se a mortalidade nos tubos controles ultrapassar os 20%, todo o teste deve ser repetido; se a mortalidade nos controles estiver entre 5% e 20%, as percentagens devem ser corrigidas pela frmula de Abbott:

% mortalidade no teste % mortalidade no controle x 100 100 % mortalidade no controle

Com as percentagens de mortalidade obtidas pode-se construir uma linha de regresso em papel "log-probit", encontrando-se por interpolao as concentraes letais (CL = LC: letal concentraton) correspondentes a 50% e 90% (CL50 e CL90), parmetros usuais na medida da eficcia de substncias inseticidas (Fig. 42). Os mesmos clculos podem ser realizados em computador por diversos programas estatsticos.

Larvas
As larvas devem ser de 3 ou de 4 estgio, jovens, minimizando-se assim a possibilidade de pupao durante o teste. Tambm aqui, devem ser feitas preferencialmente 4 rplicas para cada tempo de exposio ou de concentrao de substncia inseticida utilizada. Para cada rplica so coletadas 20 ou 25 larvas da mesma espcie, por pipetagem direta, em um recipiente preliminar, onde so lavadas com cuidado. A seguir, pode-se remov-las da gua por filtrao (Fig. 43) e pass-las, invertendo o papel diretamente para o recipiente-teste, evitan do-se assim grandes diferenas de tempo entre o preparo da primeira e da ltima amostra. O recipiente pode ser u m copo de material plstico descartvel que conter em geral, 250 ml de uma soluo da substncia a ser testada. Substncias no hidro-solveis podem ser inicialmente dissolvidas em pequenas quanti

dades de etanol ou outros solventes para posterior dissoluo em gua. Deve-se verificar, entretanto previamente, a inocuidade do solvente na concentrao empregada, devendo o mesmo estar presente tambm nas rplicas do controle. Substncias que formem pelculas sobre a gua no devem ser testadas dessa maneira, pois podem afetar mecanicamente a respirao larvria, e dessa forma invalidar os resultados. Como solvente pode ser utilizada gua destilada ou desclorada. Durante o experimento, a temperatura da gua deve manter-se entre 20 e 30C, preferencialmente prximo aos 25C (Fig. 44). Aps 24 horas so contadas as larvas mortas, sendo consideradas como tais todas aquelas incapazes de alcanar a superfcie. As larvas que puparam devem ser excludas da computao dos resultados e se isso ocorreu com mais do que 10%, o teste ter que ser repetido. O mesmo acontecer se a mortalidade no controle ultrapassar os 20%. O tratamento dos resultados para obteno das CL50 e CL90 ser similar quele utilizado para os adultos.

CRIAO DE CULICDEOS
O estabelecimento de colnias de culicdeos em laboratrio feita com muitas finalidades, tais como estudos de biologia (comportamento, fisiologia, gentica, citologia etc), infectividade com diversos patgenos e susceptibilidade a possveis agentes de controle: qumicos, fsicos ou biolgicos. Em AMCA (1970), encontram-se descritos e referidos processos diferenciados para a criao de 95 espcies de mosquitos, pertencentes a 18 gneros. Descreveremos, a seguir, apenas as normas gerais para a manuteno de colnias de mosquitos estengamos, com referncia especial a algumas espcies. Espcies eurgamas, tais como grande parte dos mosquitos dogneroAnopheles neotropicais, possuem em geral exigncias complexas, principalmente quanto s condies de acasalamento. Populaes limitadas podem ser mantidas com a utilizao de tcnicas de fecundao artificial (veja item "Colonizao: An. dea neorum e outros Nyssorhynchus", p.(194) e Arruda et al., 1982).

