EFECTO DEL AISLAMIENTO MATERNO EN LA ACTIVIDAD DE SEROTONINA IN VIVO EN LA CORTEZA PREFRONTAL MEDIA Y EL RAF DORSAL-MEDIAL EN RELACIN A LA AGRESIVIDAD EN LA RATA

MACHO ADULTO
Director de Tesis: Dr. ngel Ismael Melo Salazar. Alumno: Xavier Mozn Lpez. Tlaxcala Tlax. Junio de 2013.

Introduccin El intercambio de informacin sensorial y social a travs de la expresin de conductas sociales en los seres vivos que viven en sociedad es vital para la organizacin, reproduccin y supervivencia de la especie. Las conductas sociales se pueden dividir en afiliativas (conducta materna, sexual, acicalamiento) y agonistas (agresin). Entre las conductas sociales, la agresin es importante en el balance de las interacciones sociales. Esto debido a que participa en la mayora de los procesos comunitarios que representan adaptaciones conductuales con un significado biolgico definido: supervivencia y reproduccin. Aunque la definicin de agresin es controversial, en general se considera que una conducta es agresiva cuando existe un intento por daar a otro (s) organismo (s) (Siegel et al., 2007). La expresin de conductas agresivas puede abarcar desde el establecimiento de jerarquas y dominancia hasta conductas antisociales y agresividad extrema. Desde el punto de vista etolgico, existen diversos patrones de conductas agresivas que consisten en la expresin secuencial y temporal predecible de seales de comunicacin, actos y posturas con diferentes funciones. Dentro de un ambiente natural, un animal despliega conductas agresivas bajo particulares circunstancias, tales como la presencia de una amenaza o acceso a miembros del sexo opuesto. Estas situaciones permiten que el animal escoja su conducta dependiendo de la reaccin del conespecfico. La agresin puede ser ofensiva o como una reaccin defensiva, basados en cmo el oponente evala los costos y beneficios de ganar o perder la pelea (Wall et al., 2003). La agresin ofensiva est relacionada a una situacin de territorialidad y dominancia y puede ser expresada bajo situaciones naturales o experimentales (pruebas Residente-Intruso). La agresin defensiva, desde el punto de vista psicobiolgico, puede ser motivada por el miedo, enojo/irritabilidad o bien puede ser una respuesta condicionada o incondicionada hacia eventos nocivos (Blanchard et al., 2001; Miczek et al., 2002). En roedores, la agresin ofensiva consiste en el ataque y las mordidas en el dorso y flancos del subordinado o intruso, y la conducta del atacado (agresin defensiva) consiste en huir, enfrentar al atacante o defenderse en una posicin dorsal supina (posicin de sumisin). En contraste, si la respuesta agresiva hacia estmulos poco nocivos o ante una situacin social estable es exagerada, impulsiva, hostil, reactiva, afectiva, emocional, intensa, escalonada, no premeditada y sin causas proximales puede significar formas patolgicas de agresin (Miczek, et al., 2002; Vitiello & Stoff, 1997). Estos actos agresivos han perdido su funcin de comunicacin biolgica y sugiere una prdida del control inhibitorio. Se caracterizan por tener una tendencia a responder con latencias cortas para iniciar la agresin, alta frecuencia e intensidad, carencia de inhibicin hacia seales de sumisin del subordinado (Intruso, bajo condiciones de laboratorio), persistentes y dainos (Miczek et al., 2002). En modelos animales estas formas de agresin son utilizadas para comprender las bases neurobiolgicas de la violencia humana, as como para entender las bases genticas, epigenticas, neuroanatmicas y neuroqumicas de la agresin en animales y humanos, se ha propuesto una clasificacin que incluye dos grandes subtipos: agresin impulsiva-

