EVOLUO MOLECULAR 2006 Modificado por Tatiana Roman, a partir do texto da Prof.

Tania de Azevedo Weimer (ULBRA) INTRODUO A evoluo molecular compreende duas reas principais de estudo: a evoluo das macromolculas e a reconstruo da histria evolutiva dos genes. De forma didtica, podemos dividir estas reas em alguns tpicos mais especficos, tais como: evoluo de macromolculas em si, origem de molculas biolgicas bsicas, origem e diversificao do genoma, evoluo da estrutura gnica, evoluo da sntese protica, evoluo dos cdons e do cdigo gentico, e evoluo do tamanho e contedo do genoma. Evoluo das macromolculas e origem de molculas biolgicas bsicas Para entender a evoluo das macromolculas preciso considerar algumas questes chave: a) Qual das macromolculas originou-se primeiro: protenas ou material gentico e entre estes, DNA ou RNA? b) Como surgiram? c) O seu surgimento foi anterior ou concomitante a existncia de uma estrutura celular completa? c) Independente da resposta da pergunta anterior, como funcionaram? Em termos evolutivos, acredita-se que, antes de qualquer forma de vida, foi necessrio o surgimento de algumas molculas primordiais, capazes de fornecer condies para o surgimento da vida em si, ou ento de outras molculas intermedirias, necessrias para a existncia da vida. Estas molculas primordiais seriam macromolculas surgidas a partir de um processo que pode ser chamado de evoluo qumica, e que pode muito bem ser classificado como o incio da origem da vida. Em outras palavras, podemos afirmar que antes da evoluo da vida deve ter ocorrido uma evoluo qumica. H duas dificuldades bsicas para o entendimento da evoluo qumica: a primeira que

2 difcil visualizar o meio molecular e os eventos que ocorreram num passado to distante (estima-se de 4,0 a 4,2 x 10 anos atrs); a segunda se refere inexistncia de fsseis moleculares ou, se estes existem, sua raridade. De qualquer forma, devemos considerar que um primeiro passo evolutivo deve ter sido a origem e evoluo de matria orgnica numa atmosfera primitiva, sob condies abiticas, sendo o objetivo maior desta evoluo o surgimento de uma clula moderna, com capacidade de auto-reproduo. Mas, como esta clula poderia surgir a partir do caos original? Duas consideraes importantes devem ser feitas: a) os organismos vivos primitivos no necessitariam ser to complexos como os atuais. As caractersticas bsicas da vida (crescer e multiplicar) j deveriam existir no organismo primitivo, mas razovel supor uma forma de vida mais simples, principalmente na ausncia de competio com as formas mais sofisticadas posteriores. b) a formao de molculas orgnicas e estruturas subseqentes no devem ter sido o resultado de eventos completamente ao acaso. Esta considerao apoiada pelo fato de que a evoluo de nosso sistema solar oferece os pr-requisitos essenciais para o desenvolvimento e manuteno da vida: - a quantidade de energia disponvel a partir da irradiao solar maior do que a fornecida por qualquer outra fonte; - diferentes elementos (H, C, O, N, S, P, Ca) bem como compostos de C j estavam presentes antes e durante a formao do nosso sistema solar. Atravs de espectroscopia observa-se grande quantidade de molculas orgnicas em nuvens estrelares; - a rbita da Terra fica a uma distncia uniforme do sol, o que evita temperaturas extremas nas quais molculas orgnicas so incapazes de se formar e/ou funcionar; - a presena de gua (excelente solvente estvel) parece ser anterior ao comeo dos registros geolgicos; - gases contendo H existiram durante um longo perodo inicial da histria da Terra. Assim, uma considervel pr-adaptao molecular deve ter ocorrido na sopa primitiva de compostos qumicos, permitindo posteriormente a evoluo da matria orgnica. Embora no se possa ter certeza da natureza dos eventos moleculares originais, pode-se tentar reproduzir os mesmos a partir de reaes atuais, sob condies controladas que imitem o ambiente pr-bitico,
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deduzindo, desta forma, a origem da matria orgnica. Embora no se saiba ainda, com segurana, como era esta atmosfera pr-bitica (se fortemente redutora, fracamente redutora ou mesmo no redutora), experimentos sob diferentes condies tm mostrado a possibilidade de sntese orgnica em condies abiticas, tendo-se j obtido os seguintes compostos: aminocidos, acares (ribose, glicose, desoxirribose), purinas, pirimidinas, porfirinas (que compem hoje o ncleo do heme, da clorofila). A nica certeza que se tem a respeito do ambiente primitivo que no existiu oxignio livre at o advento das bactrias fotossintticas (cerca de 2,5-2,9 x 10 anos). Na dcada de 1920, Oparin (bioqumico russo) e Haldane (geneticista ingls) propuseram que a Terra teria uma atmosfera redutora e que os compostos orgnicos formados nesta atmosfera deveriam ser similares aos utilizados pelos organismos vivos atuais. No entanto somente cerca de trinta anos mais tarde que esta sugesto foi comprovada por dados experimentais. Miller, na dcada de 50, sintetizou molculas orgnicas numa atmosfera redutora, em condies abiticas a partir de metano, amnia, hidrognio e vapor d'gua. Muitas molculas foram formadas e embora as quantidades de cada composto, por reao, fossem pequenas, a quantidade total foi grande. O material formado, no ambiente primitivo, pode ter-se acumulado em locais protegidos (por exemplo, da UV que degrada matria orgnica), tais como fissuras de rochas ou profundidade de poos, concentrando-se em conseqncia. Uma vez concentrado houve chance para ocorrerem as polimerizaes com formao de peptdeos, polissacardeos e outros tipos de molculas maiores. Em meio aquoso as polimerizaes dependem de agentes condensadores e muitos deles existiam na Terra primitiva: cianamida, cianognio, cido cinico, dicianamida. A formao de nucleotdeos, por exemplo, pode-se dar por fosforilao de adenosina, citosina e uridina sob a catlise de cianognio. Em condies parcialmente anidras polimerizaes tambm podem ocorrer, sob ao do calor, por evaporao de H2O, na ausncia de agentes condensadores. Pirofosfato pode se formar a partir de ortofosfato e pode ser usado para a formao de ADP e ATP. Tem sido sugerido que as primeiras fontes de energia dos organismos seriam cadeias de polifosfatos e que o ATP seria introduzido s posteriormente. Lipmann (1965) props que a reao que usa PPi e o transforma em Pi liberando energia seria o fssil molecular da forma primitiva de transferncia de energia. Fox e colaboradores, nos anos 50, obtiveram proteinides (substncias semelhantes a
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protenas) a partir de uma mistura de aminocidos (AA). A proporo de AA nos proteinides no se dava ao acaso nem era proporcional s quantidades de cada AA na mistura. Alguns ocupavam preferencialmente as extremidades terminais (N e C) dos proteinides, havendo tambm interaes preferenciais de AA. - Quem veio primeiro, o ovo ou a galinha? As interaes entre cidos nuclicos e protenas so complexas, uns dependendo simultaneamente dos outros. Desta foram, muito difcil deduzir qual deve ter sido a molcula evolutivamente mais primitiva, cido nuclico ou protena. Duas hipteses tentam explicar esta questo. De acordo com a primeira, os cidos nuclicos teriam evoludo primeiro pela sua capacidade de auto-replicar e a partir dele surgiria um sistema protico que facilitaria posteriormente a auto-replicao. A descoberta do RNA cataltico apoia esta hiptese. Para a segunda, os primeiros sistemas auto-replicativos seriam protenas ou combinaes cido nuclico-protena. Haveria interdependncia, desde o incio, entre protenas e nucleotdeos. Apoiando esta hiptese, h a observao de molculas de antibiticos, oligopeptdios circulares, produzidas pela bactria Bacillus brevis, sintetizadas na ausncia de mRNA. A enzima que catalisa a reao (adio seqencial de aminocidos) serve como molde para a seqncia de aminocidos do peptdio. Embora no se tenha uma resposta definitiva a este problema, a maioria dos autores tende a aceitar preferentemente a primeira, uma vez que ao longo do tempo novas evidncias surgiram que a favorecem, as quais sero discutidas na seo a seguir. Origem e diversificao do genoma Admitindo os cidos nuclicos como anteriores s protenas, qual deve ter sido o primitivo, DNA ou RNA? A idia de Haldane (1965) e Lipmann (1965) de que os primeiros genomas eram constitudos de RNA tornou-se mais consistente com a descoberta de que molculas de RNA apresentam propriedades catalticas. Em adio s suas propriedades como molde, as molculas de RNA tm propriedades enzimticas e assim so as nicas molculas que podem funcionar como gentipo e fentipo. Vrias so as caractersticas do RNA que capacitam essa molcula como