Algumas consideraes ticas e medidas de segurana

Embora espcies de mosquitos no vetoras de doenas e aquelas com um potencial muito reduzido de se tornarem vetores possam ser colonizadas de maneira razoavelmente despreocupada, a justificativa para a criao de mosquitos

transmissores de patgenos em reas potencialmente endmicas, especialmente se exticas, deve ser cuidadosamente avaliada. Tais colnias devem ser preferencialmente evitadas. De forma alguma devem ser mantidas espcies vetoras previamente inexistentes no Brasil, mesmo que em pequeno nmero e por tempo limitado. A responsabilidade tica do entomologista nesses casos similar quela do bacteriologista que cultiva agentes patognicos (AMCA, 1970). A criao de potenciais vetores, quando inevitvel, demanda medidas adicionais de segurana: - As janelas no insetrio, se existentes, devem ser permanentemente vedadas. - Deve haver somente uma porta de acesso ao insetrio, sendo o mesmo precedido por uma antecmara, internamente pintada de branco, vazia e bem iluminada e provida de uma porta, a qual, como a outra, deve vedar perfeitamente qualquer abertura. - Cada pessoa ao deixar o insetrio dever examinar cuidadosamente a antecmara e eliminar todos os mosquitos eventualmente encontrados. - Filtros ou telagens especiais devem ser instalados nos condicionadores de ar. - A gua que drenada pelas pias, ralos etc, deve passar por reservatrios nos quais sejam colocados inseticidas regularmente. - As larvas devem ser criadas em recipientes cobertos com tela. - As pupas devem ser removidas diariamente e colocadas dentro de gaiolas para a emergncia. - Os animais para a alimentao sangunea das fmeas devem ser colocados sobre as gaiolas teladas e no dentro delas. - A manga que d acesso gaiola de adultos deve ser provida de elstico, de forma a aderir ao brao quando seja necessrio manipular utenslios dentro das gaiolas. - Deve-se treinar o pessoal tcnico no sentido de capturar imediatamente qualquer mosquito solto no insetrio. - Espalhar, num raio de 1000 m em torno do insetrio, armadilhas de oviposi o adequadas espcie em questo, controlando-as semanalmente.

O insetrio normas gerais

E essencial que seja estabelecido em uma sala na qual haja possibilidade de um bom isolamento trmico e de umidade. Uma ante-sala, que poder servir para o armazenamento de materiais utilizados no prprio insetrio, til como zona-tampo para a manuteno das condies climticas dentro do insetrio. O ideal que este no possua janelas, fazendo-se a ventilao por condicionadores de ar, mas se janelas estiverem presentes, devem ser pequenas e sempre teladas e bem vedadas. Toda a superfcie interna do insetrio deve possuir revestimento claro e lavvel, como azulejos ou pintura com tinta a leo branca e piso de cermica clara ou de materiais sintticos. As portas devem ser claras e tm que possuir ajuste perfeito, sem frestas. Deve haver um mnimo de duas pias, uma delas com torneira ligada a um reservatrio de gua desprovida de cloro.

CONTROLE DE TEMPERATURA E UMIDADE So fatores essenciais para uma colnia bem-sucedida, que possa apresentar um rendimento uniforme. Deve existir permanentemente dentro do inse trio um termmetro para medidas mximas e mnimas dirias e um higrmetro. Existem, tambm, sistemas de climatizao industriais que podem ser instalados, mantendo a temperatura e a umidade desejadas. Para a maioria dos mosquitos neotropicais esses valores se situam entre 26 a 28C e 70 a 80% de umidade relativa do ar. Na maioria das regies do Brasil, onde os extremos de temperatura so raros, podem-se obter resultados bastante satisfatrios com a utilizao de aquecedores eltricos, aos quais termostatos podem ser acoplados. A umidade pode ser aumentada com o uso de vaporizadores. Em insetrios bem isolados, esses ltimos podem tornar-se suprfluos devido existncia das numerosas superfcies aquticas formadas pelos recipientes com larvas, que por vezes fornecem a umidade desejada. Se necessrio, pode-se estender camadas de algodo ou gaze midas sobre as gaiolas contendo insetos adultos, para aumentar a umidade, tendo o cuidado de renovar essa cobertura com frequncia. LUMINOSIDADE A intensidade luminosa e a durao dos perodos de luminosidade afe tam o desenvolvimento dos mosquitos. Perodos de 14 horas de luz e 10 horas de escurido parecem ser os mais adequados a um grande nmero de espcies (AMCA, 1970). O controle dos fotoperodos pode ser conseguido com a instalao de um aparelho do tipo timer na rede eltrica.

