Dirio Oficial da Unio Seo 1

N 224, quarta-feira, 21 de novembro de 2012

RESOLUO DA DIRETORIA COLEGIADA - RDC N 55 DE 14 DE NOVEMBRO DE 2012 Dispe sobre os detergentes enzimticos de uso restrito em estabelecimentos de assistncia sade com indicao para limpeza de dispositivos mdicos e d outras providncias. A Diretoria Colegiada da Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria, no uso das atribuies que lhe conferem os incisos III e IV, do art. 15 da Lei n. 9.782, de 26 de janeiro de 1999, o inciso II, e 1 e 3 do art. 54 do Regimento Interno aprovado nos termos do Anexo I da Portaria n 354 da ANVISA, de 11 de agosto de 2006, republicada no DOU de 21 de agosto de 2006, e suas atualizaes, tendo em vista o disposto nos incisos III, do art. 2, III e IV, do art. 7 da Lei n. 9.782, de 1999, e o Programa de Melhoria do Processo de Regulamentao da Agncia, institudo por meio da Portaria n 422, de 16 de abril de 2008, em reunio realizada em 30 de outubro de 2012, adota a seguinte Resoluo da Diretoria Colegiada e eu, DiretorPresidente, determino a sua publicao: Art. 1 Fica aprovado o regulamento que estabelece os requisitos mnimos para detergentes enzimticos de uso restrito em estabelecimentos de assistncia sade com indicao para limpeza de dispositivos mdicos. CAPTULO I DAS DISPOSIES INICIAIS Seo I Objetivo Art. 2 Este regulamento possui o objetivo de estabelecer definies, caractersticas gerais, requisitos tcnicos e de rotulagem para o registro de produtos categorizados como detergentes enzimticos de uso restrito em estabelecimentos de assistncia sade com indicao para limpeza de dispositivos mdicos, de forma a minimizar o risco sade. Seo II Abrangncia Art. 3 Este regulamento se aplica aos detergentes enzimticos de uso restrito em estabelecimentos de assistncia sade e com indicao de uso para limpeza de dispositivos mdicos. Seo III Definies Art. 4 Para efeito deste regulamento, so adotadas as seguintes definies: I detergente enzimtico para limpeza de dispositivos mdicos: produto cuja formulao contm, alm de um tensoativo, pelo menos uma enzima hidroltica da subclasse das proteases EC 3.4, podendo ser acrescida de outra enzima da subclasse das amilases EC 3.2 e demais componentes complementares da formulao, inclusive de enzimas de outras subclasses, tendo como finalidade remover a sujidade clnica e evitar a formao de compostos insolveis na superfcie desses dispositivos; II atividade enzimtica em detergentes: capacidade que a enzima possui em catalisar uma reao, degradando substratos especficos, desde que o complexo enzimtico contido no detergente esteja em condies ativas dentro da formulao; III enzima hidroltica (EC 3): enzima capaz de catalisar uma reao de hidrlise;

