UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRES FACULTAD DE CIENCIAS FARMACEUTICAS Y BIOQUIMICA CARRERA DE BIOQUIMICA CATEDRA DE BIOLOGA MOLECULAR

DESNATURALIZACION Y RENATURALIZACION DEL DNA

INTEGRANTES: UNIV. AJNO APAZA ERICKA LUDY UNIV. CALLE ESCOBAR BLANCA UNIV. CUBA LIMA MILCA MERCEDES UNIV. MAMANI ALCON MAGALY UNIV. MAMANI CASTAO ORTENCIA UNIV. NAVIA ANTONIA MONICA (da mircoles) UNIV QUISBERT AGUILAR VIRGINIA UNIV. SUXO JALDIN YAJAIRA

DOCENTE: Msc. Sc. ROLANDO SANCHEZ DA DE PRCTICA: FECHA: 30 de julio de 2013 viernes

LA PAZ-BOLIVIA 2013

DESNATURALIZACION Y RENATURALIZACION DEL DNA

OBJETIVOS. General. Realizar de forma practica la desnaturalizacin del DNA mediante procedimientos de acuerdo al protocolo.

Especficos. Comprender el proceso de desnaturalizacin y renaturalizacin del DNA. Observar los efectos de ciertos componentes desnaturalizantes. Verificar la desnaturalizacin del DNA por espectrofotometra y electroforesis en gel de agarosa.

MARCO TEORICO. La desnaturalizacin de una molcula de ADN de doble cadena implica la separacin de las dos hebras. Esto se consigue aumentando el pH hasta niveles en los que todas las bases se encuentren desprotonadas y, por tanto, no se establezcan puentes de hidrgeno, o tambin elevando la temperatura para separar las hebras mediante el aumento de la vibracin trmica. Cualquiera de los mtodos anteriores, aunque se utiliza ms el segundo, permite obtener dos molculas de ADN de cadena sencilla sin conformacin alguna en la que no hay puentes de hidrgeno ni apilamiento de bases, partiendo de una doble hlice. La temperatura a la cual se ha conseguido separar el 50% de las hebras se llama temperatura de fusin TM, y da un valor representativo de la estabilidad de una secuencia determinada de ADN. Se ha comprobado que este valor depende de todos los factores que dan estabilidad al ADN, pero sobre todo depende de la cantidad de pares GC que haya, es decir, de la cantidad de puentes de hidrgeno que se establezcan. Esto pone de relevancia que estos enlaces tambin contribuyen de manera importante a la estabilidad de la doble hlice o, ms bien, que todos los procesos o caractersticas que estabilizan la estructura actan conjunta y cooperativamente. Se ha caracterizado una relacin lineal entre el porcentaje de G + C y la TM, de modo que sta aumenta 0,4 C cada 1% ms de G + C. En el hombre y los mamferos el porcentaje medio de G + C es de un 40%, con lo que la temperatura de fusin ronda los 87 C, pero hay zonas del genoma, concretamente los promotores, en los que

la proporcin de G + C sube hasta un 60%, con lo que son zonas del ADN especialmente estables en las que la TM tiene un valor de hasta 95 C. La renaturalizA0048cin de molculas de ADN es el proceso contrario al de la desnaturalizacin, es decir, se parte de dos hebras sencillas para volver a formar una doble hlice. ste es tambin un proceso cooperativo en el que hace falta un primer apareamiento estable que haga de semilla para despus seguir a lo largo de las hebras a modo de cremallera. La formacin de esas primeras interacciones se llama nucleacin, y necesita una mnima cantidad de tiempo para que se den los contactos necesarios entre las bases complementarias. Sin embargo, a diferencia de la desnaturalizacin, para la correcta renaturalizacin del ADN hace falta que se baje la temperatura lentamente y no muy por debajo de la TM (10 15 C menos) para mantener el equilibrio desnaturalizacin-renaturalizacin (que las molculas puedan moverse y encontrarse, pero que las uniones no correctas no sean tan estables ni permanentes) y evitar que apareen secuencias ligeramente homlogas donde no deben. Si se bajara la temperatura bruscamente se formara un gel de molculas de hebra sencilla parcialmente apareadas en segmentos cortos con homologa secuencial, incluso dentro de una misma hebra. Esta caracterstica se utiliza para guardar muestras de ADN que se quieran conservar como hebras sencillas.1 PROCEDIMIENTO.

RESULTADOS
RESULTADOS: Se coloc 20 uL a los 8 tubos de DNA mas Buffer TE. Se prepararon los tubos a diferentes T

0 C

37 C

60 C

100 C

0 C 4 TUBOS EN ESPECTROFOTOMETRIA 4 TUBOS EN ELECTROFORESIS A. El A.Sp

37 C B. El B.Sp

60 C C. El C.Sp

100 C D. El D.Sp

CORRIDA EN ELECTROFORESIS:

20 uL

+ Tampon de cargado ---------------- CORRIDA

1. La distancia entre anodo a catodo fue de 1 cm x 5 = 55 Volt durante 20 min 2. Se coloco el gel en Bromuro de Etidio durante 10 min a 37 C y observar