Manuteno de adultos
Os insetos adultos devem ser transferidos para gaiolas apropriadas, das quais existem vrios tipos, tamanhos e materiais (madeira, metal, Eucatex, papelo grosso etc). Gaiolas cbicas de acrlico transparente (40 x 40 x 40 cm), com cantos arredondados, possuindo 3 faces teladas e a face superior em forma de tampa removvel (Fig. 45) mostram-se muito satisfatrias quanto visibilidade, facilidade de limpeza e dificuldade de instalao de fungos e aranhas. As mangas, de tecido de nilon, so igualmente removveis. possvel conseguir o acasalamento de espcies estengamas em espaos menores, mas para uma criao em massa isso implica em aumento de trabalho e muitas vezes em menor rendimento. Quando o fundo da gaiola forrado por uma folha de papel de filtro a remoo dos insetos mortos grandemente facilitada. Dentro de cada gaiola colocado um recipiente para a alimentao aucarada, contendo uma soluo de 10% de mel em gua destilada, em contato com tiras de papel de filtro que devem permanecer sempre midas (Fig. 46). Em lugar de mel tm sido usadas tambm glicose, sacarose, frutose e outros carboidratos, passas, bananas, mas e mesmo acar slido (Eliason, 1963). Essas fontes alimentares devem ser mantidas permanentemente dentro das gaiolas e devem ser diariamente renovadas. A alimentao sangunea deve ser administrada de acordo com as preferncias alimentares e o horrio de alimentao natural dos mosquitos emprega

dos. Podem-se usar animais imobilizados ou anestesiados, tais como camundongos, ratos, cobaias, pintos, codornas etc. Em algumas situaes, a alimentao em sangue humano pode ser necessria nesse caso, o pesquisador deve certificar-se da ausncia de risco de transmisso de qualquer agente patognico por parte das fmeas que o picarem, bem como da ausncia de reaes alrgicas de sua parte. A alimentao sangunea artificial de mosquitos atravs de membrana em sangue citratado possvel em muitos casos (Rutledge et al., 1964).

Manuteno dos ovos

Os mosquitos depositam seus ovos em superfcies lquidas ou posteriormente inundveis. Para se obter ovos em laboratrio necessrio oferecer um meio que substitua adequadamente os criadouros da espcie em questo. MOSQUITOS QUE DESOVAM NA GUA Recipientes de vidro, material plstico, cermica ou esmaltados, contendo gua, devem ser colocados dentro das gaiolas contendo as fmeas grvidas. aconselhvel, para obter um bom rendimento e facilitar o manejo, que a superfcie lquida tenha no mnimo 30 cm e a profundidade no seja inferior a 2 cm. As caractersticas qumicas da gua devem ser compatveis com a oviposio da espcie (por exemplo, h espcies compatveis e incompatveis com a presena de salinidade mesmo baixa na gua). Recipientes escuros so mais atraentes para muitos mosquitos, assim como a gua na qual estiveram as formas imaturas da sua espcie; a adio de vrios tipos de matria orgnica pode ainda propiciar a oviposio (Fay & Fay, 1965; Ikeshoji & Mulla, 1970; Consoli & Teixeira, 1988). A oviposio pode ser tambm induzida pelo traumatismo, isto , fmeas cujo perodo de gravidez tenha terminado (geralmente 3 dias), ovipem, prontamente, se as anestesiamos ligeiramente com acetato de etila, arrancamolhes uma das asas e as colocamos sobre a superfcie da gua (Lanzaro et al., 1988). Quando mosquitos que habitualmente desovam na gua passam a faz-lo em superfcies midas, tais como o papel de filtro que contm o alimento aucarado, algum fator muito desfavorvel deve estar presente na gua oferecida para a oviposio. Os ovos podem ser facilmente transferidos para outros recipientes com auxlio de pedaos de papel de filtro. MOSQUITOS QUE DESOVAM EM SUPERFCIES SLIDAS A forma mais comum de se obter ovos dessas espcies oferecer-lhes recipientes com 10 a 15 cm de altura, revestidos internamente com uma superfcie rugosa, como papel de filtro ou papel corrugado e em cujo fundo haja cerca de 3 cm de gua, para se manter o papel mido. Em lugar destes, outros materiais rugosos e absorventes podem ler utilizados, tais como esponjas, materiais plsticos porosos, cermica ou algodo. Frequentemente tais ovos precisam passar por um perodo de "condicionamento" aps a postura, isto , devem permanecer