IV enzima proteoltica (EC 3.4): enzima capaz de catalisar a hidrlise de ligaes peptdicas; V - enzima lipoltica (EC 3.1): enzima capaz de catalisar a hidrlise de ligaes steres de lipdeos; VI - substrato: molculas ou substncias-alvo cuja enzima capaz de catalisar sua reao; VII estabelecimentos de assistncia sade: nome genrico dado a qualquer local ou ambiente fsico destinado prestao de assistncia sade da populao, tais como: hospitais, clnicas, consultrios, entre outros; VIII dispositivo mdico: produto para a sade, tal como instrumento, aparelho, equipamento, material ou outro artigo, utilizado isoladamente ou em combinao, destinado pelo fabricante a ser utilizado em seres humanos para fins de diagnstico, preveno, controle, tratamento, atenuao de uma doena, compensao de uma leso ou deficincia, ou controle de concepo e que no tem o objetivo de agir no corpo humano por meios farmacolgicos, imunolgicos ou metablicos, mas que pode ser assistido nas suas funes por tais meios; IX - sujidade clnica: substncia composta de matria inorgnica, orgnica ou biolgica, tipicamente encontrada em dispositivos mdicos aps uso clnico; X limpeza de dispositivos mdicos: a remoo de sujidade clnica de objetos e superfcies por meio de atividade manual ou mecnica; XI produtos de aplicao/manipulao profissional: so os produtos que, por sua forma de apresentao, toxicidade ou uso especfico, devem ser aplicados ou manipulados exclusivamente por profissional devidamente treinado, capacitado ou por empresa especializada. CAPTULO II DAS CARACTERSTICAS GERAIS Art. 5 Os produtos abrangidos por este regulamento so considerados de Risco 2 e esto sujeitos ao registro na Anvisa. Art. 6 Todos os laudos exigidos por este regulamento devem ser emitidos por laboratrios acreditados pelo Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia - Inmetro ou Habilitados na Rede Brasileira de Laboratrios Analticos em Sade Reblas. Art. 7 O registro de detergentes enzimticos para uso em estabelecimentos de assistncia sade e com indicao para limpeza de dispositivos mdicos fica restrito aplicao/manipulao profissional. Art. 8 Os detergentes enzimticos para limpeza de dispositivos mdicos devem apresentar composio condizente com sua finalidade, no podendo conter substncias que comprometam a atividade das enzimas ou que danifiquem os materiais e equipamentos que entrem em contato com estes produtos. Art. 9 Para os detergentes enzimticos com indicao de uso para limpeza de dispositivos mdicos que contenham apenas um tipo de enzima, essa deve ser da subclasse das proteases EC 3.4. Art. 10 Os detergentes enzimticos para limpeza de dispositivos mdicos no podem conter enzimas que comprometam a sade da populao, conforme as normas vigentes. Art. 11 Os detergentes enzimticos para limpeza de dispositivos mdicos quando estiverem associados a substncias com atividade antimicrobiana, devem obedecer legislao especfica, bem como cumprir o disposto neste regulamento.

Art. 12 Na formulao dos produtos de que trata este regulamento no so permitidas substncias que sejam comprovadamente carcinognicas, mutagnicas e teratognicas para o homem segundo a Agncia Internacional de Investigao sobre o Cncer da Organizao Mundial de Sade (IARC/OMS). Art. 13 As embalagens para os produtos de que trata este regulamento no devem permitir a migrao de substncias txicas das mesmas para o produto, bem como migrao do produto para o meio externo e devem ter caractersticas que garantam a estabilidade durante o seu prazo de validade. CAPTULO III DOS REQUISITOS PARA O REGISTRO Art. 14 Para obteno do registro sanitrio dos produtos abrangidos no presente regulamento, o interessado dever apresentar os seguintes documentos: I formulrios emitidos pelo peticionamento eletrnico; II - literatura e/ou ficha tcnica dos componentes da frmula que no possuam nmero de inscrio no Chemical Abstracts Service (CAS); III - documentao do fornecedor de todas as enzimas constantes da formulao informando a nomenclatura adotada pela International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB), incluindo o nmero completo do cdigo e a descrio da origem biolgica contendo o gnero e a espcie; IV - laudo da atividade proteoltica. A atividade amioltica deve ser comprovada de acordo com a presena de enzima da subclasse das amilases EC 3.2 na formulao; V - laudo de pH do produto puro e na diluio de uso; VI - estudo de estabilidade acelerado ou de longa durao para comprovao da atividade enzimtica durante o prazo de validade proposto; VII peso molecular dos tensoativos utilizados na formulao; VIII - modelo de rtulo em duas vias, em papel A4, conforme o original, impresso colorido e em resoluo que permita a leitura dos dizeres e com as cores e matizes do rtulo final. Sendo necessrio, efetuar a reduo para adequar ao tamanho A4, informando a relao de escala; IX - desenho, croqui ou foto da embalagem; X - dados gerais da empresa, tais como: Razo social, nome do responsvel legal, nome e nmero de registro do responsvel tcnico no conselho da categoria, endereo completo, nmero de telefone e fax. 1 No caso dos produtos tratados no inciso V cujo pH no possa ser medido na forma pura, esses devem ser avaliados na diluio de uso. 2 Os resultados encontrados ao final do estudo de estabilidade tratados no inciso VI devero ser declarados na rotulagem do produto. Art. 15 Os ensaios de atividade enzimtica devem ser realizados com o produto puro, quando este for para pronto uso, ou na diluio de uso recomendada pelo fabricante e devem obedecer ao disposto no ANEXO a esse regulamento. CAPTULO IV DA ROTULAGEM

