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VIII Semana de Tecnologia em Alimentos

FUNES DOS REAGENTES E ETAPAS UTILIZADAS DURANTE O PROCESSO DE ISOLAMENTO DE DNA A PARTIR DE PROTOCOLO BASE REAGENTS FUNCTIONS AND STEPS USED DURING THE DNA ISOLATION PROCESS FROM BASE PROTOCOL
Maiara Schlusaz1; Luciano Medina Macedo2; Gabriela Sartori Felkl3; Juliana Vitria Messias Bittencourt4 1,3,4 Universidade Tecnolgica Federal do Paran UTFPR Ponta Grossa Brasil maiara.schlusaz@uol.com.br 2 Universidade Federal do Paran UFPR Curitiba Brasil medinacwb@pop.com.br

Resumo A extrao dos cidos nuclicos (DNA e RNA) o primeiro passo para a realizao da maioria das metodologias de biologia molecular. O DNA pode ser obtido de vrios tipos de tecidos e clulas, existindo portanto uma infinidade de protocolos para realizao destes procedimentos. A escolha do protocolo de extrao de DNA depender de diversos fatores como: tipo de tecido a ser utilizado, tipos de reagentes qumicos, equipamentos, instalaes disponveis, grau de pureza e de integridade necessria para a aplicao em que o DNA ser utilizado (PCR, seqenciamento, clonagem gnica, etc.) (Bartlett, 2003). O objetivo deste artigo apresentar as funes qumicas dos reagentes envolvidos no processo de extrao de DNA, bem como descrever as funes das etapas realizadas durante este processo, auxiliando assim na escolha do protocolo mais adequado, de acordo com o objetivo do estudo. Palavras-chave: DNA; funes qumicas; isolamento; protocolos; reagentes.

1. Introduo Recentemente inmeras descobertas vm sendo divulgadas e atribudas bioqumica visando minimizar problemas atuais. A bioqumica quando aplicada juntamente com inovadoras tecnologias passa a se chamar biotecnologia e dentre os processos que se utilizam da biotecnologia se destacam: a) Questo ambiental desenvolvimento de microrganismos modificados para tratamento de efluentes (JONES, 2003; ASSOCIATION BIOMDITERRANE, 2007); b) Agricultura - desenvolvimento de plantas transgnicas (RECH, 2006; THE BOSTON GLOBE, 2006); c) Pecuria - formao de embries in vitro e o aprimoramento de vacinas e medicamentos (WACHSNER, 2005); d) Sade humana - desenvolvimento de novas vacinas, hormnios, medicamentos e antibiticos (ANTUNES et al., 2006), dentre outros. Assim, a biotecnologia busca por meio de sua ao, formas que possam contribuir para amenizar ou at mesmo resolver

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problemas atuais em suas mais diferentes aplicaes. Alm disso, a biotecnologia permite a utilizao de seres vivos (como microrganismos e vegetais) como parte integrante e ativa do processo de bens e servios para a indstria (VILLEN, 2011). Desta forma, as ferramentas da biotecnologia abriram um novo leque para a inovao e o desenvolvimento de novos produtos, tornando-os imprescindveis para a agroindstria, para o setor qumico-farmacutico e para a indstria alimentcia. (DURBANO et al., 2011). Os mtodos de anlises aplicados biotecnologia contam com vrias ferramentas, dentre as quais se destacam as anlises moleculares ou de DNA (cido desoxirribonuclico). O processo de isolamento ou extrao de DNA um dos principais mtodos deste tipo de anlise e possui vrios objetivos como: Reao de Polimerase em Cadeia (PCR), que muito utilizada na biologia molecular e na engenharia gentica e possui aplicaes em muitos trabalhos tais como a amplificao de sequncias gnicas, identificao genotpica (fingerprinting), testes de paternidade, anlises de dissimilaridade entre genomas, mapeamento e melhoramento gentico, (CORDEIRO, 2003); determinao de alimentos que utilizam de matrias primas transgnicas (MARCELINO, 2006); determinao de existncia de bactrias e microorganismos nocivos ou no ao ser humano (MIGUEL, 2007) e melhoramento gentico (MARINO, 2011). Com uma variedade imensa de protocolos disponveis para a realizao de isolamento de DNA, a escolha do procedimento correto e dos reagentes mais adequados para cada material a ser extrado (devido as suas caractersticas e particularidades), deve ser levada em conta e adaptada corretamente, pois em uma anlise molecular de extrema importncia o correto isolamento e qualidade do DNA extrado, para que se mantenham caractersticas necessrias na aplicao em que o DNA se destina, seja PCR, seqenciamento, etc (GOUVEIA e REGITANO, 2007; BARTLETT, 2003; ROMANO et al., 1998). Com base nestas informaes deve-se destacar a funo e a composio de cada elemento participante do processo de isolamento, seja ele qumico ou fsico, pois a partir desta anlise podese obter uma melhor compreenso do processo como um todo e adaptar procedimentos. Portanto o objetivo deste trabalho, com base em revises bibliogrficas voltadas a rea, remete-se em descrever as funes qumicas dos regentes utilizados durante esse processo de isolamento de DNA, bem como as etapas realizadas e seus objetivos no seu correto isolamento, para que sejam levadas em considerao as mudanas e elaboraes de protocolos a partir de um protocolo base. O trabalho est organizado em reviso de definies de cidos nuclicos, esquema de etapas bsicas pertencentes ao protocolo realizadas no procedimento de extrao e funes dos reagentes qumicos utilizados.