nos seus substratos midos por um ou mais dias antes de serem submetidos secagem. Aps a secagem, esses ovos podem ser armazenados por perodos variveis.

Ecloso larvria
As larvas de espcies que ovipem diretamente na gua eclodem, em geral, dentro de 2 ou 3 dias. As larvas de ovos dessecados, por vezes necessitam de gua com baixo teor de oxignio dissolvido para eclodir (Burgess, 1959).

Manuteno das larvas

As larvas recm-eclodidas devem ser colocadas em recipientes apropriados para o seu desenvolvimento. Tais recipientes podem ser de material plstico, vidro, esmaltado ou ao inoxidvel, devem possuir uma ampla rea de superfcie, mas que no sejam demasiadamente fundos. Bandejas similares s utilizadas em laboratrios fotogrficos tm sido utilizadas com sucesso para numerosas espcies. Bandejas brancas ou de colorao clara facilitam o manejo. Inmeros meios nutritivos j foram descritos para diferentes espcies de mosquitos. Asahina (1964) faz uma reviso de muitos deles. Espcies diferentes podem adaptar-se melhor a formulaes especficas. Temos obtido bons resultados na criao de vrias espcies, utilizando rao para camundongos ou gatos, em que se pode agregar um pouco de esterco bovino, ambos finamente peneirados e esterilizados. Larvas que se alimentam predominantemente na superfcie da gua, como a maioria dos Anophelinae, devem receber alimento seco, pulverizado sobre a superfcie. Para as espcies que preferem alimentar-se no fundo, como muitos Culicinae, o alimento deve ser previamente molhado para ir ao fundo. Embora as larvas sejam capazes de nutrir-se raspando superfcies, a maioria das partculas deve ser suficientemente pequena para serem diretamente ingeridas. Desta forma no contribuiro para a poluio da gua. A esterilizao prvia do alimento aconselhvel para evitar a introduo de microorganismos patognicos s larvas, particularmente fungos e bactrias dogneroBacil lus. Existem vrios sistemas descritos para distribuir as quantidades de alimento ao longo do desenvolvimento larvrio (Morland et al., 1963; Gerberg et al., 1968). Costumeiramente, so consumidos entre 3 a 6 mg de alimento por larva durante todo o seu desenvolvimento. Para minimizar os problemas causados pela poluio da gua ao longo do desenvolvimento, pode-se renov-la continuamente, por um processo de gotejamento e drenagem (Fig. 47) ou atravs de lavagens peridicas (em geral a cada 3 dias). O risco de formao de pelculas na superfcie pode ser adicionalmente prevenido, colocando-se uma bomba de ar, (similar quelas utilizadas em aqurios) dentro do recipiente de criao das larvas. Deve-se no entanto estar atento para no agitar a superfcie da gua de tal forma que as larvas encontrem dificuldade em permanecer nela. Pode-se ainda remover periodicamente a pelcula que se forma na superfcie, aderindo mesma uma folha de papel absorvente por alguns instantes.

