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RISPOSTA DELLOSPITE ALLE INFEZIONI BATTERICHE SIGNIFICATO DELLE DIFESE ANTIMICROBICHE Lesistenza di meccanismi di difesa nei confronti delle

infezioni fu sospettata sin dallantichit, quando si osserv che, durante le epidemie alcuni individui non si ammalavano nonostante contatti stretti e ripetuti con persone infette. A partire dalla fine del XIX secolo fu evidente che questo stato di resistenza o immunit era spesso dovuto a una reazione dellospite nei confronti dei microrganismi patogeni. Limmunologia la scienza che studia i meccanismi fisiologici di difesa nei confronti di agenti dannosi, con particolare riguardo ai microrganismi. I meccanismi di difesa sono numerosi ed eterogenei, ma operano nel loro complesso come ununit funzionale unica, il sistema immunitario. Non sempre, tuttavia, limmunit da una malattia infettiva si basa sulla presenza di meccanismi di difesa nei confronti del microrganismo causale. A volte lo stato di resistenza dovuto alla semplice assenza, allinterno dellospite, di condizioni favorevoli alla riproduzione del patogeno. Fenomeni di questo tipo sono spesso alla base dellimmunit di specie, una condizione per la quale una specie-ospite (ad esempio luomo) resistente a microrganismi che infettano specie diverse (ad esempio gli animali domestici). Le difese antibatteriche, e in generale quelle antimicrobiche, sono fondamentali per la sopravvivenza delluomo e di tutti gli altri esseri viventi. Li numero totale di batteri (circa 10 alla 4^) che normalmente colonizza le superfici supera di un ordine di grandezza il numero di cellule (circa 10 alla 3^) che costituiscono il nostro corpo. Questi microrganismi commensali (definiti anche flora normale o microbiota autoctono) sono essi stessi, come si dir in seguito, un importante fattore di difesa dellospite. Tra i commensali. Per esistono anche specie potenzialmente in grado di causare malattie pi o meno gravi (ad esempio Streptococcus pneumoniae e Neisseria meningitidis, agenti di sepsi e meningite, o Streptococcus mutans, agente della carie dentaria). Oltre a ci, luomo entra frequentemente in contatto con pericolosi patogeni provenienti dallambiente esterno, quali, ad esempio. Mycobacterium tuberculosis o Vibrio cholerae. Nel corso dellevoluzione il sistema di difesa delluomo ha dovuto quindi affrontare un compito immane: eliminare rapidamente i microrganismi potenzialmente dannosi e tollerare al tempo stesso quelli innocui. Ci ulteriormente complicato dal fatto che un identico tipo di batterio pu essere innocuo o dannoso in base alla densit o alla sede di colonizzazione. Il sistema decide rapidamente se intervenire o no, e con quale forza, in base a due ordini di informazioni: Sono presenti prodotti microbici ed, eventualmente, in quale sede? presente un danno o unalterazione dei tessuti del corpo? Le informazioni vengono raccolte e trasmesse da una serie di sensori molecolari (recettori di ricognizione) disposti in maniera strategica allinterno del corpo. Il sistema immune interviene con la massima intensit quando sono presenti contemporaneamente segnali delle due classi, e cio segnali che indicano la presenza di microrganismi e segnali che indicano un danno alle cellule dellospite. Un sistema di controllo di questo tipo che si pu definire binario perch si basa sullintegrazione di due classi diverse di stimoli mette in grado lospite di discriminare facilmente la presenza di patogeni (che per definizione inducono un danno) da quella di microrganismi innocui a livello delle superfici. Un secondo fattore che regola lintensit della risposta dipende dalla sede nella quale viene segnalata la presenza microbica. I recettori di ricognizione che rilevano la presenza di microrganismi sono particolarmente abbondanti allinterno dellorganismo e meno densi sulle superfici. Ogni tentativo di penetrazione allinterno del corpo (e cio di invasione della cute o delle mucose) provoca ima violenta reazione che termina solo con leliminazione completa dei microrganismi. Di conseguenza, linterno del corpo normalmente sterile, cio privo di microbi. Al contrario, questi vengono relativamente tollerati quando si trovano allesterno dei tegumenti, e cio sulla cute o sulle mucose. Questa tolleranza , per, solo parziale, dal momento che il sistema di difesa continuamente allopera per limitare con vari mezzi il numero di batteri che colonizzano le superfici esterne. Limportanza di disporre di un sistema di difesa a livello della cute e delle mucose, oltre che allinterno del corpo, dipende dal fatto che alcuni patogeni sono in grado di causare malattia semplicemente

colonizzando le superfici, anche senza invadere i tessuti (ad esempio Vibrio colera). Ci avviene mediante la produzione da parte dei batteri di prodotti tossici (tossine) che possono agire non solo nelle immediate vicinanze, danneggiando le cellule epiteliali, ma anche a distanza. Inoltre, la penetrazione dei tessuti da parte di patogeni invasivi pu essere prevenuta impedendo o limitando la colonizzazione delle superfici da parte di questi microrganismi. Da quanto detto risulta chiaro che le difese antibatteriche del corpo sono assicurate: dalla flora normale; dal sistema immunitario dellospite (tab. 7.1).

La flora normale agisce solo a livello dei tegumenti (in particolare, a livello della cute e della maggior parte delle mucose), mentre il sistema immune agisce sia a livello delle superfici sia allinterno del corpo. Esamineremo preliminarmente le difese a livello delle superfici e, successivamente, considereremo in maggior dettaglio il sistema immunitario dellospite. DIFESE A LIVELLO DELLE SUPERFICI Flora normale Il prodotto del concepimento normalmente sterile in utero. Dopo la nascita, le superfici del neonato vengono gradualmente colonizzate da microrganismi commensali fino alla formazione di un complesso ecosistema (microbiota indigeno o autoctono o flora normale) costituito da centinaia di specie batteriche diverse. Questo processo pu richiedere diversi mesi o anni per giungere a piena maturazione. Ad esempio, le spirochete orali compaiono solo dopo la pubert. I membri del microbiota autoctono competono tra loro e con i microrganismi provenienti dallesterno (o esogeni) per le risorse nutritive dellhabitat. Queste risorse, in condizioni normali, non sono disponibili ai microrganismi esogeni, in quanto tutte le fonti di materia e di energia sono utilizzate pienamente dal microbiota autoctono in un ecosistema maturo. I fenomeni di competizione per il substrato sono, pertanto, un primo meccanismo di antagonismo microbico. Un secondo meccanismo dato dalla produzione, da parte di batteri, di sostanze in grado di uccidere altri batteri, o di rallentarne la crescita. Un esempio di ci sono le batteriocine, che agiscono su specie spesso simili a quelle del batterio produttore. Le colicine (batteriocine prodotte da Escherichia coli) possono giocare un ruolo nel prevenire le infezioni da parte di patogeni dei generi Salmonella e Shigella. Le batteriocine hanno in comune tra loro la natura proteica, ma sono, altrimenti, eterogenee dal punto di vista strutturale, funzionale ed ecologico. Da quanto detto, risulta evidente che un formidabile meccanismo di difesa dellospite rappresentato dallantagonismo microbico operato dalla flora normale nei confronti non solo dei patogeni esogeni, ma anche nei confronti di membri potenzialmente patogeni esogeni, ma anche nei confronti di membri potenzialmente patogeni del microbiota autoctono (box 1).

