Clonacin de genes para la caracterizacin de la respuesta a cromo hexavalente y eventual mejora de cepas fngicas nativas de sitios contaminados

Daz Hernndez, L. Unidad Acadmica de Biologa Experimental Universidad Autnoma de Zacatecas Gutirrez Corona, F. Romo Rodrguez, S. B. P. Departamento de Biologa Divisin de Ciencias Naturales y Exactas Universidad de Guanajuato RESUMEN La cepa Ed8 de A. niger var. tubingensis es nativa de suelos contaminados con cromo hexavalente, posee resistencia al metal y la capacidad de transformarlo en Cr (III). En el laboratorio se han clonado los genes m1pd y gox de la cepa Ed8, codificantes de la Manitol 1 fosfato deshidrogenasa (M1PD) y Glucosa oxidasa (GOX), respectivamente. Tambin, se han obtenido construcciones moleculares para interferir con la funcin de dichos genes en la cepa Ed8, mediante la estrategia de silenciamiento gnico por RNA de interferencia, con el fin de conocer el papel de los correspondientes productos en la resistencia a cromo hexavalente y/o la capacidad de reducirlo a Cr (VI) de la cepa. Con el objetivo de contar con un protocolo para introducir de manera eficiente las mencionadas construcciones en el genoma de la cepa Ed8, en este proyecto de verano se avanz en el establecimiento de un protocolo de transformacin de esferoplastos. Se determinaron las condiciones para la obtencin de esferoplastos mediante tratamiento con una enzima ltica y se estableci la concentracin mnima inhibitoria de higromicina, tanto para los esferoplastos (300 M) como para conidias (70 M). Tambin, se realiz

un experimento de

PCR

para validar la utilidad de oligonucletidos diseados para

distinguir el vector de silenciamiento pSilent1 de construcciones moleculares derivadas del mismo, conteniendo fragmentos del gen gox de la cepa Ed8.

INTRODUCCIN Los compuestos de cromo son contaminantes ambientales debido al amplio uso del metal en diversas actividades industriales. Los estados de oxidacin ms estables encontradas en la naturaleza son el cromo trivalente Cr (III) y el cromo hexavalente Cr (VI). Este ltimo, que se encuentra comnmente en forma de cromatos (CrO42) y dicromatos (Cr2O72), es un fuerte agente oxidante que es considerado la forma mas toxica del metal, siendo mutagnico y carcinognico en humanos y mutagnico en bacterias (Losi y col.,1994). Por estudios previos del grupo de trabajo, se aislaron cepas de hongos filamentosos nativas de sitios contaminados con cromo hexavalente, algunas de las cuales eran resistentes al in y mostraban la capacidad de transformarlo en Cr (III) (Espino Saldaa, 2002; Acevedo Aguilar y col., 2006). Entre dichas cepas esta Ed8, cuya identificacin mediante estudios moleculares y morfofisiolgicos indic que es un aislado de Aspergillus niger var tubingensis (Fernndez Perrino y col. 2007; Coreo Alonso y col., 2009). Se ha observado que en la cepa Ed8 incubada con Cr (VI) ocurre incremento en la produccin de metabolitos como el manitol y el cido glucnico (Acevedo Aguilar, 2008; Coreo Alonso, 2009). La evidencia sobre la relacin de estos cambios con las caractersticas fenotpicas de resistencia a Cr (VI) y/o la capacidad de su transformacin a Cr (III) por la cepa Ed8, puede provenir de estudios de manipulacin de la produccin de los metabolitos mencionados por procedimientos de gentica molecular. Con este fin, en el laboratorio se ha avanzado en la clonacin de

los genes m1pd [codificante de la Manitol 1Fosfato Deshidrogenasa (M1PD), implicada en la sntesis de manitol] (Castillo Nava, 2009) y gox [codificante de la Glucosa Oxidasa (GOX) implicada en la sntesis de cido glucnico] de la cepa Ed8 (Rodrguez Preciado, 2010) y se han obtenido construcciones moleculares para interferir con la funcin de dichos genes en la cepa Ed8, mediante la estrategia de silenciamiento gnico por RNA de interferencia (Romo Rodrguez, 2010).

Justificacin La introduccin de construcciones moleculares en la cepa Ed8 de A. tubingensis requiere de la implementacin de un procedimiento de transformacin gentica y de procedimientos moleculares de verificacin de las construcciones realizadas y de anlisis de transformantes.

MTODOS Y MATERIALES Microorganismos y medios de cultivo Se utiliz la cepa resistente a cromato de Aspergillus niger var. tubingensis Ed8, aislada previamente (Espino Saldaa, 2002; Acevedo Aguilar y col., 2006). El medio de crecimiento para la obtencin de conidias es el medio mnimo Lee (Lee y col., 1975) al que se le aade dextrosa al 0.25%. Para la obtencin de germnulas a ser usadas para la obtencin de esferoplastos se us el medio de cultivo
YED

(extracto de levadura, 1 %;

Dextrosa, 1 % ; Hepes, 20 mM y a justando el pH a 8 con NaOH 1M). 1) Obtencin de germnulas. Se inocularon conidias frescas de la cepa Ed8 en 50 ml de medio
YED,

a una concentracin de 5x105 con/ml, y se incubo durante 8 hrs a 29C y

200 rpm de agitacin. Se corroboro la aparicin de germnulas al microscopio.