Manuteno das pupas

As pupas devem ser retiradas diariamente dos recipientes, manualmente com pipetas ou pequenas peneiras ou, ainda, mecanicamente com auxlio de uma bomba de vcuo cuja presso esteja suficientemente baixa para no prejudicar os insetos colhidos. Nas criaes em massa, a avaliao diria do nmero de pupas pode ser feita por um dispositivo semelhante ao descrito na Fig. 36, para a avaliao do nmero de larvas. A verificao diria do nmero de pupas importante para a percepo de quaisquer flutuaes no rendimento da col nia. Vrios autores descreveram dispositivos mecnicos para separar as pupas maiores, que originaro fmeas, das menores, que originaro os machos (Fay e Morland, 1959; McCray, 1961). Essas diferenas de tamanho no so uniformemente conspcuas em todas as espcies de mosquitos.

Manejo de colnias acidentalmente contaminadas por microorganismos e preveno

A contaminao acidental de colnias de mosquitos pode ocorrer atravs da gua utilizada, alimento no esterilizado e utenslios contaminados. Formigas e baratas tambm podem veicular mecanicamente esses agentes infecciosos. A mortalidade exagerada de insetos, principalmente na fase larvria, o seu principal sintoma. Para a identificao especfica desses microorganismos geralmente necessrio um especialista, embora um guia publicado pela OMS (WHO, 1982) fornea algumas diretrizes bsicas. Como medidas prticas para eliminar a contaminao sugerimos: 1. Verificar a possibilidade de ser a gua a fonte de contaminao. Em caso positivo, mudar a fonte de obteno de gua, desinfetar eventuais reservatrios e / o u filtr-la. A adio de algumas gotas de tintura de iodo gua utilizada, pode produzir bons resultados, desde que seja previamente ensaiada a tolerncia mesma, pelas larvas da criao. Ae. fluviatilis suporta bem 6 gotas/1 de uma tintura de iodo a 6%. Separar algumas gaiolas para adultos, lav-las muito bem e repovo-las apenas com novas pupas. Todos os utenslios usados nessas gaiolas devem ser esterilizados ou lavados em soluo sulfocrmica, por pelo menos 24 horas. Eliminar as larvas das bandejas contaminadas e esteriliz-las ou lav-las em soluo sulfocrmica. Utilizar uma pipeta estril para retirar as pupas de cada bandeja, eliminando todas as larvas to logo apaream sinais de contaminao. Prevenir novas contaminaes desinfetando ou esterilizando periodicamente todo o material empregado.

2.

3. 4. 5.

Colonizao de algumas espcies de mosquitos

Culex quinquefasciatus Say, 1823

Os ovos so depositados durante a noite diretamente na gua formando "jangadas". Recipientes escuros so mais atraentes para as fmeas que ovipem do que recipientes claros (Jobling, 1935), assim como a gua na qual estiveram larvas, pupas ou ovos (Hudson, 1956; Consoli & Espnola, 1973; Bruno & Lauren ce, 1979). As desovas devem ser transferidas para os recipientes onde sero criadas as larvas, devendo ser usada gua sem cloro. A ecloso ocorre aps aproximadamente 30 horas temperatura de 26 a 27C. As larvas podem ser alimentadas com a rao anteriormente descrita. Seu manejo no difcil, mas deve-se estar atento superpopulao e ao excesso de poluio, ambas prejudiciais ao desenvolvimento. As pupas devem ser retiradas diariamente e colocadas nas

