CAPITULO II

MTODOS UTILIZADOS EN EL LABORATORIO DE ANLISIS CLNICO (LAC) TURBIDIMTRICOS NEFELOMTRICOS ESPECTROFOTOMTRICOS ABSORCIN POTENCIOMETRA COLORIMETRA ELIZA ENZIMTICOS Y CINTICOS UNIDADES DE REPORTE

CLASIFICACIN DE LAS TCNICAS Y MTODOS INSTRUMENTALES 1.- POR LA SEAL DETECTADA

Mtodos y Tcnicas

EMISIN

Espectroscopia de emisin ultravioleta (UV) Fluorescencia X, UV y/o V Fosforescencia X, UV Espectroscopia de absorcin, X, UV, V Infrarrojo (IF) Resonancia magntica nuclear (RMN) Fotometra Espectroscopa Raman Turbidimetra Nefelometra

ABSORCIN

RADIACIN
DISPERSIN

ELCTRICA

RESISTENCIAL POTENCIAL

Conductometra Potenciometra

VELOCIDAD DE REACCIN

Cintica de reacciones

2. TIPO DE MEDIDA
NICA (Medida puntual) DOS ( 2 medidas) VARIAS (Variacin de medidas con el tiempo) DIRECTAMENTE EL ANALITO PRESENCIA O AUSENCIA CONCENTRACIN (Curvas de calibracin) Punto Final 2 Puntos Cintico Directo e Indirecto Cualitativo y Cuantitativo Aproximado (semi cuantitativo) Exacto (cuantitativos)

3. TIPO DE REACTIVO ENZIMAS Enzimtico

4. TIPO DE MUESTRA Problema Referencia

5. OTROS

Analtico Control de Calidad

Patrones = Mtodo de adicin de patrn interno Mtodo de la recta de calibracin TURBIDIMETRA Es una tcnica analtica que se utiliza para el anlisis cuantitativo y cualitativo de las suspensiones coloidales, precipitados, emulsiones, humos o nieblas. Se fundamenta en la observacin del decrecimiento de la intensidad que sufre un rayo de luz al atravesar una disolucin coloidal, debido a su dispersin. La intensidad de radiacin bloqueada por la muestra es directamente proporcional a la concentracin del analito En ste mtodo podemos apreciar la cantidad de sustancia existente en una suspensin por la disminucin de la intensidad de la luminosidad de un haz que la atraviesa Generalmente, la turbidimetra se utiliza en el anlisis de la calidad qumica del agua para determinar la claridad y para determinar el control de los procesos de tratamiento, para ste mtodo se utiliza un instrumento llamado turbidmetro.

NEFELOMETRA La nefelometra se base en la medicin de radiacin dispersa que permite determinar con bastante aproximacin el nmero de partculas dispersas en el lquido investigado, en ste mtodo utilizamos un nefelmetro que tambin mide la turbidez Si al principio la muestra es transparente ptimamente y tras la aplicacin de los reactivos aparecen las partculas en suspensin, para ajustar el espectrofotmetro se emplea generalmente un blanco muestra. Generalmente, la Nefelometra se utiliza para la medicin de transparencia de bebidas, productos farmacuticos, aguas residuales, fluviales y en refineras de petrleo

Diferencias y Semejanzas entre los dos mtodos El instrumento usado en la nefelometra es el nefelmetro en cambio en turbidimetra es el turbidmetro que es un fotmetro de filtro. El coste es menor en turbidimetra y en nefelometra es mayor la inversin La Nefelometra se basa en la medicin de radiacin dispersa en cambio la turbidimetra en la medicin de la intensidad de un haz disminuido. Los mtodos turbidimtricos son similares a los colorimtricos (se basan en la medicin de luz transmitida y los mtodos nefelomtricos son parecidos a los flourimtricos.
4

 En la aplicacin clnica se utiliza la nefelometra en la determinacin del Ca y la turbidimetra en la determinacin de protenas. Las dos tcnicas miden turbidez Utilizan la misma longitud de onda 320 y 380 nm y desde 500 a 600 nm La eleccin entre uno de ambos mtodos reside en la dispersin de luz, si es extensa, es apropiado aplicar la turbidimetra, en cambio si es mnima es apropiada la nefelometra, de sta tcnica se obtienen mejores resultados porque determina concentraciones muy pequeas (ppm), con una precisin del 1al 5 %.

