As interpretaes dos estudos de Avery, MacLeod e Maccarty sobre a natureza qumica do fator transformante em bactrias

Caroline Belotto Batisteti Elaine Sandra Nabuco de Arajo # Joo Jos Caluzi
Resumo: Neste trabalho apresentamos o resultado parcial de uma dissertao de mestrado que discute os experimentos de Oswald Theodore Avery (1877-1955) e colaboradores sobre a natureza qumica da substncia responsvel por induzir a transformao bacteriana. Analisamos alguns livros-textos de gentica, bioqumica e biologia molecular, bem como algumas publicaes que abordam a histria da biologia molecular. Conclumos que, embora o artigo de Avery, MacLeod e McCarthy, de 1944, seja considerado decisivo para atribuir ao cido desoxirribonuclico (DNA) um papel de hereditariedade, h, nas fontes consultadas, poucas informaes acerca das controvrsias sobre sua aceitao pela comunidade cientfica da poca. Entendemos que esse assunto deve ser estudado com maior profundidade, com base em fontes primrias e secundrias confiveis. Palavras-chave: histria da Biologia Molecular; fator transformante; DNA. The interpretations of MacCarty, MacLoed and Averys studies on the chemical nature of the transforming factor in bacteria

Mestranda do Programa de Ps-Graduao em Educao para a Cincia, Universidade Estadual Paulista Campus Bauru. E-mail: carolbatisteti@fc.unesp.br. # Pesquisadora do Centro de Divulgao e Memria da Cincia e Tecnologia; Bolsista PRODOC/CAPES, Programa de Ps-Graduao em Educao para a Cincia, Universidade Estadual Paulista Campus Bauru. E-mail: centro@fc.unesp.br Departamento de Fsica da Faculdade de Cincias, Universidade Estadual Paulista Campus Bauru e Programa de Ps-Graduao em Educao Para a Cincia / Universidade Estadual Paulista Campus Bauru. E-mail: caluzi@fc.unesp.br.

Filosofia e Histria da Biologia, v. 3, p. 71-94, 2008.

71

Abstract: This paper presents the partial results of a Master Degree dissertation which discusses the experiments of Oswald Theodore Avery (1877-1955) and his collaborators on the chemical nature of the substance responsible for inducing bacterial transformation. We analyzed some Genetics, Biochemistry and Molecular Biology textbooks, as well as some publications which deal with the history of molecular biology. We concluded that, despite the fact that the 1944 article by Avery and his contributors is regarded as decisive to attribute to deoxyribonucleic acid its role in heredity, there is, in the consulted sources, little information about the controversies of its acceptance by the scientific community at the time. We think that this subject must be deeply studied, taking into account trustworthy primary and secondary sources. Keywords: history of molecular biology; transforming factor; DNA

A relao entre a molcula de DNA (cido desoxirribonucleico) e a hereditariedade foi estabelecida nas dcadas de 40 e 50 do sculo XX. Antes disso, os pesquisadores propuseram que a natureza qumica do material gentico era protica, pois somente as protenas, com sua diversidade de formas, estudadas at ento de modo freqente, poderiam dar conta da complexidade da ao dos genes. Neste artigo, inicialmente, comentaremos sobre os estudos de Frederick Griffith (1877-1941), publicados em 1966, a respeito da transformao bacteriana1, que so considerados fundamentais para o desenvolvimento dos trabalhos de Oswald Theodore Avery (1877-1955); Colin Munro MacLeod (1909-1972) e Maclyn McCarthy (1911-2005), publicados em 1944, sobre a natureza qumica do princpio transformante2. Em seguida, analisaremos o modo com que os estudos de Avery, MacLeod e McCarthy so abordados em cinco livrostextos de gentica (Debusk, 1971; Gardner & Snustad, 1986;
Em linhas gerais, atualmente, a transformao bacteriana envolve a incorporao de DNA exgeno ao material gentico das clulas bacterianas, resultando em uma recombinao gnica herdvel. Griffith utilizava essa expresso ao referir-se transformao de um tipo de pneumococos em outro, por exemplo, transformao do Tipo II de pneumococos em Tipo III. 2 O termo princpio transformante diz respeito ao fator responsvel pela transformao bacteriana.
1

1 INTRODUO

72

Herskowitz, 1971; Stansfield, 1985; Thompson & Thompson, 1974); em um de bioqumica (Lenhinger, 2002), bem como em trs publicaes que abordam a histria da biologia molecular (Acot, 2003; Hausmann, 2002; Watson & Berry, 2005). 1.1 O mdico ingls Frederick Griffith dedicou-se ao estudo sobre os tipos de pneumococos, bactrias encontradas em casos de pneumonia lobar3 de 1920 a 1927. A Tabela I apresenta o total de casos examinados por Griffith e a porcentagem de incidncia dos tipos de pneumococos encontrados. No decorrer dessa pesquisa, ele percebeu a presena de dois ou mais tipos de pneumococos em uma amostra de secreo coletada de um paciente. Na tentativa de explicar essa observao, realizou vrios experimentos envolvendo a transformao de um tipo de pneumococos para outro, a partir da inoculao de culturas em ratos.
Porcentagem de incidncia dos Tipos Tipo I Tipo II Tipo III Grupo IV 30.6 42.6 34.3 32.6 21.3 7.4 6.6 3.2 4.4 30.0 32.7 53.7

A natureza qumica do fator transformante

Tabela I. Tipos de pneumococos em pneumonia lobar (Griffith, 1966, p. 130). Perodo de Total de investigao casos examinados Abril 1920 - 150 Jan. 1922 Fev. 1922 61 Out. 1924 Nov. 1924 67 Mar. 1927

O principal ponto de interesse da investigao Griffith foi a diminuio progressiva no nmero de casos de pneumonia devida ao pneumococo Tipo II [....] os nmeros podem revelar um real
3

Pneumonia a infeco do parnquima pulmonar, ocasionada por uma invaso de vrus, bactrias ou outros microorganismos. No caso da pneumonia lobar, uma seo do pulmo (lobo) afetada.

