NORMA TCNICA

L5.303
Dez/2005 23 PGINAS

Fitoplncton de gua doce: mtodos qualitativo e quantitativo: mtodo de ensaio

Companhia Ambiental do Estado de So Paulo Avenida Professor Frederico Hermann Jr., 345 Alto de Pinheiros CEP 05459-900 So Paulo SP Tel.: (11) 3133 3000 Fax.: (11) 3133 3402 http: // w w w . c e t e s b . s p . g o v . b r

FITOPLNCTON DE GUA DOCE. MTODOS QUALITATIVO E QUANTITATIVO Mtodo de Ensaio

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Sumrio

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Introduo .................................................................................................................................. 1. Objetivos .............................................................................................................................. 2. Documentos Complementares ............................................................................................... 3. Definies ............................................................................................................................. 4. Equipamentos e Reagentes .................................................................................................... 5. Execuo do Ensaio .............................................................................................................. 6. Expresso dos Resultados ..................................................................................................... 7. Controle Laboratorial e Estocagem ....................................................................................... 8. Equipamentos de Coleta e Anlise do Fitoplncton de gua Doce ........................................ 9. Modelo de Ficha de Anlise do Fitoplncton de gua Doce ................................................. 10. Exemplo de Boletim Tcnico ............................................................................................... 11. Referncias Bibliogrficas ....................................................................................................

Introduo Fitoplncton a comunidade de organismos microscpicos fotossintetizantes que flutuam livremente nas diversas camadas dos corpos dgua e que constituda principalmente por algas: clorofceas, diatomceas, euglenofceas, crisofceas, dinofceas, xantofceas e tambm cianobactrias (cianofceas). Algas so organismos vegetais unicelulares ou multicelulares que fazem parte da comunidade produtora primria de um ecossistema aqutico, podendo constituir a base da cadeia alimentar desse ambiente. Utilizando a energia solar, transformam nutrientes minerais em matria orgnica, fenmeno conhecido como fotossntese. Em geral, guas limpas e pobres em nutrientes apresentam uma comunidade fitoplanctnica pouco abundante, com alta diversidade, enquanto que guas ricas em nutrientes apresentam grande nmero de organismos, pertencentes a poucas espcies. Alm da quantidade de nutrientes da gua, outros fatores influenciam a composio e distribuio espacial e temporal da comunidade fitoplanctnica, tais como: correntes, estratificao trmica, circulao, hora do dia, profundidade de penetrao da luz, intensidade luminosa, temperatura e presena de substncias txicas. Em mananciais que recebem despejos domsticos, industriais ou de fontes agrcolas difusas, ocorrem altas concentraes de nutrientes, principalmente fsforo e nitrognio. Este fenmeno de desequilbrio ecolgico, conhecido como eutrofizao ou enriquecimento das guas, favorece a proliferao rpida de algas e cianobactrias, fato que pode acarretar vrios problemas no ambiente aqutico, tais como:

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flutuaes extremas da concentrao de oxignio dissolvido e pH; dificuldade de penetrao de luz na coluna dgua pelo acmulo de algas na superfcie, prejudicando o desenvolvimento de outras formas de vida; mudanas de colorao; presena de odores e sabores desagradveis e toxicidade gua. Estas situaes so indesejveis, principalmente em mananciais utilizados para abastecimento pblico e recreao, pois dificultam e oneram o processo de tratamento de gua. Alguns organismos fitoplanctnicos, principalmente do grupo das diatomceas, podem provocar entupimento de filtros com conseqentes problemas em estaes de tratamento. Certas espcies de algas podem ainda, contribuir para acelerar a corroso de concreto submerso, estruturas de metal, tanto diretamente nos locais onde crescem aderidas, quanto por alteraes fsicas e/ou qumicas da gua. O exame dos componentes do fitoplncton, sua identificao e quantificao so de grande interesse para avaliar as condies ecolgicas de um ecossistema aqutico, prevenir ou controlar situaes indesejveis ou incompatveis com a finalidade de utilizao de um determinado manancial e, inclusive, para o desenvolvimento de culturas de interesse econmico, como a piscicultura. O grupo das cianofceas ou cianobactrias o mais problemtico do ponto de vista sanitrio. So organismos procariotos, ou seja, com caractersticas de bactrias, porm com um sistema fotossintetizante semelhante ao das algas (vegetais), da a dupla denominao. Este grupo tem capacidade de crescimento nos mais diversos ambientes, porm ocorre preferencialmente em pH variando entre 6,0 e 9,0, temperatura entre 15 - 30C e alta concentrao de nutrientes, principalmente nitrognio e fsforo. Todas as cianobactrias so consideradas potencialmente txicas, embora algumas espcies ainda no tenham toxicidade comprovada. Existem relatos na literatura de casos de intoxicao, inclusive para o homem, causados pela ingesto de guas contendo algas txicas e/ou toxinas liberadas pelas suas floraes. As toxinas de cianobactrias so conhecidas como cianotoxinas, que por seu efeito podem ser classificadas como neuro ou hepatotxicas. Os gneros Anabaena, Aphanizomenon, Oscillatoria, Cylindrospermopsis so produtores potenciais de neurotoxinas, que podem causar insuficincia respiratria e levar morte de animais entre 2 e 30 minutos. As hepatotoxinas apresentam uma ao mais lenta, causando o tipo mais comum de intoxicao e provocando hepatoenterites. Alguns gneros produtores dessas toxinas so Microcystis, Anabaena, Planktothrix , Oscillatoria, Radiocystis e Cylindrospermopsis. Alm do efeito agudo essas toxinas tambm podem causar efeitos crnicos como por exemplo, o desenvolvimento de tumores. O controle das cianobactrias em mananciais de abastecimento importante devido ao seu potencial txico. A Portaria n 518 do Ministrio da Sade (BRASIL, 2004), relativa s Normas de Qualidade para gua de Consumo Humano (Potabilidade), estabelece que os responsveis por estaes de tratamento de gua para abastecimento pblico devem realizar monitoramento de cianobactrias e controle de cianotoxinas nos mananciais. Tambm a Resoluo CONAMA n 357 (BRASIL, 2005) contempla o monitoramento destes organismos. 1. Objetivos Esta Norma descreve os principais mtodos qualitativos e quantitativos de preservao, concentrao e contagem de organismos do fitoplncton de gua doce.
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Os estudos de fitoplncton de gua doce tm por finalidade: a) Avaliar a estrutura e funcionamento dos ecossistemas aquticos; b) Subsidiar aes de controle nas estaes de tratamento de gua para abastecimento pblico em relao a alteraes de cor, turbidez, odores indesejveis, partculas visveis na gua, obstruo de filtros e aplicao de algicidas. Determinar a eficincia de vrios estgios do tratamento e auxiliar na determinao da dosagem de cloro a ser adicionada gua; c) Identificar a origem de uma fonte ou efluente misturado na gua; d) Subsidiar a interpretao de anlises qumicas, por exemplo, correlacionando a presena ou ausncia de certas espcies com a deficincia ou excesso de determinados elementos no ambiente aqutico; e) Detectar a presena de espcies potencialmente txicas em guas de abastecimento ou recreacionais, que possam causar impacto na sade humana, e fornecer subsdios para a tomada de decises em programas de monitoramento e gerenciamento de reservatrios para minimizar seus impactos; f) Indicar a natureza, extenso e efeitos biolgicos da poluio; g) Detectar e acompanhar o processo de autodepurao em corpos dgua e o desenvolvimento e sucesso de formas fitoplanctnicas em processos de tratamento de esgotos domsticos de lagoas de estabilizao; h) Explicar os mecanismos de ao dos fatores biolgicos de guas residuais ou avaliar sua efetividade; i) Documentar a curto e longo prazo a variabilidade na qualidade da gua, como conseqncia de mudanas naturais e/ou provocadas pelo homem, especialmente por despejos ricos em nutrientes ou contaminados por metais; j) Fornecer dados sobre o estado trfico de ecossistemas aquticos; k) Acompanhar o desenvolvimento de culturas ou bioensaios com algas; e l) Avaliar a eficincia de aes de manejo para melhoria e recuperao de corpos dgua. 2. Documentos Complementares Norma Tcnica CETESB L5.313 - Coleta de fitoplncton marinho e de gua doce: procedimento, (CETESB, 1991); Guia de coleta e preservao de amostras de gua . AGUDO, E. G. (Coord.). So Paulo: CETESB, 1988; Portaria n 518 de 03/2004. Ministrio da Sade. BRASIL. Dirio Oficial [da] Repblica Federativa do Brasil, Poder Executivo, Braslia, DF, 26 mar. 2004. Seo 1, p. 266-270; Resoluo CONAMA n 357 de 03/2005. Ministrio do Meio Ambiente. BRASIL. Dirio Oficial [da] Repblica Federativa do Brasil, Poder Executivo, Braslia, DF, 17 mar. 2005. Seo 1, p. 58-63; Trabalhos tcnicos sobre identificao do fitoplncton de gua doce (item 11.1).