Art. 16 As palavras em destaque no rtulo devem ser impressas em negrito com, no mnimo, o dobro de altura do tamanho do restante do texto. Art. 17 Os dizeres de rotulagem devem ser indelveis, legveis, com limite mnimo de 1 mm de altura, sendo que a cor e o tipo das letras usadas no podem se confundir com o fundo. Art. 18 O rtulo do produto no pode conter etiquetas e dados escritos a mo e os dizeres no podem ser apagados ou rasurados durante a vigncia do prazo de validade. Art. 19 proibida a inscrio de lote, data de fabricao e validade na tampa do produto. Art. 20 No pode haver indicao de: NO TXICO, SEGURO, INCUO, NO PREJUDICIAL ou outras indicaes similares. No devem constar tambm termos superlativos tais como: O MELHOR, INCOMPARVEL, O MENOS AGRESSIVO ou similar. Art. 21 Quando a superfcie da embalagem no permitir a indicao da forma de uso, precaues e cuidados especiais, estas devem ser indicadas em prospectos ou equivalente, que acompanhem obrigatoriamente o produto, devendo na rotulagem figurar a advertncia: "ANTES DE USAR, LEIA AS INSTRUES DO PROSPECTO EXPLICATIVO" ou frase equivalente. Art. 22 O painel principal (face imediatamente voltada para o consumidor; mesmo painel onde est localizado o nome comercial do produto), dever conter as seguintes informaes: I - marca e/ou nome do produto; II - categoria do produto: DETERGENTE ENZIMTICO; III - destinao de uso: ASSISTNCIA SADE; IV - indicao quantitativa relativa ao contedo lquido da embalagem; V - a frase ANTES DE USAR, LEIA AS INSTRUES DO RTULO, em destaque e em letras maisculas; VI - a frase CONSERVE FORA DO ALCANCE DAS CRIANAS E DOS ANIMAIS DOMSTICOS, em destaque e em letras maisculas; VII - a frase PRODUTO EXCLUSIVAMENTE DE USO PROFISSIONAL PROIBIDA A VENDA DIRETA AO PUBLICO, que deve estar em destaque e em letras maisculas, ocupando uma rea igual ocupada pelo nome comercial ou tendo cada uma das letras altura de no mnimo 1/25 (um vinte e cinco avos) da maior altura do painel principal com no menos que 0,3 cm. Art. 23 O painel principal ou secundrio dever trazer as seguintes informaes: I Instrues sobre o uso do produto, com as seguintes informaes: a) recomendaes quanto qualidade da gua utilizada no preparo da soluo de limpeza (pH, condutividade e dureza); b) informaes a respeito da diluio de uso do produto que deve ser expressa em porcentagem, relao produto/diluente ou seus equivalentes no Sistema Mtrico Decimal; c) temperatura e tempo de imerso; d) para produtos de pronto uso, exceto para produtos na forma de aerossis e/ou pulverizados, a frase: A REUTILIZAO DO PRODUTO PODE PROVOCAR

