1.

EnsaiosdeGenotoxicidade Os agentes genotxicos so aqueles que interagem com o DNA produzindo alteraes em sua estrutura ou funo e quando essas alteraes se fixam de forma capaz de serem transmitidas, denominamse mutaes. As mutaes so a fonte de variabilidade gentica de uma populao, sendo portanto fundamentais para a manuteno das espcies. Porm, podem causar doenas tanto nos indivduos como nos seus descedentes, dependendo da quantidade, do tipo e local onde ocorrem e alterar o balano dos ecossistemas. Nas populaes, podem aumentar a incidncia de cncer, doenas hereditrias e do corao, bem como aumentar a virulncia de patgenos. Os compostos mutagnicos encontramse distribudos nos ecossistemas (gua, solo, ar); so transferidos e acumulados atravs das cadeias trficas, podendo causar danos genticosouefeitosgenotxicosnosindivduosoupopulaesexpostas

LesesnoDNAcromossmicoapstratamentocomagentesmutagnicos Obe&Natarajan,1982

1.1. Salmonella/microssoma(TestedeAmes) 1.1.1 Histrico Historicamente, a descoberta feita por Auerbach, em 1941, de que o gs mostarda provocava mutaes em Drosophila melanogaster foi a primeira demonstrao de mutagnese qumica induzida. Apesar da implicao desta descoberta na rea da sade humana, a maioria dos geneticistas entre 1940 e 1950 estava interessada em usar os mutgenos qumicos como ferramenta paraentendermelhorosprocessosgenticosecelulares. A preocupao com a exposio humana aos mutgenos qumicos somente se

1.1.2

iniciou nos anos 60, devido ao avano industrial psguerra, que fez com que houvesse a necessidade de se controlar a enorme quantidade de produtos lanados no ambiente. Inicialmente, foi dada maior ateno ao efeito das mutaes nas clulas germinativas, capazes de causar doenas hereditrias. Nessa poca, vrios ensaios de mutagenicidade in vivo foram desenvolvidos. Porm, apesar da teoria da mutao somtica do cncer ter sido formulada muitos anos antes por Boveri em 1914, no havia experimentos que associassem definitivamente mutgenos qumicos ao processo de carcinognese. Essa teoria foi retomada quando o Dr. Bruce Ames e colaboradores da Universidade de Berkeley, California (Ames et al, 1973, 1975) desenvolveram um teste in vitro, de curta durao, que combinado a um sistema de metabolizaoinvitro(fraoS9)desenvolvidoporMallingem1971,mostrou uma alta correlao entre vrios mutgenos e carcingenos conhecidos . Este ensaio conhecido hoje como Teste de Ames e considerado um marco na histriadaGenticaToxicolgica. Salmonella/microssomaPrincpiodomtodo O ensaio Salmonella/microssoma, conhecido como teste de Ames, o mais utilizado atualmente e o nico validado em larga escala por diversos laboratrios no mundo todo. O teste emprega linhagens de S. Typhimurium derivadas da linhagem parental LT2, auxotrficas para histidina (his), especialmente construdas para detectar mutaes do tipo deslocamento de quadro de leitura ou substituio de pares de base no DNA. Essas linhagens so incapazes de crescer em meio de cultura mnimo, sem histidina, a menos queocorrammutaesquerestauremasntesedesteaminocido. A freqncia de mutao reversa facilmente medida pela contagem do nmero de colnias que crescem em meio mnimo aps a exposio de uma populao de clulas a um agente mutagnico. O teste feito com e sem ativaometablica. As diversas linhagens de S.Typhimurium que foram desenvolvidas pelo Dr. Bruce Ames, do Departamento de Bioqumica da Universidade da Califrnia, Berkeley, CA, U.S.A., possuem mutaes para histidina em diferentes genes do operon responsvel pela biossntese desse aminocido e apresentam tambm outras caractersticas genticas que lhes conferem maior sensibilidade e versatilidade nadeteco dediversostiposdemutgenos,taiscomo:mutao rfa, deleo uvrB e a presena do plasmdio pKM101. As linhagens mais comumente utilizadas pela maioria dos autores so a TA98 e TA100, principalmente em estudos de triagem, pois elas tm se mostrado eficientes nadetecodeumgrandenmerodemutgenos. Alm da vasta base de dados existente, que nos permite comparar a contribuiodefontesespecficasparaagenotoxicidadedeumadadamistura complexa com dados obtidos no mundo inteiro, o teste de