precursor genmico: - tanto a replicao como o cdigo gentico podem ter evoludo s com o RNA (e no s com o DNA), j que o RNA pode se auto-duplicar (como ocorre com vrus de RNA) e a sntese protica toda mediada por RNA (mRNA, rRNA, tRNA); - a replicao do RNA mais simples do que a do DNA; o requerimento de primers de RNA para a duplicao do DNA pode ser um fssil molecular da replicao primitiva; - desoxirribonucleotdeos so sintetizados a partir de ribonucleotdeos e a sntese da timina se d a partir de uracil. Assim, essas duas substncias podem ter surgido mais tarde na evoluo; - ribonucleotdeos (e no desoxirribonucleotdeos) tm um papel fundamental no metabolismo. ATP, CTP, GTP, AMP cclico, NAD, NADP, por exemplo, so todos ribonucleotdeos, sugerindo que os principais aspectos do metabolismo j estavam estabelecidos antes da evoluo do DNA; - o RNA tem propriedades catalticas, como exemplificado pela atividade de auto-splicing de alguns grupos de introns. Todas estas evidncias sugerem que a transio entre o mundo qumico e o biolgico foi feita atravs de algum tipo de cido nuclico, provavelmente o RNA. Porm, acredita-se que o material gentico primitivo tenha sido na verdade um precursor de RNA baseado em anlogos de ribose, ao invs de ribose. Embora pudessem ser formados a partir da sopa primitiva, sabe-se que alguns tipos de nucleotdeos no deveriam ter sido gerados em grandes quantidades, pelo menos num primeiro momento. Alm disso, a ribose pode ser sintetizada sob forma de dois estereoismeros,
D-ribose