PERDA DA EFICINCIA. Essa frase deve estar em destaque e em letras maisculas; e) para produtos com diluio de uso, as frases: UTILIZAR IMEDIATAMENTE APS O PREPARO. A REUTILIZAO DA SOLUO DE LIMPEZA PODE PROVOCAR PERDA DA EFICINCIA. Estas frases devem estar em destaque e em letras maisculas. II- Informaes sobre composio qualitativa e princpio ativo, obedecendo aos seguintes critrios: a) na composio do produto os princpios ativos (tensoativos e enzimas) e outros componentes de importncia toxicolgica devem ser indicados pelo nome qumico aceito internacionalmente e os demais componentes da formulao por sua funo; b) devem ser informados os teores dos tensoativos em porcentagem peso por peso (% p/p); c) a atividade enzimtica mnima encontrada ao final do estudo de estabilidade deve ser expressa em Unidades de Atividade Enzimtica, conforme definido no anexo a esse regulamento. Os valores devem ser representados por nmeros inteiros, decimais ou exponenciais, sempre com arredondamento na segunda casa decimal aps a vrgula, e por meio da expresso designativa abaixo: 1. Atividade Proteoltca mnina: _ _,_ _ UP.mL .min ; 2. Atividade Amiloltica mnima: _ _,_ _ UA.mL .min .
-1 -1 -1 -1

III faixa de pH do produto puro e na diluio de uso quando este no for lquido; IV - lote ou partida e data de fabricao; V - o prazo de validade deve ser descrito na rotulagem dos produtos por meio das expresses designativas abaixo, suas abreviaes ou outras expresses equivalentes: a) VLIDO AT: (MS/ANO) ou b) VLIDO POR: ____ MESES, a partir da data de fabricao., incluindo DATA DE FABRICAO (MS/ANO) ou c) USAR EM ____ MESES, a partir da data de fabricao., incluindo DATA DE FABRICAO (MS/ANO). VI - dados do Fabricante e/ou Distribuidor e/ou Importador: a) razo social, endereo e Cadastro Nacional da Pessoa Jurdica (CNPJ) do fabricante e/ou distribuidor e/ou importador; b) Indstria Brasileira ou o nome do pas de origem do produto, no caso de produto importado; c) nmero do registro do produto junto a Anvisa/MS; d) nmero de telefone do Servio de Atendimento ao Consumidor SAC; e) telefone para emergncias toxicolgicas, Centro de Intoxicaes (CEATOX), ou servio equivalente. O nmero do disque-Intoxicao 0800-722-6001 disponibilizado pela Anvisa, que coordena a Rede Nacional de Centros de Informao e Assistncia Toxicolgica (Renaciat), poder ser informado.

VII - frases de advertncia: a) inserir a frase: ATENO! Provoca irritao ocular e cutnea. Usar luvas, avental, culos e mscara de proteo durante a manipulao do produto.. Essa frase pode ser omitida se for comprovado que o produto puro, ou na diluio de uso, quando este no for lquido, enquadra-se na classificao drmica e ocular primria como no irritante ou levemente irritante, de acordo com o teste de Draize em coelhos albinos ou atravs de ensaios in vitro devidamente validados e aceitos pela Autoridade Sanitria competente; b) inserir o smbolo de substncia irritante (figura 1) que deve ter altura equivalente a 15% da maior altura do painel principal e no inferior a 1,0 cm de altura. O smbolo deve ser na cor preta em fundo branco e com moldura vermelha (no padro CMYK: C0M100Y100K0, referncia: Pantone 485). Esse smbolo pode ser omitido se for comprovado que o produto puro ou na diluio de uso, quando este no for lquido, enquadra-se na classificao drmica e ocular primria como no irritante ou levemente irritante, conforme descrito no subitem anterior;

