El laboratorio de Androloga en Reproduccin Asistida

Capacitacin espermtica y nuevos criterios OMS 2010

Patricia Nieto-Sandoval Martn de la Sierra R3 Anlisis Clnicos Mayo 2011

Laboratorio de Androloga

-

Gestin del banco de donantes de semen Seminograma para el estudio de infertilidad del varn Congelacin/Descongelacin Capacitacin de muestras de semen Tcnicas especiales:
Fragmentacin del DNA espermtico Lavado de semen para VIH/VHC FISH espermatozoides Microdelecciones del cromosoma Y

Banco de semen de donantes

Servicio existente en Centros de Reproduccin en el que se obtienen, conservan y gestionan muestras de semen de donantes sanos para su posterior utilizacin en tratamientos de reproduccin asistida. UTILIZACIN: Parejas con varn azoosprmico Riesgo de transmisin de trastornos genticos o enfermedades infecciosas (VIH, VHC...) Fallos repetidos de ICSI sin causa femenina aparente Mujeres monoparentales

Banco de semen de donantes

Entrevista personal 1 prueba: seminograma 2 prueba: congelacin, descongelacin y capacitacin 3 prueba: Entrevista con un psiclogo Analtica
Hemograma, grupo y Rh Coagulacin Serologa: Hepatitis B y C, VIH, RPR, CMV Cultivo de semen y orina Cariotipo Fibrosis Qustica

Si OK

5-10% ACEPTADOS

Contrato Consentimiento informado

Donacin 25 muestras

Nueva serologa a los 6 meses

Criterios de seleccin de donantes y de muestras durante la donacin

Valores mnimos para aceptacin de donantes:

Concentracin > 70millones/ml Movilidad >50% Morfologa >4% EN CONJUNTO, SIEMPRE TOTAL DE MVILES >80 MILLONES

Aceptacin de muestras durante la donacin:

Concentracin > 50millones/ml Movilidad >50% EN CONJUNTO, SIEMPRE TOTAL DE MVILES >70 MILLONES

A+B=

VxCxB 100

REM IA FIV >3x106 spz totales >200-500 x10/ml Spz mviles aislados

>80

>4.5

ICSI

Nuevos valores de referencia para el seminograma. OMS 2010

SEMINOGRAMA: NUEVOS CRITERIOS OMS 2010

1999

2010

SEMINOGRAMA: NUEVOS CRITERIOS OMS 2010

Valores referencia OMS 1999
Volumen pH Concentracin spz mviles/ml Total spz en eyaculado Movilidad lineal progresiva (a+b) Movilidad lineal rpida (a) Morfologa normal Vitalidad Presencia de leucocitos 2ml 7.2 20millones 40millones 50%

Limitaciones:
-No se defini una poblacin de referencia -Colaboracin de laboratorios sin control de su metodologa

Espermatozoide normal. Criterios estrictos de Tygerberg Kruger et 1986/OMS 1992/99: 25% - Cabeza ovalada - Acrosoma 40-70% de la cabeza - Sin >20% de vacuolas 14% - Pieza media axial sin extensiones 75% - Citoplasma > 1/3 de cabeza. <1milln/ml - Cola extendida, aprox. 10 veces la cabeza

SEMINOGRAMA: NUEVOS CRITERIOS OMS 2010

Grupo de referencia: Varones con TTP 12 meses, 1953 muestras

UNSCR: hombres con fertilidad desconocida. Representan a la poblacin general. 965 muestras SCR: hombres normozoosprmicos segn OMS 1999. Historial de fertilidad desconocido. 934 muestras No TTP: hombres frtiles con tiempo para concebir desconocido 817 muestras

Estudio de la calidad seminal de la poblacin general:

SEMINOGRAMA: NUEVOS CRITERIOS OMS 2010

Estudio bien definido: 4500 hombres, procedentes de 14 pases de 4 continentes Mtodos estandarizados Siempre muestras completas. Con 2-7 das de abstinencia. Solo una muestra por hombre. Edad:17-67 aos.