Box 1 La flora normale protegge luomo dalle Infezioni La microflora intestinale presente durante il primo anno di vita ridotta rispetto a quella degli adulti. Questo relativo sottosviluppo (sia come numero complessivo di batteri sia come diversit di specie) della flora intestinale non consente adeguati fenomeni d competizione con specie patogene. Ci spiega laumentata frequenza di infezioni da Pseudomonas spiega laumentata frequenza di infezioni da Pseudomonas aeruginosa o da ceppi

enteropatogeni di Escherichia coli durante il primo anno di vita. Un esempio analogo costituito dal botulismo infantile. Nelladulto il botulismo causato esclusivamente dallingestione di tossina preformata negli alimenti, e non dallinfezione con lagente causale (Clostridium botulinum), in quanto la normale flora enterica ne impedisca la colonizzazione. Ci non si verifica, tuttavia, nei primi mesi di vita, durante i quali il botulismo pu svilupparsi come conseguenza di una colonizzazione dellintestino da parte del patogeno, con produzione locale di tossina. In qualsiasi et della vita, lequilibrio ecologico del microbiota autoctono pu essere turbato da fattori esterni. Ci comporta situazioni di dismicrobismo, cio unalterazione delle normali proporzioni delle specie allinterno del microbiota. La dieta pu alterare la composizione qualitativa e quantitativa della flora enterica diminuendone il potenziale competitivo nei confronti dei patogeni. La riduzione della flora enterica pu spiegare laumentata suscettibilit degli individui malnutriti a Vibrio colera. Lassunzione frequente di carboidrati semplici (principalmente saccarosio sotto forma carboidrati semplici (principalmente saccarosio sotto forma di dolciumi e bibite) determina, a livello della placca dentaria, un aumento dei batteri in grado di fermentare questi substrati con produzione dacido lattico. Per alcuni di questi microrganismi, come Streptococcus mutans, il saccarosio , inoltre, un fattore di colonizzazione in quanto facilita la sintesi di esopolisaccaridi insolubili che promuovono laderenza batterica sulla superficie dentaria. Labbassamento del pH dovuto allaccumulo di acido lattico determina la demineralizzazione dellidrossiapatite dello smalto e linsorgenza di carie dentaria. Nel corso di terapie antibiotiche, soprattutto se ad ampio spettro e/o prolungate, sono frequenti infezioni causate dal micete Candida albicans, principalmente a livello della bocca (mughetto), della vagina (vaginiti) o della zona perianale. Questo fenomeno legato alleliminazione, da parte degli antibiotici, di membri della flora normale in grado di rallentare la crescita di C albicans, tra cui streptococchi, Enterobacter aerogenes, E. coli e P. aeruginosa. Un meccanismo simile legato allinsorgenza di enteriti (da forme lievi di diarrea a gravi coliti pseudo membranose) nel corso di terapie antibiotiche. Queste condizioni sono invariabilmente causate dal batterio Clostridium difficile, un membro relativamente resistente agli antibiotici della flora intestinale residente. La vagina colonizzata da diverse specie del genere Lactobacillus. Queste producono acido lattico come unico prodotto terminale della fermentazione del glucosio che, a sua volta, deriva dal glicogeno presente nelle cellule esfoliate dallepitelio vaginale. La produzione dacido lattico da parte dei lattobacilli mantiene il pH vaginale a livelli acidi (pH 4 0,5) e difende la vagina dallattacco di diversi patogeni esogeni ed endogeni che mal tollerano condizioni di acidit. Batteri commensali della vagina, quali alcuni anaerobi obbligati e la specie Gardnerella vaginalis, possono prendere il sopravvento quando diminuisce il numero di lattobacilli (e quindi lacidit delle secrezioni), causando una condizione infiammatoria nota come vaginosi batterica. Anche le vaginiti causate dal protozoo Trichomonas vaginalis si verificano no prevalentemente in presenza di un innalzamento del pH (pH > 4,5). La diminuzione del numero di lattobacilli, che alla base di queste infezioni, spesso dovuta a squilibri ormonali con diminuita produzione di estrogeni. Il nesso tra numero di lattobacilli e livelli di estrogeni dato dal fatto che questi ormoni sono responsabili dellaccumulo nelle cellule epiteliali vaginali d glicogeno che, come s detto, costituisce il principale substrato energetico per la riproduzione dei lattobacilli e la produzione di acido lattico.

Barriere anatomiche e chimiche Lintegrit strutturale dei tegumenti (cute e mucose) pone una barriera invalicabile per la stragrande maggioranza dei microrganismi. Non esistono specie batteriche capaci di penetrare la cute intatta. Questa possiede, infatti, un epitelio pluristratificato ricco di cheratina che, assieme al sebo, protegge gli strati sottostanti da vari agenti chimici, fisici e biologici e dallevaporazione. In seguito a un danno (ad esempio unabrasione, unustione o una ferita), il derma e il tessuto sottocutaneo possono essere rapidamente colonizzati dai microrganismi che si trovano normalmente sullepidermide (ad es. stafilococchi) o da microrganismi esogeni, provocando infezioni. La cute un ambiente relativamente acido (pH 5), secco e iperosmolare, il che lo rende poco abitabile. Le aperture che si trovano normalmente a livello della superficie (pori, follicoli piliferi e sbocco delle ghiandole sebacee) offrono un ambiente relativamente pi favorevole. A livello delle ascelle, dellinguine e dei piedi, la presenza di una relativa umidit favorisce limpianto di una florida comunit di commensali. Questa una condizione favorevole anche al potenziale attacco da parte di patogeni (soprattutto miceli). Il piede datleta una dermatite

da miceti che si sviluppa nelle condizioni di elevata umidit e temperatura che si creano in un ambiente occlusivo, quale quello creato dalle calzature, soprattutto durante uno sforzo fisico. Oltre che dalla secchezza e dal pH acido, la cute protetta da diversi acidi grassi contenuti nel sebo, che esercitano una potente attivit batteriostatica o battericida, e dal lisozima prodotto dalle ghiandole sudoripare. I tratti respiratorio, alimentare e urogenitale sono rivestiti da mucose. Queste vengono cos definite perch sono ricoperte da muco, un fluido denso e ricco di polisaccaridi e glicoproteine. Il muco agisce come una barriera fisica mobile, capace di intrappolare i batteri e sospingerli allesterno. Nel caso dello stomaco, il muco un ambiente proibitivo (pH 2) per quasi tutti i microrganismi, con la notevole eccezione costituita da Helicobacter pylori, agente di gastrite e ulcera peptica che riesce a neutralizzare lacidit locale attraverso la produzione di ammoniaca (un composto fortemente basico) a partire dallurea, ad opera di una ureasi. Gli epiteli delle mucose sono spesso costituiti da un singolo strato di cellule, e sono quindi pi facilmente penetrabili, rispetto alla cute, da parte di alcuni batteri. Prima di attraversare le mucose, i patogeni devono aderire tenacemente ad essa e replicarsi; solo successivamente riescono a penetrare attivamente allinterno delle singole cellule epiteliali o a passare attraverso le giunzioni tra queste. La colonizzazione delle superfici cutanee e, soprattutto, mucose viene fortemente ostacolata dallattivit dilavante delle secrezioni. A causa delle loro piccole dimensioni, i microrganismi hanno un alto rapporto tra area esterna e massa e sono quindi estremamente soggetti a fenomeni di superficie, quali gli spostamenti da parte di correnti di fluidi. Lazione meccanica del muco sospinto verso lalto dalle ciglia sufficiente a mantenere la sterilit del tratto respiratorio inferiore. Talvolta i microrganismi riescono a penetrare il muco, ad aderire alle cellule epiteliali e a riprodursi su di esse. Anche in questo caso, tuttavia, essi vengono rapidamente allontanati dal processo di esfoliazione, che consiste nel distacco delle cellule pili periferiche degli epiteli. I meccanismi fisici dallontanamento dei batteri rappresentano un sistema altamente reattivo, capace di adattarsi rapidamente a stimoli provenienti dal microbiota autoctono e dal sistema immune. La quantit di muco prodotto, i movimenti muscolari verso lesterno e la velocit di esfoliazione aumentano rapidamente in risposta ai processi infiammatori. Linfiammazione delle mucose comporta pertanto unaumentata efficienza nellallontanamento dei microrganismi. Viceversa, lassenza o la riduzione della flora normale (come in animali allevati in condizioni di completa sterilit) comporta una forte riduzione della velocit di esfoliazione e del turnover degli epiteli. Le secrezioni della cute e delle mucose contengono sostanze con forte attivit batteriostatica o battericida. Le secrezioni mucose sono ricche di lisozima (una muramidasi in grado di scindere il peptidoglicano) che attivo nei confronti di diversi batteri gram-positivi. La lattoperossidasi delle secrezioni catalizza la formazione di sostanze antibatteriche quale lo ione ipoclorito in presenza di ioni cloruro e acqua ossigenata. Infine, la lattoferrina sequestra gli ioni ferrici rendendoli non disponibili al metabolismo microbico. Si tratta di una strategia molto efficace in grado di rallentare fortemente la crescita batterica, in quanto gli ioni ferrici sono indispensabili per il funzionamento di enzimi-chiave del metabolismo energetico. Le secrezioni sono ricche di immunoglobuline della classe A (IgA). Queste molecole sono prodotte da cellule del sistema immune adattativo e hanno limportante funzione di bloccare laderenza dei batteri alle cellule epiteliali legandosi alle molecole microbiche che mediano questo fenomeno (adesine). Inoltre le IgA sono in grado di neutralizzare le tossine prodotte da patogeni che colonizzano le mucose. Va sottolineato, infine, che gli epiteli sono continuamente sorvegliati da cellule del sistema immunitario (ad esempio neutrofili, cellule dendritiche e linfociti).