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1.1 cidos nuclicos Os cidos nuclicos so responsveis pelas informaes que caracterizam os seres vivos e so armazenados no interior das clulas. Existem basicamente dois tipos de cidos nuclicos: o cido desoxirribonuclico e o cido ribonucleico, os quais formam o DNA e RNA, respectivamente (COOPER e HAUSMAN, 2009; AMORIM, 2009). O DNA uma substncia qumica encontrada nas clulas de indivduos procariontes e eucariontes (SISMOTTO, 2011) e cada clula possui a cpia completa do DNA. Esta molcula faz a sntese de protenas, as quais so responsveis pela manifestao de caractersticas do indivduo e tambm pelo armazenamento e transmisso de informaes genticas (caracteres hereditrios) (GUIDOLIN, 2011). Este cido basicamente formado por nucleotdeos, onde cada nucleotdeo formado por trs componentes diferentes: um grupo fosfato, uma pentose (desoxirribose) e um grupo de base nitrogenada ( timina, adenina, citosina ou guanina) (CORDEIRO, 2003). Como a principal funo do DNA fazer a sntese de protenas (constituintes estruturais) que ocorre no ncleo das clulas, torna-se fundamental a descrio das funes destas protenas, so elas: estruturar a matria viva formando fibras dos tecidos, acelerar as reaes qumicas ocorridas (enzimas catalisadoras) e como elementos de defesa (anticorpos) (LABGEN-UFV, 2011). O RNA (cido ribonuclico) possui basicamente a mesma composio do DNA, um acar (ribose), um grupo fosfato e uma base nitrogenada (uracila, adenina, citosina ou guanina), ele uma molcula intercessora na sntese de protenas fazendo a intermediao entre o DNA e as protenas (ENQ-UFSC, 2011). Existem trs tipos principais de RNA que participam do processo da sntese protica e que se diferem em suas funes, so eles: o RNA ribossmico (RNAr), o qual forma a estrutura complexa que serve como stio para a sntese de protenas; o RNA transportador (RNAt), que a menor das trs principais molculas de RNA e que serve como um "adaptador" transportando seu aminocido especfico ao stio de sntese de protenas; o RNA mensageiro (RNAm), que transporta a informao gentica do DNA ao citosol, onde usado como molde para a sntese de protenas (CARDOSO et al., 2011). Em uma clula procaritica, tal como a das bactrias sem organelas internas ligadas na membrana, o DNA e o RNA so encontrados no citoplasma e em uma clula eucaritica como as presentes nos seres humanos que possuem organelas internas ligadas na membrana, o RNA pode ser encontrado no ncleo e no citoplasma, enquanto que o DNA somente no ncleo (ATHERLY et al. 1999; FREUDENRICH, 2010).

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2. Etapas para o isolamento de DNA Segundo Mazza e Bittencourt (2000), no procedimento de isolamento de DNA so utilizadas algumas etapas padres estabelecidas, que variam pouco e de acordo com os reagentes qumicos utilizados. A figura 1 representa esquematicamente as principais etapas para isolamento de DNA, tais como triturao mecnica, exposio a tratamento qumico seguido de trmico, homogeneizao, separao da fase orgnica e precipitao do DNA com lcool que so consideradas etapas padres, descritas abaixo.
Figura 1 Etapas do isolamento de DNA.