Filosofia e Histria da Biologia, v. 3, p. 71-94, 2008.

73

decrscimo local do Tipo II, e um correspondente aumento dos casos do Grupo IV (Griffith, 1966, p. 130). A despeito da verificao em uma amostra (secreo) de uma linhagem do Grupo IV isolada, coletada em estgio avanado da pneumonia, Griffith ressaltou que isso no significava que esse grupo de pneumococos tenha causado, de fato, a doena. Ao examinar vrias amostras coletadas em diferentes perodos, advindas de um mesmo caso, outros tipos foram identificados concomitantemente. Desse modo, haveria a possibilidade de que outros tipos causassem a doena. Foram mencionadas por Griffith trs possveis explicaes para a presena de dois ou mais tipos sorolgicos em um mesmo caso, uma delas direcionada hiptese de transformao, ou seja, a reverso de um Tipo de pneumococos em outro. Griffith descreveu uma srie de experimentos laboratoriais favorveis hiptese da transformao, em que ocorreram alteraes nos tipos sorolgicos. Ele utilizou variantes de pneumococos avirulentas e virulentas. Martin H. Dawson (1833-1871) resumiu as caractersticas que distinguem as duas formas de pneumococos:
As formas S so virulentas; elas produzem uma substncia solvel especfica, que depende da especificidade do tipo; e elas formam colnias que tm uma superfcie lisa quando examinada por luz refletida. As formas R so avirulentas; elas no produzem a substncia solvel especfica e elas formam colnias que tm uma superfcie rugosa quando similarmente examinadas. (Dawson, 1928, p. 577)

A designao S advm do termo smooth, e R do termo rough. A aparncia lisa das colnias est relacionada presena de uma cpsula de polissacardeos nas bactrias virulentas. As bactrias no virulentas no apresentam esse envoltrio. Em seus experimentos sobre modificao, Griffith utilizou linhagens de pneumococos atenuadas R, obtidas de culturas de linhagens virulentas S. Ele verificou a reverso para formas virulentas S a partir da inoculao sob a pele de ratos, de uma larga dose de cultura avirulenta R atenuada. Para ele, a reverso da virulncia era facilitada pela formao de uma massa de cultura de bactrias. Entretanto, Griffith considera que: 74

A reverso da variante R para S era devida, conforme Griffith, ao fato das linhagens R atenuadas (obtidas originalmente de linhagens S) poderem reter em suas estruturas um antgeno S original, insuficiente em circunstncias ordinrias de exercer um efeito patognico no animal. Quando a linhagem R atenuada inoculada em considervel massa sob a pele do rato, a maioria dos penumococos se rompe e o antgeno S liberado pode fornecer um pabulum que os pneumococos R viveis podem utilizar para a construo de sua estrutura rudimentar S (Griffith, 1966, pp. 145-146). A substncia ou antgeno S , conforme Griffith:
Uma estrutura protica especfica dos pneumococos virulentos que os capacita a produzir um carboidrato solvel especfico. Esta protena parece ser necessria como material que capacita a forma R a construir a estrutura protica especfica da forma S. (Griffith, 1966, p. 67)

Esta proteo vinda de um mecanismo normal de defesa do animal no pode ser o nico fator responsvel por produzir a mudana, desde que, pneumococos atenuados R podem sobreviver inalterados em tecidos subcutneos por duas ou trs semanas sem qualquer proteo. (Griffith, 1966, p. 145)

Griffith realizou experimentos para verificar se condies mais favorveis reverso poderiam ser fornecidas a partir da inoculao em ratos de uma massa de cultura derivada de pneumococos virulentos mortos juntamente com uma pequena quantidade de pneumococos R atenuados. Isso mostraria, segundo ele, que a massa de cultura de bactrias e a alta concentrao de antgeno S servem como um estmulo ou alimento para a reverso. Griffith considerou que a inoculao de pequenas quantidades da linhagem R atenuada juntamente com quantidades maiores de linhagem S mortas por aquecimento constitui um mtodo mais eficiente para a reverso das variantes R para S do que a inoculao de uma grande quantidade de linhagem R, apenas. A reverso da linhagem R para a sua forma S, a partir da inoculao de tipos distintos depende, de acordo com Griffith, do grau e do perodo de aquecimento da cultura virulenta. Um aquecimento 60 C resulta na formao de pneumococos S virulentos do mesmo tipo da cultura aquecida. A justificativa de que a mudana teria ocorriFilosofia e Histria da Biologia, v. 3, p. 71-94, 2008.

75

do devido sobrevivncia de alguns pneumococos S, aps o aquecimento, foi desconsiderada, pois, segundo Griffith, por meio dos mtodos de cultura e inoculao animal, no houve evidncias de pneumococos viveis nas culturas aquecidas. Para ele, parece no haver outra alternativa para a hiptese da transformao dos tipos (Griffith, 1966, p. 170). Apesar de os livros didticos de Biologia e Bioqumica freqentemente relacionarem o termo princpio ou fator transformante aos experimentos de Griffith, ressaltamos que este no foi mencionado no seu trabalho. A palavra transformao foi utilizada por Griffith para referir-se reverso de uma variante para outra e, para ele, a substncia S necessria para ocorrncia deste processo era uma protena. A palavra utilizada por Griffith (transformao) possui um significado descritivo, apenas. Ela possui o antepositivo form, do latim, forma, que possui o significado de forma, figura exterior, aparncia, formato. O prefixo trans, da preposio trans, do latim, atribui s palavras cinco possveis acepes, uma delas a acepo de mudana. Finalmente, ao, que, entre outras, possui a acepo de capacidade, possibilidade de executar alguma coisa. Assim, a palavra transformao significa capacidade de mudar a forma. No caso, a mudana de uma aparncia rugosa para uma lisa (R S), ou seja, de uma bactria avirulenta para uma virulenta. A introduo do substantivo fator, que possui as acepes aquele que determina ou executa algo, ou qualquer elemento que concorre para um resultado, deixa de ser apenas descritivo para uma especulao causal: aquilo que determina a capacidade de mudar de forma. No sabemos quem cunhou a expresso fator transformante, que bastante utilizada nos livrostextos atuais e atribudo a Griffith. Como afirmamos, em seu trabalho ele usa a expresso transformao, que, como explicamos anteriormente, possui conotaes diferentes. 1.2 Os pesquisadores Avery, MacLeod e McCarthy, iniciaram um trabalho de anlise mais detalhada do fenmeno de transformao dos tipos de pneumococos (Avery, MacLeod & MacCarty, 1944). Estavam interessados em isolar o fator capaz de induzir a trans76 Os experimentos de Avery, MacLeod e MacCarty