gaiolas onde eclodiro os adultos. A alimentao aucarada pode seguir os padres anteriormente descritos. Para a alimentao sangunea sugere-se a colocao durante a noite de uma gaiola de arame, do tipo utilizado para transporte de pequenos pssaros, contendo uma ou duas codornas s quais tenha sido parcialmente cortada a plumagem da cabea e dorso. No h necessidade de anestesi-las ou cont-las de qualquer outra forma. Pintos ou pombos podem substituir as codornas, embora isto seja geralmente mais trabalhoso. desnecessrio oferecer hospedeiros durante o dia, pois a hematofagia noturna marcante nessa espcie, a menos que o ambiente seja escurecido. Alguns autores sugerem, para melhores resultados, a remoo da alimentao aucarada 24 horas antes do oferecimento do repasto sanguneo (AMCA, 1970). Aedes fluviatilis Lutz, 1904 Essa espcie neotropical, domstica ou semidomstica em muitas regies do Brasil, no tem sido implicada na transmisso de doena em condies naturais. Constitui, assim, um excelente modelo experimental, podendo, em muitos casos, ser criada em substituio a Ae. aegypti ou Ae. albopictus, sem os riscos que a colonizao destes envolve. Os ovos so depositados diretamente na gua de forma isolada, devendo ser utilizada gua desclorada. Recipientes escuros ou com reflexo dourado e gua que conteve larvas ou pupas so especialmente atraentes para as fmeas. Os ovos so transferidos com papel de filtro preferencialmente para bandejas claras de material plstico, contendo gua desclorada onde sero criadas as larvas. A alimentao larvria pode seguir o padro geral descrito, devendo-se evitar cuidadosamente a formao de pelcula e o excesso de poluio, trocando e aerando a gua com frequncia. As pupas recolhidas diariamente so colocadas dentro das gaiolas para adultos, onde a maioria eclodir 2 dias depois. Quanto alimentao sangunea, essa espcie muito voraz e antropoflica, sugando principalmente de dia, mas tambm noite. Pode-se adapt-la a diversos hospedeiros, tais como camundongos anestesiados colocados sobre a tela da gaiola durante cerca de 2 horas, durante o dia. Fmeas que j sugaram sangue em dias anteriores muitas vezes voltam a sugar nos dias subsequentes mesmo sem terem desovado, mas tais repastos adicionais no aumentam c nmero de ovos produzidos. Assim uma oportunidade semanal de repasto sanguneo suficiente para cada gaiola (Consoli & Williams, 1978; Consoli & Williams, 1981; Consoli et al, 1981; Consoli, 1982; Consoli et al, 1983; Consoli & Teixeira, 1988; Consoli et al., 1988b).
Aedes aegypti Linnaeus, 1762

A colonizao dessa espcie no deveria ser feita no Brasil a no ser com excepcionais justificativas e medidas de segurana. O fato de j existirem populaes em nosso meio no justifica o risco de, eventualmente, contribuirmos para o acrscimo e/ou disseminao de linhagens, s quais poderiam contribuir para a sua maior plasticidade populacional. Os ovos so depositados em superfcies inundveis, por isso devem ser colhidos da maneira anteriormente descrita. O perodo embrionrio completa-se em poucas horas e, assim, aps uma per

manncia por cerca de 24 horas em "condicionamento" nos recipientes onde foram postos, o substrato (em geral, papel de filtro) pode ser removido e secado por 4 dias temperatura de 26 a 27 C e 80% de umidade relativa do ar. Os ovos podem ser posteriormente armazenados por pelo menos um ano. Para promover a ecloso larvria, os ovos devem ser colocados em gua desoxigenada temperatura de 27C. A ecloso deve ocorrer entre 5 a 60 minutos. As larvas devem ser criadas em bandejas pouco profundas e com ampla rea de superfcie, considerando-se em mdia a populao de 1 larva/ml como adequada (AMCA, 1970). A mesma associao recomenda a alimentao das larvas com rao para ces (Purina) pulverizada, conforme o seguinte esquema de distribuio:

As pupas so separadas das larvas e podem ser divididas conforme o sexo do adulto que originaro (McCray, 1961). At 2000 pupas podem ser colocadas em gaiolas cbicas de 30 cm de lado, sendo adequadas propores de 3 fmeas/l macho. Para alimentao aucarada, pode-se utilizar sacarose a 10% em chumaos de algodo trocados diariamente. Cobaias e coelhos anestesiados ou imobilizados com o dorso depilado so as fontes de repasto mais comuns. Em geral, usa-se um repasto por semana (Christophers, 1960). Aedes albopictus Skuse,1894 Os mesmos cuidados recomendados para o estabelecimento de colnias de Ae. aegypti devem ser observados na criao dessa espcie extica. A mesma metodologia descrita para Ae. aegypti pode ser aplicada aqui (Halcrow, 1955; Del Rosrio, 1963; AMCA, 1970). Klowden & Chambers (1992) assinalaram que em comparao com Aedes aegypti essa espcie desenvolve ovos mais facilmente com pequenos repastos sanguneos, resiste mais tempo falta de alimento na fase adulta e sua maior eficincia reprodutiva poderia, talvez, ser atribuda ao maior acmulo de reservas durante a fase larvria.