ESPECTROFOTOMTRICOS Son aquellos que sirven para medir absorbancia y consiste en hacer reaccionar la sustancia sea metabolito o anabolito con el reactivo de color o de trabajo, hacindolo reaccionar por un tiempo determinado y a una temperatura determinada para que nos de un complejo coloreado, la intensidad de ste complejo determinado es proporcional a la concentracin de la sustancia anabolito o metabolito que estamos analizando TRANSMITANCIA (T).- Es la cantidad de luz que deja pasar y es igual a la intensidad de la luz de salida (I 1) dividida para la intensidad de la luz de entrada (I0) y sus valores se expresan en porcentajes. Por ejemplo si la Intensidad de la luz de entrada I 0 (500) y la Intensidad de la luz de salida I1 es (200) T = I1 (Intensidad de la luz de salida) x 100% I0 (Intensidad de la luz de entrada) T= 200 500 T = 0.4 x 100% x 100% = 40%

ABSORBANCIA (A).- Denominada tambin densidad ptica (DO) o extincin, es la cantidad de radiacin absorbida y es igual al logaritmo negativo de la transmitancia.

A = log

1 T

- logT

= - log I1 I0

= log I0 I1

A= log I0 I1 La transmitancia va de 0 a 100 % La absorbancia va de a 0 LEY DE LAMBERT- BEER Segn el resultado de la combinacin de stas dos leyes absorcin nos indica: La relacin directamente proporcional que existe entre absorbancia de una muestra y su concentracin. de la

Lo que quiere decir que mientras ms alto sea la absorbancia mayor es la concentracin y mientras menor sea la absorbancia menor es la concentracin. Por consiguiente en la grfica siempre no dar una lnea recta. A=E.b.c A= E= b= C= Absorbancia Epsilon= coeficiente de absorbancia molar Espesor de la cubeta expresado en cm Concentracin expresada en moles /L

La mayor parte de los espectrofotmetros utilizan una cubeta de espesor 1 cm. A

( C) Sustancia + Reactivo de color t T0

6

= Complejo coloreado

En la mayora de las determinaciones de Bioqumica Clnica utilizamos el espectro de luz blanca que se encuentra conformado de tres partes: Ultravioleta 400nm Visible 650nm 700nm Infrarojo

La luz ultravioleta esta dividida en cercano ultravioleta y lejano ultravioleta igualmente sucede con la zona visible cercano visible y lejano visible. Adems el espectrofotmetro dispone de un PRISMA que sirva para separar la luz visible en diferentes partes desde el rojo hasta el violeta. Otros espectrofotmetros utilizan Red de Difraccin que es una lmina con surcos (rayados) que al hacer incidir la luz logra separar los componentes de la luz blanca.

El prisma y la red de difraccin cumplen las mismas funciones, el espectrofotmetro est constituido elementalmente por: Fuente luminosa (foco de tuxteno) Una rendija que controla el paso de la luz Prisma que separa la luz visible
7

Rejilla (dependiendo del aparataje) Cubeta con la muestra (contiene el complejo color) Detector (detecta la intensidad de la luz) Amplificador (lee la absorbancia o transmitancia) Registrador (puede ser digital o manual )