formao de variantes no virulentos oriundos de Pneumococcus Tipo II em Pneumococcus virulentos Tipo III e se possvel identificar a sua natureza qumica ou ao menos caracteriz-lo o suficiente para classific-lo em grupos gerais de substncias qumicas conhecidas, isto , protenas, lipdios, polissacardeos ou cidos nuclicos. Para esse estudo, escolheram para investigao, um exemplo tpico de transformao, anteriormente realizado por Griffith a transformao de uma variante R de pneumococos Tipo II para pneumococos Tipo III (Avery, MacLeod & MacCarty, 1944). Seus experimentos foram desenvolvidos in vitro, o que exigiu o conhecimento de diversas condies de cultura das amostras utilizadas muitas delas j descritas em trabalhos anteriores por outros pesquisadores. Dawson e Richard H. P. Sia, em 1931, efetuaram experimentos de transformao in vitro correspondentes aos que Griffith havia realizado in vivo. Um deles consistia no crescimento de pequenas quantidades de uma cultura R em meio de cultura adequada para o qual havia sido adicionada uma vacina4 de Tipo S heterloga (por exemplo, utilizava uma cultura R derivada de pneumococos S Tipo II e uma vacina de pneumomocos Tipo III) o que resultava na transformao das formas R para S do mesmo tipo empregado na vacina. Mostraram que tanto quanto in vivo, a transformao in vitro poderia ser seletivamente induzida, dependendo da especificidade do tipo de clulas S utilizadas, e, encontraram algumas condies de produo das reaes: para os experimentos serem bem sucedidos havia que ser adicionado ao meio de cultura soro ou hemcias, e, a transformao dos tipos era mais facilmente efetuada pelo emprego de soro anti-R no meio de cultura. Em 1932, Lionel J. Alloway mostrou que o princpio ativo responsvel pela transformao poderia ser extrado das clulas S na forma solvel, e concluiu que, Pneumococos R avirulentos derivados de formas S de um tipo especfico poderiam ser transformados pelo crescimento em caldo contendo soro anti-R e um aquecido, extrato filtrado de clulas S de pneumococos de um tipo
4

Clulas S encapsuladas mortas pelo calor.

Filosofia e Histria da Biologia, v. 3, p. 71-94, 2008.

77

diferente, para organismos S virulentos idnticos em tipo com as bactrias extradas (Alloway, 1932, p. 98). Alloway, em 1933, mencionou que os mtodos utilizados nos experimentos de seu trabalho acima citado resultaram na perda de uma quantidade considervel de substncia ativa, o que o levou a descrever mtodos mais eficientes de extrao e purificao dos extratos:
Extratos de pneumococos altamente ativos em induzir a transformao in vitro de tipos especficos de pneumococos tm sido preparados pela dissoluo de clulas S com desoxicolato de sdio, precipitao do material dissolvido em lcool [...], e extrao do precipitado em soluo salina. (Alloway, 1933, p. 277)

Na discusso do seu trabalho, Alloway afirmou:

Os trabalhos citados anteriormente, praticamente contemporneos aos estudos de Avery, MacLeod e McCarthy foram fundamentais para que eles desenvolvessem os procedimentos metodolgicos que adotaram em seus experimentos. Isso evidncia o processo de construo do conhecimento cientfico, a partir dos trabalhos de grupos de pesquisas que refutam ou corroboram as idias de outros. Essas idias podem ser aceitas e utilizadas pela comunidade cientfica ou no. Os experimentos de Dawson e Sia, como os de Alloway, influenciaram muito provavelmente os procedimentos experimentais utilizados por Avery, MacLeod e McCarthy. Nestes, todos os fatores descritos anteriormente relacionados s condies de uma melhor produo do processo de transformao esto presentes: utilizao de um caldo de carne nutriente enriquecido com fluido aquoso ou soro, de fluido do pulmo contendo anticorpos R; produo de um extrato, purificao e esterilizao do material com lcool. 78

Os experimentos apresentados fornecem evidncia adicional que a transformao em tipo no aparente, mas real, e que as mudanas so causadas na presena do extrato por meio da ao especfica de um constituinte solvel presente nas formas S de pneumococos. quase inconcebvel que algum elemento vivo nas clulas de pneumococos poderia sobreviver aos procedimentos drsticos empregados na preparao dos extratos. (Alloway, 1933, p. 276)

Avery, MacLeod e McCarthy mencionaram que:

Avery considerou importante para a obteno de resultados consistentes e reproduzveis: o conhecimento de que as clulas de pneumococos possuem uma enzima intracelular que destri a atividade do princpio transformante (esta inativada quando o soro aquecido a 60-65C) e, a seleo cautelosa de uma variante R adequada pois uma cultura R pode submeter-se a sucessivas dissociaes e resultar em variantes que perdem a capacidade de responder aos estmulos transformantes. A variante R selecionada por Avery resultou de sucessivas culturas seriadas de pneumococos S do Tipo II. Foi interessante o desenvolvimento de um mtodo para determinar quantitativamente a atividade transformante de diversas fraes de material ativo. Todos os fatores, condies de cultura e tcnicas anteriormente citadas foram considerados. Os resultados dessa titulao da atividade transformante foram interpretados da seguinte maneira:
As propriedades anti-R do soro no meio induzem as clulas R a aglutinarem durante o crescimento, e massas uniformes de clulas aglutinadas depositam-se no fundo do tubo deixando um sobrenadante claro. Quando a transformao ocorre, as clulas S encapsuladas, no sendo afetadas por estes anticorpos, crescem difusamente por todo o meio. Em outras palavras, na ausncia da transformao o sobrenadante permanece claro, e somente crescimento sedimentado de clulas R ocorre. (Avery, MacLeod & MacCarty, 1944, p. 142)

A efetividade de diferentes partes do soro variava e que as diferenas observadas no foram necessariamente dependentes do contedo de anticorpos R, desde que muitos soros de alto ttulo foram incapazes de dar suporte transformao. Este fato sugere que outros fatores alm de anticorpos R esto envolvidos. (Avery, MacLeod, MacCarty, 1944, p. 139)

Em seu artigo de 1944, Avery, MacLeod e MacCarty discorreram sobre os mtodos para isolamento do princpio transformante. O material de origem do princpio ativo foi uma linhagem de pneumococos Tipo III que, dentre diversos procedimentos de crescimento e conservao, foram aquecidos a uma temperatura
Filosofia e Histria da Biologia, v. 3, p. 71-94, 2008.

79

de 65C por 30 minutos (para inativao da enzima intracelular que destri o princpio de transformao). As clulas mortas pelo calor foram lavadas com salina, o que promoveu a remoo de uma grande parte de polissacardeos capsulares, muitas das protenas e cido ribonuclico. Essas clulas foram ento extradas em salina contendo desoxicolato de sdio e separadas por centrifugao. Esses extratos foram combinados e precipitados em lcool etilo absoluto como o desoxicolato de sdio solvel em lcool, ele permaneceu no sobrenadante tendo sido retirado. O precipitado formou uma massa fibrosa que flutuava na superfcie do lcool, que foi retirada; o excesso de lcool drenado e o precipitado re-dissolvido em salina. O prximo passo foi a desproteinizao e a remoo do polissacardeo capsular, por meio do uso de uma preparao purificada da enzima de bactrias capaz de hidrolisar (ou quebrar) o polissacardeo capsular Tipo III. O mtodo de desproteinizao foi novamente aplicado para remover as enzimas protenas adicionadas e os traos de protenas de pneumococos restantes (Avery, MacLeod & MacCarty, 1944, p. 143). Seguiu-se um fracionamento repetido do material em lcool etlico, para se obter a maior poro de material ativo que pudesse estar presente no extrato bruto original. Tendo em vista a grande quantidade de informaes presentes e espao disponibilizado para o presente artigo, fizemos aqui uma breve descrio acerca dos procedimentos utilizados por Avery, MacLeod e McCarthy, principalmente no que se refere ao mtodo de titulao da atividade transformante e procedimentos para isolamento e purificao do princpio ativo. Essas tcnicas podem ser encontradas, respectivamente, de forma detalhada em Avery, MacLeod e MacCarty (1944, pp. 141-144). Na tentativa de identificar o princpio ativo, Avery, MacLeod & MacCarty (1944) realizaram anlises de diversas naturezas. Tratamos aqui de alguns aspectos relevantes presentes no referido artigo que reflete claramente uma busca incessante em relacionar o fator transformante ao DNA. Em anlises qumicas, foram examinadas quatro preparaes purificadas sobre o contedo de nitrognio, carbono, hidrognio e 80 1.3 Anlises do material transformante purificado

fsforo. A razo entre nitrognio/fsforo foi estabelecida. A mdia do valor das razes encontradas estava intimamente de acordo com aquele calculado nas bases da estrutura terica da desoxirribonuclease de sdio. Em seguida complementaram: Os nmeros analticos por si ss no estabelecem que a substncia isolada seja uma entidade qumica pura (Avery, MacLeod & MacCarty, 1944, p. 145).
Tabela II. Inativao do princpio transformante por preparaes de enzimas brutas (Avery, MacLeod & MacCarty, 1944, p. 146). Preparaes enzimticas brutas Fosfatase + + + _ + Atividade enzimtica Depolimerase Inativao do Trybutyrin para Desoxiprincpio esterase ribonuclease transformante + + _ + + + _ _ + + + _ _ + +

Mucosa intestinal de cachorro Fosfatase de osso de coelho Pneumococos autolisados5 Soro normal de coelho e cachorro Rim suno

Diversas enzimas foram testadas para sua capacidade de destruir a atividade biolgica em extratos potentes. O tratamento dos extratos com tripsina6, quimiotripsina e ribonuclease7 no tiveram nenhum efeito sob o princpio transformante. Este fato, segundo os autores, evidncia adicional que esta substncia no cido ribonuclico ou uma protena suscetvel da ao de enzimas trptiA autlise um processo pelo qual a clula se autodestri espontaneamente. A tripsina e a quimiotripsina so tipos de enzimas que agem sobre protenas. 7 Enzima que cliva a molcula de RNA pela hidrlise de suas ligaes.
5 6

Filosofia e Histria da Biologia, v. 3, p. 71-94, 2008.