ESPECTROFOTOMETRIA 1. Se midi la absorvancia a 260 nm dando los siguientes datos:

muestra
blanco Muestra A 0 Muestra b 37C Muestra C 60 Muestra D 100

260 nm
0,111

280 nm
0.0921

320 nm
0.0602

0,7635

0.7245

0.5549

0.6360

0.6211

0.5723

0.7396

0.7266

0.6741

0.6266

0.6141

0.5507

Abs
0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 1 2 3 4 5 6 Abs

DISCUSION La desnaturalizacin se lleva a cabo por diferentes factores fsico (altas temperaturas) y qumicos ( concentracin de sales y agentes desnaturalizantes ) y al modo de quitarles lentamente o bruscamente estos factores la molcula se renaturaliza. Esta prctica utilizamos DNA cromosomal y plasmdico de las anteriores practicas usando de esta 20 ul de la muestra para relaizar la practica. Se utilizo cloruro de sodio ya que es un alcali este ayuda a disternsionar a l,a cadena de DNA y que el sodio se une a los grupos fosfatos de carga negativa y asi distendemos las cadenas de DNA ya desnaturalizadas luego se utilizo diferentes temperaturas por el lapso de 10 minutos ya que si nos excedemos del tiempo podriamos romper los puentes de hidrogenos si no tambien otras estructuras. Luego para la renaturalizacion la cadena de DNA enfriamois bruscamente en esta renaluralizacion puede ser que el DNA de hebras sensillas pueden perder su originalidad y tambien su funcionalidad. En cambio en los demas tubos renaturalizamos lentamente y asi damos la oportunidad a las cadenas sencillas que se unan con sus complementarias originales y en este caso la renaturalizacion es reversible. Luego tomamos el material sometido a desnaturalizacion y renaturalizacion para realizar la electroforesis.

CONCLUSIONES Realizamos de manera prctica la desnaturalizacin del DNA, frente a la accin de agentes qumicos desnaturalizante, los cuales interfieren reaccionando

directamente con las bases e impidiendo un apareamiento correcto entre ellas. Tambin se uso un agente fsico desnaturalizante como la temperatura que produce la ruptura de los puentes de hidrogeno. Se verifico de manera experimental la desnaturalizacin del DNA, con las lecturas de absorbancias y la corrida electrofortica para el formaldehido, y la renaturalizacin del DNA tambin con las lecturas de absorbancias mas no as con la corrida electrofortica debido a la poca intensidad del revelado CUESTIONARIO 1.- Qu es la desnaturalizacin? R. Es el proceso donde las temperaturas superiores a la energa de los movimientos trmicos a elevadas se rompe la estructura tridimensional de las protenas y de los cidos nucleicos. Unamacromolcula en un estado desorganizado en el que las molculas se encuentran en una configuracin prxima al enrollamiento al azar a esto se dice que esta desnaturalizada: la configuracin ordenada que es presumiblemente la que se encuentra en la naturaleza se llama nativa. La transicin entre el estado nativo y desnaturalizado se conoce como desnaturalizacin. Cundo se calienta una DNA de doble hebra o DNA nativo se rompe las fuerzas de unin entre las hebras separndose entre s; por lo tanto, el DNA desnaturalizado es de una sola hebra. 2.- Qu es la renaturalizacion? R.Una solucin de DNA desnaturalizado puede ser tratada de forma que se vuelva a formar el DNA nativo. El proceso se llana renaturalizacion o reasociacion por complementacin y el DNA que se ha reconstituido se conoce como DNA renaturalizado. Es un mecanismo muy valioso en biologa molecular donde puede utilizarse para demostrar la relacin gentica entre diversos organismos para detectar determinadas especies de RNA para comprobar si ciertas secuencias aparecen ms de una vez en el DNA de un determinado organismo y para localizar secuencias de bases especificas en las molculas de DNA. 3. Qu es el Tm de una molcula de DNA? El Tm hace referencia a la Temperatura de fusin de la molcula en Adenina Y Timina es menor y en Guanina y Citocina es mayor. Tm Temperatura De Fusin Del ADN, en la cual las doble Hebras de ADN se separan en Solucin en Dos hebras completamente Independientes. 4. Qu es El Efecto Hipercrmico?

Es cuando se da la Desnaturalizacin del DNA se aumenta la absorbancia a determinada longitud de onda. Hipercromicidad del ADN, que ocurre cuando el Dplex se desnaturaliza, dando dos cadenas sencillas que absorben ms en el ultravioleta. Esta caracterstica el ADN es una forma de seguir el Proceso de desnaturalizacin de la molcula: A medida que el proceso avanza, se observa un incremento en La absorbancia.

7.- Qu son los geles desnaturalizantes? R. Son geles con un gradiente de desnaturalizacin. Electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente, es un mtodo de electroforesis para separar fragmentos de ADN del mismo tamao en funcin de su secuencia. Para ello, se aplica a travs del gel un gradiente que va incrementando las condiciones de desnaturalizacin (normalmente mediante el aumento de la concentracin de un agente qumico desnaturalizante, como formamida o urea). 8.- Qu aplicaciones tiene un gel desnaturalizante? R. Se puede utilizar para la deteccin de mutaciones de base nica y polimorfismos de ADN genmico, clonado y amplificado por PCR.Es ideal para "Screening" de muestras con mutaciones genticas y adems se puede utilizar para el anlisis de puntos de fusin de fragmentos de ADN. En geles desnaturalizantes, el DNA de doble hebra se disocia a simple hebra y se produce una reduccin de la movilidad electrofortica. Una variante de esta tcnica consiste en desnaturalizar los fragmentos de DNA que contienen secuencias silvestres y mutadas y permitir su renaturalizacin antes de la electroforesis. BIBLIOGRAFIA
Fundamentos de biologa molecular. David Freifelder. Universidad de california, San diego, editorial ACRIBIA, S.A, Saragoza (Espaa) 1988. es.scribd.com/.../Desnaturalizacion-Renaturalizacion-y-Superenrollamien...