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3. Definies 3.1 - Auttrofo Ser vivo capaz de produzir seu prprio alimento ou matria orgnica, a partir de material inorgnico e energia luminosa ou qumica. 3.2 - Biomassa Quantidade de material vivo que pode ser expressa em peso, volume ou rea. 3.3 - Cianotoxinas Toxinas produzidas por cianobactrias que causam efeitos adversos sade do homem e de alguns animais. 3.4 - Ecossistema Unidade de natureza ativa que combina comunidades biticas e fatores abiticos com os quais interagem. Os ecossistemas apresentam grande variabilidade em relao s suas dimenses e caractersticas. 3.5 - Eutrofizao Aumento da concentrao de nutrientes, principalmente nitrognio e fsforo, tendo como conseqncia o aumento da produtividade do ambiente aqutico. 3.6 - Fitoplncton Comunidade vegetal microscpica que vive em suspenso nas diversas camadas de gua onde, graas presena de energia luminosa, promove o processo fotossinttico, principal responsvel pela base da cadeia alimentar no meio aqutico. 3.7 - Florao Crescimento intenso de algas potencialmente txicas ou no, geralmente causado por aumento de nutrientes, como nitratos e fosfatos. Essas altas densidades de organismos podem ocorrer em curtos perodos e durante todo o ano. 3.7.1 - Floraes Txicas ou Floraes de Algas Nocivas (FAN) Causam riscos para o abastecimento pblico ou balneabilidade. Esses florescimentos tambm podem matar os peixes e tornar os moluscos txicos ao consumo humano, alm de causar morte em animais que utilizam esta gua para dessedentao. 3.8 - Frstula Parede celular dura, silicosa, das diatomceas, constituda por duas partes que se assemelham s partes superior e inferior de uma caixa perfeitamente ajustada. Essas partes so chamadas de valvas ou epiteca e hipoteca.

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3.9 - Fotossntese Processo de converso de dixido de carbono para carbono orgnico (carbohidrato) que ocorre ao nvel dos cloroplastos, pela ao da energia luminosa absorvida pelos pigmentos fotossintetizantes, especialmente clorofila.

3.10 - Hetertrofo Organismo que no produz seu prprio alimento e retira sua nutrio consumindo as complexas molculas orgnicas produzidas por plantas ou presentes em outros organismos, vivos ou em decomposio.