SISTEMA IMMUNITARIO Lo studio del sistema immune ha grande interesse dal punto di vista pratico perch pu consentire lo sviluppo di metodi efficaci e a basso costo (ad esempio la vaccinazione) per controllare le malattie da infezione. Nellambito delle infezioni batteriche, ci diventato particolarmente importante da quando sono emersi i limiti degli antibiotici. oggi evidente che molti batteri hanno sviluppato resistenza a questi farmaci. Inoltre, anche nel caso di infezioni da batteri sensibili agli antibiotici, spesso non possibile una terapia efficace a causa del decorso rapido della malattia o di difficolt nella diagnosi. Da un punto di vista teorico, lo studio delle difese antibatteriche ha unimportanza che travalica lambito delle malattie infettive, poich esso ha fornito nuove prospettive per la comprensione di fenomeni patologici fondamentali (ad es. linfiammazione) e della patogenesi di malattie gravi e diffuse (ad es. malattie autoimmuni, malattie infiammatorie croniche e tumori).

La necessit di un sistema di difesa adeguato ha condizionano fortemente levoluzione delle piante, degli invertebrati e dei vertebrati. Il genoma umano, in particolare, stato modellato da questa pressione selettiva. Ad esempio, forme comuni di polimorfismo genico, quali quelle dei gruppi sanguigni ABO e degli antigeni del complesso maggiore di istocompatibilit, vengono mantenute nelle popolazioni umane per il valore che hanno in termini di difese antimicrobiche. Daltra parte, i patogeni sono co-evoluti con lospite sviluppando metodi per sfuggire al sistema immunitario. E interessante che i commensali hanno evoluto meccanismi molto simili a quelli dei patogeni per evadere i meccanismi di difesa e per manipolare i processi fisiologici dellospite. Ci indica che la capacit di resistere al sistema immune un prerequisito fondamentale per qualsiasi tipo di colonizzazione microbica indipendentemente dagli effetti (danno o beneficio) arrecati allospite. Riflessivit del sistema immune Il sistema di difesa dellospite in grado di far fronte rapidamente a condizioni mutevoli, quali quelle costituite dal contatto con microrganismi diversi. Per il funzionamento del sistema fondamentale il passaggio da uno Stato di quiescenza a uno stato di attivazione. poi altrettanto importante che il sistema ritorni nuovamente, al pi presto possibile, in uno stato di quiescenza. Lattivazione avviene in due fasi concettualmente distinguibili: nella prima, che pu definirsi afferente, stimoli specifici generano una serie di segnali di attivazione; nella seconda, quella efferente, vengono messi in atto i meccanismi microbicidi. Per la fase efferente necessaria lattivazione coordinata di pi tipi cellulari diversi. Il livello dattivazione del sistema di difesa pu variare allinterno di una gamma molto ampia; inoltre, lattivazione pu essere localizzata a una parte del corpo o generalizzata. Il sistema finemente regolato da svariati meccanismi che lo riportano a uno stato di quiescenza ai primi segni che linfezione sotto controllo. Questo programma di regolazione fondamentale, perch unattivazione continua del sistema immune comporterebbe un peso insopportabile per lospite. Una situazione di questo tipo si verifica in molte infezioni croniche (ad esempio epatiti da virus dellepatite C e gastriti da Helicobacter pylori) caratterizzate dalla persistenza di uno stato infiammatorio che a lungo andare pu determinare scompensi metabolici irreversibili e linsorgenza di cancro. Anche unattivazione breve (pochi giorni) del sistema pu provocare danni catastrofici se estesa a tutto il corpo, piuttosto che localizzata. Un esempio di questa situazione la sepsi, una condizione legata alla presenza di microrganismi nel sangue, che decorre con ipotensione, coagulazione intravascolare disseminata, emoconcentrazione e conseguentemente, con una ridotta perfusione dei tessuti. DUE TIPI D' IMMUNIT opportuno operare una suddivisione del sistema immunitario in immunit innata (sinonimi: naturale o aspecifica) e immunit adattativa (sinonimi: acquisita o specifica) (box 2). La tabella 7.2 riassume le principali differenze tra questi due tipi dimmunit.

Box 2 Interfaccia tra immunit innata e immunit adattativa Limmunit innata serve da fondamento per le risposte immuni adattative: queste sono deboli o assenti in mancanza di unattivazione del sistema innato. Pertanto, il sistema innato il vero responsabile di una decisione cruciale: se rispondere o no a un microrganismo o a un antigene e con quali modalit. Se il sistema innato decide di rispondere, ci avviene attraverso un programma abbastanza stereotipato che comporta tre effetti strettamente interconnessi: infiammazione; attivazione dei processi microbicidi; innesco dellimmunit adattativa.

I primi due effetti sono descritti nel testo. Accenneremo qui allinnesco dellImmunit adattativa nei linfociti T, che avviene attraverso due segnali (denominati segnale 1 e segnale 2). Perch si verifichi una risposta adattativa, entrambe i tipi d segnale devono essere trasmessi contemporaneamente a un linfocita T da parte di una cellula presentante lantigene (APC). Linterfaccia tra questi due tipi cellulari viene definita sinapsi immunologica. I macrofagi, i linfociti B e, soprattutto, le cellule dendritiche possono fungere da APC. La presentazione dellantigene ai linfociti T comporta la sua parziale frammentazione, lassemblaggio dei frammenti su molecole del complesso maggiore di compatibilit di classe I o II (MHC I o II) e lesposizione del complesso costituito dal frammento antigenico e dalla molecola MHC (Ag-MHC) sulla superficie cellulare, il legame del recettore per lantigene presente sui linfociti T (TCR) con il complesso Ag-MHC genera il segnale 1. Contemporaneamente la APC (se opportunamente attivata da PRR pro infiammatori, vedi testo e tab. 7.5) esprimer sulla propria superficie molecole co-stimolatorie costituite da CD40, CD80 e/o CD86 (queste ultime due molecole sono anche definite, rispettivamente B7.1 e B7.2). Le molecole co-stimolatorie vengono riconosciute da recettori complementari sui linfociti T (CD40L e CD28) che impartiscono il segnale 2.

Come s detto, un prerequisito per lattivazione dei linfociti T la presenza contemporanea sulla APC di Ag-MHC (che impartisce il segnale 1) e molecole co-stimolatorie (che impartiscono il segnale 2). La presenza del solo segnale 1 insufficiente allattivazione dei linfociti T, e induce, inoltre anergia in queste cellule, rendendole cio incapaci di rispondere a stimoli successivi. Le molecole co-stimolatorie vengono indotte solo in seguito a unattivazione del sistema innato, in associazione alla produzione di citochine pro infiammatorie. Poich anche queste ultime hanno un ruolo importante nel favorire la proliferazione dei linfociti T (e nel polarizzarli in senso Th1; vedi box 3) stato proposto che le citochine vengano considerate come il segnale 3. Da quanto detto risulta chiaro che, attraverso la produzione di molecole co-stimolatorie e di citochine, le cellule dellimmunit innata controllano le risposte adattative. Inoltre, lassenza di molecole co-stimolatorie in condizioni normali (cio in assenza di attivazione dellimmunit innata) assicura lanergia di linfociti autoreattivi T (cio con TCR in grado di legarsi a complessi Ag-MHC presenti su cellule normali dellorganismo ospite). Nonostante la maggioranza di queste cellule siano distrutte nel timo, un certo numero sfugge a questo processo ed potenzialmente in grado di aggredire le cellule dellospite (autoimmunit).

