PCR (Reaccin en cadena de la polimerasa).

La reaccin en cadena de la polimerasa es una tcnica que se basa en sintetizar muchas veces un pedazo o fragmento de ADN utilizando una polimerasa que puede trabajar a temperaturas muy elevadas, ya que proviene de la bacteria thermus aquaticus que vive a altas temperaturas (79C a 85C), de ah su nombre comercial ms conocido: taq polimerasa. En la reaccin de PCR se sintetiza el ADN y en un tubo se mezclan todos los ingredientes necesarios para hacerlo: la polimerasa, el ADN del organismo que queremos estudiar donde se encuentra el fragmento que queremos sintetizar, los oligonucletidos (llamados tambin primers, iniciadores, cebadores, oligos, etc.) necesarios para que se inicie la transcripcin, dinucletidos (dNTPs), y las condiciones para que la enzima trabaje adecuadamente (cierto pH, determinadas cantidades de magnesio en forma de MgCl, KCl, y pueden necesitarse otras sales o reactivos, dependiendo de cada polimerasa). La amplificacin in vitro del DNA se logra en tres pasos bsicos:

a).-Desnaturalizacin del DNA a copiar (molde o diana). Ello se consigue incrementando la temperatura para separar las dos cadenas que componen la doble hlice del DNA. b).-Hibridacin o apareamiento de los cebadores u oligos al DNA molde. Para ello se baja la temperatura de reaccin, de forma que pequeas secuencias de DNA de cadena sencilla (tpicamente, entre 10 y 30 bases o meros) se unan a sus secuencias complementarias del DNA diana. Cada uno de ellos se une a una de las cadenas del DNA diana, de forma que sus extremos 3OH apuntan el uno hacia el otro, delimitando la secuencia a amplificar. c).- Copia de las cadenas delimitadas por los cebadores. Se consigue elevando la temperatura de la reaccin a la ptima de la polimerasa de DNA utilizada. Cada uno de los extremos 3OH de los oligos apareados a las cadenas directa y reversa sern extendidos, generndose las cadenas hijas correspondientes. El resultado son dos hlices completas Watson & Crick en la regin delimitada por los oligos. Dicho de otra forma, se duplica el nmero inicial de molculas de DNA. Estos tres pasos de desnaturalizacin, hibridacin y polimerizacin se repiten n veces, duplicndose en cada ciclo el nmero de cadenas delimitadas por los oligos. Se trata, pues, de una amplificacin exponencial o logartmica, en que las cadenas previamente sinterizadas pueden servir de molde a futuras amplificaciones.

Componentes de la reaccin.

Nucletidos (dNTPs 10Mm): Los nucletidos se diluyen en agua, la solucin debe ser protegida (por ejemplo con 10mM Tris pH 7,7- 8,0, concentracin final). Si no, un pH cido promover la hidrlisis del dNTP en dNDP y dNMP y los har intiles para las reacciones de polimerizacin de la DNA enzimtica. Los stocks son diluidos a 10 mM, alicuotados y almacenados a -20 C. Es recomendado usar un stock de trabajo que contenga 1mM de cada dNTP. La estabilidad de los dNTP durante ciclos repetidos de PCR, es de tal manera que aproximadamente el 50% permanece como dNTP despus de 50 ciclos. Primers (forward y reverse): Los oligonucletidos iniciadores o primers son fragmentos complementarios que se unen a cada una de las dos cadenas separadas del templado de ADN. La seleccin de oligonucletidos iniciadores es muy importante en la reaccin en cadena de la polimerasa. De este paso depende el xito en el laboratorio. Criterios principales: Tamao ideal es de 20-25 nucletidos de longitud pero generalmente son de 18-30 nucletidos. La base en el extremo 3 debe ser una G o C. Temperatura de fusin 50-65 C. El contenido GC debe ser de 40-60%. La auto complementariedad debe ser evitada, para evitar la formacin de estructuras secundarias y los dmeros de primer. Debe tener un 100% de apareamiento con el molde.

Cuando el objetivo a amplificar es un locus, la posicin de los iniciadores debe ser relativa a los codones de inicio y terminacin. Es recomendable que el cebador "forward" se encuentre ms o menos a 35 pb del inicio de la secuencia que codifica, de la misma forma el cebador "reverse" debe localizarse 35 pb despus de la regin que codifica.

Altas concentraciones de primer pueden incrementar la posibilidad de generar un templado independiente llamado dmero de primer. Los productos no especficos y los dmeros de primers son por si mismos sustratos para PCR y compiten con el producto deseado por la enzima, dNTPs y primers, resultando en un bajo rendimiento del producto deseado. Primers universales: (T7 Fw- SP6 Rv). Templado: Una de las caractersticas ms atractivas de la PCR es que la cantidad y calidad de la muestra de DNA sujeta a amplificacin no necesita ser alta. El criterio esencial es que la muestra contenga al menos una cadena de DNA intacta que abarque la regin que va a ser amplificada y que las impurezas sean suficientemente diluidas como para no inhibir la polimerizacin. Taq DNA polimerasa: Una ADN polimerasa es una holoenzima que utiliza los dNTPs para alargar el terminal 3' de un primer complementado a una molcula de ADN que utiliza como plantilla o molde. Su temperatura ptima, en que se observa su actividad mxima, es entre 75 y 85 C Todas las ADN polimerasa conocidas sintetizan el ADN en la direccin 5' a 3'. Ninguna ADN polimerasa conocida es capaz de comenzar una nueva cadena. Ella slo puede aadir un nucletido en un grupo 3'-OH que ya existe. Por esta razn la ADN polimerasa necesita un cebador al grupo 3' -OH del cual puede aadir el primer nucletido. Concentracin de Magnesio: El MgCl principalmente es un cofactor necesario para la actividad enzimtica de las DNA polimerasa. Afecta el alineamiento de los primers, la temperatura de disociacin de las cadenas, tanto del templado como del producto de PCR, la especificidad del producto, la formacin de dmeros de primer y la actividad y fidelidad de la enzima. La Taq polimerasa requiere magnesio libre en la unin con el templado, los primers y los dNTPs. La presencia de EDTA u otros quelantes en el stock del primer o del templado puede alterar la concentracin ptima aparente de magnesio. Buffer: Una solucin tampn (buffer) es el que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento del ADN polimerasa. El buffer es exclusivo para su marca de enzima. *Todos los reactivos se guardan a -20 C