reactiva-hostil-afectiva y agresin controlada-proactiva-instrumental-predatoria (Vitiello & Stoff, 1997). Aunque los mecanismos que subyacen a las conductas agresivas y antisociales an no son totalmente comprendidos, su expresin est asociada a factores genticos, neurobiolgicos y psicofisiolgicos. Los sistemas neurales que median la agresin son similares entre mamferos, aunque existen ciertas variaciones entre especies. Mientras que los factores genticos y ambientales contribuyen a la estructura y funcin del circuito neural, el sistema lmbico es importante en el proceso de aprendizaje para asociar estmulos con eventos gratificantes o de castigo. Antecedentes Estudios clnicos y preclnicos (en animales de laboratorio), han propuesto que la serotonina es el mayor modulador de las conductas emocionales tales como la ansiedad, impulsividad y agresin, pues integra funciones sensoriales, cognitivas y motoras en un amplio rango de especies, incluyendo al ser humano (Takahashi et al., 2011; Olivier, 2004; Quadros et al., 2010). Estudios iniciales formularon la hiptesis del dficit de serotonina y la expresin de conductas agresivas impulsivas, hostiles y violentas (Quadros et al., 2010). Esta hiptesis est restringida a las conductas agresivas impulsivas, hostiles no premeditadas, personalidad-temperamento agresivo y no en la preparacin, ejecucin y recuperacin de la actual agresin (territorial, dominancia, predacin) (Miczek et al., 2002; Quadros et al., 2010). As, se encontr en cerebros de ratones aislados, pero no en alojados socialmente, una correlacin negativa entre los niveles de serotonina y 5-HIAA (metabolito de la serotonina) y niveles de agresin (menos serotonina ms agresin; Giacalone et al., 1968). Adems, se han reportado bajos niveles de 5-HIAA en lquido cfalo raqudeo en primates no humanos (Wesergaard et al., 1999), en marinos con historia de agresividad repetitiva (Brown et al., 1979), y en pacientes con personalidad antisocial y alcohlicos tipo II que manifiestan agresividad impulsiva (Linnoila et al., 1983). Hamsters y ratas machos instigados a pelear tienen niveles bajos de serotonina en el hipotlamo y la corteza prefrontal (Van Erp & Miczek 2000. Las neuronas del sistema serotonrgico se originan en el raf dorsal y medial, enva sus proyecciones hacia estructuras mesolmbicas y a varias estructuras ms del cerebro. Sus conexiones rostrales y caudales se dirigen hacia el hipotlamo anterior, la amgdala (medial), el sptum, la corteza orbitofrontal y prefrontal media, la sustancia grs periacueductal, el hipocampo y al ncleo accumbens (Gregg, 2003). La evidencia ms directa que el sistema serotonrgico est involucrado en la modulacin de la agresin se ha obtenido al determinar la actividad de serotonina (y dopamina) en discretas reas del cerebro a travs de microdilisis in vivo antes, durante y despus de una confrontacin agresiva con un intruso. As, se encontr una disminucin significativa en los niveles extracelulares de serotonina en la corteza prefrontal, pero no en ncleo accumbens, durante y 10 minutos despus de dicha confrontacin, efecto que persisti hasta los 60 minutos (Van Erp & Miczec, 2000; Ferrari et al., 2003). Desde la perspectiva de desarrollo, se ha reportado que las interacciones sociales entre los roedores durante la etapa preadolescente o juvenil (post-destete) son esenciales para el desarrollo de la agresin (Lukkes et al., 2011). Sin embargo, existen evidencias que sugieren que la experiencia sensorial y social durante el perodo postnatal pre-destete participa en el desarrollo de la agresin en la rata. De hecho, se ha encontrado que en la mayora de los mamferos, estas experiencias son esenciales no slo para la agresin,