3.11 - UPA (Unidade Padro de rea) Unidade Padro de rea, aceita internacionalmente para quantificar o plncton em guas de abastecimento, com valor de 400m2. 4. Equipamentos e Reagentes 4.1 - Equipamentos para amostragem: 4.1.1 - Garrafa de van Dorn (figura 1) 4.1.2 - Rede de plncton (figura 2) Observao: descries e informaes sobre aparelhos de amostragem podem ser encontrados na Norma Tcnica CETESB L5.313 (CETESB, 1991) e em Agudo (1988). 4.2 - Reagentes: 4.2.1 - Formalina - Formaldeido 40% neutralizado com tetraborato de sdio (20g/L) ou bicarbonato de sdio (5g/L), chegando a uma concentrao final na amostra de 2%; 4.2.2 - Detergente comercial neutro transparente; 4.2.3 - Soluo Transeau: 6 partes de gua, 3 partes de lcool etlico 95GL e 1 parte de formalina; 4.2.4 - Glutaraldedo neutralizado com tetraborato de sdio (20g/L) ou bicarbonato de sdio (5g/L), em concentrao final de 1 a 2%; 4.2.5 - Soluo de lugol: dissolver 10g de iodo puro, 20g de iodeto de potssio, 20mL de cido actico glacial em 200mL de gua destilada. Esta soluo deve ser armazenada em frasco escuro. Recomenda-se de 0,3 a 1,0 mL/100mL dependendo da concentrao de organismos; 4.2.6 - Hidrxido de Potssio 0,03M: dissolver 168g de Hidrxido de Potssio em 1 litro de gua destilada; 4.2.7 - Tinta nanquim.
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4.3 - Equipamentos e Instrumentos para execuo da anlise: 4.3.1 - Centrfuga; 4.3.2 - Balana com preciso de 0,1g; 4.3.3 - Provetas graduadas; 4.3.4 - Pipetas graduadas; 4.3.5 - Contador manual de uma ou de vrias teclas; 4.3.6 - Retculo de Whipple (Figura 3); 4.3.7 - Microscpio binocular comum, com ocular de aumento de 10 ou 12,5X e objetivas com aumento de 10, 20, 40, 63 e 100X, retculo de Whipple calibrado. Contraste de fase e epifluorescncia so recomendados para auxiliar na anlise; 4.3.8 - Microscpio invertido (invertoscpio), com ocular de aumento de 10X ou 12,5X e objetivas com aumento de 10, 20, e 40X (63X e 100X so opcionais), retculo de Whipple calibrado. Contraste de fase e epifluorescncia so recomendados para auxiliar na anlise; 4.3.9 - Cmaras de Utermhl (tambm chamadas de cmaras de invertoscpio), com capacidade de 2, 5, 10, 25, 50 ou 100mL (Figura 4); 4.3.10 - Cmaras de Sedgwick-Rafter com capacidade de 1mL (S-R). Estas cmaras apresentam 20mm de largura por 50mm de comprimento e 1mm de profundidade (Figura 5); 4.3.11 - Lmina micromtrica; 4.3.12 - Lminas e lamnulas comuns; 4.3.13 - Pipetas Pasteur; 4.3.14 - Cmara mida: recipiente fechado, umidificado, utilizado para manter a umidade das cmaras. 5. Execuo do Ensaio 5.1 - Princpio do mtodo O mtodo a ser utilizado para anlise do fitoplncton de gua doce depende do objetivo que se pretende alcanar. Algumas anlises tm o objetivo de determinar a composio da comunidade fitoplanctnica e avaliar suas concentraes relativas. Em outros casos, suficiente a identificao da espcie dominante que pode estar causando problemas, como por exemplo produo de sabor e/ou odor desagradveis ou obstruo de filtros. Nestas situaes, uma avaliao qualitativa suficiente. Em estudos de monitoramento, diagnstico ou ecolgicos, quando se deseja comparar locais ou diferentes pocas do ano, importante uma anlise quantitativa.
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Informaes sobre a temperatura da gua, turbidez, pH, oxignio dissolvido e nutrientes so valiosas e podem facilitar a interpretao dos resultados sobre a comunidade fitoplanctnica propriamente dita. 5.2 - Procedimento 5.2.1 - Preservao da amostra Para anlise quantitativa necessrio que a amostra seja preservada. A amostra poder ser preservada com formalina, lugol, soluo transeau ou glutaraldeido. Para a identificao de determinados grupos de cianobactrias e flagelados, necessria a observao do material antes da preservao, para verificao de movimento e de estruturas s visveis no organismo vivo. Havendo necessidade de observao dos organismos vivos, a amostra deve ser resfriada no transporte do local de coleta ao laboratrio. No quadro abaixo esto discriminadas as vantagens e desvantagens de cada conservante.
TIPO LUGOL VANTAGENS Preservao de flagelos e aumento do peso especfico das clulas, facilitando a sedimentao. Pode ser estocado por vrios anos e no muda a colorao das algas. Mantm as caractersticas das clulas como flagelos e plastos. No provoca alteraes nas clulas e pode ser utilizado em epifluorescncia. DESVANTAGENS Dissolve frstulas de diatomceas mais delicadas e escamas de silicoflagelados. Distorce a forma da clula de flagelados nus, provoca perda de flagelos, toxicidade sade humana. Grande volume utilizado. altamente txico.