Figura 1. c) No misturar com outros produtos, exceto se tal procedimento estiver indicado pelo fabricante do produto no rtulo; d) Mantenha o produto em sua embalagem original; e) No reutilize as embalagens vazias. VIII - frases de precauo: a) No ingerir. Evite inalao ou aspirao, contato com os olhos ou com a pele; IX - primeiros socorros: a) Em caso de contato com os olhos ou a pele, lave imediatamente com gua em abundncia; b) Em caso de ingesto, no provoque vmito e consulte imediatamente o Centro de Intoxicaes ou o mdico levando o rtulo do produto. CAPTULO V DOS ENSAIOS ANALTICOS PARA DETERMINAO DA ATIVIDADE ENZIMTICA Art. 24 Os ensaios de atividade enzimtica devem obedecer ao disposto no anexo a esse regulamento. Art. 25 A solicitao de incluso e/ou excluso, modificao ou adaptao aos mtodos de ensaio de atividade enzimtica estabelecidos no anexo a esse regulamento, devem ser encaminhada Anvisa, na forma de relatrio, para avaliao. O relatrio deve conter as seguintes informaes:

I justificativa tcnica; II fundamento terico da proposta; III bibliografia sobre o assunto; IV protocolo e estudo final de validao, contemplado no mnimo os parmetros de especificidade, seletividade, linearidade, intervalo, preciso, recuperao, robustez, limite de quantificao e exatido.

CAPTULO VI DAS DISPOSIES FINAIS E TRANSITRIAS Art. 26 A partir da publicao desta resoluo, o registro de novos produtos deve atender na ntegra este regulamento. Art. 27 Concede-se o prazo de 360 dias para que os produtos anteriormente notificados sejam ajustados aos dispositivos desta resoluo. Art. 28 O descumprimento das disposies contidas nesta resoluo e no regulamento por ela aprovado constitui infrao sanitria, nos termos da Lei n 6.437, de 20 de agosto de 1977, sem prejuzo das responsabilidades civil, administrativa e penal cabveis. Art. 29 Esta resoluo entra em vigor na data de sua publicao.

DIRCEU BRS APARECIDO BARBANO

ANEXO METODOLOGIA ANALTICA PARA DETERMINAO DA ATIVIDADE PROTEOLTICA UTILIZANDO AZOCASENA COMO SUBSTRATO EM DETERGENTES ENZIMTICOS.

I - CONSIDERAES GERAIS: a) Todos os reagentes utilizados nos ensaios devem ser de grau analtico; b) Todos os ensaios devem ser realizados no mnimo em triplicata, utilizando um branco para cada amostra; c) So adotadas as seguintes condies padres de ensaio: 1. Temperatura de incubao: (40 1)C; 2. Sistema tamponante: tris-HCl 0,05M pH 8,0; 3. Tempo de reao: 15 minutos. II - PRINCPIO: a) Este mtodo se baseia na determinao da atividade proteoltica pela quantificao do grupamento azo liberado pela hidrlise do substrato cromognico azocasena.

III - EQUIPAMENTOS: a) Espectrofotmetro UV/VIS; b) Centrfuga para microtubos; c) Banho-termosttico. IV - MATERIAL UTILIZADO: a) Bqueres; b) Bales volumtricos; c) Provetas; d) Micropipetas para volumes de 100 a 1000L; e) Microtubos de 2mL; f) Cubetas para espectrofotmetro com 1cm de caminho ptico.

V - REAGENTES: a) Tris (tris-hidroximetil-aminometano); b) cido clordrico 37%; c) cido tricloroactico (TCA); d) Azocasena.

VI - PREPARO DE SOLUES: a) Soluo de cido clordrico 1 M 1. Diluir 8,5mL de cido clordrico (d = 1,18 g/mL e concentrao de 37%) em gua destilada e completar o volume para 100mL. b) Sistema tamponante: Tampo tris-HCl 0,05M pH 8,0: 1. Dissolver 0,605g de tris em 90mL de gua destilada. Adicionar HCl 1M at atingir o pH 8,0. Completar o volume para 100mL. Estocar a (5 3)C por no mximo uma semana. c) Substrato: Soluo de azocasena a 2% (m/v): 1. Dissolver 2g de azocasena em 100mL de gua destilada. Esta soluo deve ser preparada no dia da anlise. d) Soluo de parada da reao: Soluo de cido tricloroactico (TCA) 20% (m/v): 1. Dissolver 20g de cido tricloroactico em 100mL de gua destilada. Estocar a (5 3)C por no mximo uma semana. VII - MTODO DE ENSAIO.

