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Mdulo 3.

BIOMOLCULAS PROTENAS, ENZIMAS Y CIDOS NUCLEICOS


PROTENAS
Las protenas son macromolculas esenciales en la qumica de la vida . Estas macromolculas se emplean como componentes estructurales de las clulas y tejidos, de modo que el crecimiento, la restauracin y el mantenimiento del organismo dependen del abastecimiento adecuado de esas sustancias. Algunas protenas actan como catalizadores o enzimas, molculas especiales que regulan miles de reacciones qumicas distintas que ocurren en los seres vivos. Los protenas constitutivas de cada clula son la clave de su estilo de vida. Cada tipo celular posee una distribucin, cantidad y especie de protenas que determina el funcionamiento y la apariencia de la clula. Por ejemplo, una clula muscular difiere de otras en virtud de su gran contenido de protenas contrctiles, como la miosina y la actina, a las que se debe, en gran parte su apariencia y su capacidad de contraccin. La protena llamada hemoglobina, que se encuentra en los glbulos rojos o eritrocitos, se ocupa de la especializada funcin de transportar oxgeno. La mayor parte de las protenas son especficas de cada especie ; es decir, las protenas varan un poco de una especie a otra. As, las protenas presentes en las clulas de un perro son un poco diferentes en relacin a las de un zorro o de un coyote. Se cree que el grado de diferencia depende de las relaciones evolutivas. Los organismos escasamente relacionados tienen protenas que difieren en forma ms marcada que las de aquellos entre los cuales se establece una relacin evolutiva ms estrecha. Algunas protenas son diferentes an entre individuos de una misma especie, por lo que se considera que cada organismo es nico, desde el punto de vista bioqumico . Slo individuos genticamente idnticos (gemelos idnticos o cepas de organismos cultivados en relacin muy estrecha) presentan protenas idnticas. Funciones biolgicas de las protenas Describir las funciones de las protenas equivale a describir en trminos moleculares todos los fenmenos biolgicos. Gracias a su gran hetereogeneidad estructural, las protenas pueden asumir funciones muy variadas, de las cuales podemos destacar: Funcin enzimtica. La gran mayora de las reacciones metablicas tienen lugar gracias a la presencia de un catalizador de naturaleza proteica especfico para cada reaccin. Estos biocatalizadores reciben el nombre de enzimas. La gran mayora de las protenas son enzimas. Funcin hormonal. Las hormonas son sustancias producidas por una clula y que una vez secretadas ejercen su accin sobre otras clulas dotadas de un receptor adecuado. Algunas hormonas son de naturaleza proteica, como la insulina y el glucagn (que regulan los niveles de glucosa en sangre) o las hormonas segregadas por la hipfisis como la hormona del crecimiento, o la calcitonina (que regula el metabolismo del calcio), pero existen hormonas que no son protenas. Reconocimiento de seales qumicas . La superficie celular alberga un gran nmero de protenas encargadas del reconocimiento de compuestos qumicos de muy diverso tipo: receptores de hormonas, de neurotransmisores, de anticuerpos, etc. En muchos casos, los ligandos que reconoce el receptor ( hormonas y neurotransmisores) son tambin de naturaleza proteica y en otros casos son organismos (bacterias, virus). Funcin de transporte. En los seres vivos son esenciales los fenmenos de transporte, bien para llevar una molcula hidrofbica a travs de un medio acuoso (transporte de oxgeno o lpidos a travs

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de la sangre) o bien para transportar molculas polares a travs de barreras hidrofbicas (transporte a travs de la membrana plasmtica). Los transportadores biolgicos son siempre protenas. Funcin estructural. Las clulas poseen un citoesqueleto de naturaleza proteica que constituye un armazn alrededor del cual se organizan todos sus componentes, y que dirige fenmenos tan importantes como el transporte intracelular o la divisin celular. En los tejidos de sostn (conjuntivo, seo, cartilaginoso) de los vertebrados, las fibras de colgeno forman parte importante de la matriz extracelular y son las encargadas de conferir resistencia mecnica tanto a la traccin como a la compresin. Funcin de defensa. La propiedad fundamental de los mecanismos de defensa es la de discriminar lo propio de lo extrao. En bacterias, una serie de protenas llamadas endonucleasas de restriccin se encargan de identificar y destruir aquellas molculas de ADN que no identifica como propias. En los vertebrados superiores, las inmunoglobulinas se encargan de reconocer molculas u organismos extraos y se unen a ellos para facilitar su destruccin por las clulas del sistema inmunitario. Funcin de movimiento. Todas las funciones de motilidad de los seres vivos estn relacionadas con las protenas. As, la contraccin del msculo resulta de la interaccin entre dos protenas, la actina y la miosina. El movimiento de la clula mediante cilios y flagelos est relacionado con las protenas que forman los microtbulos. Funciones de reserva. La ovoalbmina de la clara de huevo, la lactoalbmina de la leche, la gliadina del grano de trigo y la hordena de la cebada, constituyen una reserva de aminocidos para el futuro desarrollo del embrin. Funciones reguladoras. Muchas protenas se unen al ADN y de esta forma controlan la transcripcin gnica. De esta forma el organismo se asegura que la clula, en todo momento, tenga todas las protenas necesarias para desempear normalmente sus funciones. Las distintas fases del ciclo celular son el resultado de un complejo mecanismo de regulacin desempeado por protenas como la ciclina. Otras funciones. Los fenmenos de transduccin (cambio en la naturaleza fsico-qumica de seales) estn mediados por protenas. As, durante el proceso de la visin, la rodopsina de la retina convierte (o mejor dicho, transduce) un fotn luminoso (una seal fsica) en un impulso nervioso (una seal elctrica) y un receptor hormonal convierte una seal qumica (una hormona) en una serie de modificaciones en el estado funcional de la clula.

Aminocidos Es esencial tener un conocimiento bsico acerca de la qumica de las protenas para comprender procesos como la nutricin y otros conceptos del metabolismo. Qumicamente, las protenas se componen de carbono, hidrgeno, oxgeno, nitrgeno y a veces, azufre. Los tomos de estos elementos suelen formar subunidades moleculares denominadas aminocidos. Los aminocidos conforman las unidades estructurales de las protenas . Contienen un grupo amino (-NH2) y un grupo carboxilo (-COOH) unidos al mismo tomo de carbono, llamado carbono alfa y difieren entre s en su grupo R o cadena lateral unida a este carbono alfa. La glicina, el aminocido ms simple presenta un hidrgeno como grupo R o cadena lateral, la alanina un grupo metilo (-CH 3), la valina un grupo isopropilo, etc. De todos los aminocidos posibles, slo veinte se encuentran normalmente en las protenas (aminocidos naturales). Los aminocidos son slidos cristalinos que al disolverse en una solucin de pH neutro se comportan como iones dipolares, siendo esta la forma en que se comportan en el pH celular. El grupo amino (-NH2) acepta un protn hasta convertirse en -NH 3+ (ion amonio) y el grupo carboxilo dona un protn convirtindose en -COO- (carboxilato) disociado. El carbono alfa de un aminocido es un carbono asimtrico. Por tanto, cada aminocido puede presentarse en dos ismeros pticos distintos, las formas L y D. Sin embargo, los ismeros de aminocidos presentes en los seres vivos son casi exclusivamente L-ismeros . Una excepcin seran los pocos aminocidos D presentes en los antibiticos producidos por los hongos.