Limmunit innata viene cos definita perch comporta uno stato di resistenza presente fin dalla nascita e quindi indipendente da precedenti contatti con lagente patogeno. Limmunit adattativa comporta invece una reazione dadattamento a uno specifico microrganismo. Tale adattamento acquisito, in quanto indotto da un precedente contatto con lagente patogeno. Limmunit adattativa estremamente specifica perche lo stato di resistenza limitato al patogeno con cui avvenuto il precedente contatto, e non si estende ad altri patogeni. Ad esempio, chi ha gi contratto la parotite (orecchioni) resistente per tutta la vita al virus della parotite, ma pienamente suscettibile a tutte le altre malattie infettive (ad esempio alla rosolia, alla scarlattina ecc.). Al contrario della risposta adattativa, la risposta innata si esplica in maniera simile nei confronti di diversi tipi di agenti. Fenomeni dimmunit innata che sono buoni esempi di questa relativa specificit sono le barriere cutanee e mucose, la fagocitosi, il complemento, linfiammazione e la febbre. Unaltra importante differenza tra i due tipi dimmunit sta nellIntervallo che intercorre tra stimolo e risposta. Limmunit innata pienamente efficace gi dalle primissime fasi dellinfezione e rappresenta la prima linea di difesa contro i patogeni. Al contrario, le risposte adattative necessitano di diversi giorni prima di raggiungere una qualsiasi efficacia. Esse hanno la massima importanza in quelle situazioni in cui limmunit innata, da sola, non riesce a eliminare completamente i microrganismi. In questi casi lintervento, a distanza di giorni, del sistema adattativo quasi sempre risolutivo ed eradica completamente linfezione. I fenomeni dimmunit innata sono dovuti a tipi cellulari diversi da quelli dellimmunit adattativa (fig. 7.1 e tab. 7.2).

Alcune cellule dellimmunit innata sono altamente specializzate, come i fagociti professionali (costituiti da leucociti polimorfo nucleati, monociti e macrofagi), le cellule dendritiche e le cellule natural killer. Anche cellule meno professionali quali le cellule epiteliali, i fibroblasti e le cellule endoteliali svolgono un ruolo importante nelle risposte innate. I fenomeni dimmunit adattativa sono mediati dai linfociti T e B. Ognuna di queste cellule (sia quelle dellimmunit innata sia quelle dellimmunit adattativa) presenta recettori di ricognizione diversi per ciascun tipo cellulare (vedi tab. 7.2). In questo contesto, per recettori di ricognizione si intendono quelle molecole che sono in grado di legarsi agli stimoli che innescano la risposta immune (ad esempio prodotti microbici) e di trasmettere alla cellula segnali di attivazione. Ai recettori di ricognizione dellimmunit innata si d il nome di PRR o Pattern Recognition Receptors (recettori di ricognizione di motivi molecolari). I ligandi dei PRR, e cio le sostanze microbiche da loro riconosciute, vengono denominati PAMP (Pathogen-Associated Molecular Patterns o motivi molecolari associati a patogeni). I PAMP possiedono tutti la caratteristica di essere molecole indispensabili per la sopravvivenza del microrganismo e sono pertanto comuni a un vasto numero di specie microbiche diverse e relativamente invarianti. 1 recettori di ricognizione dei linfociti T e B vengono denominati recettori per lantigene. Per antigene (Ag) si intende una molecola contro la quale si ha una risposta immune di tipo adattativo (si tratta quindi di una definizione a posteriori). I recettori per lantigene sono costituiti, nel caso dei linfociti B, da unimmunoglobulina di superficie (sIg) e, nel caso dei linfociti T, da un TCR (recettore per lantigene dei linfociti T). Mentre i recettori per lantigene non sono presenti sulle cellule dellimmunit innata, ma solo sui linfociti, alcuni PRR sono presenti sui linfociti, soprattutto sui linfociti B. I recettori per lantigene sono altamente variabili, al punto che, assieme, essi costituiscono un repertorio di centinaia di migliaia di tipi differenti. In altre parole, esistono migliaia di sIg o di TCR diversi, ciascuno dei quali capace di legare un antigene diverso. La variabilit di questi recettori confinata a una parte della molecola (regione variabile), che responsabile del legame con lantigene. I recettori per lantigene espressi su un singolo linfocita avranno tutti unidentica regione variabile e unidentica specificit per lantigene. Un determinato tipo di sIg o TCR sar quindi espresso, tra tutti i linfociti del corpo, solo su uno o pochissimi linfociti e sulla loro progenie (o cloni). Si dice, pertanto, che questi recettori hanno una distribuzione clonale {vedi tab. 7.2). Al contrario, i PRR presenti su una cellula dellimmunit innata sono identici ai PRR presenti SU altre cellule del medesimo tipo cellulare. In altre parole, ciascun tipo di PRR sar assolutamente identico in tutte le cellule di un individuo, in quanto il gene che lo codifica presente nella linea germinale, cio nel genoma della cellula uovo fecondata. Al contrario, i geni che codificano per i recettori per lantigene non sono presenti in forma matura nella linea germinale, che contiene solo frammenti discontinui di questi geni. Questi frammenti vengono assemblati (riarrangiati) in maniera altamente variabile durante la differenziazione dei linfociti; di conseguenza, il gene maturo (gi riarrangiato) presente solo nei linfociti (cio in una linea somatica).

Immunit adattativa

Limmunit adattativa si distingue in immunit umorale (mediata da linfociti B) e immunit cellulare o cellulomediata (mediata da linfociti T). Lattivazione dei linfociti B comporta quasi sempre un aiuto da parte di linfociti T, che per questo motivo vengono definiti helper o Th. In seguito allattivazione innescata da uno specifico antigene, i linfociti B si differenziano in plasmacellule che secernono immunoglobuline (Ig o anticorpi) di vari isotipi (classi e sottoclassi) nel plasma e nelle secrezioni (tab. 7.3).

Le immunoglobuline prodotte dalle plasmacellule conservano la capacit di legarsi allantigene che ha originariamente stimolato i linfociti B. Come si detto, le immunoglobuline hanno importanti funzioni nel controllo delle infezioni. In primo luogo, possono neutralizzare lattivit biologica di prodotti microbici che funzionano come fattori di virulenza. Ci spesso sufficiente a far pendere la bilancia a favore dellospite. Oltre a ci, le immunoglobuline potenziano i meccanismi effettori dellimmunit innata, funzionando come opsonine, attivando il complemento, inducendo la de granulazione di mast-cellule o processi di citotossicit. Ogni isotipo di immunoglobuline ha diverse attivit effettrici. Ad esempio, solo le IgE inducono la de granulazione delle mastcellule e solo le IgG sono capaci di attraversare la placenta e di proteggere il neonato nei primi mesi di vita. Anche i linfociti T hanno diverse attivit funzionali in base alla sottopopolazione di appartenenza (box 3).

Lattivazione da parte dallantigene comporta un processo di proliferazione dei linfociti T o B. Naturalmente solo i linfociti dotati di un recettore Specifico per un determinato antigene andranno incontro a proliferazione. Infatti, sia la specificit sia la memoria (cio la capacit di ricordare precedenti contatti con il patogeno) tipiche dellimmunit adattativa dipendono dalla replicazione di un ristrettissimo numero di cellule, selezionato dallantigene a partire da un vasto repertorio di linfociti, ciascuno dei quali esprime un recettore diverso sulla superficie. A questo fenomeno si d il nome di espansione o selezione clonale (fig. 7.2).