FORMOL TRANSEAU GLUTARALDEDO

5.2.2 - Cuidados na preparao da amostra Para a preparao da amostra necessrio que se realizem os seguintes procedimentos: 5.2.2.1 - Deixar a amostra em temperatura ambiente. Se a amostra estiver refrigerada e for colocada diretamente nas cmaras de contagem (Sedgwick-Rafter e Utermhl), bolhas de ar iro se desenvolver prejudicando a sedimentao. 5.2.2.2 - Homogeneizar a amostra vrias vezes para promover a distribuio uniforme. 5.2.2.3 - O local para a preparao e sedimentao dos organismos, nas cmaras de contagem, dever apresentar superfcie plana e estar abrigado de luz e movimentos. Com a finalidade de realizar a avaliao quantitativa, a anlise de amostras de fitoplncton de gua doce requer com grande freqncia, que os organismos nelas presentes sejam concentrados. Vrias tcnicas de concentrao foram desenvolvidas, todas elas apresentando vantagens e desvantagens, e cada qual deve ser aplicada de acordo com o objetivo do estudo. Os mtodos de concentrao mais utilizados so o de centrifugao e o de sedimentao. importante considerar que para cada etapa deste procedimento, fatores de converso devero ser calculados. 5.2.3 - Concentrao das amostras por centrifugao Este mtodo d uma resposta mais rpida porm pode causar perda de organismos, alterao de seu aspecto e rompimento de clulas. O volume a ser centrifugado ir depender da concentrao das algas na
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amostra; se a concentrao final para a anlise for muito elevada, a contagem ser mais trabalhosa e demorada. Se em funo da capacidade da centrfuga, houver necessidade de dividir a amostra em dois volumes, procede-se da seguinte forma: para 100mL, por exemplo, aps a centrifugao de cada um dos dois tubos de 50mL referentes mesma amostra, so desprezados 45mL do sobrenadante. Homogeneizam-se os 5mL restantes de um dos tubos e verte-se ao outro, obtendo-se desta forma, 10mL de amostra concentrada 10 vezes. As amostras devem ser centrifugadas a 2500 rpm durante 20 minutos. A anlise do material centrifugado pode ser feita em cmaras de Sedgwick-Rafter ou, utilizando-se uma micropipeta e adicionando uma gota de volume definido, em lmina normal de microscpio com lamnula selada. Este ltimo mtodo recomendado apenas na ausncia dos demais, uma vez que devido ao pequeno volume utilizado pode ocorrer perda de material. Observao 1: Para amostras provenientes de ambientes que apresentam grande quantidade de algas, como por exemplo lagoas de estabilizao, no necessrio que se concentre o material. Observao 2: Para rios ou corpos dgua que apresentem muito material em suspenso necessrio diluir a amostra e, se a concentrao fitoplanctnica for baixa, analisar vrias subamostras e proceder aos clculos correspondentes. 5.2.4 - Concentrao das amostras por sedimentao Outro mtodo de concentrao de amostra o de sedimentao de organismos em cmaras de Utermhl, nas quais a amostra preservada colocada e levada a uma cmara mida, onde permanece durante 12 horas ou mais. Alguns autores recomendam 2 horas de repouso da amostra para cada centmetro da coluna, enquanto outros sugerem de 3 a 4 horas por centmetro. Quando a amostra estiver preservada com formalina, o tempo necessrio para sedimentao ser o dobro. Dependendo da quantidade de algas presentes na amostra, utilizam-se cmaras de volumes diferentes, sendo as mais comumente empregadas de 2,5 a 10mL (Figura 4) podendo variar at 50 ou 100mL. Para a preparao de uma cmara de Utermhl deve-se proceder da seguinte forma: 5.2.4.1 - Colocar a cmara em posio plana e horizontal; 5.2.4.2 - Homogeneizar a amostra preservada e retirar, com auxlio de uma pipeta, uma subamostra em quantidade suficiente para preencher o volume da cmara de Utermhl; 5.2.4.3 - Com a lmina de vidro espesso, recobrir cuidadosamente a cmara, evitando a formao de bolhas; 5.2.4.4 - Levar a subamostra preparada a uma cmara mida onde deve permanecer durante o tempo necessrio para sedimentao dos organismos. Se no houver disponibilidade de um microscpio invertido ou centrfuga, tambm possvel sedimentar a amostra em proveta e desprezar o sobrenadante. Observao 3: Todo o material utilizado, principalmente as cmaras de Sedgwick-Rafter e Utermhl deve estar limpo, isento de poeira ou gordura.