Salmonella/microssoma ainda nos d idia de que grupamentos qumicos podem ser responsveis pelo efeito que se observa, pois as respostas das diferentes linhagens, na presena e ausncia de ativao metablica so caractersticas de um ou outro grupo qumico. Ainda h a possibilidade de realizar, nas amostras ambientais, procedimentos de extrao orgnica preferenciais para diferentes classes de compostos, permitindo melhor direcionamentodasanlisesqumicas.Estascaractersticaseaflexibilidadedo ensaio de Salmonella/microssoma fazem dele a nossa escolha para uso rotineiro, como excelente ferramenta de monitoramento, que nos permite triar locais de interesse e auxiliar nas aes de fiscalizao e controle de poluio. 1.1.3 Preparodeamostrasambientais

Os compostos qumicos podem ser testados diretamente ou dissolvidos em solventesapropriados,comoporexemploguadestiladaoudimetilsulfxido (DMSO). As amostras ambientais lquidas como gua bruta, tratada e efluentes podem ser testadas diretamente aps esterilizao por membrana filtrante, porm so mais usualmente submetidas a processos de concentrao e extraoorgnica. Existemvriosmtodosdeextraoorgnica,cadaumsendopreferencialpara determinados grupos de substncias qumicas, devendose, portanto, escolher omtodomaisapropriadoparaotipodeamostraaseranalisada.Recomenda seousodeextraoporresinastipoXAD2ouXAD4paraguabrutaetratada. Efluentes industriais, cujo contedo orgnico normalmente mais elevado, podem ser testados diretamente, ou aps extrao lquidolquido, ou ainda emresinasXAD. As amostras ambientais slidas e de material particulado de ar, podem ser extradas atravs de ultrasonicao ou "soxhlet" com solventes apropriadosoulixiviadoscomguadestilada. Os extratos orgnicos obtidos pelos processos acima so ressuspendidos em pequenos volumes de dimetilsulfxido (DMSO) e ento testados frente s linhagens selecionadas, de forma a obterse as concentraesdeexposiodesejadas.

 1.1.4 Salmonella/microssomavariaesdomtodo 1.1.4.1 IncorporaoemplacasTestedeAmes Para o mtodo de incorporao em placas, a amostra misturada a 0,1 mL de cultura pernoite de bactria e a 3 mL de gar de superfcie, estabilizado a 45C. Para o teste com ativao metablica, adicionase tambm0,5mLdamisturaS9ao"topagar". O contedo de cada tubo deve ser homogeneizado e vertido sobre a superfcie de uma placa contendo gar mnimo com traos de histidina e biotina. Aps solidificao do "top agar", as placas so incubadas invertidas, por 4866 horas, a 37C. Procedese ento a contagem do nmero de revertentes por placa. O ensaio deve ser realizado em triplicata. Para o mtodo de princubao, a amostra misturada com as bactrias na presena ou no da mistura S9 durante 20 a 30 minutos, seguindose o plaqueamento em gar mnimo. Esse procedimento especialmente indicado para amostras com compostos apolares que no se difundem bem nas placas de gar, principalmente amostras oleosas.

Refernciasbsicas:Maron&Ames,1983eMortelmans&Zeiger,2000 1.1.4.2 EnsaioemmicrossuspensoTestedeKado O teste de Kado, tambm denominado ensaio em microssuspenso, se baseianoaumentodaquantidadedebactriasutilizadasnoensaioena reduo da quantidade de amostra e mistura S9, aumentando assim a sensibilidadedoteste. O teste emprega as mesmas linhagens de S. Typhimurium do teste de Ames e baseiase no mesmo princpio. Ele feito sempre pelo mtodo de princubao e aps concentrao da cultura num fator de 5X atravs de centrifugao, volumes de 50uL so misturados a 2uL de

amostra e a 50uL de mistura S9 (ou tampo fosfato), incubados por 90 minutos a 37C. Aps esse perodo, adicionase gar de superfcie e verteseemplacasdegarmnimocombiotinaetraosdehistidina. A partir da todo procedimento o mesmo descrito para o teste de Ames. Valores de taxa de reverso espontnea ligeiramente mais altos podem ocorrer, no prejudicando, no entanto, a confiabilidade do ensaio. Refernciasbsicas:Kadoetal,1983e1987

1.1.4.3 MtodoDireto O mtodo direto uma modificao do teste de Ames descrito pelo CORIELL INSTITUTE FOR MEDICAL RESEARCH (1986), que permite testar 2 mL de amostra como volume mximo, ao invs de 0,2 mL do ensaio tradicional.Estamodificaoconsistenautilizaodegardesuperfcie mais concentrado. Esse mtodo aplicado para amostras ambientais lquidas, sem concentrao, principalmente nos casos de efluentes industriais e lixiviados. A amostra deve ser filtrada em membranas 0,45m e/ou 0,22m para sua adequada esterilizao. Algumas propriedades da amostra podem dificultar a aplicao desse mtodo. O pHeaforainicadaamostrapodemsertxicosparaasbactrias. 1.2 Microncleos 1.2.1 Definio As consequncias possveis da presena de agentes genotxicos no ambiente pode ser avaliada por meio do estudo de danos genticos em organismos sentinela. Mexilhes, animais bentnicos, ourios, esponjas, anfbios e peixes so alguns dos exemplos de organismos que tm sido utilizados para monitorarapoluioemambientesaquticos.