e L-ribose. Somente a D-ribose usada para formar o RNA, embora

ambas sejam formadas em quantidades iguais nos experimentos pr-biticos. Um tipo de molcula anlogo aos nucleotdeos de ribose, sintetizado mais facilmente e que no fosse inibida pela presena de diferentes estereoismeros, mas que tivesse a propriedade de autoreplicao deve ter sido o precursor do RNA. Tal molcula poderia ter sido, por exemplo, o glicerol fosfato, que, alm das caractersticas acima, tambm retm a capacidade de pareamento. Alm disso, uma verso de cido nuclico baseada somente em purinas deve ter precedido os cidos nuclicos atuais. Posteriormente, o RNA poderia ter surgido para estabilizar o genoma precursor estruturalmente, e, ao provar ser superior a este funcionalmente, t-lo substitudo gradativamente. A passagem do mundo de RNA para o de DNA s teria ocorrido aps a evoluo da sntese protica, do surgimento do processo de transcrio reversa e do desenvolvimento de

processos enzimticos capazes de converter precursores de ribonucleotdeos em precursores de desoxirribonucleotdeos. Uma vez formado o DNA este se manteve como repositrio permanente da informao gentica devido a trs caractersticas que lhe conferem maior estabilidade: - a falta do grupo OH no carbono 2' da ribose, o que torna a molcula menos suscetvel hidrlise; - a estrutura em dupla hlice, que no s facilita a replicao, como mais conservativa, facilitando o mecanismo de reparo, uma vez que a fita intacta serve para a correo da fita anmala; - a substituio de U por T representa uma alta estabilidade gentica (ou baixa taxa de mutao), devido a alta estabilidade tautomrica da T em comprao U. A pr-clula com material gentico de DNA deve ter sido mais similar a clulas eucariticas modernas do que a clulas procariticas, e deve ter garantido a alta especializao evolutiva, onde o DNA fica responsvel pela manuteno e transmisso da informao gentica, e as protenas pelas atividades enzimticas, mantendo-se o RNA como a ligao entre esses dois tipos de molculas.
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Evoluo da estrutura gnica O gene eucarioto atual tem a estrutura composta por exons e introns, enquanto os dos procariotos no tm introns. Considerando que os exons codificam pedaos de protenas que correspondem a mdulos estruturais ou funcionais (domnios proticos), duas possibilidades existem para explicar a estrutura atual dos genes: os introns teriam sido inseridos por algum processo de transposio, aps a separao entre procariotos e eucariotos, tendo esta insero separado, com preciso, as regies codificadoras; a estrutura exons/introns faria parte do genoma primitivo e os introns teriam sido eliminados da linhagem procariota por economia genmica. Gilbert (1987) sugere ser a segunda hiptese a correta, baseado no fato de que os introns, apesar de aparentemente sem funo, so hot spots recombinacionais, devido ao seu grande tamanho. Este autor prope que os primeiros genes, essencialmente de RNA, tinham estrutura com introns e exons. A partir deste gene primitivo diferentes cpias poderiam ser feitas, com a reorganizao dos exons simples j existentes. Os introns atuariam como os elementos de reunio e separao, afastando exons adjacentes ou aproximando exons distantes, possivelmente atravs de um mecanismo de proto-splicing. Isto permitiria a obteno de genes diferentes e mais complexos, conforme as combinaes resultantes dos exons reunidos e separados. Este processo chamado de

 exon shuffling (embaralhamento de exons), e aceito como o mecanismo que deve ter atuado na organizao dos genes eucariotos. O fato de que os exons de um determinado gene codificam domnios da protena que equivalem a mdulos estruturais e/ou funcionais a maior evidncia de que tal embaralhamento foi responsvel pela organizao gnica. Alm disso, existem vrios exemplos de genes eucariticos claramente formados de partes (exons) de outros genes, como genes de protenas do sistema sanguneo de vertebrados. Como os genes formados de RNA continham introns, a evoluo da estrutura genmica para o DNA manteve a combinao exons/introns. Por outro lado, a formao de genes por embaralhamento sugere que os introns estavam presentes antes da evoluo da estrutura gnica. Desta forma, seria coerente afirmar que os introns no foram inseridos aps o surgimento dos eucariotos, mas sim perdidos pelas bactrias aps a separao dos dois grandes reinos. Em outras palavras, o ltimo ancestral comum de pro e eucariotos deve ter tido introns em seus genes, com os procariotos perdendo-os subseqentemente devido a uma presso seletiva forte para reduo do tamanho genmico e para um aumento na eficincia da expresso gnica, mais apropriada para clulas pequenas e de crescimento e multiplicao muito rpidos. A presena de homologia nos domnios estruturais e funcionais de uma srie de protenas em pro e eucariotos, bem como a localizao similar de exons e introns, uma evidncia que apia fortemente esta hiptese. Evoluo da sntese protica Acredita-se que as primeiras protenas tenham sido homopolmeros simples (di ou tripeptdeos), envolvendo poucos aminocidos, mas com as seguintes funes bsicas: reunio de RNAs em membranas, isolando o material gentico e melhorando a funo celular, conseqentemente; funo como canais ou poros de membranas; suporte da estrutura tridimensional das ribozimas. A transio de um mundo de RNA para um de RNA-protena provavelmente ocorreu gradualmente: os aminocidos (aa) iniciais poderiam ter sido ativados para formar pequenas cadeias peptdicas com funo estrutural, uma vez que o RNA e cofatores seriam suficientes para realizar as funes qumicas nas estruturas celulares primordiais. Posteriormente, polimerizaes mais complexas de aa poderiam ter suplantado gradualmente as funes da maioria das ribozimas, inicialmente atravs de combinaes RNA-protena e, em seguida, atravs de estruturas proticas completas.