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Los aminocidos se agrupan segn las propiedades de sus cadenas laterales. Los aminocidos con cadenas laterales no polares son hidrfobos, en tanto que aqullos con cadenas laterales polares son hidrfilos. Los aminocidos cidos tienen cadenas laterales con un grupo carboxilo. En el pH celular, el grupo carboxilo se disocia de manera que el grupo R tiene una carga negativa. Los aminocidos

bsicos tienen carga positiva debido a la disociacin del grupo amino en su cadena lateral. Las cadenas laterales cidas o bsicas son inicas y por lo tanto son hidrfilas. Adems de los veinte aminocidos naturales conocidos, algunas protenas contienen otros aminocidos menos comunes. Por ejemplo, la lisina y la prolina pueden convertirse en hidroxilisina e hidroxiprolina, respectivamente, despus de incorporarse al colgeno. Estos aminocidos dan origen a enlaces cruzados entre las cadenas peptdicas del colgeno. Dichos enlaces aportan la firmeza y la fuerza de las molculas del colgeno, que es uno de los principales componentes del cartlago, del hueso y de otros tejidos conectivos. Con pocas excepciones, las plantas sintetizan todos sus aminocidos a partir de sustancias ms simples. Las clulas humanas y animales fabrican algunos de importancia biolgica, aunque no todos, si cuentan con la materia prima necesaria. Aquellos que los animales no pueden sintetizar, deben obtenerlos en la dieta: stos son los llamados aminocidos esenciales. Los animales tienen distintas capacidades de biosntesis, es decir que lo que para un animal es un aminocido esencial, para otro puede no serlo. Las cadenas de polipptidos se forman a partir de aminocidos Los aminocidos se combinan qumicamente unos con otros enlazando el carbono del grupo carboxilo de una molcula con el nitrgeno del grupo amino de otra. El enlace covalente que une dos aminocidos se denomina enlace peptdico. Cuando dos aminocidos

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se combinan, se forma un dipptido; una cadena ms larga recibe el nombre polipptido. El elaborado proceso por medio del cual se sintetizan polipptidos se discutir ms adelante. Un polipptido contien varias decenas, cientos o hasta miles de aminocidos unidos en un orden lineal especfico. A su vez, una protena puede estar compuesta por una o varias cadenas de polipptidos, de modo que puede formarse una variedad casi infinita de molculas protenicas, las cuales difieren entre s en cuanto al nmero, tipo y secuencia de los aminocidos que las conforman. Los veinte tipos de aminocidos que se encuentran en las protenas podran considerarse como letras de un alfabeto, de manera que cada protena sera una palabra formada por distintas letras. Estructura de las protenas: tipos Las cadenas de polipptidos que forman una protena se encuentran enrolladas o plegadas en una conformacin especfica, tridimensional. Esta conformacin determina la funcin de la protena . Por ejemplo, la conformacin de una enzima le permite "identificar" y actuar sobre su sustrato, sustancia que dicha enzima regula. La forma de una protena hormonal le permite combinarse con su receptor en el sitio de la clula blanco (la clula sobre la cual la hormona est diseada para actuar). Las protenas se clasifican en fibrosas o globulares. En las protenas fibrosas, las cadenas de polipptidos estn dispuestas en lminas largas; en las protenas globulares las cadenas de polipptidos se encuentran plegadas en forma estrecha a fin de producir una molcula compacta, de forma esfrica. La mayor parte de las enzimas son protenas globulares. Hay varios tipos de estructuras en una molcula proteica: primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria. Estructura primaria La secuencia, es decir el orden en que se disponen los aminocidos en una cadena polipeptdica determina su estructura primaria. Esta secuencia se encuentra especificada en la informacin gentica del organismo. La insulina, hormona secretada por el pncreas que se utiliza en el tratamiento de la diabetes, fue la primera protena cuya secuencia de aminocidos pudo determinarse. La insulina contiene 51 unidades de aminocidos unidos en dos cadenas (una de 30 y otra de 21 aminocidos) conectadas por puentes disulfuro. Estructura secundaria Las cadenas peptdicas no suelen encontrarse aplanadas ni se pliegan al azar, sino que forman una estructura tridimensional especfica, en general en forma de hlice o de otra estructura regular, disposicin espacial que se conoce con el nombre de estructura secundaria. Esta disposicin se debe a las interacciones entre los tomos del esqueleto regular de la cadena peptdica. Los grupos funcionales no intervienen en la formacin de enlaces de la estructura secundaria. Una estructura secundaria que se observa con frecuencia en las molculas de protena es la llamada hlice alfa. Esto abarca la formacin de espirales de una cadena peptdica. La hlice alfa es una estructura geomtrica muy uniforme y en cada giro se encuentran 3,6 aminocidos. La estructura helicoidal se determina y mantiene mediante enlaces por puente de hidrgeno entre los aminocidos en los giros sucesivos de la espiral. En la estructura alfahelicoidal, los puentes de hidrgeno ocurren entre tomos de una misma cadena peptdica. Otro tipo de estructura secundaria es el denominado Hlice alfa lmina plegada beta. En stas los puentes de hidrgeno pueden ocurrir entre diferentes cadenas polipeptdicas ( lmina intercatenaria); cada cadena en forma de

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zigzag est completamente extendida y los enlaces de hidrgeno ocasionan la formacin de la estructura en forma de lmina. Pero tambin se pueden formar lminas plegadas entre regiones diferentes de una misma cadena peptdica (lmina intracatenaria). Esta estructura es ms flexible que elstica. Son posibles dos formas laminares, segn el alineamiento de las diferentes cadenas o segmentos: si stos se alinean en la misma direccin (de extremo N- a C-terminal, por ej.) la disposicin es una lmina beta paralela, en tanto que si estn alineados en sentido opuesto, la lmina es beta antiparalela. Si bien ambos casos ocurren en la naturaleza, la estructura antiparalela es ms estable porque los dipolos C=O y N H estn mejor orientados para una interaccin ptima. En la mayora de las protenas la estructura secundaria siempre tiene una porcin que no es ni helicoidal ni laminar, denominada aleatoria (zonas de conexin). De este modo las protenas pueden ser parcialmente helicoidales y aleatorias, parcialmente laminares y aleatorias, totalmente aleatorias o una mezcla variable de partes de ordenamiento helicoidal, laminar y aleatorio. Un concepto muy utilizado en la estructura tridimensional de una protena es el dominio, que corresponde a una zona de la molcula que tiene caractersticas estructurales definidas. En una molcula de protena puede haber ms de un dominio y este hecho est relacionado con la funcin de la misma. Los dominios suelen ser muy conservados a lo largo de la evolucin: las proteasas tipo papana de virus, bacterias, plantas y animales tienen una estructura compuesta de dos dominios entre los cuales se ubica el sitio activo de la enzima.
Lmina plegada beta

Estructura terciaria La estructura terciana de una molcula de protena est determinada por la forma que adopta cada cadena polipeptdica. Esta estructura tridimensional est determinada por cuatro factores que se deben a interacciones entre los grupos R: 1. Puentes de hidrgeno entre los grupos R de las subunidades de aminocidos en zonas adyacentes de la misma cadena de polipptidos. 2. Atraccin inica entre los grupos R con cargas positivas y aqullos con cargas negativas. 3. Interacciones hidrfobas derivadas de la tendencia de los grupos R no polares para asociarse hacia el centro de la estructura globular, lejos del Iquido que los rodea. 4. Los enlaces disulfuro, que son covalentes (-SS-), unen los tomos de azufre de dos subunidades de cistena. Estos enlaces pueden unir dos porciones de una misma cadena o dos cadenas distintas.

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Estructura cuaternaria Las protenas compuestas de dos o ms cadenas de polipptidos (protenas multimricas) adquieren una estructura cuaternaria: cada cadena muestra estructuras primaria, secundaria y terciaria y forma una molcula protenica biolgicamente activa. La hemoglobina, protena de los glbulos rojos encargada del transporte de oxgeno, es un ejemplo de protena globular con estructura cuaternaria. La hemoglobina es una protena tetramrica compuesta por 574 aminocidos dispuestos en cuatro cadenas polipeptdicas: dos cadenas alfa idnticas y dos cadenas beta idnticas entre s. Su frmula qumica es C3032H48160872S8Fe4 La estructura de las protenas determina su funcin La estructura de las protenas determina la actividad biolgica de stas. De entre las innumerables conformaciones tericamente posibles de una protena, generalmente hay una que predomina. Esta conformacin es generalmente la ms estable y en ese caso se dice que la protena se encuentra en estado nativo (protena nativa). La actividad biolgica de una protena puede ser afectada por cambios en la secuencia de aminocidos o en la conformacin de la protena. Cuando ocurre una mutacin (cambio qumico en un gen) que ocasiona un cambio en la secuencia de aminocidos de la hemoglobina, puede producirse un trastorno, denominado anemia falciforme. Las molculas de hemoglobina en una persona con anemia falciforme tienen el aminocido valina en la posicin 6, en vez de cido glutmico, es decir, el sexto aminocido del extremo terminal de la cadena beta. La sustitucin de la valina con una cadena lateral sin carga por glutamato con una cadena lateral con carga hace que la hemoglobina sea menos soluble y ms propensa a formar estructuras en forma de cristal, lo que provoca un cambio en la forma de los glbulos rojos (de ah el nombre de falciforme). Los cambios en la estructura tridimensional de una protena tambin alteran su actividad biolgica. Cuando una protena se calienta o se trata con algunas sustancias qumicas, su estructura terciaria se distorsiona y la cadena peptdica en espiral se desdobla para dar lugar a una conformacin ms al azar. Este desdoblamiento se acompaa de una prdida de su actividad biolgica; por ejemplo de su capacidad de actuar como enzima. Este cambio en la forma de la protena y la prdida de su actividad biolgica se Ilama desnaturalizacin. En general, la desnaturalizacin no puede revertirse; sin embargo, en determinadas condiciones, algunas protenas que han sido desnaturalizadas recuperan su forma original y su actividad biolgica cuando se restauran las condiciones normales del medio. Las protenas no son eternas y en las clulas es frecuente que las molculas de protena se sinteticen y se degraden de acuerdo a las necesidades celulares. La degradacin de una protena es llevada a cabo por proteasas o peptidasas que hidrolizan algunas o todas las uniones peptdicas, con lo que la protena puede quedar reducida a sus unidades constitutivas, los aminocidos, que pueden luego ser utilizados para construir molculas de la misma o de otra protena. El proceso de hidrlisis destruye todas las estructuras, incluso la primaria y puede ser llevado a cabo en el laboratorio por la accin de enzimas, o por cidos o lcalis concentrados a elevadas temperaturas.