81

cas (Avery, MacLeod & MacCarty, 1944, p. 146). Alm dessas enzimas, os testes envolveram preparaes enzimticas obtidas de rgo de vrios animais. Essas preparaes foram testadas em relao a diferentes atividades enzimticas e os resultados foram comparados com a capacidade de destruio do princpio transformante. A Tabela II resume os dados encontrados.
Tabela III. Inativao trmica diferencial de enzimas em soro de cachorro e coelho que destri a substncia transformante (Avery, MacLeod & MacCarty, 1944, p. 148). Testes triplicados Diluio* 1 Crescimento Difuso Forma da colnia somente R SIII SIII SIII SIII SIII 2 Crescimento Difuso Forma da colnia somente R SIII SIII SIII SIII SIII 3 Crescimento Difuso _ _ _ + + + + + Forma da colnia somente R SIII SIII SIII SIII SIII

Tratamento trmico do soro

No aquecido 1:5 Soro do cachorro

No _ diludo 1:25

_ _ _ + + + +

_ _

No + diludo 60C por + 1:5 30 min. + 1:25 No + diludo 65C por + 30 min. 1:5

82

No aquecido 1:5

No diludo 1:25

_ _ _

somente R SIII SIII SIII SIII SIII SIII

_ _ _ _ _ _ + + + +

somente R SIII SIII SIII SIII SIII SIII

_ _ _ _ _ _ + + + +

somente R SIII SIII SIII SIII SIII SIII

No _ diludo 60C por _ 1:5 30 min. _ 1:25

Soro do coelho

No + diludo 65C por + 1:5 30 min. + 1:25 Controle (nenhum soro) Nenhum No + diludo + 1:5 +

+ +

+ +

1:25

* Diluio da mistura da essncia do soro e substncia transformante.

Interessante foi a justificativa dada por Avery para a realizao do teste da atividade com a depolimerase:

Em cada anlise, os elementos anteriormente obtidos eram sempre considerados por exemplo, nas anlises qumicas ele havia obtido dados que o levaram a pensar que ao menos um dos componentes do princpio ativo poderia ser o DNA, ento, por
Filosofia e Histria da Biologia, v. 3, p. 71-94, 2008.

Visto que no material transformante altamente purificado isolado de extratos de pneumococos foi encontrado cido desoxirribonuclico, estas mesmas enzimas foram testadas para atividade depolimerase sob conhecidas amostras de cido desoxirribonuclico isolado. (Avery, MacLeod & MacCarty, 1944, p. 146)

83

que no testar a atividade da enzima que age sobre o DNA em relao ao princpio transformante? Sobre a anlise dos resultados dos testes acima realizados, os investigadores concluram que:
Independentemente da presena de fosfatase ou esterase somente aquelas preparaes que mostraram conter uma enzima capaz de despolimerizar amostras autnticas de cido desoxirribonuclico eram encontradas inativar o princpio transformante. (Avery, MacLeod & MacCarty, 1944, pp. 146-147)

Estes autores realizaram procedimentos, envolvendo o mtodo de titulao, descrito anteriormente, para verificar o efeito do soro de coelho e cachorro sob a atividade do princpio transformante. Os dados so apresentados na tabela III. Os dados apresentados na Tabela III indicam que, na ausncia de tratamento trmico, ambos os soros eram capazes de destruir completamente a atividade do fator transformante. Enquanto o aquecimento 60C foi suficiente para inativar completamente a enzima responsvel por destruir o princpio transformante presente no soro do cachorro; para destruio completa da enzima correspondente no soro do coelho foi necessrio aquecimento 65C. Essas mesmas amostras dos soros de cachorro e coelho foram testadas em relao as suas atividades de depolimerase sob uma preparao de desoxirribonuclease de sdio. A quantificao da atividade foi medida acerca da viscosidade. Basicamente, Avery, MacLeod e McCarthy encontraram que ambos os soros, quando no aquecidos, apresentavam baixa viscosidade, e, portanto, a atividade da depolimerase estava presente, entretanto, quando aquecidos 65C a viscosidade relativa era alta, ocorrendo destruio completa da depolimerase. Somente o fluoreto, dentre as vrias substncias testadas sobre suas capacidades em inibir a ao da enzima que destri o princpio de transformao, apresentou efeito significante. Segundo Avery havia sido encontrado que o fluoreto, nas mesmas concentraes, inibia tambm a despolimerizao do DNA.
O fato que a atividade transformante destruda somente por aquelas preparaes contendo depolimerase para cido desoxirribonuclico e que em ambos os exemplos as enzimas relacionadas

84

De acordo com as anlises sorolgicas, a perda de reatividade sorolgica do material ativo isolado indicou que constituintes como protenas de pneumococos e protenas capsulares estavam quase completamente removidas das preparaes finais. Percebemos que Avery, apesar de excluir a possibilidade da presena de protenas, no afirma convincentemente que o nico constituinte do princpio ativo seria o DNA. Nas frases: de especial interesse que no exemplo estudado, material altamente purificado e livre de protenas consistindo grandemente, se no exclusivamente (Avery, MacLeod & MacCarty, 1944, p. 152), e a evidncia apresentada suporta a crena que um cido nuclico do tipo desoxirribose a unidade fundamental do princpio transformante (Ibid., p. 156), a afirmao acima evidenciada. Destacamos a colocao de Avery sobre uma possvel limitao dos mtodos:
Os dados obtidos por anlises qumicas, [...] indicam que, dentro dos limites dos mtodos, a frao ativa no contm protenas demonstrveis [...] e consiste principalmente, se no somente, de forma altamente polimerizada, viscosa de cido desoxirribonuclico. (Avery, MacLeod & MacCarty, 1944, p. 156, sem nfase no original)

so inativadas para a mesma temperatura e inibidas pelo fluoreto fornecem evidncia adicional para a crena que o princpio ativo um cido nuclico do tipo desoxirribose. (Avery, MacLeod & MacCarty, 1944, pp. 149-150)

Na discusso, Avery, MacLeod e MacCarty (1944, p. 154) discorreram seus entendimentos acerca do processo envolvido na transformao:
Os eventos bioqumicos que so a base do fenmeno sugerem que o princpio transformante interage com a clula R causando uma srie coordenada de reaes enzimticas que culminam na sntese do antgeno capsular Tipo III. Os achados experimentais tm claramente demonstrado que as alteraes induzidas no so aleatrias mas previsveis, sempre correspondendo em especificidade do tipo para aquelas das clulas encapsuladas da qual a substncia transformante foi isolada. Uma vez que a transformao tem ocorrido, as caractersticas novamente adquiridas so desde ento transmitidas em sries atravs de inmeras transferncias em meio artificial sem nenhuma adio do agente transformante.