Para a evoluo da sntese protica, alguns passos crticos devem ter surgido e se estabelecido. O primeiro o perfeito carregamento do aminocido pelo tRNA, processo este mediado pelas aminoacilsintetases. Estas enzimas fazem dois reconhecimentos crticos: escolhem um dos 20 aminocidos e os respectivos tRNAs entre cerca de 40 destas molculas, havendo, assim, a necessidade de coevoluo enzima-tRNA, para o desenvolvimento da sntese correta. O reconhecimento do aminocido especfico pela sintetase um problema difcil, porque muitos aminocidos so quimicamente semelhantes. Este reconhecimento pode ocorrer tanto por uma forte discriminao primria (tirosil-sintetase, cisteil-sintetase), ou por uma baixa discriminao, seguida de reviso (proofreading) (valil-sintetase). Esta reviso feita pelas prprias, sintetases que desenvolveram uma atividade enzimtica adicional para garantir a correo do processo: catalisam a hidrlise de aminocidos incorretamente ligados, reforando assim a discriminao perfeita. Embora no haja regras estritas, parece haver uma forte correlao negativa entre a similaridade dos aminocidos e a capacidade seletiva da enzima, e entre esta ltima e a capacidade de correo. Os aminocidos que apresentam maiores diferenas qumicas so mais facilmente reconhecidos e suas sintetases apresentam menor capacidade de correo secundria. A discriminao sintetase/tRNA mais fcil pois o tRNA uma molcula maior, com mais stios de reconhecimento. Alm disso, os tRNAs coevoluiram com as sintetases (h uma s sintetase para todos os tRNAs de um mesmo aminocido), enquanto os aminocidos so fixos. Verificou-se, em experimentos laboratoriais, que a discriminao entre tRNAs e sintetases de espcies diferentes menor que aquele intra-especfico, demonstrando que o tRNA e a sintetase de uma mesma espcie coevoluiram para a discriminao mxima, enquanto entre espcies diferentes no houve coevoluo. O reconhecimento sintetase/tRNAs feito, principalmente, pelo anticodon, especificamente pelo nucleotdio comum a todos os anticodons de um mesmo aminocido. Ainda, um dos ltimos 3 pares de base da haste aceptora tambm reconhecido, existindo tambm uma base discriminadora, invarivel entre tRNAs de aminocidos iguais, localizada entre a ala aceptora e a extremidade CCA do tRNA. O carregamento correto dos tRNAs depende exclusivamente de uma atividade de reviso exercida pelas sintetases: eles se ligam facilmente ao stio de reconhecimento da enzima, mas a sua permanncia depende de uma reviso feita pela sintetase. O segundo passo crtico o reconhecimento perfeito entre aminoacil-tRNA e ribossoma. A seleo do ribossoma entre os diferentes tRNAs depende do reconhecimento pelo stio A do

anticdon, e a freqncia de erros neste processo diretamente correlacionada com a freqncia de malpareamento codon-anticodon. A evoluo dos codons foi, ento, tambm um processo crtico para o estabelecimento da sntese protica como a conhecemos hoje. Evoluo dos codons e do cdigo gentico O codon altamente conservado, sendo idntico em todos os organismos, j que qualquer modificao seria fortemente selecionada contra. As nicas excees observadas na universalidade do codon so: a) Nas mitocndrias: as alteraes esto relacionadas reduo do tamanho do genoma. Vrias modificaes ocorrem nos codons das mitocndrias e todas elas so compatveis com a reduo do nmero de tRNAs que passa de 30-40 no genoma nuclear para 22 nas mitocndrias de mamferos e a 25 nas de leveduras. As modificaces envolvem, principalmente, a utilizao de uma U na primeira posio do anticodon para parear com qualquer base na terceira posio do codon. Tais modificaes so: Codon Universal UGA AUA CUN AGA AGG Fim Ile Leu Arg Arg Codon das mitocndias Mamfero Trp Met Leu Fim Fim Drosophila Trp Met Leu Ser no usado Levedura Trp Met Thr Arg Arg

b) No ncleo: h apenas duas excees e ambas envolvem codons de Fim: em protozorios ciliados os codons UAA e UAG codificam para glutamina, havendo apenas um codon de Fim (UGA). No procarioto Micoplasma o codon UGA codifica para triptofano. Um aspecto importante do codon a ocorrncia de pareamento oscilante (wobbling), na 3 posio (1 posio do anticodon). Se o wobbling fosse eliminado, seriam necessrios 61 tRNAs para reconhecer os 61 codons correspondentes aos 20 aminocidos. Os nove aminocidos com 2

codons tm um nico tRNA, aminocidos com 4 codons tm 2-3 tRNAs e aqueles com 6 codons tm 3-5 tRNAs. Algumas das oscilaes comuns so:

Base na 1 posio do anticodon U (no modificada) U* (modificada) G C I (inosina) A (rara)