a) Preparo da amostra 1. A amostra dever ser preparada na diluio de uso declarada pelo fabricante. b) Ensaio da amostra: 1. Em um microtubo de 2mL, adicionar 200L de tampo tris-HCl 0,05M e 100L do substrato (azocasena 2%); 2. Incubar em banho-termosttico a (40 1)C e deixar atingir o equilbrio trmico (aproximadamente de 1 a 2 minutos); 3. Adicionar 100L da amostra a temperatura ambiente, preparada conforme item VII a nos microtubos, em intervalos de tempo previamente estipulados (15 a 30 segundos) entre as adies, e incubar no banho por 15 minutos na mesma temperatura; 4. Parar a reao adicionando 800L de TCA 20% observando os intervalos estipulados (15 a 30 segundos) para que o tempo de reao (15 minutos) seja o mesmo em todos os microtubos; 5. Em seguida, centrifugar os microtubos a 6000g (no mnimo) por 5 minutos, recolher o sobrenadante e ler em espectrofotmetro a 400nm; c) Ensaio do branco da amostra: 1. Preparar um branco adicionando em um microtubo de 2mL, 200L de tampo tris-HCl 0,05M, 100L de azocasena 2% e 800L de TCA 20%; 2. Acondicionar em banho-termosttico a (40 1)C, deixar atingir o equilbrio trmico (aproximadamente de 1 a 2 minutos); 3. Adicionar 100L de amostra e deixar no banho por 15 minutos a mesma temperatura; 4. Em seguida centrifugar os microtubos a 6000g (no mnimo) por 5 minutos, recolher o sobrenadante e ler em espectrofotmetro a 400nm. VIII - RESULTADO. a) Definio da Unidade de Atividade Proteoltica (UP.mL .min. ): 1. Definida como a quantidade de enzima necessria para produzir uma variao de uma unidade de Densidade ptica (DO) em uma cubeta de 1cm de caminho ptico por mL de amostra por minuto, sob condies padres. b) Clculo do resultado:
-1 -1

Atividade Pr oteoltica [UP.mL1 . min . 1 ] =

ONDE: ABSAM ABSBR

( ABS AM

ABS BR ) * 10 15

absorbncia da amostra. absorbncia do branco da amostra.

OBS.: caso a amostra no possa ser analisada na diluio de uso (em virtude da atividade proteoltica gerar uma densidade ptica maior do que o limite mximo de confiana do

espectrofotmetro = 0,9), realizar diluio 5 vezes da amostra descrita no item VII a; se necessrio, realizar diluies subseqentes (ex.: 10 vezes, 15 vezes, e assim sucessivamente). .

Atividade Pr oteoltica [UP.mL1 . min .1 ] =

ONDE: ABSAM ABSBR fd

( ABS AM

ABS BR ) * 10 * fd 15

absorbncia da amostra absorbncia do branco da amostra fator de diluio

Para o clculo da atividade, deve ser considerada somente a primeira diluio que apresentar resultado dentro da faixa de deteco do aparelho (a leitura da absorbncia deve ficar entre 0,1 e 0,9).

METODOLOGIA ANALTICA PARA DETERMINAO DA ATIVIDADE AMILOLTICA UTILIZANDO AMIDO SOLVEL COMO SUBSTRATO EM DETERGENTES ENZIMTICOS.