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LAS ENZIMAS, UN TIPO ESPECIAL DE PROTENAS Las enzimas son protenas altamente especializadas que funcionan como catalizadores de las reacciones de los sistemas biolgicos. Tienen un gran poder cataltico, a menudo muy superior al de los catalizadores sintticos. Poseen un elevado grado de especificidad respecto a sus sustratos, aceleran reacciones qumicas especficas y funcionan en soluciones acuosas en condiciones muy suaves de temperatura y pH. Hay pocos catalizadores no biolgicos que tengan todas estas propiedades. Las enzimas constituyen una de las claves para conocer de qu modo sobreviven y proliferan las clulas. Actuando en secuencias organizadas catalizan cientos de reacciones consecutivas en las rutas metablicas mediante las que se degradan nutrientes, se conserva y transforma la energa qumica y se fabrican las macromolculas biolgicas a partir de precursores sencillos. Algunas de las enzimas que participan en el metabolismo son enzimas reguladoras que pueden responder a diversas seales metablicas cambiando adecuadamente su actividad cataltica. La funcin de las enzimas reguladoras es la de coordinar la multitud de actividades metablicas diferentes que son necesarias para la vida. El estudio de las enzimas tambin tiene una importancia prctica inmensa. En algunas enfermedades, especialmente en las que son genticamente heredables, puede haber una deficiencia, o incluso una ausencia total, de una o ms enzimas en los tejidos. Tambin se pueden producir situaciones anormales por la actividad excesiva de un enzima especfico. La medicin de la actividad enzimtica en el plasma sanguneo, eritrocitos o muestras de tejido es importante en el diagnstico de enfermedades. Las enzimas se han convertido en herramientas prcticas importantes, no slo en medicina sino tambin en la industria qumica, en el tratamiento de los alimentos y en la agricultura; juegan un papel incluso en las actividades domsticas diarias tales como la preparacin de alimentos (enzimas tiernizantes de la carne como la papana) o en la limpieza (proteasas y lipasas que degradan protenas y grasas, respectivamente, que son incorporadas a los detergentes). Con la excepcin de un pequeo grupo de molculas de ARN cataltico ( ribozimas), todas las enzimas son protenas. Su actividad cataltica depende de la integridad de su conformacin proteica nativa. Si se desnaturaliza o disocia un enzima en sus subunidades, se pierde normalmente la actividad cataltica. Si se descompone un enzima en sus aminocidos constituyentes, siempre se destruye su actividad cataltica. As, las estructuras primaria, secundaria, terciaria y (cuando la poseen) cuaternaria de las protenas enzimticas son esenciales para su actividad cataltica. Las enzimas, al igual que otras protenas, tienen masas moleculares relativas que van desde unos doce mil hasta ms de un milln de daltons (12 a 1000 kDa). Muchas enzimas no requieren ninguna otra sustancia para desarrollar su actividad. Otras requieren un componente qumico adicional Ilamado cofactor. El cofactor puede ser uno o varios iones inorgnicos tales como Fe 2+, Mg2+, Mn2+ o Zn2+ o un complejo orgnico o metaloorgnico denominado coenzima. Cuando la coenzima o el ion metlico estn unidos covalentemente a la protena enzimtica el conjunto se denomina grupo prosttico. Las coenzimas actan como transportadores transitorios de grupos funcionales especficos. Muchas vitaminas, que son nutrientes orgnicos requeridos en pequeas cantidades en la dieta, son precursoras de coenzimas. Finalmente, algunos enzimas son modificados por fosforilacin, glucosilacin y otros procesos. Gran parte de estas alteraciones intervienen en la regulacin de la actividad enzimtica. El nombre de muchas enzimas se forma aadiendo el sufijo asa al del sustrato sobre el que actan (como la ureasa, que cataliza la hidrlisis de la urea) o utilizando una palabra o frase que describe su actividad (como la ADN polimerasa, que cataliza la sntesis de ADN en el proceso de duplicacin o replicacin del ADN). Otros enzimas, tales como la pepsina y la tripsina (enzimas digestivas), tienen nombres que no se refieren a sus sustratos. Cmo funcionan las enzimas? La catlisis enzimtica de las reacciones qumicas es esencial para los sistemas vivos. En las condiciones que predominan en los sistemas biolgicos, las reacciones sin catalizar tienden a ser lentas. La mayora de las molculas biolgicas son muy estables en el pH neutro, la temperatura suave y el

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ambiente acuoso que existe en el interior de las clulas. Muchas reacciones comunes del metabolismo de los seres vivos resultaran poco probables en el ambiente celular sin la presencia de enzimas. Una enzima soluciona estos problemas al proporcionar un ambiente dentro del cual una reaccin determinada es energticamente ms favorable. El rasgo distintivo de una reaccin catalizada enzimticamente es que tiene lugar dentro de un hueco de la molcula de la enzima denominada sitio activo o centro activo. La molcula sobre la que acta la enzima y que queda fijada en el sitio activo se denomina sustrato. El complejo enzima-sustrato es de importancia central en la accin de las enzimas Las enzimas alteran las velocidades de reaccin pero no los equilibrios La velocidad de una reaccin catalizada enzimticamente depende de: a) La concentracin de enzima. b) La concentracin de sustrato. c) Las condiciones de reaccin (pH, concentracin de iones, temperatura, etc). Se puede escribir una reaccin enzimtica sencilla (1) como:
E+S ES EP E+P (1)

donde E, S y P representan enzima, sustrato y producto, respectivamente. ES y EP son complejos de la enzima con el sustrato y con el producto, respectivamente. Para entender la catlisis, hemos de apreciar en primer lugar la importante distincin entre equilibrios de reaccin y velocidades de reaccin. La funcin de una enzima es aumentar la velocidad de una reaccin. Las enzimas no modifican los equilibrios de reaccin . Cualquier reaccin, por ejemplo S P, donde S es el sustrato y P es el producto, puede describirse mediante un diagrama de la coordenada de reaccin, que es una descripcin grfica del camino energtico de la reaccin. En su forma normal estable, o estado basal, cualquier molcula (tal como S o P) contiene una cantidad caracterstica de energa. El equilibrio entre S y P refleja la diferencia de la energa (G) de sus estados basales. En el ejemplo que se muestra en la figura, la energa del estado basal de P es inferior al de S, con lo que el equilibrio favorece la degradacin de S y la formacin de P . Este equilibrio no es afectado por la actividad de la enzima.
Estado de Transicin

Energa de activacin S P

Variacin de energa ( G) entre los estados basales de S y P

No obstante, un equilibrio favorable no indica que la conversin S P sea rpida. Para que haya reaccin las molculas han de superar una barrera representada por la colina energtica de la figura, que es el resultado de una serie de reacomodamientos que tienen que producirse en las molculas participantes (alineamiento de los grupos reactivos, formacin de cargas inestables transitorias, reordenamientos de enlaces, etc.) En la cumbre de la colina energtica existe un punto en el que la cada hacia el estado S o P es igualmente probable (en cualquier caso es de bajada). Es lo que se denomina el estado de transicin. El