Filosofia e Histria da Biologia, v. 3, p. 71-94, 2008.

85

Avery relacionou s mudanas hereditariedade, mas no deixou claro o estabelecimento entre uma possvel funo do DNA nesse processo. As questes levantadas sobre a limitao dos mtodos e a identificao de uma entidade qumica talvez no pura podem ter aberto espao para um campo obscuro de dvidas.

[...] evidente, portanto, que no somente o material capsular reproduzido em sucessivas geraes mas que o fator primrio, que controla a ocorrncia e a especificidade do desenvolvimento capsular, tambm reduplicado nas clulas filhas. [...] Igualmente, se no mais significante o fato que estas mudanas so previsveis, tipo-especficas, e herdveis. (Avery, MacLeod & MacCarty, 1944, p. 154)

2 A APRESENTAO DOS RESULTADOS OBTIDOS

Dada a importncia dos estudos de Avery, MacLeod e McCarthy considerados como desencadeadores da idia de DNA como material gentico, os seus resultados so frequentemente abordados em livros-textos de Gentica e Bioqumica. Selecionamos alguns desses livros utilizados nos cursos de graduao em reas biolgicas, incluindo os cursos de Licenciatura em Cincias Biolgicas. A Tabela IV apresenta os ttulos das publicaes por ns analisadas: A seguir, uma discusso acerca das abordagens histricas apresentadas nas publicaes mencionadas na Tabela IV.

POR AVERY, MACLEOD E MCCARTHY NOS LIVROS DIDTICOS

2.1

Em estudos histricos que discutem sobre a contribuio de Avery, MacLeod e McCarthy possvel encontrar diferentes posies como, por exemplo, a de Pascal Acot que comentou:

Interpretaes historiogrficas sobre os resultados obtidos por Avery, MacLeod e McCarthy

Em nenhum momento Avery menciona a idia de hereditariedade nesse artigo. Muitos historiadores das cincias consideram que Avery focaliza estritamente sua reflexo no fator transformante do pneumococo, o que teria impedido de compreender plenamente o papel do DNA em matria de hereditariedade. (Acot, 2003, p. 4)

86

Tabela IV. Dados das publicaes analisadas

Ttulo Gentica Molecular Gentica Mdica Gentica Autor

Princpios bsicos de gentica molecular Gentica Princpios de Bioqumica Histria da Biologia Molecular A dupla revoluo da dupla hlice

Aron Gib. Debusk James. S. Thompson e Mar1974 garet W. Thompson. Eldon J. Gardner e D. Peter 1986 Snustad Irwin H. Herskowitz Rudolf Hausmann Pascal Acot William D. Stansfield Albert L. Lenhinger

Ano de publicao 1971

1971

2002

1985 2002

DNA: o segredo da vida

James D. Watson e Andrew Berry

2003 2005

Destacamos que Avery, MacLeod e McCarthy, na concluso de seu artigo, no evidenciaram a relao entre o DNA e hereditariedade. Porm, na introduo mencionaram os esforos de biologistas para entender quimicamente o mecanismo de induo de mudanas previsveis e especficas em organismos superiores que poderiam ser transmitidas em sries como caractersticas hereditrias. Em seguida, os autores relataram os exemplos de alteraes herdveis e especficas em microorganismos. No livro Histria da Biologia Molecular, Rudolf Hausmann tambm fez consideraes acerca da concluso do trabalho de Avery:
Em suma, o trabalho ao qual [...] Avery dedicou totalmente os ltimos anos da sua vida [...] era minucioso e inatacvel, valendo at hoje de competncia e tcnica e escrupulosidade. Porm a nica afirmao que os trs autores ousaram fazer foi: as observaes expostas apiam a suposio de que um cido nuclico, do tipo da desoxirribose, seja a unidade bsica do princpio transformante do Pneumococcus Tipo III. (Hausmann, 2002, p. 98)

Filosofia e Histria da Biologia, v. 3, p. 71-94, 2008.

87

Ressaltamos que Hausmann aventou que um dos motivos que levaram Avery a omitir a relao entre a hereditariedade e o DNA, pode ter sido:

Acot mencionou que alguns historiadores atribuem excessiva modstia de Avery o fato dele no ter interpretado o DNA como responsvel pela hereditariedade e acrescentou:

Porm, quem sabe?... Talvez o gene protico fosse especialmente termoresistente? Ou talvez fossem os genes protegidos pelo DNA, que possivelmente, desempenhavam uma funo decisiva, embora no determinante de especificidade? O engano de Willsttter8 em relao natureza das enzimas [...], cerca de 15 anos antes, ainda estava vvido na lembrana! Avery et al. (1944) se eximiam com cautelas. (Hausmann, 2002, p. 92)

Com relao s controvrsias acerca da aceitao dos resultados de Avery pela comunidade cientfica, elas so reportadas no livro DNA: o segredo da vida de James Dewey Watson e Andrew Berry da seguinte forma:
Em parte por causa das suas implicaes explosivas, a monografia apresentada em 1944 por Avery, MacLeod e McCarty foi recebida com sentimentos ambguos. Muitos geneticistas aceitaram as concluses. Afinal, se o DNA encontrado em todo cromossomo, por que no haveria de ser o material gentico por excelncia? Por sua vez, contudo, a maioria dos bioqumicos expressou dvida quanto ao DNA ser uma molcula suficientemente complexa para agir como repositrio de uma quantidade to vasta de in-