La conseguenza del processo di proliferazione o espansione cellulare che, a un secondo contatto, il patogeno trover preformato nellorganismo un numero molto maggiore di linfociti specifici per i propri antigeni rispetto a quelli presenti in un ospite naive, cio mai venuto in precedenza a contatto con il patogeno. Ci spiega la resistenza alla malattia da parte di individui venuti a contatto con il patogeno in maniera naturale (infezione) o artificiale (vaccinazione). Lespansione cellulare denominata clonale in quanto d luogo a cloni e cio a popolazioni omogenee per il fatto di derivare da una singola cellula. Tutti i membri di un clone, naturalmente, erediteranno il medesimo recettore. Da quanto esposto, risulta chiaro che recettori per lantigene, presenti su linfociti B o T, hanno distribuzione clonale e la memoria dellimmunit adattativa ha le propri basi cellulari in fenomeni di espansione clonale. Meccanismi effettori del sistema immune Come si detto, leliminazione dei microbi pu avvenire semplicemente mediante lallontanamento fisico dal corpo attraverso il deflusso delle secrezioni verso lesterno. Inoltre, il sistema di difesa pu rallentare la crescita dei microrganismi o ucciderli con varie modalit, delle quali la pi importante la fagocitosi: essa comporta lingestione del patogeno e la sua esposizione a sostanze antimicrobiche allinterno di compartimenti intracellulari. Alcune cellule del sistema immune, i fagociti professionali, sono specializzate nello svolgimento di questa funzione. I fagociti professionali sono cellule dellimmunit innata, ma la loro funzione pu essere grandemente potenziata dalle cellule dellimmunit adattativa, e cio dai linfociti B e T e dai loro prodotti (rispettivamente, immunoglobuline e interferone-gamma). Alcuni microrganismi non possono essere ingeriti (fagocitati) perch troppo grandi (come gli elminti) o perch riescono a bloccare i meccanismi dingestione. In questi casi i fagociti possono riversare allesterno, a ridosso dei microrganismi, il contenuto dei loro granuli, che sono ricchi di sostanze antimicrobiche e pro infiammatorie (esocitosi). Lesocitosi da parte di granulociti eosinofili e mast-cellule ha un ruolo importante nel controllo delle infezioni da elminti, ma non delle infezioni batteriche. Viceversa, lesocitosi da parte di granulociti neutrofili efficace come prima arma di difesa nei confronti di alcuni batteri. I cosiddetti patogeni intracellulari riescono a penetrare attivamente in cellule non fagocitarle prima di essere intercettati dai fagociti professionali, Oppure, fattisi ingerire da questi, ne sovvertono i meccanismi microbicidi. Contro questi patogeni, che riescono a replicarsi allinterno delle cellule dellospite, il sistema di difesa usa la tattica di distruggere le cellule parassitate. Il processo viene definito citotossicit e comporta linduzione di apoptosi nella cellula bersaglio da parte di vari tipi cellulari tra i quali i pi importanti sono le cellule natural killer e i linfociti T citotossici. Si tratta di una strategia logica che priva il microrganismo di un santuario e cio di una nicchia favorevole alla riproduzione. Molto spesso la stessa cellula infettata a decidere il suicidio andando incontro ad apoptosi senza aiuti esterni. La cellula apoptosica e i microrganismi intrappolati al suo interno vengono in seguito ingeriti dai fagociti professionali. Citotossicit e apoptosi spontanea sono particolarmente importanti nel caso delle infezioni da virus, da clamidie e da rickettsie. Per questi parassiti intracellulari obbligati, la localizzazione allinterno delle cellule dellospite indispensabile per la riproduzione. Al contrario, nel caso di molti batteri, funghi e protozoi in grado di replicarsi anche in assenza di cellule, il parassitismo intracellulare non una tappa obbligata, ma piuttosto una strategia per proteggersi dalle difese extracellulari dellospite (parassitismo intracellulare facoltativo). Anche nei confronti dei parassiti intracellulari facoltativi lapoptosi spontanea e quella indotta sono strategie utili di difesa. Infine, poich la capacit dei microrganismi di produrre malattia legata alla produzione di particolari sostanze (definite fattori di virulenza), la neutralizzazione di tali fattori ad opera di immunoglobuline (Ig o anticorpi) prodotte da linfociti B spesso di importanza cruciale per la risoluzione dellinfezione. Esempi di fattori di virulenza sono sostanze che conferiscono ai microbi la capacit di aderire alle cellule dellospite (adesine batteriche o anti-recettori virali), di danneggiarle (tossine) o di antagonizzare la fagocitosi. Immunit innata Pattern Recognition Receptors (PRR)

Lattivazione del sistema immune innato comporta linduzione di: infiammazione; meccanismi microbicidi (ad esempio fagocitosi e citotossicit); risposte adattative. Questi effetti sono mediati dallattivazione di recettori di ricognizione, i Pattern Recognition Receptors, in seguito al loro legame con prodotti di microrganismi o di cellule danneggiate (tab. 7.4).

Esistono gruppi funzionalmente diversi di PRR. Alcuni recettori si limitano semplicemente a propagare il segnale ad altri recettori. Alcuni PRR stimolano direttamente linternalizzazione di particelle (recettori fagocitari), la citotossicit (recettori delle cellule natural killer) o la produzione di molecole co-stimolatorie (vedi box 2). Probabilmente il gruppo pi importante di recettori quello che induce direttamente la produzione di mediatori dellinfiammazione (recettori pro infiammatori). Linfiammazione ha un ruolo cruciale nelle risposte antimicrobiche in virt della sua capacit di concentrare i componenti (cellulari e umorali) del sistema immune nel sito di infezione, amplificando, nel contempo, i f fenomeni di attivazione. Inoltre, i PRR pro infiammatori mediano unaumentata espressione di molecole costimolatorie sulle APC, e quindi linnesco dellimmunit adattativa, favorendo, in particolare, una polarizzazione in

senso Th1. Questo tipo di polarizzazione fondamentale nelle difese contro i batteri, i miceti e i protozoi unicellulari (vedi box 3). Ciascun PRR in grado di legarsi a specifici prodotti microbici ampiamente conservati tra i principali gruppi di microrganismi (cio a PAMP come il peptidoglicano, presente in tutti gli eubatteri, o al lipopolisaccaride, presente in tutti i batteri gram-negativi). Assieme, i PRR sono capaci di riconoscere la presenza di qualsiasi tipo di microrganismo, dai virus ai protisti eucarioti. Alcuni PRR sono in grado di percepire segni tipici di sofferenza cellulare (ad es. la diminuzione della pressione osmotica intracellulare) o segni di lisi cellulare, tipica della necrosi (ad es. la presenza nello spazio extracellulare di molecole di ATP). Sofferenza e necrosi cellulare si verificano costantemente nel corso delle malattie infettive e rappresentano, pertanto, utili segnali indiretti della presenza di patogeni. In figura 7.3 viene illustrato come i PRR possano essere suddivisi in quattro gruppi in base alla sede, rappresentata da: plasma e/o secrezioni, in forma solubile; superficie cellulare (membrana plasmatica); membrana degli endosomi e altri organuli intracellulari; citosol. Il segnale di attivazione pu essere propagato da PRR solubili a PRR espressi sulla superficie cellulare o da un PRR di superficie (co-recettore) a un altro PRR di superficie. I PRR solubili comprendono il complemento, le collectine e le pentrassine. I PRR cellulari si distinguono in recettori Toll-simili (TLR), recettori NOD-simili (NLR), recettori RIGsimili (RLR), e in svariati recettori fagocitari. Inoltre, un discorso a parte meritano i recettori sulle cellule natural killer (vedi oltre). I pili importanti PRR pro infiammatori sono il complemento, i TLR, gli NLR e gli RLR. Certi TLR sono espressi sulla superficie (ad esempio TLR2 e TLR4), mentre altri sono espressi a livello endosomale (TLR7, TLR8 e TLR9). NLR e RLR sono presenti nel citosol. I RLR sono in grado di rilevare la presenza di acidi nucleici virali (RNA a doppia elica o RNA fosforilato) mentre gli NLR rilevano la presenza di prodotti batterici.

Infiammazione Linfiammazione la risposta immediata dellospite alla presenza di microrganismi o di un danno cellulare di qualsiasi natura. Il significato funzionale dellinfiammazione quello di mobilizzare molecole e cellule del sistema di difesa concentrandole nel sito nel quale viene rilevata la presenza di una situazione abnorme. La vasodilatazione e laumento della permeabilit capillare, tipiche dellinfiammazione, fanno s che passino dal sangue ai tessuti: macromolecole che normalmente non si trovano nei liquidi interstiziali (ad esempio componenti del complemento, immunoglobuline); leucociti. Ci porta alla formazione di un essudato (e cio un liquido infiamma torio ad alta concentrazione proteica) ricco di neutrofili che, dopo le prime 24 ore, possono essere affiancati da monociti o linfociti. I caratteristici segni dellinfiammazione sono larrossamento, laumento di calore (dovuto alliperemia, e cio allaumentato contenuto di sangue nel tessuto), il gonfiore (dovuto al passaggio di macromolecole e acqua nel liquido interstiziale) e il dolore. Linfiammazione ha inoltre limportante funzione di favorire la coagulazione con produzione di fibrina, contribuendo, di concerto con i fagociti, alla localizzazione del patogeno. I mediatori dellinfiammazione sono classificabili in 4 gruppi in base alla natura chimica. Il primo gruppo costituito da citochine pro infiammatorie, caratterizzate da unelevata potenza (box 4).