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estado de transicin es un momento molecular fugaz en el que acontecimientos tales como ruptura o la formacin de un enlace y el desarrollo de carga han llegado al preciso instante en el que la vuelta al estado inicial del sustrato o la generacin de un producto son igualmente probables. La diferencia entre los niveles de energa del estado basal y del estado de transicin se denomina energa de activacin. La velocidad de una reaccin refleja esta energa de activacin, ya que si la energa de activacin es ms elevada, la reaccin es ms lenta. Las velocidades de reaccin pueden aumentarse incrementando la temperatura, porque se aumenta el nmero de molculas con energa suficiente para superar la barrera energtica. De modo alternativo, puede disminuirse la energa de activacin aadiendo un catalizador. Los catalizadores (como las enzimas) aumentan las velocidades de reaccin disminuyendo la energa de activacin. Se puede ilustrar este principio general considerando la reaccin de la glucosa con el O 2 para formar CO2 y H2O, que representa los estados inicial y final del proceso de respiracin que veremos ms adelante. Glucosa + Oxgeno Dixido de carbono + agua Esta reaccin tiene una variacin de energa libre muy grande, ya que el contenido de energa libre de la glucosa es notoriamente mayor que el de los productos, por lo que la reaccin debera ser espontnea, es decir que la glucosa debera descomponerse rpidamente formando dixido de carbono y agua. Sin embargo, se puede colocar glucosa en un recipiente con oxgeno de manera casi indefinida sin que reaccionen. En las clulas, en cambio, la glucosa es degradada rpidamente a CO 2 y H2O en una ruta metablica catalizada por enzimas. Estas enzimas no slo aceleran las reacciones sino que las organizan y controlan de tal manera que gran parte de la energa liberada en este proceso se recupera en otras formas que pueden ser utilizadas por la clula para realizar todas sus funciones. Esta es la ruta primaria de formacin de energa para las clulas y las enzimas que actan en ella permiten que el proceso tenga lugar en una escala de tiempo til para las clulas . Unos pocos principios explican el poder cataltico y la especificidad de las enzimas Las enzimas son catalizadores extraordinarios. Los aumentos de velocidad conseguidos por las enzimas son de 7 a 14 rdenes de magnitud con respecto a las reacciones no enzimticas. Las enzimas son tambin muy especficas, discriminando fcilmente entre sustratos con estructuras muy similares. Cmo se pueden explicar estos incrementos enormes y altamente selectivos? De dnde viene la energa que proporciona un descenso espectacular de las energas de activacin de reacciones especficas? Parte de la explicacin de la accin enzimtica proviene de acciones qumicas bien estudiadas que tienen lugar entre un sustrato y grupos funcionales de las enzimas (cadenas laterales de aminocidos especficos, iones metlicos y coenzimas). La energa requerida para disminuir la energa de activacin proviene generalmente de interacciones dbiles no covalentes entre el sustrato y la enzima (puentes de hidrgeno e interacciones inicas, hidrofbicas y de van der Waals) que se denomina energa de fijacin. La necesidad de mltiples interacciones dbiles para impulsar la catlisis es una de las razones de que las enzimas (y algunas coenzimas) sean tan grandes. El enzima ha de aportar grupos funcionales para interacciones inicas, puentes de hidrgeno y otras interacciones y ha de posicionar estos grupos de forma precisa para que la energa de fijacin en el estado de transicin pueda ser ptima. La energa de fijacin mantiene los sustratos en la orientacin correcta para reaccionar, lo que es una contribucin muy importante a la catlisis, ya que las colisiones efectivas que pueden ocurrir al azar entre molculas en solucin son extremadamente raras. Como consecuencia de la presencia de la enzima, los sustratos se pueden alinear de forma precisa. Una multitud de interacciones dbiles entre cada sustrato y grupos localizados de manera estratgica en la enzima mantienen juntas las molculas de sustrato en las posiciones adecuadas.

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Las enzimas estn sujetas a inhibicin reversible e irreversible Las enzimas catalizan virtualmente todos los procesos celulares, por lo que no es sorprendente que los inhibidores enzimticos se encuentren entre los principales medicamentos. La aspirina ejerce su accin analgsica y antitrmica porque inhibe el primer paso de la sntesis de las prostaglandinas, que elevan la temperatura corporal produciendo inflamacin y dolor. Existen dos tipos de inhibidores enzimticos: reversibles e irreversibles. Los inhibidores reversibles pueden ser de distintos tipos, pero los ms comunes son los inhibidores competitivos, que son generalmente sustancias que se parecen al sustrato y que compiten con el sustrato por el sitio activo de la enzima. Cuando se ha fijado el inhibidor la reaccin catalizada por la enzima no tiene lugar, pero como la reaccin es reversible, se puede desplazar el equilibrio agregando ms sustrato. La inhibicin competitiva se utiliza en el tratamiento de envenenamiento con metanol, que se convierte en formaldehido por la enzima alcohol deshidrogenasa; el formaldehido lesiona muchos tejidos, en especial los ojos. El etanol compite con el metanol por la enzima, de modo que la terapia para el envenenamiento con metanol es la aplicacin endovenosa de etanol, lo cual hace que la formacin de formaldehido sea lo suficientemente lenta como para que el metanol se pueda eliminar inocuamente en la orina. Los inhibidores irreversibles son los que se combinan con (o destruyen) un sitio esencial para la actividad de la enzima. La farmacoterapia moderna hace uso de variados inhibidores competitivos para el tratamiento de algunas enfermedades, incluido el SIDA. La actividad enzimtica es afectada por diversos factores Las enzimas tienen un pH ptimo o un intervalo de pH en el que la actividad es mxima. Esto es debido a que las cadenas laterales que intervienen en la actividad cataltica presentan diferentes grados de ionizacin a diferentes valores de pH. La fuerza inica del medio tambin afecta significativamente la actividad enzimtica, debido a la posible interaccin de grupos cargados con los sitios activos de la enzima. Por el hecho de ser protenas, las enzimas son sensibles a la accin de la temperatura. El incremento de la temperatura produce un incremento de la actividad enzimtica, pero al llegar a determinados valores de temperatura la enzima comienza a desnaturalizarse y se produce el efecto inverso. De todos modos debe tenerse en cuenta que en la mayora de los organismos la temperatura celular es relativamente constante. Enzimas reguladoras En el metabolismo celular es muy frecuente que haya grupos de enzimas que funcionan conjuntamente en rutas formadas por varios pasos. En tales sistemas enzimticos, el producto de la reaccin catalizada por la primera enzima se convierte en el reactivo (sustrato) de la siguiente, y as sucesivamente (A B C D E). En cada sistema de reacciones hay al menos una enzima que fija la velocidad global, porque cataliza la reaccin ms lenta, que es la que limita la velocidad de la reaccin total. Estas enzimas reguladoras muestran una actividad cataltica mayor o menor en respuesta a la accin de ciertas sustancias (moduladores) que se unen a la enzima en forma reversible, con lo que la velocidad de cada secuencia metablica se ajusta constantemente a la necesidad de la clula. Un mecanismo diferente de regulacin enzimtica lo constituyen los precursores inactivos de algunas enzimas (zimgenos). Muchas proteasas del estmago (pepsina) y del pncreas (tripsina y quimotripsina) se sintetizan en forma de proenzimas inactivas (pepsingeno, tripsingeno, quimotripsingeno) que requieren la accin de una proteasa especfica que libera un residuo polipeptdico, con lo que se obtiene la enzima activa. El sistema de formacin de precursores inactivos no slo se da en las enzimas: la hormona insulina se sintetiza como proinsulina y la protena fibrosa colgeno se sintetiza como procolgeno; en ambos casos proteasas especficas liberan restos polipeptdicos innecesarios y producen la protena activa (en los ejemplos dados, insulina y colgeno, respectivamente).

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ACIDOS NUCLEICOS En las clulas se encuentran dos variedades de cidos nucleicos: el cido ribonucleico (ARN) y el cido desoxirribonucleico (ADN). El ADN forma genes, el material hereditario de las clulas, y contiene instrucciones para la produccin de todas las protenas que el organismo necesita. El ARN est asociado a la transmisin de la informacin gentica desde el ncleo hacia el citoplasma, donde tiene lugar la sntesis de protenas, proceso al cual est estrechamente relacionado. Hay tres tipos de ARN que actan en el proceso de sntesis de protenas: ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt) y ARN ribosmico (ARNr). Al igual que las protenas, los cidos nucleicos son molculas grandes y complejas. Fueron aisladas por primera vez por Miescher en 1870, a partir del ncleo de las clulas del pus; su nombre se origina del hecho de que la primera vez que se identificaron se observ que eran cidos, adems de que fueron identificados por primera vez en el ncleo celular. Nucletidos: subunidades de los cidos nucleicos Los cidos nucleicos son biopolmeros, pero a diferencia de los polisacridos como el almidn o el glucgeno, en los que el monmero es una molcula simple (la - o la -glucosa, respectivamente), los monmeros de los cidos nucleicos son los nucletidos, unidades moleculares que constan de: 1) un azcar de cinco carbonos, ya sea desoxirribosa en el caso del ADN o ribosa en el caso del ARN; 2) un grupo fosfato y, 3) una base nitrogenada, ya sea una purina de doble anillo o una pirimidina de anillo simple.