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5.2.5 - Procedimento de anlise Dependendo da quantidade de organismos, a subamostra ser analisada integralmente ou parcialmente, por meio da contagem de transectos ou campos aleatrios, com o auxlio do retculo de Whipple calibrado. Para auxiliar na visualizao de estruturas hialinas, como flagelos por exemplo, pode ser utilizado o contraste de fase e para distinguir as cianofceas de pequenas dimenses de bactrias que no devem ser quantificadas na amostra, pode-se usar epifluorescncia. O uso de nanquim para visualizao de bainhas, principalmente para as cianofceas, tambm recomendado. 5.2.6 - Calibrao do retculo de Whipple O microscpio binocular comum e o invertoscpio, ao serem utilizados para contagem de microrganismos, devem estar equipados com retculo de Whipple na ocular. O microscpio dever ser previamente calibrado, com o auxlio de um micrmetro (rgua milimtrica), para a objetiva e a ocular que sero utilizadas durante o exame. Para se realizar a calibrao, o micrmetro colocado na platina do microscpio e superposto a um dos lados do retculo de Whipple. Procura-se um ponto de correspondncia entre as graduaes do retculo e do micrmetro, a fim de que seja medido o lado do retculo. Encontrado o ponto de correspondncia, pode-se calcular o valor da menor diviso do retculo e a rea do mesmo. Exemplo: Em um microscpio binocular comum, usando-se objetiva com aumento de 20X e ocular com aumento de 10X, superpondo-se o retculo de Whipple e o micrmetro, verificou-se que houve correspondncia de escalas no quinto quadrado do retculo e a medida no micrmetro foi 190m. Assim, dez quadrados que compem o lado do retculo de Whipple eqivalem a 380m, um quadrado a 38m e a menor subdiviso do retculo, a 7,6m. 5.3 - Clculo para contagem de organismos e clulas 5.3.1 - Contagem de organismos Os organismos fitoplanctnicos podem ser unicelulares, multicelulares, filamentosos ou coloniais. Assim, pela variedade de formas e configuraes, a contagem pode ser um problema para o analista. Por exemplo: um indivduo colonial com 4 clulas, como Scenedesmus, pode ser contado como um organismo. J para as diatomceas, em uma cadeia de clulas ou colnia, conta-se cada clula como um organismo. Por exemplo: uma colnia de Asterionella conta-se cada clula como um organismo pois os indivduos esto unidos apenas por espinhos ou por mucilagem. No uso do retculo para a contagem de organismos, necessrio estabelecer critrios: por exemplo, quando os indivduos no esto totalmente dentro da grade, como mostrado na figura abaixo, pode-se estabelecer que se o organismo estiver com mais de 50% da sua rea fora do retculo, este no dever ser contado e se estiver com mais de 50% da sua rea dentro, dever ser contado.