2) Obtencin de esferoplastos. Se filtraron las germnulas en un filtro tipo monodur. Despus fueron transferidas a solucin
OM

(1.2 M MgSO4 + 0.1 M Na2HPO4); a esta

solucin se le agregaron enzimas lticas de Rhizoctonia solani a una concentracin final de 2.5% y la mezcla se incubo por 3 hs a 29C y 60 rpm de agitacin. Se corrobor la aparicin de esferoplastos al microscopio. Una vez que se observaron los esferoplastos formados, estos se filtraron en filtros monodur y el filtrado conteniendo los esferoplastos se centrifugo a 3000 rpm a 4C durante 30 min. Se retiro el sobrenadante y se recuperaron los esferoplastos con solucin
STC

(15% sorbitol, 0.75% CaCl2.2H2O, 1M

Tris HCl pH 7.5), se agrego 10% de PEG y 1% de DMSO para su almacenamiento. 3) Tincin con calcoflor. Una alcuota de los esferoplastos producidos se mezclo en una dilucin 1:1 con el colorante Calcoflor white al 0.1%. La mezcla anterior se observo al microscopio con un filtro para calcoflor. 4) Reaccin en cadena de la polimerasa. Para las reacciones de amplificacin se uso la enzima DreamTaq
DNA

Polymerase de Fermentas. Los oligonucletidos para

amplificar al vector pSilent1 usados fueron SilF1(Directo 5 CAAGCATCGATACCGTCG 3) y SilR1 (Reverso 5 TTAAGTGGATCCGGGGCC 3). Las condiciones de amplificacin fueron 94C por 30 seg, 55C por 30 seg, 72C por 1 min, 30 ciclos. Los vectores usados para la amplificacin fueron pSilent1 y pSilSGOXc. 5) Obtencin de la concentracin mnima inhibitoria (CMI) de higromicina para esferoplastos. La obtencin de la
CMI

se

realizo

mediante

la

adicin

de

aproximadamente 105 de estas clulas mezcladas con top agar a cajas de medio mnimo; despus de 12 horas de incubacin se agreg una capa de top agar con diluciones del antibitico que iban desde los 260 hasta los 320 g/ml. Despus de 57 das de incubacin, se registraron los resultados de ausencia o presencia de colonias en las cajas.

DISCUSIN DE RESULTADOS 1. Preparacin de esferoplastos Con el fin de avanzar en el establecimiento de un protocolo de transformacin para la cepa ambiental Ed8 de A. tubingensis, se establecieron las condiciones para la obtencin de esferoplastos. Primeramente se determinaron las condiciones adecuadas para la obtencin de germnulas, determinndose que a las 8 hrs de cultivo en medio
YED

alrededor del 90% de las esporas inoculadas inicialmente presentaban el tubo germinativo. Estas germnulas se colocaron en una solucin de enzimas lticas de Rhizoctonia solani con actividad de glucanasa, esto con el fin de eliminar los componentes de la pared celular. Se observo que a las 3 hs de contacto con dicha solucin ya se apreciaba la aparicin de posibles esferoplastos; como se muestra en la Figura 1A, los esferoplastos se tien con calcoflor de manera difusa, probablemente debido a que despus del tratamiento en la superficie celular aun quedan fragmentos de pared. Tambin, se observa que las conidias no digeridas no se tien con el calcoflor (Fig. 1B.).

Figura 1. Tincin de esferoplastos con calcoflor. A) Microscopa de campo claro 40x; B) El mismo campo observado por microscopa de fluorescencia con filtro para calcoflor. Se observa que solo el esferoplasto () se ti de manera difusa con la solucin de calcoflor, mientras que la espora () no presenta la tincin.

2. Determinacin de la CMI para higromicina en esferoplastos Se sembraron alrededor de 105 protoplastos en cajas de medio mnimo conteniendo como soporte osmtico sacarosa y suplementado con diferentes concentraciones de higromicina. Como se muestra en la Fig. 2B, a 250 g/ml de higromicina el crecimiento disminuye, hasta que es completamente inhibido en medio con 300 g/ml del antibitico (Fig. 2C). En base a estas observaciones, la concentracin de 300 g/ml de higromicina podr ser utilizada para seleccionar transformantes mediante tratamiento con vectores conteniendo como marcador de seleccin el gen de resistencia a higromicina.

A)

B)

C)

Figura 2. Protoplastos.