El ADN contiene las bases pricas Adenina (A) y Guanina (G) y las bases pirimdicas Citosina (C) y Timina (T), junto con el azcar desoxirribosa y el fosfato. El ARN contiene las mismas bases pricas (A y G), pero en cuanto a las bases pirimdicas el Uracilo (U) reemplaza a la timina. Las molculas de los cidos nucleicos estn formadas por cadenas de nucletidos, cada uno de ellos unido al siguiente por enlaces covalentes entre la molcula de azcar de una cadena (el carbono 3de la ribosa o de la desoxirribosa) y la molcula de fosfato de la otra cadena, que a su vez est unido al carbono 5de la pentosa. Estos enlaces son Ilamados uniones o puentes fosfodister, porque el fosfato est unido por una unin ster fosfato al azcar del nucletido y por otra unin equivalente al azcar del nucletido que lo precede. Las molculas de ADN son considerablemente ms grandes que las de ARN, pero adems poseen una

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estructura doble, ya que estn constituidas por dos cadenas que son complementarias entre s. Las dos cadenas se enfrentan por las bases, que se mantienen unidas por la existencia de puentes de hidrgeno, pero la complementariedad proviene de que siempre una base prica (de mayor dimensin) se enfrenta con una base pirimdica y que el acoplamiento siempre enfrenta a A con T y a G con C. Este hecho es fundamental para permitir la duplicacin (replicacin) del ADN, ya que cada una de las cadenas sirve de molde para que se produzca la cadena complementaria respectiva. Como consecuencia de su elevado contenido en cido fosfrico y a raz del pH cercano a la neutralidad del medio celular, las molculas de ADN en el ncleo poseen carga negativa. Este hecho favorece su asociacin con protenas bsicas (las histonas), que aparentemente juegan un rol protector y que en conjunto con el ADN constituyen la cromatina nuclear. El ADN (y las histonas asociadas) se dispone en forma helicoidal y parcialmente enrollada mientras la clula est en actividad normal, pero sufre una gran condensacin (superenrrollamiento) en el momento de la divisin celular, dando lugar a los cromosomas. En realidad no existen diferencias estructurales entre la cromatina nuclear y los cromosomas, sino que se trata de distintos grados de condensacin de la molcula de ADN. Si bien el trmino cromatina se sigue utilizando (proviene de la poca de las primeras observaciones microscpicas de ncleos coloreados: cromatos = color), la tendencia moderna es llamar cromosoma al ADN nuclear, independientemente del grado de condensacin que exhiba. La diferencia esencial entre ADN y ARN, adems del reemplazo de la desoxirribosa por la ribosa y de T por U, es que el ARN est constituido por una cadena nica y que sus dimensiones son considerablemente ms reducidas que las del ADN. Los tres tipos principales de ARN (mensajero, de transferencia y ribosmico) estn asociados con el proceso de sntesis de protenas, que tiene lugar en los ribosomas, estructuras que contienen ARN y protenas y que constituyen el lugar fsico en el que se desarrolla la sntesis de las molculas proteicas. El ARNm contiene generalmente la informacin de la secuencia de aminocidos de una nica protena y obtiene dicha informacin por el proceso de transcripcin, a travs del cual una enzima especfica (ARN polimerasa) copia la informacin contenida en un sector (un gen) de una de las dos cadenas del ADN. Este proceso ocurre naturalmente en el ncleo, pero el ARNm pasa al citoplasma a travs de los poros nucleares y se encuentra con los ribosomas. La secuencia de bases del ARNm (que como se dijo es complementaria de la secuencia de bases de un sector de ADN) contiene la informacin sobre la posicin que deben ocupar los aminocidos en la protena. Esta codificacin recibe el nombre de cdigo gentico. Por su parte distintos ADNt son los encargados de reconocer a cada uno de los aminocidos y ubicarlos en el lugar sealado por el cdigo gentico en un proceso conocido como traduccin.

transcripcin n

traduccin

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Otros nucletidos importantes Adems de su importancia como subunidades de los cidos nucleicos, los nucletidos intervienen en otras importantes funciones celulares. El trifosfato de adenosina (ATP), compuesto de adenina, ribosa y tres fosfatos tiene una importancia destacada como fuente de energa para las clulas. Los dos fosfatos terminales se unen al nucletido mediante enlaces "ricos en energa", que se sealan por el smbolo P. Estos enlaces reciben tal nombre porque liberan una gran cantidad de energa cuando se someten a hidrlisis. La energa qumica que se libera es biolgicamente utilizable y puede transferirse a otras molculas. La mayor parte de la energa qumica de las clulas se almacenan en enlaces de fosfato (ATP) ricos en energa, lista para liberarse cuando el grupo fosfato se transfiere a otra molcula. Un nucletido puede convertirse en una forma cclica por medio de enzimas Ilamadas ciclasas. De esta manera la adenilatociclasa convierte al ATP en adenosn monofosfato cclico (AMP cclico). Los nucletidos cclicos juegan un papel importante en la mediacin de los efectos hormonales y en la regulacin de varios aspectos de la funcin celular. Las clulas contienen varios dinucletidos de importancia especial en los procesos metablicos. Por ejemplo, como se discutir en el Mdulo 9, el dinucletido de adenina y nicotinamida (NAD) y el dinulcletido de adenina y flavina (FAD) son muy importantes como receptores y donores de hidrgeno y electrones en funciones biolgicas de oxidacin y reduccin en las clulas. BIBLIOGRAFA Bohinsky, R.C. Bioqumica (1991) Addison-.Wesley Iberoamericana, 5a. Edicin. Lehninger, A.L., D.L. Nelson y M.M. Cox (1993) "Principios de Bioqumica", Ediciones Omega S.A. (. Solomon, E.P., L. R. Berg, D.W. Martin & C.A. Villee (1996) La Biologa de Villee, Interamericana McGraw-Hill. Curtis, H. y N.S. Barnes (2000) Biologa. 6 edicin espaola. Editorial Mdica Panamericana. Lodish, H., A. Berk, S.L. Zipursky, P. Matsudaira, D. Baltimore & J. Darnell (2002). Biologa Celular y Molecular, Editorial Mdica Panamericana,. Cooper, G.M. (2002). La Clula. 2 edicin. Marbn Libros, S.L., Espaa. (traducido de la 2 edicin inglesa, 2000). Purves, K.W., D. Sadava, G.H. Orians & H.C. Heller (2003) Vida. La Ciencia de la Biologa, 6. Edicin. Editorial Mdica Panameicana (traducido de la 6 edicin inglesa, 2001).

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CUESTIONARIO TERICO
1) Los aminocidos (seleccione la opcin correcta): a) son molculas de alto peso molecular que poseen por lo menos un grupo amino y un grupo carboxilo. b) Son molculas de bajo peso molecular no ionizables. c) Poseen por lo menos un grupo amino y uno carboxilo, pudiendo presentar cadenas laterales de diferente naturaleza qumica. d) son molculas altamente hidrofbicas, al igual que los triacilglicridos, incapaces de establecer uniones dbiles con el agua. 2) La carga elctrica neta de los aminocidos en solucin: a) es siempre positiva b) es siempre negativa c) depende del pH de la solucin d) es nula, ya que no poseen grupos ionizables en su molcula 3) Cuntos aminocidos y de qu tipo intervienen en la formacin de las protenas?. Cmo se unen entre s para formar las uniones peptdicas y qu tomos intervienen?. Los aminocidos que intervienen en la unin peptdica pueden intervenir en la formacin de puentes de hidrgeno? 4) Cules de las siguientes frmulas representan un - aminocido? R | HOCCO.OH | H (a) R | H2NCCO.OH | H R | H2N CCH2CO.OH | H