I - CONSIDERAES GERAIS: a) Todos os reagentes utilizados nos ensaios devem ser de grau analtico; b) Todos os ensaios devem ser realizados no mnimo em triplicata, utilizando um branco para cada amostra; c) So adotadas as seguintes Condies Padres de Ensaio: 1. Temperatura de incubao: (40 1)C. 2. Sistema tamponante: citrato-fosfato 0,05M pH 6,0. 3. Tempo de reao: 30 minutos. II - PRINCPIO: a) Este mtodo baseia-se na determinao da atividade amiloltica pela quantificao dos acares redutores liberados pela reao de hidrlise do amido catalisada por amilases. III - EQUIPAMENTOS: a) Espectrofotmetro UV/VIS; b) Banho-termosttico; c) Placa de aquecimento.

IV - MATERIAL UTILIZADO: a) Bqueres; b) Bales volumtricos;

10

c) Pipetas volumtricas de 15mL; d) Provetas; e) Micropipetas para volumes de 10 a 5000L; f) Tubos de ensaio com capacidade mnima de 25mL com tampa;

g) Cubetas para espectrofotmetro com 1cm de caminho ptico.

V - REAGENTES: a) Amido solvel; b) cido ctrico; c) Fosfato de sdio dibsico; d) Glicose; e) Hidrxido de sdio; f) Tartarato de sdio e potssio;

g) Metabissulfito de sdio; h) Fenol; i) cido 3,5-dinitrosaliclico;

VI - PREPARO DE SOLUES: a) Soluo de cido ctrico 0,05M: dissolver 1,05g de cido ctrico em 100mL de gua destilada. b) Soluo de fosfato de sdio dibsico 0,05M: dissolver 1,38g de fosfato de sdio dibsico em 100mL de gua destilada. c) Sistema tamponante (tampo citrato-fosfato 0,05M pH 6,0): em um balo de 100mL, adicionar 36 mL de cido ctrico 0,05M e juntar com 64 mL de fosfato de sdio dibsico 0,05M. Se necessrio, corrigir o pH com uma destas solues. Estocar a (5 3)C por no mximo uma semana.

d) Substrato: Soluo de amido solvel 1% (m/v): dissolver 1g de amido em 100mL de gua destilada, aquecer at a fervura, esfriar e completar o volume novamente para 100mL. Esta soluo deve ser preparada no dia da anlise. e) Soluo padro de glicose 55,6 mol.mL (1% m/v): dissolver 1g de glicose em 100mL de gua destilada, considerando a pureza do reagente.
-1

f)

Reagente de cido 3,5-dinitrosaliclico (reagente DNS): em 236mL de gua destilada adicionar 3,0g de hidrxido de sdio e dissolver at solubilizao total. A partir desta soluo, adicionar sequencialmente 51g de tartarato de sdio e potssio, 1,38g de metabissulfito de sdio, 0,63g de fenol e 1,77g de cido 3,5-dinitrosaliclico.

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OBS.: a adio de cada reagente dever ser feita aps a dissoluo do reagente anterior. VII - MTODO DE ENSAIO. a) Curva analtica de glicose: 1. Transferir 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120 e 140L da soluo glicose a -1 55,6mol.mL para tubos de ensaio com tampa; 2. Adicionar respectivamente 600, 580, 560, 540, 520, 500, 480 e 460L de tampo citrato-fosfato 0,05M, pH 6,0, conforme tabela 1.

Tabela 1. Valores para construo da curva de calibrao de glicose. Tubo N 0 1 2 3 4 5 6 7 Volume da soluo de glicose 1% (L) 0 20 40 60 80 100 120 140 Volume de tampo (L) 600 580 560 540 520 500 480 460 Conc. final de glicose -1 (mol. mL ) 0,000 0,06515 0,1303 0,1954 0,2609 0,3257 0,3909 0,4560