sino tambin para el desarrollo, maduracin y organizacin de diversos sistemas fisiolgicos, cognitivos, emocionales, neuroendocrinos y conductuales (Fleming et al, 2002). En especies altriciales esta experiencia es mediada, principalmente, por el cuidado materno y la interaccin entre hermanos (Melo et al., 2006, 2009; Levy et al., 2003). La conducta materna consiste en la expresin de una serie de patrones motores y eventos somatosensoriales desplegados por la madre al final de la gestacin, durante el parto y en el perodo postnatal pre-destete. En la rata, la madre construye el nido, acarrea a las cras hacia el nido, les lame el cuerpo y los genitales y los amamanta. As, la progenie obtiene, adems de calor, nutrientes y proteccin, los estmulos sensoriales, sociales y humorales necesarios para su desarrollo (Rosenblatt & Lehrman, 1963). Cuando la interaccin madre-cras se altera a travs de diversos paradigmas experimentales, como la manipulacin materna o la separacin materna el desarrollo de los sistemas antes descritos se modifica positiva o negativamente, respectivamente. La separacin materna total (SMT) consiste en separar a cras de 3 das de vida del nido, colocarlas y mantenerlas dentro de un sistema de crianza artificial, para proveerles de calor, proteccin, y nutrientes, hasta el destete (22 das de edad). Se ha reportado en ratas adultas que sufrieron SMT y criadas en el sistema de crianza artificial: 1) dficit de atencin e hiperactividad (Melo et al., 2009; Gonzalez et al., 2001), 2) dficit de aprendizaje social (Levy et al., 2003), 3) dficit en la expresin de la conducta sexual masculina (Lenz et al., 2008), y en la conducta materna (Gonzalez et al, 2001; Melo et al., 2009), 4) incremento en la respuesta al estrs (Gonzalez et al., 2001), 5) incremento en los niveles de agresin ofensiva en hembras no gestantes (Melo et al., 2006) y materna (Melo et al., 2009), y 6) mayor impulsividad (Lovic et al., 2011). Interesantemente, la adicin de estmulos sensoriales (con una brocha de pelos de camello) o sociales (se colocan cras de la misma edad dentro de los recipientes de aislamiento) durante el aislamiento, previenen parcialmente algunos de los efectos negativos de la SMT. Los datos anteriores sugieren que los estmulos sensoriales, sociales durante la interaccin madre-cras en el perodo de lactancia son de capital importancia para el desarrollo de diversos sistemas del individuo. Estos efectos conductuales de privacin son similares a los encontrados en nios hurfanos, los cuales presentan problemas de interaccin social, hiperactividad, dficit de atencin y agresin (Roy et al., 2004). Respecto a la participacin de la experiencia sensorial y social en el perodo postnatal predestete (PPNP) en el desarrollo de la agresin, se ha reportado que ratones destetados a los 14 das postnatales atacan con mayor frecuencia y tardan menos tiempo en iniciar los ataques (mayor agresin) hacia un intruso, que aquellos que fueron destetados a los 21 das (Nakamura et al., 2003), Adems, ratas juveniles de madres que son agresivas, pero que fueron criadas durante el PPNP por hembras no agresivas, muestran menor agresin hacia un intruso, mientras que las hijas de madres no agresivas criadas por madres agresivas, fueron ms agresivas hacia un intruso (Flandera & Novkiv, 1974). En ratones se ha reportado que cras machos y hembras que sufrieron separacin parcial durante el PPNP, son ms agresivas en la etapa juvenil que aquellas manipuladas por humanos (Brain, 1975). Recientemente se ha reportado que hembras adultas que fueron criadas artificialmente durante el PPNT son ms impulsivas que las criadas por su madre (Lovic et al., 2011), muestran altos niveles de agresin ofensiva (Melo et al., 2006) y de agresin materna, adems del dficit de cuidados maternos hacia sus propias cras (Melo et al., 2009). De manera interesante, la substitucin de estmulos sociales durante el aislamiento (Grupo