(b) (c) 5) Cuntos extremos -amino y -carboxilo libres existirn en: a) un aminocido? b) un decapptido lineal? c) el antibitico gramicidina, un decapptido circular? d) una protena formada por la asociacin (no covalente) de cuatro cadenas polipeptdicas? 6) Por qu los aminocidos cuando estn disueltos en agua forman estructuras dipolares (zwitterion o anfipticas)?. 7) Cuntas uniones peptdicas posee un octapptido y por qu? 8) Cul es el resultado probable de una alimentacin deficiente en uno o ms aminocidos esenciales?. 9) Mencione algunas de las funciones biolgicas asociadas a las protenas. 10) Cmo se llama el tipo de enlace que mantiene el orden lineal de los aminocidos de una protena?. Cmo se denomina este nivel de estructura? A qu nivel estructural pertenece la unin de varias cadenas polipeptdicas para la formacin de una protena multimrica?. 11) Si el peso molecular promedio de los 20 aa es de 128, por qu cuando se quiere averiguar el nmero de residuos que constituyen a una protena se divide el PM de la misma por 110? 12) Qu tipo de estructuras secundarias conoce? Que es un dominio?. Defina estructura terciaria. Puede ser dicho trmino utilizado como sinnimo de dominio? 13) Discuta el siguiente prrafo: la funcin de toda protena est basada en el reconocimiento especfico de la protena a otra molcula. Este reconocimiento es tridimensional, y se ejerce a travs de interacciones dbiles, entre las cuales los puentes de hidrgeno son responsables prioritarios de la especificidad en la interaccin. 14) Cules son las fuerzas ms importantes que dirigen el plegamiento de una protena en solucin acuosa? y si la protena (o parte de la misma) se encontrase en un medio hidrofbico?. Justifique con ejemplos. 15) Analice el siguiente prrafo: De todas las conformaciones posibles, una protena adopta una nica conformacin denominada conformacin nativa y es la conformacin fisiolgica ms estable. Se

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est afirmando en dicho prrafo que la estructura nativa de una protena es rgida y que no sufre variacin alguna mientras la misma es funcional?. Respecto a las dems conformaciones posibles, todas sern inestables? 16) En una cadena polipeptdica, la posicin de cada aminocido se identifica con un nmero y la numeracin se inicia en el aminocido situado en el extremo amino-terminal. Contando con esa nica informacin, puede asegurarse que en una protena los aminocidos que ocupan las posiciones 2 y 80 estarn espacialmente ms alejados que los que ocupan las posiciones 2 y 20? 17) Cul sera el efecto de una enzima sobre: a) La energa de activacin de la reaccin. b) La constante de equilibrio de la reaccin. 18) Cmo regula la clula la actividad enzimtica? 19) Cmo explicara el enorme poder cataltico y la alta especificidad que presentan las enzimas? 20) Indique todas las diferencias que existen entre las molculas de ADN y ARN 21) Cul es la razn de que el ADN est compuesto de dos cadenas complementarias? 22) Qu tipo de unin se establece entre nucletidos de una misma cadena? 23) A qu se denomina extremo 5y 3de una hebra de ADN? 24) Qu derivados de nucletidos conoce y cul es su importancia en la clula? 25) Escriba la secuencia de bases de la hebra complementaria de una hebra de ADN cuya secuencia es la siguiente: 5-ATCCTAATGGAATGTCA-3 26) Qu tipos de ARN conoce?. Explique brevemente la funcin de cada uno de ellos.

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Mdulo 3. TRABAJO EXPERIMENTAL


OBJETIVOS GENERALES
Que el alumno conozca: Las principales propiedades de las protenas y que se familiarice con los procesos generales de extraccin, identificacin y cuantificacin de las mismas. Que las enzimas constituyen una clase especial de protenas, que requieren condiciones ptimas de accin, que catalizan reacciones qumicas especficas y que para su funcionamiento resulta esencial mantener la conformacin nativa.

I. PROTENAS
OBJETIVOS ESPECFICOS Discutir la importancia de la eleccin del mtodo de obtencin de una muestra. Comprender los fundamentos de las tcnicas que permiten detectar la presencia o ausencia de protenas en muestras biolgicas. Discutir el significado de los trminos falso positivo y falso negativo aplicados a una reaccin de caracterizacin. Conocer el significado y la importancia de la expresin sensibilidad del mtodo y discutir las condiciones en que determinado mtodo se puede aplicar. Realizar ensayos de caracterizacin cualitativos de protenas en diferentes muestras biolgicas. Realizar la determinacin de la cantidad de protenas presentes en una muestra por mtodos colorimtricos: ensayo de caracterizacin cuantitativo.

1. Extraccin y valoracin de las protenas presentes en los frutos de anan Para obtener un determinado componente a partir de un material biolgico deben realizarse distintas operaciones, tales como extraccin, aislamiento y purificacin. La necesidad de efectuar una o ms de estas operaciones depender del material de partida y de los objetivos perseguidos. Por ejemplo, si se desea determinar el contenido de glucosa en orina, no es necesario realizar ninguna operacin previa (salvo las indicadas por el mtodo elegido), ya que este monosacrido se encuentra disuelto en la orina. En cambio, si se desea determinar la concentracin de glucgeno en clulas hepticas de cobayo, necesariamente se deber: a) separar y disgregar el tejido heptico del animal b) liberar el glucgeno de las clulas, esto es, realizar las operaciones necesarias para extraer el glucgeno heptico. Asimismo, dependiendo del mtodo de determinacin a emplear, ser necesario realizar una o varias etapas de separacin o aislamiento del glucgeno: separarlo de otros componentes celulares que puedan interferir con las determinaciones. Por ltimo, si el objetivo es analizar la estructura del glucgeno, ser necesario purificarlo. En el presente trabajo prctico se realizar una extraccin de las protenas solubles en medio acuoso que se encuentran presentes en frutos de anan. Luego de la extraccin, las protenas sern separadas de impurezas tales como azcares y pigmentos por tratamiento con acetona, que produce la precipitacin de las protenas, las que luego sern redisueltas y posteriormente cuantificadas por el mtodo del biuret.

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2. Reaccin del biuret Fundamento de la reaccin Consiste en tratar una protena o pptido con Cu ++ en medio alcalino, producindose una coloracin violcea por formacin de un complejo de coordinacin entre el Cu ++ y los pares electrnicos libres de los nitrgenos de los grupos imino de la unin peptdica, siendo la intensidad de color de este complejo, proporcional a la concentracion de protena presente en la muestra. Son necesarias por lo menos dos uniones peptdicas para que tenga lugar la reaccin.

Retomando lo visto anteriormente en el trabajo experimental del mdulo 2 (ver algunas consideraciones), cuando se caracteriza un grupo o familia de sustancias (por ejemplo, caracterizacin cuali o cuantitativa de protenas en una muestra problema) o identifica una sustancia en particular (por ejemplo comprobar la presencia de ovoalbmina en clara de huevo) se debe tener muy en cuenta el objetivo que se persigue. En funcin de este objetivo se seleccionar el mtodo ms indicado. La reaccin del biuret no es una reaccin especfica para protenas. Eso hace que un resultado positivo con este reactivo deba ser cuidadosamente evaluado para descartar los resultados falsos positivos. Un resultado negativo de la reaccin del biuret sobre una muestra problema no necesariamente indica la ausencia de protenas, ya que puede ocurrir a) que no existan protenas o pptidos en la muestra (ni tampoco otras sustancias no proteicas biuret positivas), b) que existan una o ms sustancias interferentes en la muestra que impidan que se produzca la reaccin (lo que dara lugar a un resultado falso negativo). Esto puede descartarse (o evitarse) si se conoce de antemano la composicin aproximada de la muestra. Por ejemplo, si se desea determinar el contenido de pptidos generados por una reaccin de hidrlisis cida, los H + del medio interferirn con la reaccin del biuret, ya que sta necesita de un medio alcalino para la formacin del complejo con Cu ++. En este caso la interferencia puede eliminarse alcalinizando el medio antes de realizar el ensayo (en caso contrario obtendra un falso negativo como resultado) y c) Que existan pptidos, pero a una concentracin inferior al lmite de sensibilidad del mtodo. Todo mtodo permite determinar la presencia de un compuesto slo si la concentracin del mismo es superior a cierto valor. Existen otros mtodos de cuantificacin de protenas mas sensibles que el biuret. 3. Confeccin de la curva de calibracin Una vez que se ha detectado la presencia de un componente es importante conocer la cantidad del mismo presente en la muestra y en consecuencia se debe hallar una manera de cuantificarlos. Para llevar a cabo el anlisis cuantitativo es necesario efectuar una curva de calibracin. Para la confeccin de dicha curva se utilizan diluciones de una protena pura de concentracin conocida ( protena patrn; en nuestro caso utilizaremos albmina bovina). Sobre cada dilucin se lleva a cabo la reaccin del biuret y la curva de calibracin se obtiene graficando los datos de absorbancia 1 correspondientes a cada una de las
1

En la mayora de las reacciones de coloracin la intensidad del color producido es proporcional a la concentracin del compuesto en la muestra. Esta intensidad puede ser evaluada espectrofotomtricamente por medida de un parmetro especfico: la absorbancia.