Base reconhecida na 3 posio do codon U,A,C,G A,G C,U G U,C,A U

Uma conseqncia desta oscilao que alguns aminocidos so representados por mais de um cdon, havendo uma boa correlaco entre o nmero de codons de um aminocido e sua ocorrncia nas protenas. O uso dos aminocidos assim, pelo menos em parte, dependente da disponibilidade dos codons. Dados estereoqumicos sugerem que os codons so determinados por afinidades qumicas naturais entre os aminocidos e os anticodons particulares. Uma possibilidade, ento, que o cdigo gentico tenha se originado por interaes diretas anticodon-aminocido e que as sintetases, que hoje garantem a exatido da aminoacilao, evoluram mais tarde. Outra possibilidade, segundo Osawa e Jukes (1988), que o codon tenha evoludo por interaes codonanticodon. Estes autores propuseram 23 anticodons como o nmero mnimo para parear com os codons atuais dos 20 aminocidos. A partir deste nmero mnimo teria surgido o cdigo gentico primitivo, que seria quase idntico ao cdigo gentico atual das mitocndrias de mamferos. Este teria evoludo por diferentes presses de mutao GC/AT em duas direes principais: por um lado teria originado o cdigo dos eucariotos (e deste o dos protozorios ciliados), e por outro o das eubactrias e, a partir destas, o das mitocndrias, cloroplastos e micoplasma. H, no entanto, vrias outras propostas para a evoluo do cdon. Crick e cols (1976) propuseram que na interao mRNA/tRNA primitiva, alem do anticodon, participariam as bases adjacentes. Como as alas de anticodon atuais tm uma estrutura 3'-NR y UY- 5'(N = qualquer ba se , R = purina , Y = pirimidinae y = anticodon), o pareamento s seria possvel com um codon primitivo com composio RRY. Eigen e Schuster (1978) advogam, dentro do mesmo raciocnio, um codon primitivo do tipo RNY. Corrobora a sua teoria o fato de que os aminocidos mais provveis de terem ocorrido no ambiente primitivo (glicina, alanina, cido asprtico e valina) podem ser codificados por codons RNY, mas no RRY.

Para Fitch e Upper (1987) o codon primitivo teria composio NNN, que evoluiria para NYN codificando aminocidos hidrofbicos e NRN para aminocidos hidroflicos. Num segundo passo evolutivo haveria diferenciao da 1 base, gerando codons YYN, RYN, YRN, RRN que especificariam quatro grupos diferentes de aminocidos. Assim, por exemplo, todos os aminocidos cclicos teriam codons com pirimidina na 1 posio. Num ltimo passo evolutivo as pirimidinas seriam separadas em C e U e as purinas em A e G. Jurka e Smith (1987) relacionaram a origem do codon biossntese proteica: os aminocidos centrais que so interconvertveis e a partir dos quais todos os outros podem ser sintetizados, so todos codificados por codons RRN. Assim, possvel que este tenha sido o codon bsico primitivo. Outra idia, bastante interessante, sugere que o cdigo gentico inicial, sendo essencialmente composto por RNA, tenha se baseado em apenas duas bases: A e U. O agrupamento destas bases em triplets consegue produzir 8 diferentes significados, incluindo um cdon de Fim. As demais possibilidades de combinaes so compatveis com aminocidos pr-biticos, com exceo da asparagina, o que, por sua vez, pode ter sido compatvel com as primeiras formas de vida. A introduo gradual de novas bases, especificamente C e G, poderia originar novas combinaes formadas por duas letras velhas e uma letra nova, permitindo a codificao de novos aminocidos, sobre os quais a evoluo agiria no sentido de manter os que causassem as menores mudanas fenotpicas. Quando a proporo de letras velhas e novas nos codons fosse a mesma, atingindo o cdigo o mximo de redundncia possvel, novos codons formados apenas por letras novas surgiriam, formando mais alguns aminocidos. O cdigo atual poderia representar, ento, um equilbrio entre todas estas opes e o efeito das mesmas nas protenas e na atividade celular. A hiptese de que originalmente duas e no trs bases poderiam formar os codons, sendo posteriormente agregada uma terceira base, tambm compatvel com a idia de que apenas A e U existiam como cdigo gentico inicialmente. O fato de que a maioria da informao gentica atual reside nas duas primeiras letras dos codons apia esta hiptese. Evoluo do tamanho e do contedo do genoma Desde a origem da vida a partir da evoluo qumica, houve por um lado, um grande aumento na complexidade gnica at o surgimento do gene eucarioto e de sua organizao cromossmica, e por outro um aumento no contedo de DNA. Desta forma a quantidade de DNA

de mamferos cerca de 1000 vezes maior que a das bactrias. Este aumento no , no entanto, perfeitamente correlacionado complexidade do organismo (o chamado paradoxo do valor C). Embora um organismo mais complexo deva ter maior quantidade de genes no genoma, uma quantidade maior de DNA pode corresponder a uma maior proporo de DNA no codificador e no, necessariamente, de genes funcionais. Hoje sabe-se que isso verdade, tanto que a presena de seqncias no codificadoras pode deixar em patamares similares quanto ao tamanho do genoma organismos to diferentes como sapos e homens. Os altos contedos de DNA de organismos superiores so decorrentes, principalmente, de duplicaces gnicas ou de duplicaes genmicas (poliploidias). Este ltimo fator deve ter tido um papel muito importante na evoluo das plantas. Nos animais a poliploidia pode ter ocorrido apenas antes da evoluo dos cromossomos sexuais, uma vez que aps o perfeito estabelecimento desta forma de determinao sexual, os tetraplides que surgissem no se manteriam na populao. Por outro lado, a duplicao gnica por crossing-over desigual deve ter tido um papel muito importante na evoluo genmica, o que se pode deduzir pelo grande nmero de genes que formam clusters ou famlias. A duplicao gnica pode originar genes com funes relacionadas, mas novas (genes da famlia da globina ) ou aumentar o nmero de genes com a mesma funo (genes de rRNA e histona). Formao de novos genes: a) duplicao de genes completos: se dois genes so formados por duplicao de DNA, um deles pode mutar adquirindo uma funo inteiramente nova. Note-se que uma nova funo gnica pode surgir atravs de relativamente poucos passos mutacionais.A mioglobina e as cadeias da hemoglobina apresentam muitas similaridades, sugerindo a sua origem a partir de uma cadeia ancestral comum. As funes de alguns pares de protenas homlogas como a mioglobina e a hemoglobina so consideravelmente diferentes, enquanto outras como as das cadeias e da globina permanecem essencialmente iguais. b) elongao gnica: muitas protenas tm seqncias internas repetidas e estas repeties correspondem, freqentemente, a domnios funcionais ou estruturais, corroborando a hiptese da origem de genes complexos por recombinao de introns de genes mais simples. Maeda e cols (1984) demonstraram, por exemplo, que o alelo 2 da haptoglobina humana resulta da duplicao do