Anopheles deaneorum Rosa-Freitas, 1989 e outros Nyssorhynchus At quanto sabemos, a colonizao dos anofelinos brasileiros do subgnero Nyssorhynchus dificultada pelo comportamento eurigmico exibido por nossas espcies. Isto , os nossos Nyssorhynchus, inclusive An. deaneorum, no so capazes de copular em gaiolas como as usadas na criao dos Culicneos, descritas acima. Para superarmos esta dificuldade necessitamos lanar mo da tcnica de cpula forada ou artificial, descrita a seguir, de acordo com Ow Yangetal.(1963). a. Machos com idade em torno de 3 dias (3 ou 4 dias para An. deaneorum; de 3 a 8 para An. albitarsis), sempre mantidos com alimentao aucarada, so rapidamente anestesiados com vapores de acetato de etila (no mximo por 8 a 10 segundos). Antes que os machos se recuperem da leve anestesia, transpassa-se o seu trax, lateralmente (aproximadamente, mas no obrigatoriamente, no meio do mesocatepisteno) com um estilete (um microalfinete fixado ponta de uma haste de madeira) (Fig. 48.a). Deixar os machos presos aos microalfinetes, em repouso, at que se recuperem completamente da anestesia (Fig. 48.b). A recuperao evidenciada pela agitao enrgica das pernas e asas diante de estmulos, como leves sopros ou toques em suas pernas. Isso leva cerca de 5 minutos para acontecer. Arrancar, com cuidado, todas as patas e a cabea dos machos recuperados da anestesia (restam apenas o trax, com as asas, e o abdome presos ao estilete) (Fig. 48.c). Fmeas com idade em torno de 3 dias (mas podem ser usadas fmeas com 2 a 6 dias, ou mais), aps um perodo de seis horas de completo jejum (inclusive de alimentao aucarada), so alimentadas com sangue at a repleo. Fmeas mal alimentadas com sangue geralmente no produzem ovos. A alimentao sangunea pode ser feita no mesmo indivduo que executa a tcnica (enquanto prepara os machos) ou em animal de laboratrio. Anestesiar as fmeas bem alimentadas, preferencialmente de duas em duas, com vapores de acetato de etila (20 a 30 segundos). Deitar as fmeas anestesiadas em decbito dorsal, em uma rodela de papel filtro, com o eixo longitudinal de seu corpo perpendicular ao indivduo que executa a tcnica, porm com o pice do abdome na direo oposta (Fig.48.d). Friccionar o pice do abdome (genitlia externa) de um macho (preparado no item d) ao pice do abdome de uma fmea (preparada no item g). Isto deve ser feito com o eixo longitudinal do corpo do macho em ngulo reto, ou quase reto, com o do corpo da fmea (obviamente com a face ventral do macho voltada para o indivduo que executa a tcnica) (Fig. 48.e). Africodeve ser feita suavemente, como se estivssemos pincelando lentamente os ester nitos VII e VIII com a genitlia externa do macho, sempre no mesmo sentido, isto , do esternito VII para o pice. Essa operao deve ser executada vrias vezes, utilizando-se uma lupa (estereoscpio).

b.

c.

d.

e.

f. g.

h.

i.

j.