Fonte: BIOAGENCY, 2011

1) Triturao do material, onde sofrido um processo mecnico de macerao das amostras; 2) Adio de tampo de extrao e homogeneizao; 3) Banho trmico temperaturas e tempos estabelecidos em protocolo; 4) Agitao por centrifugao para isolamento de fases; 5) Adio de solvente orgnico para dissoluo da matria orgnica em soluo aquosa 6) Separao de resduos orgnicos por centrifugao 7) Repetio das etapas 5 e 6, onde quando necessrio so adicionados enzimas, como proteinase K, juntamente com o tempo adequado de reaes. Aps a etapa 7, o DNA ento precipitado por meio da adio de lcool, seco e diludo em gua para posterior armazenamento.

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3. Funes dos reagentes e etapas do isolamento de DNA

3.1 Triturao do material

A triturao ou macerao do material a ser utilizado um processo puramente mecnico, onde uma fora exercida a fim de deixar o material gentico o mais exposto possvel. Esta etapa depender muito da origem das amostras utilizadas, pois microorganismos cultivados em meio lquido ou placas de petri possuem paredes celulares que podem ser rompidas por sonicador, exigindo pouco ou nenhum esforo mecnico para seus rompimentos (VOET et al., 1999). Por outro lado, os materiais de origem vegetal necessitam de um esforo mecnico maior para que ocorra o rompimento celular, devido esta etapa ser a nica e fundamental para o rompimento. Independentemente da origem do material, todos necessitaro da etapa de lise celular para que o material gentico seja exposto ao tampo de extrao e o isolamento de DNA tenha sucesso. (BARICHELLO et al., 2010).

3.2

Tampo de extrao

A adio do tampo/extrator ou detergente serve para auxiliar quimicamente na ruptura das membranas celulares, fazendo com que os cidos nuclicos fiquem expostos em soluo para posterior desestabilizao hidrofbica, expondo as macromolculas na sua forma original (DANTAS-UFSC, 2011). Existem alguns tipos de detergentes normalmente utilizados e que so considerados extratores de DNA, tais como o SDS e o CTAB. Estes detergentes diferenciam-se principalmente nas suas composies qumicas e carga das molculas do material a ser isolado, sendo de suma importncia a escolha correta de acordo com o material a ser isolado (DANTAS-UFSC, 2011). Os extratores SDS e CTAB so antioxidantes do material gentico, tambm auxiliando na lise celular e sequestro de carboidratos livres, devido seu poder como detergentes surfactantes e separadores de cidos nuclicos que faz com que estes possam ser precipitados seletivamente (ROMANO et al., 1998). O SDS (duodecil sulfato de sdio) um detergente aninico desnaturante, tendo afinidade por ctions, possuindo assim capacidade de desestabilizar quimicamente esses ons (REZA et al., 2002). De maneira contrria, o CTAB (brometo de hexadeciltrimetilamnio) um detergente catinico, possuindo afinidade por nions e tambm os desestabilizando quimicamente (DOYLE & DOYLE, 1987). Ambos os tampes so compostos de TRIS + EDTA + NaCl + PVP + SDS/CTAB.

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- Componentes do tampo de extrao: O TRIS (tris hidroximetil aminometano) utilizado para condensao de aldedos e possui a funo de manter o pH do tampo constante. O EDTA (cido etilenodiamino tetra-actico) um agente quelante inibidor de enzimas e tem grande afinidade por ons metlicos tais como Mg+2 e Ca+2, os quais so cofatores para vrias enzimas ativas no interior das clulas, incluindo as nucleases que digerem as molculas de DNA. Uma vez que a clula se rompe, o envelope nuclear se apaga e o contedo nuclear entra em contato com o contedo celular, que rico em nucleases. Assim, a clula quebrada tratada com EDTA quelando os ons de modo que nucleases percam sua funo obtendo um bom rendimento de DNA. O NaCl (cloreto de sdio) um sal que fornece ons Na + para que as cargas negativas de fosfatos presentes no DNA sejam neutralizadas atravs de ligao inica, impedindo a repulso entre as molculas de DNA e permitindo que estas se unam e precipitem. O PVP (polyvinylpyrrodilone) um agente antioxidante que quando adicionado ao tampo reduz este efeito indesejvel, que possui relao aos compostos fenlicos, tais como taninos, quinonas e polifenis (DOYLE & DOYLE, 1987). Segundo Romano e Brasileiro (2003), as extraes a partir de materiais vegetais por exemplo, utiliza-se de ambos os tampes, porm a maioria dos protocolos descritos na literatura utilizam o protocolo CTAB padro com algumas modificaes, com o objetivo de resolver problemas especficos da espcie em estudo. Outros protocolos freqentemente empregados so variaes do descrito por Dellaporta e colaboradores (DELLAPORTA et al., 1983) onde esses mtodos se fundamentam na precipitao simultnea de protenas e polissacardeos na presena de SDS e altas concentraes de acetato de potssio. O mtodo mais utilizado com sucesso para diferentes espcies o baseado no uso do detergente CTAB (WEISING et al., 1995). Portanto partir destas definies pertinentes ao trabalho, deve-se ter em estabelecido algumas informaes sobre o material a ser isolado para que seja feita a escolha do detergente correto atravs de suas especificaes.