3. Adicionar 1,5 mL de reagente DNS; 4. Em seguida ferver por 5 minutos em banho-maria; 5. Aps os 5 minutos de fervura, resfriar os tubos transferindo-os para outro becker contendo gua a temperatura ambiente; 6. Aps resfriamento dos tubos de ensaio, adicionar 15 mL de gua destilada em cada tubo de ensaio; 7. Agitar os tubos de ensaio fechados; 8. Ler em espectrofotmetro a 550nm; 9. Construir uma curva analtica para glicose (concentrao de glicose [mol] vs. absorbncia), utilizando o primeiro ponto como zero do equipamento, conforme tabela 1; 10. Construir a equao da reta, para clculo posterior. NOTA: a concentrao de acares redutores ser expressa em mol. mL de glicose.
-1

b) Preparo da amostra 1. A amostra dever ser preparada na diluio de uso declarada pelo fabricante.

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c) Ensaio da amostra: 1. Em um tubo de ensaio com tampa, adicionar 300L de tampo citratofosfato 0,05M e 200L de soluo de amido solvel 1%. 2. Incubar em banho-termosttico a (40 1)C, deixar atingir o equilbrio trmico (aproximadamente de 1 a 2 minutos). 3. Realizar um branco para cada replicata, com adio de amostra, substituindo o volume do substrato por tampo. Este deve ser lido juntamente com a amostra; 4. Realizar um branco sem adio de amostra, substituindo o volume da amostra por tampo. Ser utilizado para zerar o equipamento, no comprimento de onda do ensaio; 5. Adicionar em cada tubo de ensaio 100L de amostra a temperatura ambiente, preparada conforme item VII b, em intervalos de tempo previamente estipulados (15 a 30 segundos) entre as adies, e deixar no banho-termosttico por 30 minutos; 6. Parar a reao adicionando 1,5 mL de reagente DNS, observando os intervalos estipulados (15 a 30 segundos) para que o tempo de reao (30 minutos) seja o mesmo em todos os tubos de ensaio. 7. Em seguida ferver por 5 minutos em banho-maria; 8. Aps os 5 minutos de fervura, resfriar os tubos transferindo-os para outro becker contendo gua a temperatura ambiente; 9. Aps resfriamento dos tubos de ensaio, adicionar 15 mL de gua destilada em cada tubo de ensaio; 10. Agitar os tubos de ensaio fechados;

11. Ler em espectrofotmetro a 550nm; 12. Determinar a concentrao de acares redutores utilizando a curva analtica de glicose. VIII - RESULTADO. a) Definio da Unidade de Atividade Amiloltica (UA.mL .min ): 1. Definida como a quantidade de enzima necessria para liberar 1 mol de acares redutores por mL por minuto, conforme condies descritas acima. b) Clculos: Clculo da Concentrao na curva analtica (mol/mL):
-1 -1

x=

y b a

C=

( ABS AM

ABS * BR ) b a

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ONDE:

C (ABSAM) (ABS*BR) b a

concentrao, em mol.ml valor da leitura na amostra, em nm valor da leitura no branco, em nm coeficiente linear coeficiente angular
-1

* Se a leitura do branco da amostra (sem substrato) for negativa, deve-se desconsiderar no clculo.

Clculo da atividade amiloltica:

Atividade Amiloltica [UA.mL1 . min . 1 ] =

ONDE: C

C 10 30

concentrao de acares redutores na amostra (mol), determinada atravs da curva analtica de glicose.

OBS.: caso a amostra no possa ser analisada na diluio de uso, por apresentar atividade maior do que a faixa analtica da curva presente no item VII a, realizar diluio 5 vezes da amostra descrita no item VII b; se necessrio, realizar diluies subsequentes (ex.: 10 vezes, 15 vezes, e assim sucessivamente).

Atividade Amiloltica [UA.mL1 . min . 1 ] =

ONDE: C

C 10 fd 30

fd

concentrao de acares redutores na amostra (mol), determinada atravs da curva analtica de glicose. fator de diluio da amostra, quando houver.

Para o clculo da atividade, deve ser considerada somente a primeira diluio que apresentar resultado dentro da faixa de deteco da curva analtica.

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