3. Amplificacin de fragmentos en los plsmidos pSilent1 y pSilSGOXc En el laboratorio ya se contaba con el vector de silenciamiento pSilent1 y con la construccin pSilSGOXc, esta ltima basada en el vector pSilent1 pero que adems cuenta con la insercin de fragmentos del gen gox, necesarios para que se lleve a cabo el silenciamiento de este gen en la cepa Ed8 de A. tubingensis (Romo, 2010). Se disearon oligonucletidos iniciadores (SilF1 y SilR1) los cuales amplifican un fragmento del vector pSilent1 y que flanquean a los sitios multiclonaje en donde se insertaron las secuencias gnicas para el silenciamiento. Mediante PCR con los oligonucletidos SilF1 y SilR1 se realiz la amplificacin de la regin mencionada usando como templado
DNA

del vector pSilent1 o de la construccin pSilSGOXc. Como se muestra en la Figura 3, los oligonucletidos amplifican los fragmentos esperados para cada uno de los plsmidos mencionados; para el caso de la construccin pSilSGOXc, se observa la amplificacin de un fragmento de alrededor de 800 pb, correspondiente a la insercin de un fragmento de 600 pb del gen gox dentro del vector pSilent1 y 200 pb correspondientes al vector pSilent1. Por otra parte, como se esperaba, con el vector pSilent1 el producto amplificado es de alrededor de 200 pb (carril 2). Con lo anterior se demuestra que este par de oligonucletidos es til para los fines que fueron diseados.

Figura 3. Amplificacin por PCR de fragmentos de los vectores pSilent1 y pSilSGOXc. Carril 1, productos de la reaccin usando como templado DNA del plsmido pSilSGOXc; carril 2, productos de amplificacin usando como templado DNA del vector pSilent1; carril 3, marcadores de tamao molecular (tamaos indicados a la derecha).

CONCLUSIONES 1. En la cepa Ed8 de A. tubingensis los esferoplastos pueden ser formados mediante tratamiento con enzimas lticas de Rhizoctonia solani 2. Es factible la distincin del vector pSilent1 de construcciones derivadas del mismo, como pSilSGOXc, mediante el uso de los oligonucletidos SilF1 y SilR1. Estos tambin
7

podrn ser aplicados para la verificacin de transformantes de la cepa Ed8 conteniendo diferentes construcciones.

BIBLIOGRAFA AcevedoAguilar, F.J. (2008). Estudio analtico de la reduccin de cromo hexavalente y sus implicaciones en sistemas biolgicos. Tesis doctoral, Posgrado Institucional en Qumica, Universidad de Guanajuato. AcevedoAguilar, F.J., EspinoSaldaa, A.E., LeonRodriguez. I.L., RiveraCano, M.E., AvilaRodriguez, M., Wrobel, K., Wrobel, K., Lappe, P., Ulloa, M. y Gutierrez Corona, J.F. (2006).Hexavalent chromium removal in vitro and from industrial wastes using chromateresistant strains of filamentous fungi indigenous from contaminated wastes. Can J Microbiol 52:809815. Buxton, F.P., Gwynne, D.I. y Davies, R.W. (1985). Transformation of Aspergillus niger using the argB gene of Aspergillus nidulans. Gene 37:207214. Castillo Nava, R. (2009). Aislamiento del gen que codifica para una manitol 1fosfato deshidrogenasa de Aspergillus sp. Tesis de Licenciatura, Universidad de Guanajuato Coreo Alonso, A. (2009). Caracterizacin del sistema de reduccin de Cr(VI) de la cepa Ed8 de Aspergillus niger resistente a cromato. Tesis doctoral, Posgrado en Biologa Experimental, Universidad de Guanajuato. Espino Saldaa, A.E. (2002). Aislamiento y caracterizacin de hongos resistentes a cromato nativos de desechos industriales. Tesis de Licenciatura, Universidad de Guanajuato. Fernndez Perrino, F.J., Hernndez Ramirez, L. y Gutirrez Corona, J.F. (2007). Tipificacin molecular de cepas de hongos filamentosos resistentes a cromato.

Proyecto de Servicio Social, Departamento de Biotecnologa, UAMIztapalapa e Facultad de Qumica, Universidad de Guanajuato.

IIBE,

Lee, K.L., Buckley, H.R. y Campbell, C.C. (1975). An aminoacid liquid synthetic medium for the development of mycelial and yeast forms of Candida albicans. J Med Vet Mycol 13:148153 Losi, M.E. Amrhein, C. y Frankenberger, W.T.J. (1994). Environmental biochemistry of chromium. Rev Environ Contam Toxicol. 136:91131. Romo Rodrguez, P. (2010). Alteracin gentica de posibles molculas involucradas en la tolerancia y/o reduccin de Cromo VI en la cepa Ed8 de Aspergillus niger var. tubingensis. Tesis doctoral (en proceso). Posgrado en Biologa Experimental, Universidad de Guanajuato.