Los espectrofotmetros pueden ser manuales, semi atomticos y atomticos de diferentes marcas, tamaos y colores. Mientras ms fino el es ancho de la banda es mejor MTODO A PUNTO FINAL En ste mtodo la reaccin entre la muestra ms el reactivo se produce hasta el final. A+B+C = D+E A = Muestra B, C = Reactivos comerciales Si utilizamos los reactivos comerciales, hay que tomar en cuenta condiciones de temperatura, pH, tiempo indicado en cada caso. Cuando la concentracin es muy alta no se cumple la ley de Lambert- Beer y por tanto hay que hacer diluciones en la muestra y el factor de correccin para que se encuentre dentro del rango lineal. Para determinar la concentracin de la solucin problema se emplea una solucin acuosa patrn del mismo parmetro, de concentracin conocida

e indicada por la casa comercial. Si aplicamos la ley de Lambert-Beer para la solucin patrn (pt) y para la muestra problema (pr) A= E.b.c Apt = E.b.Cpt Apr = E.b.Cpr Como el valor de epsilon, E es constante y b = 1cm en la dos ecuaciones, si se dividen Apt / Apr Apt Cpt Apr Cpr Cpr = Apr Cpt Apt

MTODOS CINTICOS Se mide la velocidad de la reaccin antes de que sta concluya, manteniendo en la reaccin siempre las condiciones de temperatura, tiempo, pH para garantizar la confiabilidad de los resultados. En stas determinaciones analticas la absorbancia no es directamente proporcional a la concentracin del parmetro biolgico en la muestra problema. Es la variacin de la Absorbancia ( ) en un tiempo establecido, lo que es proporcional a la concentracin. La ley de Lambert-beer que se aplicar en stos casos adapta como: se modifica y se

A = E.b.c Siendo la letra griega la que representa la variacin de la magnitud en ste caso la absorbancia, extincin o densidad ptica por lo que se la expresa tambin: A = E = DO

Generalmente se toma un minuto como una unidad de tiempo a medida de la variacin de la densidad ptica.
9

DO/min = E.b.c Siendo E y b valores constantes, se expresa su producto como un Factor Numrico que lo proporcionan las casas comerciales de tal manera que la concentracin quedara. C = DO/min E.b C = DO / min . F Los mtodos cinticos se utilizan generalmente para qumica sangunea.

MTODO ELECTROFORTICO O ELECTROFORSIS

10

La electroforesis es un mtodo de laboratorio en el que se utiliza una corriente elctrica controlada con la finalidad de separar biomolculas segn su tamao y carga elctrica a travs de una matriz gelatinosa. Se fundamenta en que las partculas coloidales o macromolculas colocada en un campo elctrico tiende a hacia uno de los polos segn el signo de su carga provocando un movimiento y la separacin de los componentes de la muestra, ste movimiento de las partculas est determinada de forma proporcional al voltaje aplicado. De forma general, las sustancias cargadas positivamente se dirigirn hacia el polo negativo (ctodo) y las cargadas negativamente hacia el polo positivo (nodo). Constituye una de los mtodos de anlisis ms importantes de protenas, lpidos, cidos nucleicos, separacin de protena, cidos orgnicos, cidos fenlicos e indoles. La electroforesis se utiliza en la industria del caucho para separarlo del ltex, en la flotacin de minerales, en la purificacin del aire en el que se eliminan polvos y humos por efecto de un potente campo magntico. MTODOS POTENCIOMTRICOS Es un mtodo de anlisis cuantitativo instrumental que se basa en la ecuacin de Nerst que relaciona el potencial con las concentraciones de las formas oxidadas y reducidas Se fundamenta en que permite deducir la concentracin de sustancias en disolucin por el potencial que adquiere un electrodo sumergido en la misma. Para sta tcnica se utiliza el potencimetro el cual es un instrumento de precisin empleado para medir o comparar diferencias de potencial entre dos puntos de un circuito.
Sumerge

Metal

Disolucin de metales

Crea
Potencial entre el metal y la disolucin

Libera e

11

MTODOS COLORIMTRICOS Denominamos as a las reacciones analticas que se miden empleando longitudes de onda () dentro del visible. Se basa en que la sustancia problema se somete a una reaccin qumica cuyo producto final es coloreado, mtodo que utiliza reactivos que hacen referencia a los cromgenos (sustancias coloreadas) capaces de formar compuestos coloreados y que absorben en el visible. La intensidad del color o su variacin es directamente proporcional a la concentracin del parmetro a determinar. Para determinar la concentracin se puede emplear patrones acuosos: Cpr= Apr Apt . Cpt

Cpr = Puede ser reaccin del punto final y mtodos cinticos.