A seu favor, convm lembrar que em 1944 a comunidade cientfica no estava pronta para atribuir ao DNA um papel de hereditariedade, considerando que esta molcula era por demais regular e montona em comparao com a complexidade to rica das protenas. Muitos pesquisadores avanaram, portanto a idia de que os resultados de Avery podiam explicar-se por uma contaminao das preparaes de DNA pelos traos de protenas. (Acot, 2003, p. 4)

8 Segundo Hausmann, Richard Willsttter afirmava que enzimas no eram protenas (Hausmann, 2002).

88

Hausmann citou alguns autores, entre eles, Erwin Chargaff e Joshua Lederberg que enunciaram, aps a dcada de 60, a importncia dos trabalhos de Avery. Porm, ainda segundo Hausmann, nas publicaes de Chargaff (1950) e de Norton D. Zinder e Lederberg (1952), os trabalhos de Avery foram citados de forma irrelevante. Ele ainda acrescentou que, estes trabalhos foram omitidos em trs publicaes de 1953, na de James Watson e Francis Crick, na de Maurice H. F. Wilkings, Alex R. Stokes & Herbert R. Wilson e na de Rosalind Franklin e Raymond G. Gosling (Hausmann, 2002, pp. 92-93). A partir das consideraes anteriores, percebemos indcios que apontam para o baixo impacto dos trabalhos de Avery dentro da comunidade cientfica da poca. Alm das publicaes aqui analisadas que tratam da histria da biologia molecular, no livro texto de Lenhinger a hiptese de contaminao do preparado de DNA por vestgios proticos levantada por pesquisadores na poca tambm foi mencionada, conforme a citao a seguir:
Avery e seus colaboradores concluram que o DNA extrado da cepa virulenta transportava a mensagem geneticamente herdvel da virulncia. Nem todos aceitaram essas concluses, porque traos de impurezas proticas presente no DNA poderiam ter sido o transportador real da informao gentica. Essa possibilidade logo foi eliminada pela descoberta de que o tratamento do DNA com enzimas proteolticas no destrua a atividade transformadora, mas sim o tratamento com desoxirribonuclease (enzimas que hidrolisam o DNA). (Lenhinger, 2002, p. 256, sem nfase no original)

formaes biolgicas. Continuaram acreditando que as protenas, o outro componente dos cromossomos, acabariam por se revelar a substncia da hereditariedade. (Watson & Berry, 2005, p. 52)

Chamamos a ateno para o fato de que, Avery, MacLeod e McCarthy, diferente da afirmao de Lenhinger, no relacionaram o DNA hereditariedade diretamente. Alm disso, o trecho em destaque na citao anterior induz a pensar que os tratamentos com proteases, desoxirribonucleases e ribonucleases, foram realizados em um experimento posterior aos relatados no artigo de Avery, MacLeod e McCarthy (1944). Porm, nesse artigo, j esto descritos tais tratamentos.
Filosofia e Histria da Biologia, v. 3, p. 71-94, 2008.

89

Diante da constatao de que o livro texto citado anteriormente faz referncias a aspectos histricos do tema em questo, na prxima sub-seo discutimos as possveis abordagens histricas presentes nos livros textos analisados. Abordagens histricas dos trabalhos de Avery, MacLeod e McCarthy nos livros-textos analisados

2.2

Os trabalhos de Avery, MacLeod e McCarthy so abordados em todas as fontes por ns consultadas. Constatamos que, nos livros textos analisados, em geral, nos tpicos em que so descritos os experimentos de Avery acerca da natureza qumica do princpio transformante, h uma relao direta entre esse e o material gentico. Por exemplo, em Aron Gib Debusk (1971), o tpico intitula-se O DNA como material gentico. Idia similar apresentada nos tpicos de Gardner e Snustad (1986) e Lenhinger (2002), em que os trabalhos de Avery so discutidos. Contudo, conforme j comentamos na anlise histrica, esta relao no claramente estabelecida por Avery, MacLeod e McCarthy. Em Thompson e Thompson (1974), a palavra Evidncias no ttulo do tpico, sugere certa cautela na abordagem dos experimentos de Avery como evidncias de que o DNA o material gentico. J em Herskowitz (1971), o ttulo A transformao gentica de bactrias aparentemente preocupa-se em fornecer informaes recentes acerca da transformao, pois utiliza a palavra gentica que no foi empregada por Griffith em seus trabalhos sobre transformao bacteriana e nem por Avery, MacLeod e McCarthy. Para Lenhinger, os trabalhos de Avery foram a primeira evidncia direta de que o DNA o possuidor da informao gentica (Lenhinger, 2002). Esta opinio compartilhada pelos outros autores de livros-textos por ns analisados, ver tabela IV. No entanto, conforme discutido no subitem anterior, evidncias sugerem que pesquisadores renomados da poca no consideraram em suas pesquisas os dados obtidos por Avery sendo estes completamente ignorados. Isso parece estabelecer uma enorme contradio entre o que livro-texto dispe atualmente como fundamental evidncia ao desenvolvimento da relao DNA - informao gentica e a importncia atribuda aos trabalhos, no perodo em que foram publicados, que permeavam essa idia. 90

Herskowitz (1971) fez uma breve descrio a respeito da maneira como o material gentico de uma bactria pode ser modificado por DNA de uma linhagem diferente, porm em momento algum mencionou os nomes de Griffith ou Avery. Interpretamos essa abordagem como ahistrica. Stansfield (1985) no fez referncia aos trabalhos de Avery. Lenhinger (2002), apesar de iniciar a temtica aqui tratada com uma perspectiva histrica diacrnica, se referindo aos estudos do ncleo da clula, posteriormente, quando se referiu relao do DNA com a informao gentica fez uma descrio bastante simplista dos experimentos de Avery:
Esses pesquisadores descobriram que o DNA extrado de uma cepa virulenta (causadora da doena) da bactria Streptococcus pneumoniae, tambm conhecida como pneumococo, transformava geneticamente uma cepa no-virulenta desse organismo em uma forma virulenta. (Lenhinger, 2002, p. 256)