Quando o macho est saudvel e apto para a cpula, ele abre seus gono coxitos e gonostilos no instante em que sua genitlia toca na da fmea. Neste momento, a genitlia do macho prende a fmea pelo final do abdome, como um frceps. Para se certificar de que a cpula est sendo bem sucedida, suspende-se o es tilete onde o macho est preso at uma altura de aproximadamente 5 cm (Fig. 4S.f). Se os anofelinos estiverem copulando, o macho ser capaz de manter a fmea suspensa por alguns segundos. As operaes (h), (i) e (j) devem ser repetidas na mesma fmea, por trs vezes, utilizando-se o mesmo macho ou no, de modo a assegurar a fecundao.

Cada macho (preparado no item d; Fig. 48.c) pode copular seis vezes, ou mais. De modo geral, empregamos um macho para fecundar duas fmeas, fa zendo-se com que ele copule trs vezes com cada uma. As fmeas devem ser copuladas j ingurgitadas com sangue. A anestesia pelo acetato de etila tende a inibir a fome. A cpula artificial se faz mais facilmente em ambiente com temperatura baixa (23 a 24C). As fmeas copuladas (item j) devem ser mantidas com alimentao aucarada durante trs dias. Ento, podemos lhes oferecer local para a desova ou lhes forar a oviposio segundo a tcnica de Lanzaro et al. (1988) (ver item "Mosquitos que desovam na gua" p.(187)). As larvas de An. deaneorum e de outros Nyssorhynchus eclodem em dois dias (no mximo trs). As larvas eclodidas so transferidas para os recipientes apropriados para o seu desenvolvimento. Em geral, se usam cubas redondas, esmaltadas ou de plstico, de cor branca, com 15 a 20 cm de dimetro e 4 a 6 cm de profundidade. A manuteno das larvas de alguns Nyssorhynchus beneficiada colocando-se um ramo de planta aqutica (Elodea ou Pistia) no recipiente de criao. Essas plantas devem ser, prvia e cuidadosamente, lavadas em gua corrente, para evitar a introduo de patgenos ou de predadores na cuba de criao. Recomendamos fazer flutuar na superfcie da gua pequenos tringulos equilteros (4 cm lado), feitos com pedao de canudo de plstico (dos que se usam para tomar refrigerantes), dobrados sobre si mesmos e com as pontas conectadas. Os tringulos e as plantas oferecem maior substrato para que as larvas neles se encostrem e repousem enquanto se alimentam e respiram na superfcie. O alimento das larvas deve ser pulverizado sobre a superfcie da gua, em quantidades pequenas, porm crescentes, de acordo com os estgios de desenvolvimento. Usa-se rao para peixe ( base de farinha de peixe) ou diferentes frmulas (ver item "Manuteno das larvas" p.(188)), dentre as quais desta cam-se aquelas base de farinhas (uma parte de farinha de peixe: uma de farinha de po: duas de germe de trigo; ou apenas uma parte de farinha de peixe: duas de germe de trigo). Em todos os casos, as raes devem ser bem trituradas, peneiradas e, se possvel, autoclavadas. O excesso de comida na cuba, correspondendo geralmente sujeira sedimentada, deve ser recolhido, diariamente, com uma pipeta. Dependendo da

quantidade ou/e qualidade da rao usada, no basta pipetar a sujeira do fundo, necessitando-se trocar totalmente a gua da cuba de criao. A gua da cuba deve estar sempre translcida, com aspecto de lmpida. Se ela turvar, ou aparecer uma espcie de gosma viscosa no fundo da cuba, sinal de que chegou o momento de trocar totalmente a gua. Os demais cuidados com as larvas e pu pas so os sugeridos nas pginas 188 a 190. O desenvolvimento das larvas de An. aquasalis beneficiado se as criamos em gua dotada de certa salinidade (0,5% de gua do mar). Os adultos de Nyssorhynchus so alimentados, desde a emergncia, com alimentao aucarada (ver item "Manuteno de adultos", p.(185)). Dados adicionais sobre a colonizao de An. deaneorum, An. albiartsis e An. aquasalis podem ser obtidos em Arruda et al., (1982) e Klein et al., (1990).