C.S.de Tcnico de Laboratorio.

Microbiologa Clnica: Tcnicas de siembra

TCNICAS DE SIEMBRA Y RECUENTO DE BACTERIAS

1. TCNICAS DE SIEMBRA:
1.-INTRODUCCIN.2.- MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACIN.3.-PREPARACIN DE INCULOS.4.-TCNICAS DE SIEMBRA.5.- NORMAS GENERALES: 2. RECUENTO DE BACTERIAS

1 TCNICAS DE SIEMBRA:
1.-INTRODUCCIN.Para la identificacin de una especie bacteriana es preciso estudiarla en un cultivo puro y para ello es necesario aislarla. El aislamiento consiste en obtener bacterias de un solo tipo, de tal forma que en su estudio no se produzcan errores, llegando a un diagnstico falso al haber varias especies bacterianas mezcladas. Normalmente las infecciones bacterianas estn ocasionadas por un solo tipo de microorganismos y es muy raro que intervengan dos o ms especies, lo cual no significa que no haya otro tipo de bacterias acompaantes en la infeccin, ya que esta ocasiona unos cambios fisicoqumicos que facilitan la proliferacin de dichas bacterias acompaantes (oportunistas). Hay que tener en cuenta los posibles microorganismos que se pueden aadir durante la manipulacin en el laboratorio, por ejemplo la presencia de Staphylococcus aureus. El aislamiento es la separacin de un determinado microorganismo de las poblaciones mixtas existentes en la naturaleza, hasta conseguir una sola o los descendientes de esta nica bacteria. A esta bacteria separada se denomina unidad formadora de colonias Para realizar el aislamiento y contaje de bacterias es preciso depositarlas en un medio de cultivo apropiado, a este procedimiento se llama siembra o inoculacin. El mtodo ms usual es la siembra por estras en placa, utilizando el asa de siembra, mediante la cual y a partir de una pequea cantidad de muestra se separan e inmovilizan las clulas bacterianas sobre un medio nutritivo slido. Despus de un tiempo y temperatura de incubacin adecuados cada clula viable origina una colonia bacteriana que es visible macroscpicamente y a partir de la cual es posible obtener un cultivo puro. Cada colonia tiene unas caractersticas determinadas en cuanto a su forma, borde, elevacin, tamao, consistencia, etc.

C.S.de Tcnico de Laboratorio. Microbiologa Clnica: Tcnicas de siembra Es muy importante realizar el mayor nmero de estras para diluir la muestra, de manera que si bien aparecen colonias confluentes o una masa continua de microorganismos, en las estras finales debern aparecer colonias perfectamente separadas unas de otras. 2.- MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACIN.1. Asa de siembra.-Es utilizada para la inoculacin o siembra por estras en medio slido y para siembras en medios lquidos, la ms usada tiene un calibre de 0,01mililitros. 2. Hilos.- Se usan para siembras en medios slidos y semislidos en picadura . 3. Asas de Digrasky.-Son asas de vidrio en forma de triangulo ms o menos abierto. Se utiliza para extenderle inculo lquido previamente adicionado a la placa con una pipeta pasteur. 4. Hisopos.- Se utilizan para la toma de muestra y extender dicha muestra en el medio de cultivo. Es desechable 5. Pipetas.- Pueden ser de vidrio o de plstico. 3.-PREPARACIN DE INCULOS.Un inculo es una cantidad suficiente y representativa de microorganismo problema. Se debe de partir por un lado: a) de un cultivo puro y b) de una concentracin adecuada de microorganismo problema. a) Si la muestra no es pura, se aislar por estra en placa o por agotamiento, de esta forma, una muestra natural que en principio no es pura puede ser aislada y desarrollada como cultivo puro. b) Si el problema est en la cantidad de microorganismo, que no es suficiente, ser necesario preparar un inculo con el fin de obtener una cantidad microbiana suficiente y representativa para obtener resultados fiables.

4- MTODOS DE PREPARACIN DE INCULOS

a) Si la muestra es slida o semislida se tomar con asa estril. Si se adiciona a un medio lquido se homogeneizar por agitacin y si se adiciona a un medio de cultivo slido se utilizarn diferentes tcnicas de siembra y se incubar en ambos casos. b) Si la muestra es lquida se tomar con pipeta graduada o pipeta Pasteur. Si se adiciona a un medio de cultivo lquido se homogenizar y se incubar .Si se aade en un medio de cultivo slido, se extender con el asa y se incubar. A veces al principio es necesario partir de un inculo con un nmero aproximado de microorganismos. Los inculos se preparan en medios lquidos y el n de microorganismos se cuentan por comparacin con la escala de Mc-Farland. 4.-TCNICAS DE SIEMBRA Siembra o inoculacin es el paso de una muestra microbiana a un medio de cultivo ya sea lquido o slido. Resiembra es el paso de una muestra microbiana de un medio de cultivo a otro. a) SIEMBRA DEL INCULO EN MEDIO LQUIDO. Se realiza con asa de siembra, se carga sta con muestra slida o lquida y aadindose al medio liquido y agitando el asa dentro del mismo.