Protocolo: En un tubo ependorf de 500 [L] (0,5 ml) para PCR, se agregan por cada reaccin:

Reactivos Buffer 10x MgCl 50 [ mM ] dNTPs 10 [ mM ] Primer Fw T7 [10 uM] Primer Rev SP6 [10Um] Taq polimerasa 5 [U/L] ADESI ADN TOTAL

1X 2,5 [L] 0,75 [L] O,5 [L] 0,625 [L] 0,625 [L] 0,125 [L] 18,8 [L] 1,0 [L] 25,0 [L]

4X 10,0 [L] 3,0 [L] 2,0 [L] 2,5 [l] 2,5 [l] 0,5 [l] 75,2 [l] ---------100,0 [L]

6X 15,0 [L] 4,5 [L] 3,0 [L] 3,75 [l] 3,75 [l] 0,75 [l] 112,8 [l] -----------150,0 [L]

* No olvidar agregar un control negativo (sin templado). Los tubos con el master mix ingresan al termociclador y se programan con el siguiente perfil trmico: Denaturacin inicial 5 minutos a 98 C 1 ciclo Denaturacin - 30 segundos a 94 C Hibridacin 30 segundos a 58 C Extensin 1,5 minutos a 72 C Extensin final 5 minutos a 72C 1 ciclo

35 ciclos

Fundamento etapas: Desnaturalizacin: Para que pueda iniciarse la reaccin es preciso que las molculas de ADN molde se encuentren en forma de cadena simple. Esto se consigue calentando a temperatura de 98 a 94C para que produzca la rotura de los enlaces puente de hidrogeno (esta temperatura depende de la cantidad G-C que posea el fragmento), para asegurar la completa separacin de la doble cadena del ADN esta temperatura debe mantenerse unos minutos. Si el ADN solo se desnaturaliza parcialmente ste tender a renaturalizarse muy rpidamente dificultando con esto el proceso de hibridacin. Hibridacin: Una vez que el ADN est desnaturalizado se disminuye la temperatura de la reaccin hasta los 58 C(T7 Fw y SP6 Rev) para que se pueda producir la hibridacin especfica del cebador a la secuencia flanqueante del fragmento que se desea amplificar, la temperatura a la que se realiza esta etapa depende de la longitud de los cebadores y su secuencia (Temperaturas inferiores a la ptima producirn hibridaciones inespecficas de los cebadores y temperaturas superiores nos dificultarn la eficiencia de la misma). Extensin: Durante esta etapa la ADN polimerasa (termo resistente proveniente de bacteria Thermus aquaticus) incorpora nucletidos en el extremo 3 del cebador utilizado como molde la cadena de ADN previamente desnaturalizada. La temperatura a la que se realiza esta etapa de la reaccin suele ser de 72C ya que es la temperatura a la que la Taq polimerasa alcanza su mxima actividad. Normalmente una extensin de 20 segundos es suficiente para fragmentos menores de 500 pares de bases, y 40 segundos para fragmentos por encima de 1.2 kb. Al finalizar cada uno de los ciclos el nmero de copias obtenidas se duplica y despus de 20 ciclos ya tenemos aproximadamente 1 milln de copias de cada una de las molculas molde iniciales ADN.

Gel para visualizar PCR Se usa un gel de agarosa 1%. 1. Preparacin del gel 1%, agregamos 0,5[gr] de agarosa y 50 [ml] de buffer TAE/ADESI en un frasco. Mezclar y fundir en el microondas hasta obtener una mezcla homognea libre de grumos. 2. Esperar que enfre un poco y agregar 0,5 [L] del fluoroforo, vaciar en el pocillo que moldeara el gel con la peineta puesta o ponerla luego, esperar al cambio de coloracin de este (gel) a uno ms blanco (lo que indica que est en estado slido). 3. Despegar el gel del molde y poner en la cmara de electroforesis, agregar el buffer de corrida TAE-ADESI hasta cubrir el gel y quitar la peineta con mucha precaucin evitando que formen burbujas en el gel y romperlo. 4. En parafilm agregar 1[L] de buffer de carga 6x por cada una de las muestras.

5 Depositar esto en cada uno de los pocillos. Despus de depositadas todas las muestras en el primer carril poner el marcador de peso que en este caso corresponde a uno de 1 Kb (este comienza a migrar muy rpido por eso se deposita en ltimo lugar). 6. Encender la cmara electrofortica, tapar y dejar correr durante 30 min a 80 volts.

Resultados PCR

M.P

El pocillo 1 muestra el marcador de peso; los pocillos 2, 3, 4 y 5.; corresponde analizar. Los pocillos 2,3, 4 y 5 presentan las bandas que indican amplificacin.