3.3

Banho trmico

Nesta etapa adiciona-se temperatura s amostras (j com o tampo e homogeneizadas), para que as reaes ocorram mais rapidamente e com maior interao qumica entre reagentes e material, ou seja, a temperatura age como um catalisador das reaes ocorridas, portanto acelerando-as. Outras funes importantes da temperatura no isolamento a solubilizao, homogeneizao da suspenso e a desnaturao de algumas protenas. Uma temperatura alta tambm possui a funo de inativar as enzimas que degradam o DNA (USP-CDCC, 2011).

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3.4

Solvente orgnico

O solvente adicionado ao material com a funo de solubilizar lipdeos, protenas e compostos fenlicos para que sejam removidos aps a centrifugao (SANTOS et al., 2002). Como o solvente possui peso molecular maior que o do material gentico e das protenas, ele precipita e desloca-se para baixo do material gentico, necessitando de uma melhor homogeneizao. Dentre os solventes orgnicos utilizados em isolamento encontra-se o CIA, que composto por clorofrmio e lcool isoamlico, sendo o clorofrmio responsvel pela dissoluo de lipdeos e o lcool isoamlico pela reduo da formao de espuma e garante a inibio da RNAse (DANTAS, 2011). Segundo Tsay & Olson (1991), outro solvente tambm utilizado o Fenol-clorofrmio mais conhecido como PCIA, composto por fenol, clorofrmio e lcool isoamlico, onde o fenol solubilizador de protenas, o clorofrmio solubilizador de lipdeos e o lcool isoamlico redutor da formao de espuma e inibidor da RNAse. Os solventes so utilizados vrias vezes durante o protocolo de isolamento, a fim de solubilizar cada vez mais matria orgnica e impurezas indesejadas ao processo, como as protenas, as quais acarretam problemas posteriores, tais como na amplificao de segmentos especficos de DNA, o PCR (FANG et al., 1992). Atualmente a utilizao do PCIA tem sido diminuda devido alta toxidade que os compostos fenlicos possuem, sendo substitudo pelo CIA, composto menos nocivo a sade humana e mais comum em laboratrios que possuem esse tipo de anlise (ABRO et al., 2005).

3.5

Agitaes

As agitaes presentes entre uma etapa e outra so necessrias para que todo o contedo seja exposto ao solvente (neste caso solubilizando as protenas e lipdeos encontrados na amostra) ou ao reagente utilizado na etapa (neste caso para que reaja com todo o meio), portanto homogeneza-se o material para que fique o mais exposto possvel. Nesta fase utiliza-se tambm agitadores mecnicos para obter uma melhor agitao (MAGALHES, 2008).

3.6

Centrifugao

A centrifugao tem a finalidade de separar as fases e materiais encontrados na amostra, tornando assim o contedo heterogneo, separando solvente de protenas e material orgnico da amostra, ficando os cidos nuclicos solubilizados na fase aquosa e sobrenadante da amostra (FANG et al., 1992).

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A rotao utilizada varia de acordo com o tipo de amostra e sua composio, girando em torno de 10000 a 14000 rpm, pois nesta faixa de rotao encontrada a melhor separao de fases requerida.

3.7

Tampo de extrao concentrado

Segundo Ferreira & Grattapaglia (1998), o CTAB concentrado utilizado quando o material possui grande quantidade de carboidratos, como por exemplo, sementes e folhas. O tampo concentrado possui a mesma funo do tampo com menor concentrao, porm tem um maior poder de limpeza da amostra devido sua alta concentrao.