I mediatori lipidici comprendono le prostaglandine, i leucotrieni e il platelet activating factor (PAF). Le amine biogene (istamina e serotonina) sono piccole molecole liberate da un numero limitato di tipi cellulari (soprattutto mast-cellule e granulociti basofili) in seguito allo scoppio e alla fuoriuscita (de granulazione) del contenuto di granuli ricchi di queste amine preformate Le chinine sono mediatori proteici derivati da precursori inattivi (chininogeni) presenti nel plasma. Nel corso dellinfiammazione i chininogeni vengono soggetti a idrolisi parziale ad opera di proteasi e trasformati in chinine biologicamente attive, tra le quali la pi importante la bradichinina. Lo stimolo principale per il rilascio di bradichinina lattivazione del fattore di Hageman, un fattore della coagulazione. Febbre La febbre la manifestazione pi eclatante di una serie dalterazioni dei meccanismi di termoregolazione (ad esempio brividi, sudorazione, sensazioni di caldo o di freddo) che si verificano spesso durante le malattie infiammatorie. La febbre, che particolarmente frequente nelle malattie infettive, pu essere definita come un aumento abnorme della temperatura corporea che si verifica in seguito a una riprogrammazione dei centri di termoregolazione encefalici. La febbre differisce dallipertermia, che un aumento della temperatura corporea rispetto a quella programmata dai centri termoregolatori, a causa di uneccessiva produzione o di uninsufficiente dispersione di calore. Allinizio dellepisodio febbrile i pazienti hanno sensazioni di freddo che li spingono ad adottare comportamenti (come quello di coprirsi) che ostacolano la dispersione di calore. Inoltre, i brividi comportano uniperattivit muscolare con

produzione di calore. Sensazione di freddo e brividi cessano solo quando la temperatura corporea raggiunge i nuovi valori programmati dai centri termoregolatori. Laumento di temperatura un importante meccanismo di difesa in quanto la grande maggioranza dei patogeni cresce in maniera ottimale alla temperatura corporea normale di 36-37 C. Anche un aumento di pochi gradi in grado di rallentare considerevolmente la crescita microbica. Gli animali eterotermi cercano di sfruttare un meccanismo simile ricorrendo solo a modifiche comportamentali. Ad esempio, in presenza di uninfezione, i rettili elevano la propria temperatura corporea esponendosi a lungo al sole. La febbre causata da pirogeni endogeni (e cio dalle citochine pro infiammatorie, soprattutto interleuchina-1, tumor necrosis factor e interleuchina-6) in seguito alla stimolazione delle cellule dei nuclei dellipotalamo preposti alla termoregolazione. Pertanto, la febbre prodotta dalle stesse citochine che innescano linfiammazione. I pirogeni esogeni sono PAMP (ad esempio le endotossine dei batteri gram-negativi e il peptidoglicano) in grado di stimolare la liberazione di pirogeni endogeni. Nel corso delle malattie batteriche vengono classicamente riconosciuti quattro tipi diversi di febbre: febbre continua: la febbre rimane elevata per tutto il periodo delle 24 ore, con oscillazioni inferiori a 1 C; questo tipo di febbre tipico del tifo addominale (causato da Salmonella typhi) e del tifo esantematico murino (causato da alcune specie di rickettsie); febbre remittente: anche in questo caso che si verifica spesso nel corso di infezioni da batteri piogeni (streptococchi e stafilococchi) la febbre permane elevata nelle 24 ore, ma con oscillazioni superiori a un grado; febbre intermittente: la temperatura normale in parte della giornata; febbre ricorrente: causata, ad esempio, da diverse specie di Borrelia; la temperatura rimane normale per lunghi periodi di tempo intervallati da nuovi attacchi febbrili. segno di uninfezione non del tutto guarita che si riaccende periodicamente.

Fagociti e fagocitosi Per fagocitosi si intende, in senso stretto, un processo di endocitosi che porta allinternalizzazione di particelle con un diametro uguale o superiore a 0,3 m. Intesa in senso lato, la fagocitosi comporta anche le fasi successive di uccisione e digestione della particella ingerita (fig. 7.4).

Il significato funzionale della fagocitosi quello di distruggere i microrganismi e di eliminare le cellule apoptosiche dellorganismo. In condizioni normali, 500 miliardi di cellule vanno ogni giorno incontro ad apoptosi (o morte cellulare programmata) durante processi di ricambio degli epiteli, di rimodellamento tissutale o di senescenza. fondamentale che queste cellule siano rimosse prima che vadano incontro a necrosi secondaria, cio a un processo associato a perdita dellintegrit della membrana cellulare e allo stravaso di contenuti citoplasmatici a forte attivit pro infiammatoria nello spazio extracellulare. Tutte le cellule del corpo, comprese le cellule epiteliali e i fibroblasti, sono in grado di internalizzare microrganismi e altre particelle in processi di fagocitosi. Solo alcuni tipi cellulari, i fagociti professionali, sono tuttavia in grado di compiere questi processi con rapidit, ingerendo diverse particelle al minuto, e digerendole efficientemente. I fagociti professionali comprendono alcuni leucociti del sangue (granulociti polimorfonucleati neutrofili, eosinofili, basofili e monociti), i macrofagi e le cellule dendritiche immature che sono normalmente presenti nei tessuti. I macrofagi e le cellule dendritiche mieloidi derivano da monociti che vanno incontro a un processo di differenziazione nei tessuti dopo aver lasciato il sangue. I monociti, i macrofagi e le cellule dendritiche immature vengono definiti fagociti mononucleati per distinguerli dai fagociti polimorfo nucleati. Questi ultimi comprendono i granulociti eosinofili, basofili e neutrofili. Dal punto di vista delle difese antibatteriche, i neutrofili sono funzionalmente pi importanti degli altri granulociti. Un processo correlato alla fagocitosi, definito autofagia, comporta la digestione, da parte della cellula, di una porzione dei propri contenuti citoplasmatici. Il significato di questo processo quello di rimuovere organelli o parti di citosol danneggiati e di promuovere il ricambio dei contenuti cellulari. Lautofagia ha un ruolo importante anche nellimmunit innata in quanto promuove la digest ione di porzioni di citoplasma contenenti microrganismi. Durante lautofagia porzioni di citoplasma sono sequestrate in un caratteristico vacuolo a doppia membrana (definito autofagosoma) e digerite in seguito a fusione con lisosomi. Lautofagia sta emergendo come un fenomeno importante nel mediare luccisione di patogeni intracellulari quale Mycobacterium tuberculosis. Aspetti generali della fagocitosi I fagociti vengono prodotti nel midollo osseo, passano nel sangue e, di qui, ai tessuti, nei quali possono spostarsi mediante movimenti ameboidi. Presentano varie forme di inclusioni granulari (lisosomi) contenenti sostanze battericide ed enzimi litici, quali lisozima, proteine cationiche, proteasi, fosfatasi, nucleasi e lipasi. I neutrofili (box 5) sono ricchi di lisosomi preformati (granuli), mentre i macrofagi (box 6) hanno pochi granuli, che tuttavia sono in grado di sintetizzare rapidamente alloccorrenza. I fagociti vengono attratti nei tessuti da stimoli chimici (chemiotassi positiva) rappresentati da prodotti batterici (ad esempio peptidi formilati) o mediatori prodotti dal sistema di difesa dellospite. Tra questi sono comprese diverse citochine pro infiammatorie, chemochine (citochine ricche di cisteina dotate di forte attivit chemio tattica) e fattori del complemento (soprattutto C5a). Queste sostanze fanno s che i fagociti lascino il sangue e si dirigano verso il focolaio infiammatorio, venendo a contatto con i microrganismi. I fagociti possono aderire ai microrganismi mediante uninterazione diretta dei propri PRR di membrana con i rispettivi PAMP microbici (fagocitosi non opsonica) oppure per lintermediazione di opsonine e cio di PRR solubili o di immunoglobuline (fig. 7.5).

Le Opsonine ricoprono il patogeno rendendolo pi appetibile da parte del macrofago. Il termine opsonina deriva dal greco opsao, preparare o condire. Le opsonine funzionano da ponte, legandosi da una parte al microrganismo e dallaltra al fagocita tramite specifici recettori posti sulla superficie di questi ultimi. Tra le opsonine hanno un ruolo preminente le immunoglobuline (che non sono PRR, ma molecole di ricognizione dellimmunit adattativa) e i prodotti dellattivazione del complemento (tab. 7.5).