12

MTODOS FOTOMTRICOS Se basa en el comportamiento que tienen los electrolitos como el (Na, K, Fe, Mg, P, Cu) en sus niveles energticos. MTODOS ELISA Mtodos de enzimoinmunoanlisis, tcnica inmunolgicas, son pruebas fciles de realizar, se prestan para examinar muchas muestras no requieren uso de sustancias radioactivas son sensitivas y especficas. Se les clasifica en Indirectas, Competitivos y de Captacin de antgenos La mayora de estos tipos usan antgenos del VIH que se fijan en una fase slida (soporte), junto con un conjugado y un sustrato. ELISA INDIRECTA: El suero del paciente se agrega a la fase slida que contiene el antgeno se incuba por un tiempo especfico y una temperatura particular. En ste mtodo hay ms color a medida que la concentracin del anticuerpo desconocido aumenta en la muestra. ELISA TIPO CONPETITIVO: Difiere en que anticuerpo anti VHI compite con el conjugado (que es un anticuerpo tambin dirigido contra el antgeno del VIH) para ocupar sitios reactivos en el antgeno fijado. Conjugado ms muestra con anticuerpo anti VIH se agregan a la fase slida al mismo tiempo. Habr ausencia de coloracin debida a que no habr mucha fijacin de la enzima como para unirse al sustrato. En caso contrario se producir inversamente las reacciones por lo tanto, habr presencia de color. ELISA DE CAPTURA DEL ANTGENO: Puede ser de tipo indirecto o competitivo y solo difiere en la etapa inicial de fijacin del antgeno en la fase slida. Un anticuerpo monoclonal es fijado al soporte slido para capturar el antgeno especfico del VIH. Para la eleccin de la prueba debemos considerar lo siguiente:
13

- Algunas pruebas Elisa pueden realizarse en 22 horas y otras en 5 minutos. - Algunas requieren instrumentacin sofisticada mientras que otras no requieren ninguna. - Algunas requieren volmenes elevados (800ul) y otras slo necesitan (1 ul). - Algunas producen color y otras no producen ningn color como sistema indicador. - Algunas se leen a simple vista, otras con un detector fluorescente y otras con un espectrofotmetro. - Algunas requieren una gran prctica para realizarlas, mientras que otras son tan simples que un laboratorista sin experiencia podra realizarlas con precisin. - El costo tambin vara. La prueba de ELISA es la primera que se hace porque resulta barata, sencilla y da resultados confiables. Si la prueba de ELISA sale negativa, no se hacen ms pruebas. Cuando sale positiva, es preciso practicar la prueba Western Blot para confirmar los resultados. La confiabilidad de una prueba mdica depende de dos factores: el nivel de sensibilidad de la prueba y el grado de especificidad. La prueba ELISA es sumamente sensible (~ 99,5%), lo que significa que puede detectar cantidades muy pequeas de anticuerpos al VIH. PRUEBAS DE CONFIRMACIN