Ressaltamos que Avery, MacLeod e McCarthy no utilizaram expresses como transformava geneticamente. Em Thompson e Thompson observamos uma histria anacrnica: A interpretao foi de que algum DNA do Tipo III S foi incorporado ao material gentico dos II R, ocasionando uma transformao permanente (Thompson & Thompson, 1974, p. 23). Consideramos as abordagens de Lenhinger (2002) e Thompson e Thompson (1974), anteriormente mencionadas, problemticas, pois as explicaes atuais foram utilizadas como se tivessem sido dadas por Avery, o que ocasiona distores histricas. Em DeBusk, encontramos uma histria pautada em nomes e datas: Foi somente em 1944 que trs pesquisadores, Avery, MacLeod e McCarty, realizaram o experimento crucial de fracionamento das clulas mortas para identificar a substncia responsvel pela transformao (Debusk, 1971, p. 19) o que frente a todo o contexto cientfico metodolgico em que os experimentos de Avery ocorreram extremamente reducionista. No livro Gentica, embora os experimentos de Avery no tenham sido tratados de forma detalhada, os autores lembraram que Avery, MacLeod e McCarty publicaram o resultado de um conjunto de extensos e trabalhosos experimentos (Gardner & SnusFilosofia e Histria da Biologia, v. 3, p. 71-94, 2008.

91

tad, 1986, p. 64). H um panorama geral do contexto cientfico existente durante os trabalhos de transformao de pneumococos, principalmente queles referentes a Griffith o que a nosso ver permite que os leitores desse livro reconheam que a construo de um conhecimento cientfico no se d de forma isolada ou pontual.

3 CONSIDERAES FINAIS

Percebemos que o artigo de Avery, MacLeod e McCarthy (1944) foi decorrente de estudos anteriores efetuados por eles, bem como por outros pesquisadores, entre os quais Griffith, Alloway e Dawson que estavam inseridos num contexto de trabalhos sobre transformao bacteriana. As fontes secundrias por ns consultadas, que tratam da histria da biologia molecular, reforam a idia de que h um hiato entre a publicao do artigo de 1944 e o reconhecimento da molcula de DNA como material gentico. Porm, nenhuma delas discute profundamente as causas desse fato. Com relao aos livros-textos analisados, consideramos que em geral h uma abordagem histrica superficial do tema estudado, sendo que, alguns deles apresentam informaes que no so consistentes com o artigo de Avery, por exemplo, Acot (2003) e Lenhinger (2002). Reforamos a necessidade de novos estudos relacionados ao tema, baseados em fontes primrias e secundrias confiveis o que principal objeto de uma pesquisa mais aprofundada que estamos desenvolvendo. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

ACOT, Pascal. A dupla revoluo da dupla hlice. Cincia & Ambiente 26: 7-26, 2003. ALLOWAY, J. Lionel. The transformation in vitro of R pneumococci into S forms of different specific types by the use of filtered pneumococcus extracts. The Journal of Experimental Medicine 55: 91-99, 1932. . Further observations on the use of pneumococcus extracts in effecting transformation of type in vitro. The Journal of Experimental Medicine 57 (2): 265-278, 1933. AVERY, Oswald Teodore.; MACLEOD, Colin M.; MACCARTY, Maclyn. Studies on the chemical nature of the 92

substance inducing transformation of pneumococcal types. Induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus Type III. The Journal of Experimental Medicine 79: 137-158, 1944. CHARGAFF, Erwin. Chemical specificity of nucleic acids and mechanism of their enzymatic degradation. Experientia 6: 201240, 1950. DAWSON, Martin H. The interconvertibility of R and S forms of pneumococcus. The Journal of Experimental Medicine 47 (4): 577591, 1928. DAWSON, Martin H.; SIA, Richard H. P. In vitro transformation of pneumococcal types. I. A technique for inducing transformation of pneumococcal types in vitro. The Journal of Experimental Medicine 54: 681-699, 1931. DEBUSK, Aron Gib. Gentica molecular. Trad. Jos. T. do Amaral Gurgel e Joo Lcio Azevedo. So Paulo: Universidade de So Paulo/Polgono, 1971. GARDNER, Eldon J.; SNUSTAD. D. Peter. Gentica. Trad. Cludia Nunes Duarte dos Santos et. al. 7. ed. Rio de Janeiro: Guanabara, 1986. GRIFFITH, Frederick. The significance of pneumococcal types. The Jounal of Higiene 64 (2): 129-165, 1966. HAUSMANN, Rudolf. Histria da biologia molecular. Trad. Celma E. Lynch de Arajo Hausmann. 2. ed. Ribeiro Preto: Fundao de Pesquisas Cientficas de Ribeiro Preto, 2002. HERSKOWITZ, Irwin H. Princpios bsicos de gentica molecular. Trad. Eleneide R. de S. Nazareth e Joyce A. D. Andrade. So Paulo: Companhia Editora Nacional/Editora da USP, 1971. LENHINGER, Albert Lester. Princpios de bioqumica. Trad. Arnaldo Antnio Simes e Wilson Roberto Navega Lodi. 3. ed. So Paulo: Sarvier, 2002. STANSFIELD, William D. Gentica. Trad. Temis R. Saiz Jarbado. 2. ed. So Paulo: McGraw-Hill do Brasil, 1985. THOMPSON, James S.; THOMPSON, Margaret W. Gentica mdica. Trad. Paulo Armando Motta. So Paulo: Atheneu, 1974. WATSON, James Dewey; BERRY, Andrew. DNA: o segredo da vida. Trad. Carlos Afonso Malferrari. So Paulo: Companhia das Letras, 2005.
Filosofia e Histria da Biologia, v. 3, p. 71-94, 2008.

93

ZINDER, Norton D.; LEDERBERG, Joshua. Genetic exchange in Salmonella. Journal of Bacteriology 64: 679-99, 1952.

94