C.S.de Tcnico de Laboratorio. Microbiologa Clnica: Tcnicas de siembra Si se realiza con pipeta se toma un volumen de muestra problema y se vierte al medio de cultivo lquido agitndose hasta su homogeneizacin. Si se realiza con escobilln o hisopo el mtodo es igual que con el asa de siembra. b) SIEMBRA DEL INCULO EN MEDIO SLIDO. Estas siembras pueden darse en placa o en tubo. 1.-Siembra del inculo en placa a) Tcnica de Barry. Siembra previa al vertido del medio en la placa. Para ello en el medio de cultivo previamente fundido (de 20 a 25 mililitros de medio a una temperatura de 45 a 50 0C) en tubo, se adicionar la cantidad de inculo que oscila entre 0,1 a 0,4 y se homogeneiza la muestra en el tubo mediante el vibrador. Una vez, constituida la muestra, se vierte sta en la placa petri estril y se dejar solidificar. La mezcla tambin se podra realizar en la misma placa Petri, aunque la homogeneizacin en este caso es ms difcil. Esta tcnica es utilizada, por ejemplo, para la determinacin del CMI (concentracin mnima inhibitoria) de un antibitico frente a determinados microorganismos.

b) Siembra de muestra lquida en placa con asa de Digrasky.Consiste en adicionar al medio slido un inculo que pueda oscilar entre 0,2 y 1 ml con pipeta estril y posteriormente se extiende con el asa de Digrasky estril. Esta tcnica se usa en el estudio de antibiogramas. c) Siembra por agotamiento o aislamiento en estras. 1.-Flamear toda la longitud del asa de siembra hasta la incandescencia, mantenindola vertical en el mechero bunsen. 2,-Si la muestra se encuentra en el tubo de ensayo, utilizando el dedo meique de la mano derecha quitar el tapn metlico o el algodn de! tubo que contiene la muestra y flamear la boca de ste. 3.-Tomar con el asa una delgada pelcula de la muestra. 4.-Volver a poner el tapn en el tubo tras el flameado de la boca. 5 Con la placa invertida sobre su tapa, levantarnos el fondo y sostenerlo sobre la mano durante la inoculacin, y hacer unas estras en superficie sin apretar excesivamente sobre el medio con movimientos en zig-zag de un extremo a otro de la placa no 3

C.S.de Tcnico de Laboratorio. Microbiologa Clnica: Tcnicas de siembra tomndose en ningn momento nuevo inculo y no levantndose el asa hasta concluir la siembra de toda la placa. Finalizada la operacin se tapa la placa. 6.- Se lleva a incubacin a la temperatura especifica para esa muestra (normalmente 370C) durante 24-48 horas. d) Tcnica de los cuatro cuadrantes. Con un rotulador para vidrio, en la base de la placa (reverso), se dibujan dos lneas perpendiculares que se cruzan en el centro de la placa, formndose cuatro cuadrantes. Se tomar con el asa de siembra estril una cantidad de inculo y se adicionar en el extremo superior de uno de los cuadrantes extendindose por todo ese cuadrante en forma de zig-zag. Realizaremos la misma operacin sin flamear en todos los dems cuadrantes siguiendo un orden de tal forma que iremos arrastrando el microorganismo problema, observndose en el ltimo cuadrante las colonias ms aisladas o separadas.

2.-Siembra del inculo en tubo. a) Siembra en tubo inclinado.1.- Flamear el asa en toda su longitud. 2.- Tomar la muestra, en caso de que se encuentre en tubo quitar el tapn. 3.- Flamear la boca del tubo, 4.- Introducir el asa y sembrar en estras la parte superior dcl medio (pico de flauta). 5.- Flamear la boca del tubo, tapar y llevar a incubacin. b) Siembra en picadura.Sembrar igual que en el tubo inclinado pero utilizando un hilo en lugar de un asa y se introduce con la muestra verticalmente hasta el final de tubo (aprox. 1 cm del fondo). c) Siembra en picadura y estras.Sembrar primero en picadura y sin sacar el hilo sembrar en estrias en la superficie. 5.- Normas generales: 1. Marcar adecuadamente las placas de petri que contienen el medio de aislamiento. Los rtulos deben ser hechos en aquella parte de la placa que lleva el medio, nunca en la tapadera. Utilizar placas sin agua de condensacin en la tapadera, ni en el medio de cultivo. 2. Colocar las placas en posicin invertida, es decir con el medio de cultivo arriba, de esta manera se evitan las contaminaciones y que el agua de condensacin caiga sobre el medio.