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diluciones versus la concentracin de protena de las mismas. El rango de deteccin de protenas para el mtodo es de 1 a 5 mg/ml, dentro del cual la relacin absorbancia-concentracin se mantiene lineal. 4. Ensayos de estabilidad de protenas en dispersin acuosa Las protenas se mantienen dispersas gracias a interacciones con las molculas de solvente y de solutos presentes. Su estabilidad, al igual que sucede con otras macromolculas que forman dispersiones coloidales, se fundamenta en dos factores: hidratacin y carga elctrica, que actan contraponindose a la influencia de la gravedad que tiende a producir la sedimentacin de las partculas dispersas. En el seminario de trabajos prcticos se discutir en detalle de qu forma distintos agentes (pH, agentes deshidratantes, solventes orgnicos, etc) influyen sobre la estabilidad de las protenas. 5. Electroforesis Fundamento Si se aplica un campo elctrico a una solucin que contiene una molcula con carga neta (+ o ), sta migrar a una velocidad que depende del valor de su carga, su tamao y su forma. Esta tcnica, denominada electroforesis, se utiliza para separar mezclas de molculas cargadas (protenas, cidos nucleicos), ya sea sobre un soporte (papel, cellogel) o dentro de un gel (agarosa, almidn o poliacrilamida). La movilidad electrofortica es la relacin de la velocidad de la molcula (v) y el potencial elctrico (E). Tambin es igual a la carga neta de la molcula (Z) dividida por el coeficiente friccional (f), que es la resistencia que el soporte o el gel oponen al movimiento de la partcula.

=v/E=Z/f
En la frmula puede verse que a mayor carga elctrica, mayor ser la movilidad de la molcula. Un parmetro importante a considerar en la electroforesis de aminocidos y protenas es su punto isolelctrico (pI), ya que conociendo el pI y el pH del medio, conoceremos la carga de la molcula. Cuando el pH es mayor que el pI la molcula tendr carga negativa; por el contrario, si el pH es menor que el pI la carga de la molcula ser positiva.
R + | H3NCCO.OH | H OH H+

R | H2NCCO.OH | H

OH

H+

R | H2NCCO.O | H

+
pH < pI pI

pH > pI

De esta manera, de acuerdo al pH del buffer de electroforesis utilizado, la muestra se sembrar en uno u otro polo: si la molcula tiene carga negativa se sembrar cerca del polo negativo (ctodo), con lo que migrar hacia el polo positivo (nodo) y viceversa.

II. ENZIMAS
OBJETIVOS ESPECFICOS

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Detectar la presencia o ausencia de actividad enzimtica en saliva (actividad amiloltica) y en jugo de anan (actividad proteoltica). Determinar el valor de la actividad enzimtica variando algunos parmetros que la afectan (pH, temperatura). Si en un extracto biolgico se desea establecer la presencia de una determinada protena con actividad biolgica, tal como una enzima, no basta con determinar la existencia de dicha protena, sino que se requiere un ensayo que pruebe que la misma es biolgicamente funcional. Cuando la actividad biolgica es especfica (como ocurre en el caso de las enzimas) muchas veces resulta innecesaria la etapa de purificacin, ya que la actividad biolgica ser evidenciable an en presencia de otras protenas, aunque ser necesaria la eliminacin de cualquier sustancia que interfiera con su actividad. Para medir la actividad enzimtica slo se requiere un mtodo analtico sencillo que determine la desaparicin del sustrato o la aparicin de los productos de reaccin. Enzima Sustrato Productos Para medir la influencia del pH, de la temperatura, de la concentracin de enzima, etc. sobre la velocidad de la reaccin, debe realizarse dicha reaccin variando el factor en estudio y dejando constantes todos los dems. 1. Degradacin de almidn por accin de amilasa salival Fundamento El mtodo se basa en la hidrlisis del almidn (sustrato), en condiciones de pH y temperatura fisiolgicos, por accin de una amilasa presente en la saliva. Los productos de reaccin son polisacridos de menor peso molecular hasta llegar a disacridos (maltosa), no evidenciables con el reactivo de Lugol (pero s con Fehling). 2. Determinacin de la actividad proteoltica de las enzimas presentes en el jugo de anan Fundamento: El mtodo se basa en la hidrlisis de la casena (sustrato) por accin de enzimas proteolticas (proteasas) en condiciones de pH y temperatura adecuados, obtenindose como producto de reaccin pptidos de menor peso molecular que no precipitan por el agregado de cido tricloroactico y que pueden evidenciarse por medio de la reaccin del biuret previa alcalinizacin del medio. Medida de la actividad proteoltica
proteasas

CASENA

pptidos pequeos

La reaccin se detiene por inactivacin de la enzima proteoltica con cido tricloroactico al 5% (TCA 5%). Es necesario realizar blancos de reaccin (tiempo cero de la reaccin) y para ello la enzima es inactivada con TCA 5% antes de la adicin del sustrato. La concentracin de pptidos solubles en TCA liberados luego de la reaccin enzimtica es directamente proporcional a la cantidad de casena hidrolizada y por lo tanto es un medida directa de los productos de la reaccin proteoltica. El grado de hidrlisis del sustrato puede ser evaluado por la reaccin del biuret. Al detener la reaccin con TCA (ms aun si se defecta a tiempos cortos) observaremos la presencia de un precipitado que corresponde a la casena que no ha sido hidrolizada por la enzima. Este precipitado puede redisolverse con hidrxido de sodio al 10% y determinarse la concentracin de protenas por el mtodo del biuret, lo que proporcionar una medida indirecta de la actividad enzimtica.

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PROTOCOLO DE LAS EXPERIENCIAS


I. PROTENAS
1. REACCIN DEL BIURET Reactivos y muestras: Dispersiones de diferentes protenas Dispersin de una protena conocida (control positivo) Agua destilada o solucin en la que est disuelta la protena (control negativo) Hidrxido de sodio al 10% Sulfato de cobre al 10% Protocolo de la Reaccin del Biuret Colocar en un tubo de ensayo: Solucin a investigar Hidrxido de sodio al 10% Sulfato de cobre al 1% mezclar por agitacin Ensayo cualitativo de protenas Tomar 4 tubos de ensayo Rotularlos como se indica en la segunda columna de la siguiente tabla Empleando el protocolo correspondiente, realizar la reaccin del biuret con cada una de las soluciones indicadas en la tercera columna de la misma tabla Tipo de Ensayo Control Negativo (Blanco) Control Positivo Muestra 1 Muestra 1 Interpretar los resultados. 2. EXTRACCIN Y CUANTIFICACIN DE LAS PROTENAS PRESENTES EN LOS FRUTOS DE ANAN 1) Obtener por prensado el jugo de una rodaja de anan de 2 cm de espesor. 2) Medir el volumen obtenido. 3) Precipitar las protenas contenidas en 2,5 ml de jugo por la adicin de 7,5 ml de acetona fra. Atencin: la acetona ser agregada gota a gota y la mezcla jugo-acetona ser mantenida en un bao de hielo para evitar la desnaturalizacin proteica. 4) Centrifugar y eliminar el sobrenadante. 5) Redisolver el precipitado obtenido en 2,5 ml de buffer fosfatos 0,1M de pH 7,5 y realizar la reaccin del biuret como se indica en el protocolo. 6) Determinar el contenido de protenas por ml de jugo empleando una curva de calibracin 2.
Para la confeccin de la curva se utilizaron diferentes diluciones de protena patrn (albmina bovina de concentraciones 0; 1; 1,25; 2,5; 3,75 y 5 mg/ml) sobre las cuales se realiz la reaccin del biuret. La curva de calibracin se obtuvo graficando los datos de
2

0,5 ml 0,5 ml 1 gota

Rotular B P G H

Solucin a investigar Agua destilada Casena al 0,1% Gelatina comercial al 1% Clara de huevo al 10%