Aislado-Social) previno parcialmente los efectos negativos del aislamiento sobre la agresin materna, pero no los de la conducta materna. Finalmente, resultados preliminares de nuestro laboratorio muestran que machos juveniles (24-25 das de edad) que sufrieron SMT durante el PPNP despliegan altos niveles de juego-lucha rudo hacia un macho Intruso de la misma edad. Especficamente, la frecuencia de mordidas al cuerpo y cara del intruso, as como el acicalamiento agresivo es mayor en los machos aislados que la mostrada por los criados por su madre. Interesantemente la adicin de cras de la misma edad dentro del recipiente de aislamiento (grupo Aislado-Social) previene dichos efectos (Ochoa et al., 2008). Evidencia indirecta a travs de la manipulacin materna y estrs inducido por separaciones parciales sugiere que la experiencia temprana modifica el desarrollo del sistema serotonrgico, aunque no se sabe si este efecto influye en la expresin de la agresividad. Se ha sugerido fuertemente que la experiencia temprana, positiva (manipulacin materna o negativa (separacin maternal y social total; SMT), participa en el desarrollo del sistema serotonrgico y que de esta manera podra estar modulando la expresin de la agresividad. Para entender cmo la experiencia temprana modifica el desarrollo de la agresin, as como el papel que pudiera tener la serotonina en dichas alteraciones conductuales, en el presente trabajo se propone la realizacin del siguientes experimento: para determinar la actividad de la serotonina in vivo al medir su contenido por microdilisis en las reas propuestas, antes y despus de un encuentro agresivo. Los resultados que se obtengan de este experimento nos darn una informacin ms fisiolgica del sistema serotonrgico. El presente estudio contribuir con el entendimiento de los procesos neuroqumicos que subyacen al desarrollo de la agresividad empleando un modelo animal vlido y confiable. Hiptesis El incremento en la agresividad de machos que sufrieron separacin maternal y social de los hermanos de camada durante el periodo postnatal temprano se debe a una disminucin en los niveles de serotonina en la corteza prefrontal media y el raf dorsalmedial. Objetivo general. Establecer si el nivel de agresin de la rata macho adulta se relaciona con cambios en los niveles in vivo de serotonina en la corteza prefrontal y el raf dorsal-medial en machos adultos Aislados, Aislados-Sociales y Criados por su madre (Grupo Control). Objetivos especficos. 1) Determinar la actividad de la serotonina in vivo a travs de medir su contenido por microdilisis en la corteza prefrontal media y el raf dorsal-medial en machos adultos Aislados, antes y despus de un encuentro agresivo. 2) Determinar si la presencia de compaeros de camada (Grupo Aislados-Sociales) durante el periodo de aislamiento previene los efectos de la separacin materna.

METODOLOGIA

Se utilizarn ratas Wistar hembras primparas de 3-4 meses de edad provenientes del bioterio del Centro de Investigacin en Reproduccin Animal, CINVESTAV-Laboratorio Tlaxcala, Universidad Autnoma de Tlaxcala. Las hembras sern alojadas individualmente en cajas de plexiglass (22x44x30 cm) con el piso cubierto de aserrn. Sern mantenidas bajo un esquema 12/12 hrs. luz/oscuridad, la luz se encender a las 8:00 hrs. La temperatura del bioterio oscilar entre 22 y 24 C. Las ratas sern alimentadas con alimento balanceado para roedores (Laboratory rodent Chow 5001) y agua ad libitum. Procedimiento experimental.- En el da del parto, la camada ser agrupada a 8 cras (cinco machos y tres hembras). Cinco das despus, cuatro machos sern separados del nido para implantarles un catter de polietileno (PE10) en la mejilla . De las tres cras implantadas, a una de ellas se le retirar el catter y se regresar con su madre (grupo control; ciego). Las dos cras implantadas restantes sern colocadas dentro de un sistema de crianza artificial, con temperatura controlada y alimentadas con una frmula lctea. Finalmente, la ltima cra que fue separada del nido se regresar al nido para ser criada por su madre (grupo Control). Al final del perodo postnatal (22 das de edad) las cras criadas por su madre sern destetadas y, las criadas bajo aislamiento, sern separadas del