alelo 1 por crossing-over desigual em um heterozigoto para os subtipos F e S deste alelo. c) genes hbridos: o produto de um "crossing-over" desigual em uma regio de DNA contendo dois genes pode ser um novo gene formado por partes daqueles dois. A hemoglobina Lepore humana formada pela regio 5' da cadeia e 3' dac a de ia. Este fenmeno parece ocorrer mais ou menos freqentemente, uma vez que diferentes hemoglobinas Lepore tm sido descritas, o que deve ser decorrente do alto grau de similaridade (93%) entre essas cadeias globnicas. Genes hbridos, em geral, levam a efeitos deletrios, a menos que o gene original seja mantido, juntamente com o hbrido. Neste caso o gene composto pode evoluir para uma nova funo. Aumento do nmero de genes com mesma funo O genoma eucarioto contm vrios tipos de DNA repetitivo: famlias multignicas (genes com funes relacionadas), famlias supergnicas (conjunto de genes com um ou mais domnios de origem comum), genes moderadamente repetitivos (genes para rRNA e tRNA) e levemente re pe titivo (ge ne s pa ra a sc a de ia s e da globina e para as cadeias de imunoglobulinas), alm de seqncias altamente repetitivas ainda sem funo totalmente esclarecida (DNA satlite, famlia ALU humana), O processo bsico para a evoluo das famlias multignicas a duplicao recorrente, com o aumento do nmero de genes passo a passo. Conforme as necessidades da clula, e do organismo em si, os genes duplicados podem assumir outras funes, como explicado no item duplicao de genes completos. Neste caso, duplicao seguida de divergncia em diferentes graus o principal mecanismo responsvel (entenda-se divergncia como a diminuio da similaridade na seqncia, devida principalmente a mutaes). No caso dos agrupamentos gnicos com nveis variados de repetio, como ocorre com os genes dos rRNAs, a manuteno da identidade da seqncia certamente fundamental para a realizao das funes dos produtos codificados. Assim, a divergncia molecular posterior duplicao deve ser muito mais limitada do que a que ocorre com as famlias gnicas clssicas, como a das globinas, por exemplo. importante salientar que a localizao genmica fundamental para a divergncia: cpias agrupadas tendem a permanecer mais similares entre si do que cpias localizadas em locais distantes, como em diferentes cromossomos. Isto no exclui a possibilidade de eventos intermedirios de divergncia, como ocorre na famlia das histonas, onde repeties de

genes capazes de codificar diferentes histonas existem ao longo dos genomas. Aumento do nmero de seqncias altamente repetitivas Para a evoluo de seqncias altamente repetitivas a duplicao gnica apenas no parece ser suficiente e outras explicaes tm sido propostas. Uma delas a evoluo em concerto: crossing-over desigual entre genes ou cromossomos no homlogos levaria repetio de um segmento de DNA e a um aumento ou reduo (ao acaso) do nmero de genes. O crossing-over teria o efeito de homogeneizar as seqncias num agrupamento, que, na ausncia de mutao, manteriam-se idnticas. Na realidade, mutaes sempre ocorrem, de modo que mesmo em um agrupamento espera-se encontrar algumas variantes. Acredita-se que este mecanismo tenha sido o principal responsvel pela origem dos grandes blocos de DNA repetitivo em tandem, e que ainda hoje influencie na organizao do genoma como um todo. No caso dos mini e dos microssatlites, o escorregamento das fitas (strand slippage) durante a replicao do DNA parece ser o principal mecanismo de origem e organizao destas seqncias, podendo ser responsvel diretamente pelo tamanho das mesmas. A principal evidncia a favor desta hiptese advm do fato de que o escorregamento envolve em geral pequenas partes de DNA de cada vez. Porm, possvel que mecanismos de crossing-over desigual tenham influenciado o surgimento e origem dos minissatlites, uma vez que a principal fonte de variao, neste caso, o nmero de cpias de uma mesma seqncia presente em determinado loco cromossmico. No caso dos satlites, escorregamento de fitas pode ter sido importante nos passos iniciais da formao do satlite, enquanto que crossing-over desiguais atuariam em estgios mais tardios da evoluo dos mesmos. A principal justificativa para esta idia o fato de que os satlites so em geral resultados de repeties de alta ordem de seqncias curtas, havendo, ento, possibilidade de ocorrncia dos dois mecanismos. Uma outra origem para as seqncias repetitivas pode ser a transcrio reversa. A famlia ALU, do genoma humano, uma famlia gnica que apresenta cerca de 1 000 000 de cpias espalhadas por todo o genoma. As pores 5' e 3' do gene 7 SL RNA (RNA citoplasm tico abundante que atua na sntese protica como partcula de reconhecimento de sinal) so homlogas seqncia ALU, sugerindo ter esta se originado por deleo da poro central do gene 7 SL RNA. A