Loccupazione di recettori non-opsonici od opsonici (esempi di questo secondo tipo sono i recettori per la porzione Fc di IgG o FcyR e i recettori per il complemento o CR) induce la fagocitosi attraverso un processo che comporta laggregazione dei recettori in fasci (crosslinking) sul piano della membrana. Questa aggregazione determinata dal fatto che la particella si comporta come un ligando multivalente. Lingestione preceduta dalla riorganizzazione del citoscheletro al di sotto della membrana con polimerizzazione dellactina ad opera di GTPasi della famiglia Rho. Il risultato di questa riorganizzazione la formazione di una sorta di coppa che avvolge la base della particella da fagocitare. Ai bordi di questa si accrescono rapidamente degli pseudopodi (le pareti della coppa) fino a ricongiungersi al di sopra della particella. Ci porta alla chiusura di un vacuolo neoformato contenente il microrganismo (fagosoma) e, successivamente, al suo spostamento verso linterno della cellula. Il fagosoma va quindi incontro a diversi cicli di fissione e fusione con altri organelli, tra i quali endosomi che si formano normalmente nella cellula per un processo di endocitosi spontanea. In questo processo definito maturazione il fagosoma acquisisce proteine presenti sulle membrane di endosomi spontanei o di porzioni del complesso Golgi-reticolo endoplasmatico. I fagosomi si distinguono in precoci o tardivi. In base allacquisizione di specifici marcatori di maturazione (Rab5 ed EAA1 per gli endosomi precoci; Rab7 e LAMP-1 per gli endosomi tardivi). Durante il processo di maturazione il fagosoma si dissocia dalle proteine del citoscheletro e va incontro a una progressiva acidificazione ad opera di ATPasi vacuolari. Il fagosoma maturo si fonde con lisosomi che riversano in esso i propri contenuti per formare il fagolisosoma ricco di sostanze microbicide e di idrolasi acide (tab. 7.6).

Il processo di acidificazione, iniziato nellendosoma, continua nel fagolisosoma. Il meccanismo generale di formazione di fagosomi e fagolisosomi comune a tutti i tipi di fagociti (polimorfo nucleati e fagociti mononucleati). Le sostanze contenute nel fagolisosoma sono pi che sufficienti per luccisione di qualsiasi microrganismo, a meno che questo non riesca a sovvertire il funzionamento del fagocita (box 7).

Killing Luccisione dei microrganismi ingeriti pu essere opera della semplice acidificazione del fagosoma. Pi spesso luccisione avviene ad opera di una serie di sostanze presenti nel fagolisosoma classificabili come segue: intermedi reattivi dellossigeno; intermedi reattivi dellazoto; proteine cationiche, comprese le defensine e la proteina battericida che incrementa la permeabilit (BPI); idrolasi, comprese serin-proteasi e fosfolipasi; fattori nutri privi, cio proteine capaci di sottrarre sostanze nutritive essenziali, quale lo ione ferrico e il triptofano. Lingestione del microrganismo ad opera di certi recettori (ad es. CRI e FcyR) ma non di altri (ad es. CR3 o scavanger receptor) innesca una serie di reazioni a livello del complesso enzimatico nicotinamide adenina dinucleotide fosfato (NADPH) ossidasi, presente sulla membrana dei fagociti e nel fagolisosoma, che culminano nella produzione di intermedi reattivi dellossigeno (ROI). In questo processo uno dei cinque componenti del lanione superossido (O2-) Questo d luogo alla formazione di prodotti tossici quali il perossido di idrogeno o acqua ossigenata (H2O2), il radicale idrossilico (OH) e lossigeno singoletto. I fagociti fanno uso di queste forme tossiche dellossigeno per uccidere i microrganismi ingeriti. Lattivit microbicida dei ROI viene grandemente esaltata dalla mieloperossidasi che in presenza di ioni cloruro forma acido ipocloroso (il componente attivo della varechina), una sostanza a forte attivit antibatterica. Lacido ipocloroso reagisce a sua volta con unaltra molecola di H2O2 per dar luogo a una seconda molecola di ossigeno singoletto. In presenza di mieloperossidasi, analoghe interazioni possono aversi tra ROI ed altri alogeni (ad esempio bromuro e ioduro). Il risultato lossidazione di costituenti strutturali o enzimatici essenziali per il microrganismo. In questo processo gioca un ruolo importante la

per ossidazione dei lipidi e di costituenti della cromatina che sono in grado a loro volta di ossidare altri prodotti microbici. Lattivazione dei macrofagi induce inoltre (in grado diverso a seconda della specie: in misura minore nelluomo e maggiore nei roditori) la produzione di intermedi reattivi dellazoto (RNI) da parte dellenzima inducibile NO (ossido nitroso) sintetasi. NO tossico per i batteri e inibisce la replicazione virale. Esso pu reagire con prodotti tossici dellossigeno per dar luogo a radicali a base di perossinitrato. Esistono importanti differenze tra i fagociti mononucleati e i polimorfo nucleati neutrofili {vedi box 5 e box 6). I neutrofili hanno vita breve (2-3 giorni) e, allesame istologico, non si riscontrano in condizioni normali negli organi, con leccezione del sangue e del midollo osseo. I fagociti mononucleati, al contrario, vivono per diversi anni nei tessuti, e hanno un ruolo importante nel regolare il funzionamento e la differenziazione delle cellule circostanti. Sistema del complemento Il sistema del complemento composto da almeno 25 proteine solubili nel plasma e da 7 recettori cellulari. Per effetto di svariati stimoli queste componenti agiscono di concerto per: indurre infiammazione; potenziare la fagocitosi attraverso lopsonizzazione; uccidere microrganismi o cellule dellospite infettate attraverso la formazione di pori sulla membrana cellulare (lisi). Il complemento normalmente inattivo, ma pu venire rapidamente attivato in seguito a contatto con microrganismi, superfici estranee o complessi antigene-anticorpo (fig. 7.6).

Questi ultimi attivano il sistema tramite la cosiddetta via classica del complemento, mentre il contatto diretto con microrganismi attiva la via alterna. I segnali di attivazione vengono propagati con un meccanismo a cascata: ciascun componente attiva quello successivo scindendolo per proteolisi; a seguito della scissione, ciascuno dei frammenti acquisisce una nuova attivit fisiologica o enzimatica. Ad esempio, un frammento di un componente potr avere azione chemio tattica, mentre laltro funzioner