sistema de crianza artificial y se alojarn en cajas de acrlico, junto con tres o cuatro conespecficos de la misma edad y sexo. Posteriormente se iniciar la transicin de ingestin alimenticia colocando dentro de la caja de acrlico un recipiente con una mezcla de frmula lctea y alimento pulverizado. Despus se alojarn dentro de un bioterio de ratas hasta el momento en que sean utilizadas (3-4 meses de edad). Se formarn los siguientes grupos: 1) Aislados, estas cras permanecern solas dentro de un recipiente, 2) Aislados-Social, estas cras se mantendrn dentro del recipiente junto a dos cras de la misma edad provenientes de nodrizas. Dichas cras se cambiaran cada 12 hrs. por otras dos recin alimentadas, 3) Control-Ciego (CM-C), este grupo es control de la ciruga y, 4) Control (CM), estas cras sern criadas por su madre. Cinco das despus del parto (DPN 5), cuatro machos sern separados del nido, se colocarn en un recipiente con aserrn y con temperatura controlada, y a tres de ellos se les implantar un catter de polietileno (PE-10) en la mejilla (Lvy et al. 2003). Las crias se anestesian con 1-2 ml de metoxifluorano (Metofane, CDMV, Inc). Acto seguido, se introduce un catter PE-10 (Clay Adams), con una gua de acero (D=0.25 mm) en su interior y con un tubo de silastic (Dow Corning) en la punta, en el hocico de las cras se fija a la mejilla. Despus se retira el tubo metalico y se deja el catter. Se formarn los siguientes grupos: 1) Aislados, estas cras permanecern solas dentro de un recipiente, 2) AisladosSocial, estas cras se mantendrn dentro del recipiente junto a dos cras de la misma edad provenientes de nodrizas. Dichas cras se cambiaran cada 12 hrs por otras dos recin alimentadas, 3) Control-Ciego (CM-C), este grupo es control de la ciruga y, 4) Control (CM), estas cras sern criadas por su madre. Todas las cras recibirn diariamente dos estimulaciones anogenitales con una brocha hmeda durante 30 segundos para estimular la miccin y la defecacin. Al final del perodo postnatal (22 das de edad) las cras criadas por su madre sern destetadas y, las criadas bajo aislamiento, sern separadas del sistema de crianza artificial y se alojarn en cajas de acrlico, junto con tres cuatro conespecficos de la misma edad y sexo. Posteriormente se iniciar la transicin de ingestin alimenticia colocando dentro de la caja de acrlico un recipiente con una mezcla de frmula lctea y alimento pulverizado. Despus se alojarn dentro de un bioterio de ratas hasta el momento en que sean utilizadas (3-4 meses de edad).

Crianza Artificial.- Despus del implante del catter, las cras se alojarn individualmente en recipientes de plstico flotando dentro de un acuario lleno de agua caliente (36-40C), dentro de un cuarto mantenido a 24-25C y con una humedad de 4648%. La temperatura dentro de los recipientes se debe mantener a una temperatura similar a la encontrada dentro del nido, de acuerdo a la edad de las cras. El catter PE10 se conectar a otro catter de mayor calibre (PE-50) y ste a su vez a una jeringa de 10 ml con frmula tibia la cual estar montada sobre una bomba de infusin programable Harvard Mod. PH2000. Esta ltima ser programada para infundir leche durante 10 minutos cada hora, las 24 horas del da. El volumen y la velocidad de infusin se calcularn en funcin del peso promedio de todas las cras conectadas a la bomba. El primer da de aislamiento (da postnatal 3), las cras recibirn un volumen de leche igual a 33% de peso corporal promedio, y esta cantidad se incrementar 1% por da. Diseo Experimental Determinacin in vivo.