C.S.de Tcnico de Laboratorio. Microbiologa Clnica: Tcnicas de siembra 3. En condiciones de esterilidad, tomar una gota de la mezcla bacteriana con ayuda de un asa estril. Si se trata de un cultivo puro, en cuyo caso se suministrarn sembrados en tubos inclinados de TSI, tomar la menor cantidad de masa bacteriana posible. 4. Hacer estras paralelas juntas pero nunca superpuestas, avanzando sobre la superficie de agar 5. Incubar las placas seleccionando el tiempo y la temperatura de incubacin adecuados para cada bacteria. (Normalmente 37 durante 24 horas). 6. Observar las colonias y describir los diferentes tipos encontrados. 7. Seleccionar 1 o 2 colonias para realizar el cultivo puro. 8. Los tubos se mantendrn inclinados para evitar la contaminacin. 9. No dejar los tapones de los tubos en la mesa para evitar la contaminacin. 10. Los instrumentos de siembra cuando se esterilizan por flameado hay que dejarlos enfriar antes de la manipulacin de las bacterias, ya que estas pueden ser destruidas por el calor. 11. Antes de sembrar revisar el medio a inocular para ver si est contaminado. 12. Sacar los medios del lugar de almacenamiento con anterioridad para que estn a temperatura ambiente en el momento de la siembra. 13. Las muestras se agitarn para homogenizar su contenido antes de sembrarlos. TCNICA DE UN CULTIVO PURO Cultivo puro.Se trata de desarrollar un solo tipo microbiano en un medio de cultivo, por ejemplo en un tubo de agar nutritivo. Para ello, a partir de cada una de las colonias distintas que se obtienen en un aislamiento de una muestra, se logra masa bacteriana sembrando estras muy juntas. Obtenido el cultivo puro de la bacteria deseada es conveniente realizarle una tincin de Gram, para comprobar que no est contaminado. Tambin es aconsejable antes de proceder a la obtencin del cultivo puro tomar la colonia seleccionada y hacer un segundo aislamiento, si todas las colonias de la segunda placa resultan idnticas puede usarse una de ellas para establecer un cultivo. Los cultivos puros son mantenidos en el laboratorio por resiembras (pase de una bacteria de un medio a otro) sucesivas, una de las copias puede ser liofilizada para su conservacin. Tcnica.1. Seleccionar una colonia perfectamente aislada, rodendola con una marca, con ayuda de un rotulador. 2. Con el asa estril tocar la colonia asegurndose de no rozar otras colonias vecinas. 3. Inocular un tubo inclinado de TSI o agar nutritivo haciendo estras muy juntas para obtener un tapiz continuo de masa bacteriana. 4. Incubar los tubos que debern estar perfectamente rotulados con todos los datos necesarios.

2.-RECUENTO DE BACTERIAS
En muchas muestras la deteccin de bacterias sugiere infeccin pero no asi en otras, como por ejemplo en la orina donde siempre hay bacterias. En las muestras no estriles normalmente la infeccin viene dada por un incremento en el nmero o por cambio de las especies presentes. 5

C.S.de Tcnico de Laboratorio. Microbiologa Clnica: Tcnicas de siembra As mismo los tratamientos se deben valorar como satisfactorios si han hecho desaparecer o al menos han reducido el nmero de bacterias. Por todo ello es fundamental realizar estudios que nos permitan saber el nmero de bacterias presentes en la muestra.

Tcnicas de recuento: 1) Manuales: - En medio slido: se consiguen sembrando fracciones de muestras con escaso nmero de microorganismos, de tal modo, que su siembra nos va a dar tras la incubacin colonias que puedan ser contadas (lo ideal entre 50 y 250 por placa) y de ah deducir el nmero de bacterias. Las fracciones de muestra se pueden obtener mediante diluciones de la muestra o con un asa calibrada y sembrando en placas de la forma ms homognea posible. Con el asa calibrada se realiza haciendo una estra longitudinal en el centro de la placa y sobre ella se realizan estras muy juntas en distintas direcciones, la primera de la cuales ser perpendicular a la estra longitudinal Tambin se pueden realizar sucesivas diluciones de la muestra en un medio de cultivo lquido y tras la incubacin ver qu diluciones han presentado turbidez y calcular el nmero de bacterias vivas que contena. 2) Electrnicos: Consiste en un contador electrnico de partculas semejantes a otros empleados en el laboratorio, como por ejemplo el recuento de hemates en los cuales hay una diferencia de conductividad al paso de una bacteria u otra partcula que se traduce en una seal que se va registrando y contabilizando.