SEMINOGRAMA: NUEVOS CRITERIOS OMS 2010

Progresivo (a+b) Movilidad total: PR+NP 40% No progresivos (c) Movilidad progresiva: PR 32% stos sonInmviles los valores de referencia de la OMS2010 y no diagnostican

la infertilidad sino que indican que el parmetro seminal est por debajo de la gran mayora (95%) de varones frtiles

SEMINOGRAMA: NUEVOS CRITERIOS OMS 2010

SEMINOGRAMA: NUEVOS CRITERIOS OMS 2010

Conclusiones del estudio:

La fertilidad masculina depende de muchos factores: no es esttica. Los resultados del seminograma tienen que interpretarse junto con la valoracin clnica del varn. Los resultados del seminograma NO tienen que interpretarse como diagnstico de infertilidad si estn por debajo de los valores de referencia. El TTP-Time To Pregnancy NO depende exclusivamente del varn, sino que debemos tener en cuenta y en igual medida la valoracin de la mujer.

Congelacin del semen

Tratamiento de conservacin y mantenimiento de espermatozoides a temperaturas de -196C.
UTILIDADES
o o o o o o o

Libertad de utilizacin del eyaculado Semen del donante Posibilidad de paternidad tras quimio o radioterapia Vasectomias Conservacin de muestras valiosas Dificultad de recogida de la muestra Mejora el aprovechamiento de un nico eyaculado Disminucin de la calidad espermtica DESVENTAJAS Excepcionalmente supervivencia nula

Congelacin del semen

ETAPAS
-

Licuefaccin Recuento y concentracin opcional Dilucin con el crioprotector Equilibrado y refrigeracin Congelacin: vapores de nitrgeno hielo seco descenso programado de temperatura Penetrantes No penetrantes Prueba de descongelacin
ENVASES criotubo pldoras ampolla pajuela

Muy hidrosolubles Baja toxicidad Isoosmticos e isotnicos con el plasma seminal pH neutro Compuestos nutritivos Antibiticos Sustancias crioprotectoras

Congelacin del semen: vapores de nitrgeno (congelacin lenta)

Centrifugacin 2000 rpm,5
vvvvvv

Eliminacin plasma seminal

Adicin crioprotector

Rampa de Nitrgeno

Alicuotar

Parte superior 20 Sumergido 20

Nevera 4, 20

Guardar en N2 -196 C

Congelacin del semen: Hielo seco (congelacin rpida)

Centrifugacin 2000 rpm,5
vvvvvv

Eliminacin plasma seminal

Adicin crioprotector

Nevera 4, 20

Guardar en N2 -196C

Pldoras en CO2

Preparacin hielo seco

descenso controlado de temperatura

Congelacin del semen:

Protocolo de congelacin lenta. Utiliza un congelador biolgico. Equipo programable que permite un estricto control de las condiciones para bajar la temperatura fracciones de grado centgrado por minuto. El recipiente de congelacin donde colocamos la muestra se conecta a un tanque de nitrgeno lquido. Mediante un programa especfico y sensores especiales, el ordenador registra la temperatura en el interior del recipiente, y segn las indicaciones programadas, inyectar vapores de N2 para bajar la temperatura.

Banco de semen

Capacitacin espermtica

Fase final del desarrollo del espermatozoide donde adquiere la habilidad de fecundar al ovocito. In vivo, ocurre cuando los espermatozoides entran en contacto con los diferentes fluidos del tracto genital femenino. Mientras estn en el sistema reproductor masculino est inhibida por sustancias presentes en el plasma seminal. Durante la capacitacin, el espermatozoide sufre cambios: Adquiere la capacidad de unirse a la zona pelcida del ovocito y de llevar a cabo la reaccin acrosmica. Su movimiento deja de ser rectilneo para desplazarse con un movimiento oscilante. In vitro, por tanto tiene dos objetivos: Fusin de la membrana citoplasmtica con la membrana Eliminar elacrosomal plasma seminal externa en la zona apical de la cabeza del spz Separar los espermatozoides dede mejor calidad del resto en el originando la liberacin la enzimas almacenadas acrosoma y la de exposicin de la membrana acrosomal (REM: Recuperacin espermatozoides mviles)
interna.