- Con la finalidad de corroborar la hiptesis de que el aislamiento reduce los niveles de serotonina en reas neurales involucradas en la modulacin de la agresin, en grupos independientes de ratas, se determinar el contenido de 5-HT en la corteza prefrontal media y el raf dorsal-medial, antes y despus del encuentro agresivo, lo que podra dar una medida ms fisiolgica del sistema serotonrgico. Machos Aislados, Aislados-Sociales y CM y CM-C de 3-4 meses de edad sern implantadas con una cnula gua en la corteza prefrontal media y el raf dorsal-medial. Cuatro das despus sern colocadas (individualmente) dentro de cajas de acrlico y al siguiente da sern conectadas a un sistema de perfusin de microdilisis. Se iniciarn las mediciones de serotonina extracelular basales cada 10 minutos por un perodo de 40 minutos. Posteriormente se iniciar la prueba Residente-Intruso al colocar un macho Intruso de la similar edad dentro de la caja, la cual tendr una duracin de 10 minutos. Al finalizar la prueba el macho intruso se retirar y el Residente se volver a conectar al sistema de perfusin para continuar con las mediciones de serotonina cada 10 minutos y por un perodo de 60 minutos. La principal ventaja de este diseo experimental es que cada sujeto ser su propio control, de modo que los datos sern expresados en trminos del cambio en la concentracin basal de 5-HT (previo al encuentro). Ciruga.- Los sujetos sern anestesiados con hidrato de cloral (450 mg/kg va ip) y posteriormente se implantar estereotxicamente una cnula gua en el raf dorsalmedial y en la corteza prefrontal media con las coordenadas corregidas por ensayo y error a partir de las sugeridas por Paxinos (1997). Los animales tendrn un periodo de 5 das para recuperarse de la ciruga. Microdilisis.- Transcurrido el periodo de recuperacin operatoria, se realizaran las mediciones de los contenidos extracelulares de 5-HT y DA en el el raf dorsal-medial y la corteza prefrontal media usando cnulas de microdilisis con membranas de 1mm de longitud y con un dimetro externo de 0.24mm (CMA 11, BAS). El lquido de perfusin ser una solucin ringer compuesta por cloruro de sodio (NaCl) 137mM, cloruro de calcio (CaCl) 1.2mM, cloruro de potasio (KCl) 3mM, sulfato de magnesio (MgSO4) 1mM, fosfato monosdico di-hidrogenado (NaH2PO4) 0.5mM, fosfato disdico hidrogenado (Na2HPO4) 2mM y glucosa 3mM. La solucin ringer ser perfundida a una velocidad de 2 l/min por medio de un microcatter de polietileno que una la cnula de microdilisis a una jeringa de 2.5 ml anclada a una bomba de microdilisis (CMA 100/ BAS). El sistema de perfusin permitir al animal libre movimiento. La salida de la cnula de microdilisis estar conectada a un colector de muestras (CMA) que contendr viales a los que se les adicionar 10% de una solucin de cido fosfrico 0.1N y EDTA. La cnula de

microdilisis ser insertada en la gua al menos 2 horas antes de iniciar la coleccin de dializados. Histologa.- Al final de los experimentos de microdilisis, los animales sern sacrificados con una sobredosis de pentobarbital sdico y sern perfundidos intracardialmente con salina al 0.9% seguida de solucin fijadora (formaldehdo en solucin al 10%). Los cerebros sern removidos y permanecern en la solucin fijadora durante tres das. Cortes coronales de 100 m sern realizados para verificar los sitios en los que se realiz la dilisis.
ANLISIS ESTADSTICO. Para el anlisis estadstico de las pruebas de agresin se utilizar la frecuencia (nmero de veces que presenta una conducta), duracin (tiempo total que expresa la conducta) y la latencia (intervalo de tiempo para que se emita una conducta) como parmetros de las conductas previamente descritas. Se emplear un ANOVA de 2 entradas de medidas repetidas, donde el factor 1 ser la modalidad de aislamiento, el factor 2 ser el tiempo de las colectas expresadas en trminos de % de cambio respecto a las concentraciones basales promedio de cada sujeto. Los anlisis estadsticos se realizarn con los programas SPSS versin 11.0 y Graphpad Prism. Las grficas se elaborarn con el programa SigmaPlot 2001. En todos los casos un valor de p<0.05 ser considerado estadsticamente significativo.

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