As tcnicas citogenticas tm sido comumente utilizadas para determinao dos efeitos causados por agentes genotxicos presentes no ambiente no DNA de organismos expostos. So procedimentos relativamente simples que podem ser feitos com amostras de rgos ou tecidos destes organismos coletados no ambiente a ser avaliado,oupodesetestaras amostrasdoambienteemanimaiscriadosnolaboratrio.Paraestudosinvitro asclulasemculturasoaferramentautilizada. Os microncleos resultam de fragmentos cromossmicos acntricos ou que se atrasaram em relao aos demais em sua migrao em direo aos polos do fuso mittico. Podem ser induzidos por agentes que so capazes de quebrar o DNAoudeinterferircomaformaodofuso. Refernciasbsicas: 1.2.2.Microncleoemeritrcitosdepeixes No ambiente aqutico, os peixes so considerados bons monitores biolgicos porparticiparememdiferentesnveisdacadeiatrfica. Os animais so coletados em redes de pesca, vivos, anestesiados e uma amostra de sangue retirada por meio de puno caudal. Os organismos so devolvidos ao ambiente natural e so feitas extenses sanguneas (esfregaos) no local ou no laboratrio. As clulas so fixadas com metanol e coradas com Giemsa. So analisadas 4000 clulas por organismo e o resultado expresso em freqncia de microncleos/1000clulas. 1.3 EnsaioCometa(SGCSinglecellgellassay) 1.3.1 Princpiodomtodo O Ensaio Cometa, ou Single Cell Gel assay, permite a obteno de grande quantidade de dados em clulas individuais, necessita de um nmero

extremamentepequeno declulas(<10.000),temgrandesensibilidadeepode ser realizado virtualmente com qualquer tipo de clula de eucarioto. Neste ensaio, as clulas so aplicadas em um gel de agarose sobre uma lmina de microscpio e a seguir lisadas e submetidas a um campo eltrico em tampo alcalino. A presena de quebras simples, stios lbeis alcalinos e crosslinks resultantes da ao de compostos genotxicos, altera a estrutura do DNA das clulas, que normalmente est superenrolado e fortemente compactado, causando relaxamento em partes da molcula que migram em direo ao anodo. Desta forma, aps aplicao de corantesespecficos,podesevisualizarem microscpio de fluorescncia a migrao doDNA,queseassemelhaaumcometa. A capacidade que o DNA tem de migrar funo tanto do tamanho da molcula como da quantidade de extremidades livres (quebras, por exemplo) que, mesmo ligadas a segmentos maiores, migram numa distncia pequena do corpo do cometa. O tamanho da cauda inicialmente aumenta proporcionalmente quantidade de danos, mas a migrao mxima determinada pelas condies da eletroforese, no o tamanho dos fragmentos. A intensidade da fluorescncia na cauda em relao quela do corpodocometaforneceinformaessobreaquantidadedequebrasnoDNA. Assim, podese avaliar o dano gentico tanto atravs da medida do comprimento da cauda do cometa, como atravs da quantidade de DNA presente,sendoambosfunodasdosesdeexposio Refernciasbsicas:Singhetal.,1988;Fairbainetal,1995,Tice,1995. Cometaemsanguedepeixes Os animais so coletados em redes de pesca, vivos, anestesiados e uma amostra de sangue retirada por meio de puno caudal. Os organismos so devolvidos ao ambiente natural e o sangue coletadolevadoaolaboratrio. Sobre uma lmina de microscpio previamente coberta com uma camada de agarose normal (1,5%), acrescentase uma camadadeagarosedebaixopontodefuso(lowmeltingpoint)misturadacom uma alquota do sangue coletado. O material posteriormente lisado e as lminas mergulhadas em tampo de eletroforese alcalino, o que permite a desespiralizaodoDNA.Omaterialgenticosubmetidoaumaeletroforese

1.3.2

(25V, 300mA, 20 minutos), aps o que neutralizado e fixado com etanol. As lminas so coradas com soluo de brometo de etdio e analisadas em microscpiodefluorescncia.Soavaliadas100clulaspororganismo.