Capacitacin espermtica

Mtodos:
Lavado centrifugado Mtodos de migracin: Swim-up Mtodos de centrifugacin: Gradiente de densidad Mtodos de filtracin

1234-

Capacitacin espermtica: Swim-up

Caractersticas de la tcnica:
Basados en la capacidad de desplazamiento del espermatozoide. Procedimiento ms fisiolgico Tiempo de duracin: entre 60-75 minutos Adecuado para muestras de semen con buenos parmetros seminales

Capacitacin espermtica: Swim-up

Diluir con medio (1:1) Centrifugar 2400 rpm 10

Aadir medio (0.5-1.5ml)

Eliminar sobrenadante

Obtencin del pellet

Colocar en 45

37C,45 en 45

Recuperar de la superficie

Capacitacin espermtica: Gradiente de densidad

Caractersticas de la tcnica:
Basados en la capacidad de separacin por la densidad celular Tiempo de duracin: 45-60 minutos Procedimiento menos fisiolgico Adecuado para muestras de semen con bajos parmetros seminales

Capacitacin espermtica: Gradiente de densidad

Aadir semen Centrifugar 1600 rpm, 15

Preparacin gradientes Aadir medio fresco Centrifugar 2000rpm,5

Eliminar sobrenadante

Recuperar pellet

Capacitacin espermtica

Ventajas:
Mtodo de migracin: Swim-up
Proceso ms fisiolgico La muestra capacitada suele quedar ms limpia Es ms independiente del volumen del eyaculado Se dispone de ms tiempo libre Presenta mayor capacidad de recuperacin Buenos resultados para muestras pobres o congeladas Requiere menos tiempo de realizacin

Mtodo de centrifugacin: Gradiente de densidad

Fragmentacin del DNA espermtico

Aproximadamente, un 15% de los varones estriles tienen un seminograma normal. Es posible los parmetros clsicos no sean del todo indicativos de la calidad del semen. Otros parmetros: integridad del acrosoma, vitalidad, evaluacion de actividad enzimticas, integridad funcional de la membrana Ningn parmetro tiene valor diagnstico de la infertilidad. Integridad del DNA espermtico es vital para el inicio del mantenimiento de un embarazo a trmino. En tcnicas de reproduccin asistida, la calidad de los espermatozoides requiere un control mucho ms delicado.

Fragmentacin del DNA espermtico

Causas de las lesiones en el DNA espermtico:

Intrnsecas: Seleccin ineficiente de los espermatozoides Maduracin incorrecta Extrnsecas: Dao inducido por quimio/radioterapia Varicocele Episodio de fiebre alta Exposicin a altas temperaturas Enfermedad inflamatoria crnica o aguda Estrs oxidativo post-testicular

Fragmentacin del DNA espermtico

Utilidad clnica:
Infertilidad de causa desconocida Fallos repetidos en tcnicas de reproduccin asistida Mala calidad embrionaria Abortos de repeticin Varicocele Varones infrtiles con edades superiores a 40 aos Episodio febril en los ltimos 3 meses

Fragmentacin del DNA espermtico

1)

Mtodos basados en:

Marcar las roturas, tanto de cadena sencilla como de cadena doble en la molcula de ADN: TUNEL (Terminal dUTP Nick-End Labeling), ISNT (In situ Nick Translation) Medir la distinta capacidad del DNA, para desnaturalizarse frente a determinados tratamientos: SCSA (Sperm Chromatin Structure Assay), DBD-FISH (DNA Breakage Detection Fluoresce In situ Hybridation), SCD (Sperm Chromatin Dispersion)

2)

GRACIAS