ALU parece assim ser uma classe gigante de pseudogenes e ter-se originado por transcrio reversa do mRNA processado, com posterior insero do transcrito. Como as ALU mantm as seqncias promotoras e so transcritas, mesmo no sendo funcionais, podem gerar mais cpias de si mesmas e inserir-se no genoma pelo mesmo processo de transcrio reversa, podendo ento mover-se como um transposon. Este efeito cascata aumenta grandemente a chance de disperso das seqncias ALU atravs do genoma. Alm das ALU outros pseudogenes parecem originar-se por transcrio reversa de mRNAs processados. O genoma do camundongo, por exemplo, possui muitos pseudogenes de globina, alguns dos quais faltam introns. Independente do mecanismo de origem, a grande questo que fica em relao ao DNA repetitivo : qual a sua funo no genoma? Acredita-se que, de alguma forma, estas seqncias so funcionalmente importantes; ou, ento, talvez elas sejam mantidas porque suas altas taxas de mutao contribuem para o potencial evolucionrio a longo prazo da populao, servindo em ltima anlise como reserva de variabilidade. Esta ltima hiptese poderia explicar a ocorrncia do DNA repetitivo em tandem. Mas, e quanto s seqncias ALU e outros tipos de transposons? A nica vantagem adaptativa aparente parece ser para elas prprias, j que o potencial mutagnico imenso. Porm, possvel que estas seqncias representem genes baratos, que podem conter alguma informao capaz de se expressar mais ou menos independentemente em diferentes locais do genoma. De qualquer forma, o papel das seqncias altamente repetitivas tanto na evoluo do tamanho, como na organizao do genoma como um todo incontestvel e fundamental, e provvel que no s tenha agido em pocas passadas, mas que tambm esteja atuando atualmente, continuamente nos genomas dos diferentes organismos vivos. Relgio molecular Um dos aspectos interessantes da evoluo ao nvel molecular que, para uma dada protena, a taxa de substituio de aminocidos e de nucleotdeos aproximadamente constante entre linhagens bem como dentro das linhagens. Se as protenas evoluem a taxas constantes elas podem ser utilizadas para estimar as taxas e tempos de divergncia entre organismos e para construir filogenias. Isto conhecido como relgio molecular. Sua existncia foi primeiro sugerida por Zuckerkandl e Pauling (1965), aps a anlise da taxa de substituio de aminocidos da Hb e do Cit C em diferentes linhagens de mamferos e da verificao da constncia das mesmas.

Atualmente, taxas de mutaes nas seqncias do DNA genmico e das organelas (mitocndrias e cloroplastos) vm sendo utilizadas no entendimento das relaes evolutivas entre os organismos.

Alguma controvrsia existe sobre o mecanismo do relgio molecular, alguns autores pondo dvidas sobre sua validade. Gillespie (1984,1986) sugeriu que a taxa de substituio variaria ao acaso, com o tempo, em cada linha evolutiva. Neste caso, o relgio molecular se tornaria episdico, com perodos de substituies sendo separados por outros com poucas alteraces. Segundo Goodman (1981) as taxas de evoluo seriam maiores aps a ocorrncia de duplicaes gnicas e as protenas evoluiriam mais rapidamente em perodos de irradiao adaptativa. Nei (1987) fazendo uma longa reviso sobre o assunto, concluiu que, embora a taxa de substituio no seja estritamente constante e varie consideravelmente entre os organismos, ela pode ser considerada aproximadamente constante quando se considera o longo tempo evolutivo. Uma maneira simples de testar o relgio molecular estimar o nmero de substituies de aminocidos ou de nucleotdeos em cada ramo de uma rvore evolutiva e relacionar com o tempo evolutivo avaliado. Alguns exemplos, no entanto, tm surgido ao longo do tempo de excees ao relgio molecular: a) o padro de substituio de aminocidos embora constante com o tempo evolutivo varia consideravelmente entre as diferentes protenas a depender de seus requerimentos funcionais. Protenas como as histonas, extremamente necessrias estrutura do cromossomo eucarioto mantiveram-se evolutivamente estveis (dos 105 aminocidos destas protenas apenas dois so diferentes entre espcies to distantemente relacionadas como a ervilha e o boi). Protenas menos crticas como o fibrinopeptdio suportam muito mais mudanas. Por outro lado, dentro de uma mesma protena, a taxa de substituio varia com o domnio estrutural ou funcional. Assim, por exemplo, a taxa de substituio na superfcie da molcula de Hb cerca de 10 vezes mais alta do que no grupo heme (Kimura e Ohta, 1973). b) a estrutura primria tambm parece interferir na taxa de mutao. Graur (1985) mostrou uma correlao negativa significante entre a proporo de glicinas e a taxa de mutao. Como a glicina o menor aminocido, sua substituio por outro, levaria provavelmente a uma alterao na funo, sendo ento selecionada contra. c) o tempo de gerao dos organismos tambm interfere com a constncia evolutiva.