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3. ENSAYOS DE ESTABILIDAD DE PROTENAS EN DISPERSIN ACUOSA 3.1. Efecto del pH En un tubo de ensayo colocar 1 ml de dispersin de casena de leche al 1% Agregar cido actico al 10% gota a gota hasta obtener un precipitado Al observar la formacin de precipitado comenzar a agregar hidrxido de sodio al 10% hasta lograr la redisolucin del precipitado Interpretar los resultados obtenidos. 3.2. Efecto de agentes deshidratantes En un tubo de ensayo centrfuga colocar 1 ml de dispersin de gelatina al 1% Agregar gota a gota solucin saturada de sulfato de amonio hasta que no se observe ms formacin de precipitado Interpretar los resultados obtenidos. 3.3. Efecto de solventes orgnicos En un tubo de ensayo colocar 1 ml de dispersin de casena de leche al 1% Agregar acetona fra gota a gota y agitando Observar el fenmeno de precipitacin Interpretar los resultados obtenidos. 4. ELECTROFORESIS DE PROTENAS SRICAS SOBRE TIRAS DE CELLOGEL Equipamiento Cuba electrofortica Fuente de poder Reactivos: Buffer de corrida: Veronal - veronal sdico, pH 8,6. Colorante: Amidoschwarz 10B. Decolorante: cido actico al 5%. Deshidratante: metanol puro. Transparentizante: metanol/cido actico/glicerol. Tcnica: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. Sumergir en el buffer las tiras durante diez minutos y luego secarlas entre papeles de filtro Colocar el buffer en la cuba electrofortica Extender las tiras sobre el puente de la cuba, con la superficie permeable hacia arriba Sembrar la muestra a un centmetro del borde Conectar la fuente de poder de tal modo que el polo negativo quede en el lado de la siembra y correr durante 75 minutos Desconectar la fuente de poder Secar las tiras y sumergirlas en la solucin colorante durante cinco minutos Sumergir tres o cuatro veces en solucin decolorante Sumergir las tiras en el deshidratante durante treinta minutos Pasarlas a la solucin transparentizante durante un minuto Colocarlas sobre una placa de vidrio adhirindolas bien y dejar en estufa durante unos minutos Observar las bandas e interpretar los resultados.

absorbancia correspondientes a cada una de las distintas soluciones ledas a 530 nm en funcin de la concentracin de la protena patrn.

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CUBA ELECTROFORTICA tapa tira de papel o cellogel

buffer

nodo

+
fuente de poder

ctodo

buffer

II. ENZIMAS
1. DEGRADACIN DE ALMIDN POR ACCIN DE LA AMILASA SALIVAL 1.1. Preparacin de la solucin stock de enzima Colocar gotas de saliva diludas en 0,5 ml de agua destilada. 1.2. Ensayo cualitativo. Deteccin de la atividad amilsica Agregar 0,5 ml de la solucin stock de amilasa salival a un tubo Lugol positivo (solucin de almidn ms Lugol, color violceo) A otro tubo Lugol positivo agregar 0,5ml de agua destilada Luego de unos minutos, el tubo con saliva comenzar a cambiar de color por desaparicin del complejo almidn-yodo Anotar el cambio de color e interpretar los resultados. 2. DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD PROTEOLTICA EN JUGO DE ANAN 2.1. Preparacin del stock de enzima. Se utilizar el extracto proteico (precipitado acetnico redisuelto) del jugo de anan obtenido anteriormente. 2.2. Medida de la actividad proteoltica Protocolo para la determinacin de la actividad proteoltica Colocar los tubos plsticos (adecuados para centrfuga) para los diferentes ensayos y el blanco, debidamente rotulados, en un bao a 37 oC Agregar los reactivos indicados en la tabla, en el orden que se seala en la tabla

Reactivo Ensayos Blanco (tiempo 0) Casena al 1% (sustrato) 1 ml 1 ml TCA al 5% 2 ml Muestra 0,1ml 0,1ml Incubar a 37 oC durante el tiempo indicado TCA al 5% 2 ml Centrifugar los tubos a 3.000 rpm durante 10 Tomar 1 ml del sobrenadante y alcalinazarlo por agregado de 0,5 ml de OHNa 1M

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Agregar una gota de SO4Cu Comparar los resultados

2.2.1. Efecto del pH Segn el protocolo indicado arriba se determinar la actividad enzimtica empleando como sustrato soluciones de casena al 1% disuelta en soluciones de diferente valor de pH (2; 7 y 11) Rotular cuatro tubos de la siguiente manera: B (para el blanco), 2 (para la solucin de casena de pH 2), 8 (para la solucin de casena de pH 8) y 11 (para la solucin de casena de pH 11) Agregar los reactivos segn se indica en la tabla del protocolo Cortar la reaccin enzimtica a los cinco minutos por agregado de TCA 5% Continuar el desarrollo del protocolo Interpretar los resultados obtenidos

2.2.1. Efecto de la temperatura Segn el protocolo indicado arriba se determinar la actividad enzimtica empleando como sustrato soluciones de casena al 1% a pH 8 incubando a diferentes temperaturas. Rotular cuatro tubos de la siguiente manera: B (para el blanco), 0 (para el tubo incubado a cero grados), 25 (para el tubo incubado a temperatura ambiente) y 60 (para el tubo incubado a 60 grados) Agregar los reactivos (previamente incubados a la temperatura correspondiente) segn se indica en la tabla del protocolo Cortar la reaccin enzimtica a los cinco minutos por agregado de TCA 5% Continuar el desarrollo del protocolo Interpretar los resultados obtenidos

2.2.3. Efecto del tiempo Segn el protocolo indicado arriba se determinar la actividad enzimtica empleando como sustrato solucin de casena al 1% a pH 8, cortando la reaccin a diferentes tiempos (2, 5 y 10 minutos). Rotular cuatro tubos: de la siguiente manera: B (para el blanco),y 2, 5 y 10 para los ensayos a los diferentes tiempos Agregar los reactivos segn se indica en la tabla Cortar la reaccin enzimtica del tubo 2 a los dos minutos Cortar la reaccin enzimtica del tubo 5 a los cinco minutos Cortar la reaccin enzimtica del tubo 10 a los diez minutos Continuar el protocolo

IMPORTANTE: Es imprescindible que todo el material de vidrio utilizado se encuentre perfectamente limpio. El lavado se realiza con detergente. Debe enjuagarse repetidas veces con agua de la canilla para que no queden restos de detergente. Finalmente enjuague con agua destilada.

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CUESTIONARIO DEL TRABAJO EXPERIMENTAL


1) En tres dispersiones acuosas A, B y C, de composicin desconocida, se realizaron diversos ensayos con los siguientes resultados: Reaccin Muestra A Muestra B Muestra C Biuret + Lugol + Fehling + + Precipitacin con (NH4)2SO4 + En base a los resultados del cuadro, qu compuesto/s podrn hallarse en cada una de las muestras? 2) Qu reacciones de caracterizacin realizara para verificar la naturaleza proteica de la gelatina? Cul es el fundamento de esta reaccin de caracterizacin? Indicar reactivos y visualizacin de la reaccin. 3) Una protena con estructura helicoidal, da positiva la reaccin de Lugol?. 4) Si realiza la reaccin del biuret sobre una solucin del aminocido alanina, obtendr resultado (+) (-)? 5) Puedo utilizar el mtodo de biuret para identificar albmina bovina en una mezcla de protenas? Fundamente su respuesta. 6) En qu caso el resultado de la reaccin de biuret puede generar un falso negativo? 7) Qu operaciones debera efectuar si se desea cuantificar el contenido de protenas en el jugo de anan? 8) Se realiza la reaccin del biuret en una muestra problema y los resultados son los siguientes: agua destilada: (-) muestra: (-) solucin de casena al 1%: (+) Explique los resultados obtenidos 9) Explique el efecto del (NH4)2SO4 sobre las protenas. 10) Cul es el fundamento de la tcnica de electroforesis?. De qu factores depende la migracin diferencial de las molculas? A qu tipo de compuestos puede aplicarse esta metodologa? 11) Cul es la razn para utilizar un reactivo de caracterizacin de hidratos de carbono (Lugol) en la determinacin de la actividad de la amilasa salival, que es una protena? 12) Por qu en los ensayos en blanco de actividad proteoltica agrega cido tricloroactico antes de agregar el sustrato? 13) En la determinacin de la actividad proteoltica del jugo de anan usted determin la existencia de pptidos que han sido producidos por la hidrlisis enzimtica de la caseina a travs de la reaccin del biuret. Es esta una medida directa o indirecta de la actividad? De qu otro modo podra realizarla? 14) Qu informacin aporta el conocer el valor de la actividad enzimtica a diferentes valores de pH? 15) Cul es el objeto de realizar la medida de la actividad enzimtica a diferentes tiempos?

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