Las pruebas llamadas de confirmacin tienen como objeto verificar (confirmar) que los resultados obtenidos con las pruebas de cribado son correctos. Western blot El fundamento de la principal prueba confirmatoria de la actualidad, o Western blot (WB), es una discriminacin de los antgenos del VIH frente a los que se dirigen los anticuerpos presentes en la muestra. Bsicamente se basa en la separacin de las protenas (antgenos) obtenidas del VIH-1 procedentes del lisado del cultivo del virus y purificadas por centrifugacin. La protena viral as obtenida se coloca en un gel de poliacrilamida en forma de lminas delgadas y luego se efecta una
14

electroforesis con la que las protenas de menor peso molecular (p17, p24) emigran ms lejos en el gel mientras que las de mayor peso molecular se mantienen cerca de su lugar de depsito. Despus se transfieren a una tira de nitrocelulosa y se cortan en tiras de unos 5 mm de ancho. Estas son las tiras que se exponen al suero humano diluido, despus de una incubacin se lavan y se vuelven a incubar con una IgG antihumana marcada con una enzima que con la exposicin a un revelador enzimtico producir una banda coloreada en las zonas correspondientes a los anticuerpos especficos que contenga la muestra. Por lo general cada uno de los diferentes equipos comerciales que existen para la realizacin de la prueba contienen instrucciones precisas de cmo interpretar los resultados obtenidos con unos criterios de positividad ms o menos restrictivos y sus tiras pueden contener un nmero variable de bandas; las principales bandas del WB se recogen en la tabla.

UNIDADES DE REPORTE La unin Internacional de Qumica Pura y Aplicada (IUPAC) y la Federacin Internacional para Qumica Clnica (IFCC) han recomendado las siguientes unidades de concentracin basadas en el Sistema Internacional de Unidades (SI). LONGUITUD La unidad bsica es el metro (M) La unidad ngstrom no debe utilizarse y los ngstrom convertimos a nm (1A = 10-1 nm) VOLUMEN La unidad bsica es el metro cbico (m3) La unidad de trabajo es el litro (L),el cual equivale al decmetro cbico (dm3). Para todas las mediciones de volumen, deben emplearse los mltiplos y sub mltiplos del litro. El microlitro (ul) es el nombre correcto par 10-6 litros. MASA
15

La unidad bsica es el kilogramo (Kg); la unidad de trabajo es el gramo (g). Se utilizan mltiplos y submltiplos del gramo. El microgramo (ug) es el nombre correcto para 10-6 gramos PRESIN La unidad bsica es el Newton por metro cuadrado (N/m2), determinada alternativamente Pascal (pa). Las unidades convencionales son los milmetros de mercurio (mm Hg) y los centmetros de agua (cm H2O). Valores de conversin en condiciones normales: 1mmHg = 133N/m2 1cm H2O = 98 N/m2 TIEMPO La unidad bsica es el segundo (seg) , otras unidades son el minuto (min), la hora (h). TEMPERATURA TERMODINMICA La unidad bsica es el Kelvin (K) La unidad de trabajo es (0C) CANTIDAD DE MUESTRA La unidad bsica es la mol, que sustituye trminos tales como molculagramo, el in gramo y el equivalente gramo. La concentracin se expresa como moles / litro (mol/L). a) Concentraciones molares Unidas bsica : mol/L Unidad recomendada: mol/L, mmol/L, u mol/L Cuando trabajamos con sustancias de pesos moleculares conocidos, sus concentraciones deben expresarse en mol/L o submltiplos. Por el contrario cuando los pesos moleculares son desconocidos, la concentracin debe expresarse en mg/dL.

16

En 1977 la organizacin Mundial de la Salud recomend la utilizacin del SI. La adopcin de este sistema de unidades en el laboratorio clnico dar lugar a algunos inconvenientes pasajeros, como pueden ser el aprendizaje de nuevos valores de referencias, costos, etc. Sin embargo, resulta evidente que el uso del Sistema Internacional en el laboratorio se va imponiendo poco a poco en todo el mundo. Por eso hacemos referencia las unidades tradicionales que generalmente utilizamos en el Laboratorio Clnico: - Hematologa : - Qumica Sangunea: - Enzimologa: dm3, cm3, mm3 mg/dL (mol/L; mmol/L; uL) U/L (Katal/L).

17

18