3.8

Enzima para protenas (Proteinase K)

largamente utilizada devido a sua especificidade ampla e tem por objetivo digerir protenas indesejadas, eliminar contaminaes de preparaes de cidos nuclicos de amostras das reas da biologia molecular, tais como inativao de nucleases de DNA e RNA, mesmo na presena de produtos qumicos. uma enzima proveniente de extratos de fungos, possuindo atividades nas protenas nativas, e que estimulada por desnaturantes como a SDS e CTAB (SIGMA-ALDRICH, 2011; ZHOU et al., 1996). Portanto deve-se optar por enzimas quando se possui um alto ndice de protenas ou contaminaes na amostra. Uma soluo de proteinase K estvel em uma ampla faixa de pH (4,0-12,5, tima pH 8,0) e tambm estvel na faixa de temperatura de 25 a 65C durante o uso. Em pH 8,0 as solues so estveis por pelo menos 12 meses a 4C (SIGMA-ALDRICH, 2011).

3.9

Lavagens com lcoois gelados

As lavagens com lcoois determinadas concentraes servem para uma melhor purificao do DNA e tambm para sua visualizao atravs da sua desidratao, possibilitando um posterior agrupamento de suas molculas, tornando o DNA insolvel em lcool e condensando-o (BARICHELLO et al, 2010). Os lcoois mais utilizados so o etanol, etilenoglicol e polietilenoglicol, e as concentraes utilizadas variam de amostra para amostra. Uma menor concentrao, em torno de aproximadamente 70% deve-se a precipitao e nebulizao do DNA, e uma maior concentrao, em torno de 96% para uma melhor limpeza e secagem da amostra para posterior dissoluo. Outra

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observao importante nesta etapa a temperatura do lcool, pois quanto menor sua temperatura mais insolvel o DNA se torna (SANTOS et al., 2002).

3.10

Dissoluo

Como o DNA solvel em gua, ele solubilizado em gua mili-Q e armazenado em freezer para posterior utilizao. Pode tambm ser solubilizado em tampo TE quando o meio apresenta mudanas de pH, o TE composto por Tris-EDTA onde tem a funo de degradar o RNA, fazendo com que reste somente o DNA (ABRO et al., 2005).

3.11

Eletroforese

A eletroforese um meio de se analisar a qualidade obtida a partir do isolamento de DNA e sendo assim, d suporte a vrias tcnicas como: clonagem e subclogagem de fragmentos gnicos, construo de bibliotecas genmicas e de DNA complementar, tcnicas baseadas na amplificao via reao de polimerase em cadeia (PCR), no controle de procedimentos de extrao de DNA e RNA e em estudos genticos de caracterizao e mapeamento gentico (CORDEIRO, 2003). A etapa de eletroforese se d pela migrao de colides sob a influncia de um campo eltrico. Seu princpio simples e se baseia em separao de molculas por suas cargas eltricas: molculas de carga negativa migram para o plo positivo e, molculas com carga positiva migram para o plo negativo e, tambm, por seus pesos moleculares. A eletroforese pode ser feita a partir de um tecido e da migrao dos componentes e suas cargas num gel (amido, agarose, acrilamida) submetido a uma corrente eltrica contnua (que se diferencia significativamente com a mudana de marcador), onde o sentido e a velocidade de migrao so determinados pelo tamanho e carga das protenas (NODARI et al., 2008).

4. Consideraes finais

Este trabalho teve como intuito definir atravs de um protocolo base utilizvel, as funes dos reagentes qumicos e das etapas realizadas na matria a ser analisada durante o isolamento de DNA. Pois em um processo de anlise molecular torna-se fundamental as claras especificaes destes quesitos para que se leve em considerao as individualidades de cada etapa e de cada material, desde a estrutura e equipamentos disponveis at o aperfeioamento de protocolo e escolha de reagentes qumicos que se adequem amostra devido suas faixas de atuao, a fim de se obter uma pesquisa consistente e resultados confiveis.

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Abstract The extraction of nucleic acids (DNA and RNA) is the first step to achieving most of the methodologies of molecular biology. DNA can be obtained from various tissues and cells, so there is a infinity of protocols to perform these procedures. The choice of DNA extraction protocol will depend on various factors such as type of tissue being used, types of chemical reagents, equipment, facilities, purity and integrity necessary for the application in which DNA is used (PCR, sequencing, gene cloning, etc.) (Bartlett, 2003). The aim of this paper is to present the functions of chemical reagents involved in the process of DNA isolation, as well as to describe the steps taken during this process, thus assisting in choosing the most appropriate protocol according to the objective. Keywords: DNA; chemical functions; isolation; protocols; reagents. Referncias

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VIII Semana de Tecnologia em Alimentos

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