Verificou-se que a taxa de substituio de AA duas vezes maior em macacos do que no homem (medida em stios/ano) e maior em roedores que em primatas. Considerando as variaes nos tempos de gerao destes organismos, as maiores taxas poderiam ser decorrentes de mais ciclos de duplicao de DNA. Quando organismos com mesmos tempos de gerao so comparados as taxas evolutivas se mantm constantes. Desta forma o relgio molecular se aplica para espcies estritamente relacionadas. d) taxa de substituio em organelas: O genoma das mitocndrias de mamferos tem de 15000 a 17000 pares de bases, correspondendo a 1/10000 do genoma nuclear. Apresenta uma nica seqncia, no repetida, codifica 13 protenas, 2 rRNA e 22 tRNA, apresentando uma regio controle; um genoma estruturalmente muito estvel. O genoma das mitocndrias de plantas apresenta muita variabilidade estrutural, sofre rearranjos, duplicaes e delees com freqncia, de modo que o tamanho varia de 40000 a 2500000 pares de bases; este genoma pode ser linear ou circular e a informao pode ser dividida em molculas de DNA separadas, em crculos sub-genmicos; codifica 15-30 protenas, 3 rRNA, um nmero varivel de tRNAs e os genes estruturais parecem estar em mltiplas cpias. O genoma dos cloroplastos possui de 120000 a 220000 pares de bases e bastante estvel. Na Nicotiana tabacum os cloroplastos codificam 37 tRNA (8 dos quais contm introns), 8 rRNA, 45 protenas (algumas contm introns) alm de 59 "open reading frames" de funo desconhecida. A taxa de substituio sinnima nas mitocndrias de mamferos foi estimada em 5,7x10
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subst./stio/ano; este valor cerca de 10 vezes maior que aquele estimado para as substituies sinnimas dos genes nucleares. As taxas de substituio no sinnima variam consideravelmente entre protenas, mas so bem maiores que aquelas dos genes nucleares. As maiores taxas de mutao do genoma mitocondrial podem ser devidas a: baixa fidelidade na replicao do DNA mit.; ausncia de reparo ou reparo ineficiente nas mitocndrias; alta concentrao de mutgenos na mitocndria (como radicais livres, superxidos). As mitocndrias dos vegetais e os cloroplastos apresentam menores taxas de substituio que os genes nucleares. Assim no existe correlao entre as taxas de substituio e a evoluo estrutural, sugerindo que os dois processos ocorrem independentemente; da mesma forma no existe corrrelao entre a evoluo das organelas e a

evoluo do genoma nuclear, o que indica que os dois processos tambem so independentes. e) as taxas de mutao variam com a regio do gene, em funo das restries seletivas: O estudo da taxa de evoluo ao nvel do DNA muito mais informativo do que aquele envolvendo seqncias proticas devido a: a) muitas mutaes no se refletem em aminocidos, em funo dos codons sinnimos; b) muitas seqncias de DNA no so codificadoras. Estudos neste nvel de investigao tm mostrado que a taxa de substituio de nucleotdeos muito maior na 3 posio do codon que nas demais; isto possivelmente devido ao fato de que a maioria das substituies na terceira posio (mas no todas) so silenciosas. Para a maioria dos genes funcionais a taxa de substituies sinnimas muito maior (cerca de cinco vezes) do que a de no sinnimas e enquanto estas variam enormemente de gene a gene as sinnimas tm, em geral, taxas muito semelhantes em todos os genes. Assim a taxa de mutao na 3 posio do codon nos genes de histona aproximadamente igual do fibrinopeptdio, embora a proporo de substituio de aminocidos seja praticamente nula naquela e bastante alta nesta. Estudos comparando a taxa de substituio de nucleotdeos entre genes funcionais, pseudogenes e regies no codificadoras mostraram que a taxa de substituio de nucleotdeos segue a sequinte ordem decrescente: pseudogenes > mutaes sinnimas nas regies codificadoras > introns > regies flanqueadoras > mutaes no sinnimas nas regies codificadoras. Este padro facilmente explicvel pelas diferentes funces e importncias das vrias regies do DNA. Os pseudogenes sendo no funcionais podem acumular mutaes ao longo do tempo, j que no sofrem a ao da seleo; raciocnio semelhante se aplica s regies codificadoras, no que se refere s mutaces sinnimas. Os introns e regies flanqueadoras por estarem envolvidos no processamento do transcrito de RNA e regulao da sntese suportam menos as mutaes e finalmente modificaes nas regies que levam a alteraes das protenas so eliminadas por seleo natural, mantendo-se em nveis muito baixos. f) o uso de codons sinnimos no se d ao acaso; este fato foi observado em procariotos e eucariotos. Genes de um organismo e de espcies relacionadas mostram o mesmo padro de escolha entre os codons sinnimos; os codons mais utilizados so aqueles reconhecidos pelos tRNAs mais abundantes. Alm disto os desvios dos codons so maiores em genes fortemente expressos que em genes fracamente expressos.

g) transferncia horizontal de genes: ocasionalmente ocorre transferncia de informao gentica entre diferentes taxa ao longo da evoluo. A simbiose entre procariotos e eucariotos, que deu origem s mitocndrias e aos cloroplastos, seria o primeiro exemplo deste fenmeno. Vrus e plasmdios podem carregar genes e atuar como agentes para a transferncia de genes entre espcies relacionadas ou no. A leghemoglobina de soja e de outras leguminosas to semelhante Hb de vertebrados que parece possvel que o gene tenha sido transferido dos animais para estas plantas.