da proteasi per scindere il componente successivo nella serie. Le proteine del complemento vengono indicate con numeri preceduti dalla lettera C o con lettere maiuscole. Le principali componenti sono C1C9, B, D e P. Inoltre fanno parte del complemento altre proteine (ad esempio H e I) con funzione inibitoria dellattivazione. Partecipano al sistema altre proteine con funzione inibitoria normalmente presenti sulla superficie di tutte le cellule dellospite (quale il decay accelerating factor o DAF). La via classica di attivazione composta da C1, C2 e C4; la via alterna da C3, B, D e P, mentre le proteine C3 e C5-C9 costituiscono la via comune. C3 il componente pi importante del sistema e fa parte sia della via alterna che della via comune. Esso il componente centrale sul quale agiscono sia la via classica sia la via alterna. C3 a sua volta innesca quasi tutti i meccanismi effettori del complemento. Come si detto, le proteine del complemento si attivano a cascata, come quelle della coagulazione del sangue, in una sequenza ordinata. Con lesclusione di C4, lordine di attivazione segue la sequenza numerica (ad es. C5 attiva C6, C6 attiva C7 ecc.). Il complemento ha un ruolo fondamentale nelle difese nei confronti di qualsiasi tipo di batterio grazie alla sua efficacia nel richiamare i neutrofili e i monociti nel sito dellinfezione (chemiotassi) e nel favorire laderenza e lingestione dei microrganismi (opsonizzazione). Lattivit chemiotattica nei confronti dei neutrofili e dei monociti mediata da C5a e, in minor misura, da C3a, derivanti dalla scissione, rispettivamente, di C3 e C5. Inoltre, C5a un potente attivatore dei neutrofili. C3a e C5a determinano la liberazione di istamina, un mediatore dellinfiammazione, da parte di mast-cellule, basofili e piastrine. C3a e C5a vengono denominate anafilotossine per la capacit di indurre sintomi dellanafilassi (ipotensione e bronco costrizione) in seguito a inoculazione endovenosa negli animali. Lattivit opsonizzante del complemento mediata in primo luogo da C3b e dai suoi prodotti di trasformazione (iC3b e C3d). Questi componenti si legano alla superficie di molti tipi diversi di microrganismi e interagisconocon specifici recettori (CRI, CR2 e CR3) sulla superficie dei fagociti favorendo linternalizzazione del microrganismo. La formazione di pori a livello delle membrane mediata da alcune proteine del complemento (specificamente da C5b, C6, C7, C8 e C9) che formano il complesso litico o complesso di attacco. Tra i batteri, alcuni gram-negativi (tra cui specie del genere Neisseria) sono sensibili alleffetto litico del complemento, mentre i gram-positivi sono resistenti a causa dello spesso strato di peptidoglicano che riveste la membrana. I pazienti con difetti genetici di componenti del complesso litico sono pi sensibili a infezioni da Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis, agenti rispettivamente di gonorrea e meningite, ma non a infezioni da altri microrganismi. Al contrario una deficienza di C3, una malattia genetica alquanto rara determina una marcata suscettibilit a infezioni da parte di diverse specie batteriche. Deficienze genetiche di proteine della via alternativa determinano unaumentata suscettibilit a infezioni da enterobatteri. Interferoni Gli interferoni sono citochine con una spiccata capacit di inibire la replicazione virale. Furono scoperti alla fine degli anni cinquanta del secolo scorso in seguito a studi sul fenomeno dellinterferenza virale, in base al quale cellule infettate da un virus sono resistenti alla superinfezione da parte di altri virus. Lo stato di resistenza legato alla secrezione, da parte delle cellule infette, di interferoni capaci di agire, mediante recettori specifici, sia sulle stesse cellule produttrici sia su cellule vicine. Sono stati identificati diversi interferoni (IFN), suddivisi in due tipi principati (tipo I e tipo II). Gli IFN di tipo I (che comprendono diversi sottotipi di IFN-, INF- e singoli sottotipi di IFN-k, IFN-, IFN-, IFN-, IFN- e IFN-) si legano a un recettore comune (IFNAR), distribuito su tutte le cellule del corpo. Esiste un singolo sottotipo di IFN di tipo II, denominato IFN-. Questo si lega a un diverso recettore (IFNGR, espresso prevalentemente su cellule del sistema immune quali i macrofagi). stato recentemente scoperto un terzo tipo di IFN, costituito da 3 sottotipi di IFN-. che si legano a un complesso recettoriale composto da IFNLR e IL10R. Gli IFN di tipo I sono citochine primarie nel senso che vengono prodotte in seguito allesposizione diretta ad acidi nucleici di virus e batteri o al lipopolisaccaride dei batteri gram-negativi. LIFN- invece prodotto dalle cellule del sistema immune in seguito a stimolazione da parte delle citochine primarie IL12 e IL-18. Le attivit biologiche dei tre tipi di IFN sono solo in parte sovrapponibili e vanno ben oltre alla semplice attivit antivirale. Ad esempio, gli IFN di tipo I vengono usati nella terapia di alcuni tipi di tumore e di malattie autoimmuni, rispettivamente come agenti antiproliferativi e immunomodulatori. Come si detto lIFN-y ha un ruolo fondamentale nel potenziare la fagocitosi e il killing di patogeni non virali. Gli IFN di tipo 1 hanno, rispetto allIFN-, una maggiore attivit antivirale, ma una minore capacit di

stimolare lattivit fagocitaria. Capacit di stimolare lattivit fagocitaria. Nel complesso, i vari tipi di IFN agiscono in maniera sinergica per produrre i seguenti effetti: blocco della replicazione virale; attivazione di macrofagi e natural killer; blocco della proliferazione cellulare; potenziamento della presentazione dellantigene attraverso unaumentata espressione di molecole di i istocompatibilit e co-stimolatorie; potenziamento dellapoptosi. Cellule natural killer (NK) Le cellule natural killer (NK) sono cellule ad attivit citotossica (capaci cio di uccidere cellule dello stesso organismo) che hanno un ruolo fondamentale nellimmunit innata. Come tali costituiscono una prima linea di difesa, capace di distruggere cellule infettate da virus e da altri patogeni intracellulari senza un precedente contatto col patogeno (e cio in maniera naturale). Oltre allattivit citotossica, le NK hanno ima spiccata capacit di produrre IFN-, che, come si detto, un fondamentale fattore antibatterico. Come i neutrofili, le NK sono cellule mature che possono funzionare immediatamente dopo lattivazione. Da un punto di vista morfologico le NK sono grandi linfociti granulari cio linfociti con citoplasma abbondante, ricco di reticolo endoplasmatico in attiva sintesi proteica e contenenti tipici granuli azzurro fili. Le NK sono prive di marker di superficie tipici dei linfociti T (e cio TCR o CD3) o dei linfociti B (sIg). Esse invece esprimono CD16 (FcRIII, un recettore a bassa affinit per la porzione Fc degli anticorpi IgG1 e IgG3) e CD56 (una molecola di adesione caratteristica delle NK). Da un punto di vista funzionale, le NK sono notevoli per la loro capacit (unica tra le cellule del sistema immise) di riconoscere il s mancante e cio lassenza di determinate molecole-chiave tipicamente presenti su cellule normali. Infatti, le cellule NK hanno una serie di recettori capaci di legarsi a molecole di istocompatibilit di classe I (MHC I) presenti sulle cellule dellospite. La maggior parte di questi recettori hanno ima funzione inibitoria e cio bloccano lattivazione delle NK. Questi freni inibitori vengono persi quando le NK vengono a contatto con cellule bersaglio che esprimono bassi livelli di MHC I. Si tratta di un meccanismo utile perch le cellule infettate da patogeni intracellulari (soprattutto virus, ma anche batteri) esprimono ridotti livelli di MHC I. Poich anche le cellule tumorali presentano spesso questa caratteristica, le NK hanno un ruolo importante anche nelle difese antitumorali. Oltre ai recettori inibitori, le NK presentano diversi recettori eccitatori. Non ancora del tutto chiara la natura degli stimoli, espressi sulla superficie di cellule bersaglio, capaci di innescare questi recettori stimolatori. curioso comunque che le varie famiglie di recettori NK contengano sia membri ad attivit stimolatoria sia membri ad attivit inibitoria. Altri stimoli (pi convenzionali) capaci di attivare le NK sono classici mediatori del sistema immune come le citochine pro infiammatorie (soprattutto IFN di tipo I) o la presenza di anticorpi legati alle cellule bersaglio (la cui presenza viene avvertita tramite FcgRIII o CD16). Tramite questo recettore le NK possono esercitare, al pari dei fagociti, unazione citotossica anticorpo-dipendente {antibody dependent cell-mediated cytotoxicity-ADCC). Le cellule NK attivate da citochine vengono definite LAK (lymphokine-activated killer). Queste cellule hanno unattivit citolitica pi spiccata delle NK e sono in grado di Usare un numero maggiore di linee tumorali in confronto alle NK non attivate. Dopo essere entrate in contatto con una cellula bersaglio in grado di attivarla, le NK liberano lungo larea di aderenza il contenuto di granuli preformati ricchi di perforina e di un gruppo di proteasi noto come granzimi. La perforina forma pori a livello della membrana (in maniera analoga al complesso litico del complemento) e consente la penetrazione dei granzimi che causano apoptosi nella cellula bersaglio. Inoltre le NK producono un peptide ad attivit antibiotica (granulisina) capace di uccidere alcuni microbi intracellulari. importante notare che la morte cellulare indotta da NK avviene per apoptosi piuttosto che per necrosi (box 8).

Questultimo meccanismo comporterebbe la lisi immediata con la possibile fuoriuscita di virus o di altri patogeni intracellulari. Al contrario, durante lapoptosi, i patogeni rimangono intrappolati allinterno della cellula e distrutti direttamente o in seguito a fagocitosi del corpo apoptotico. Le cellule NKT si differenziano dalle NK per il fatto di esprimere sulla superficie il recettore per lantigene dei linfociti T (TCR) e di differenziarsi nei timo. Le NKT sono pertanto da considerarsi una sottopopolazione di linfociti T. Esse riconoscono, tramite un ristretto repertorio di TCR, glicolipidi, lipidi e peptidi idrofobici presentati nel contesto di molecole CD1d, le quali presentano somiglianze con molecole MHC di tipo I.