Contar este organismo

No contar este organismo

Observao 4: O aumento ideal para a contagem em microscpio invertido de 400X.

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Dependendo da concentrao de organismos, a subamostra ser analisada integralmente ou parcialmente por meio da contagem de transectos ou campos aleatrios, com o auxlio do retculo de Whipple calibrado.
Transecto s Campo

5.3.2 - Contagem de clulas de cianofceas (cianobactrias) Para atender Portaria n 518 (BRASIL, 2004) e Resoluo CONAMA n 357 (BRASIL, 2005), as estaes de tratamento de gua tero que providenciar a contagem de clulas de cianofceas para o manancial de abastecimento. Esta metodologia foi desenvolvida com base nas orientaes descritas em Lawton. (1999). O grupo das cianofceas possui formas filamentosas, coloniais e solitrias. Para a contagem de clulas das colnias e filamentos, podem ser utilizados os seguintes mtodos: a) Formas coloniais - As clulas de cianofceas coloniais so agregadas por bainhas ou mucilagens. Para facilitar a contagem de clulas, quando estes organismos so dominantes, por exemplo, em floraes, recomendvel dissolver estas mucilagens e desmembrar as colnias em clulas soltas. Uma das metodologias de dissoluo da mucilagem a digesto a quente com hidrxido de potssio (KOH) a uma molaridade de 0,03M: coloca-se o hidrxido de potssio na amostra na proporo 1:1. Mantm-se as amostras em estufa a 80C-90C por 15 minutos. Aps a digesto, a amostra pode ser preparada em cmaras de Sedgwick-Rafter ou em cmaras de Utermhl, para quantificao. Com este mtodo no possvel identificar os organismos. Outra metodologia consiste em utilizar o retculo de Whipple como auxiliar na contagem de clulas de formas coloniais. Pode-se contar quantas clulas ocupam cada quadrado do retculo, calcular a mdia de 10-30 quadrados e multiplicar esse nmero pelo nmero de quadrados ocupados pela colnia (vide esquema a seguir). b) Formas filamentosas - As cianofceas filamentosas so organizadas por clulas e conectadas por parede celular, formando os filamentos que, envoltos pela bainha, so denominados tricomas. As clulas podem ser cilndricas, quadrticas, mais longas que largas, mais largas que longas ou esfricas, dependendo da ordem, famlia ou gnero a que pertenam. A contagem de clulas de cianofceas filamentosas pode ser feita de duas maneiras. Em caso de amostras com filamentos de comprimento uniforme, contam-se as clulas dos primeiros trinta filamentos e calcula-se a mdia de clulas por filamento para cada espcie, valor que posteriormente ser multiplicado pelo nmero de filamentos contados. No caso de amostras com filamentos de comprimento muito varivel, pode-se contar o nmero de clulas por quadrado do retculo e multiplicar pelo nmero de retculos que compem os filamentos. c) Amostras mistas com formas coloniais e filamentosas - Em amostras com colnias e filamentos nas quais no seja possvel a dissoluo da mucilagem, pode-se utilizar o retculo de Whipple. Caso as
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colnias sejam muito densas, e levando-se em conta que estas podem possuir vrias camadas de clulas, pode-se multiplicar o nmero de clulas contado em cada quadrado do retculo por 2, ou pelo nmero de camadas existentes, para obter uma estimativa mais precisa. Quanto s filamentosas, caso no seja possvel a visualizao das clulas em aumento de 40X, pode ser medido o comprimento do tricoma e, com auxlio de bibliografia especializada, verificar o comprimento celular e assim estimar o nmero de clulas por tricoma.

Colnia Filamento

Retculo de Whipple 5.3.3 - Clculo para contagem de organismos em cmara de Sedgwick-Rafter A contagem de organismos de uma faixa horizontal corresponder contagem dos organismos contidos no retngulo cuja largura ser delimitada pelo retculo de Whipple (que igual a 380m, ou 0,038cm, no exemplo citado no item 5.2.6) e o comprimento ser o da prpria cmara (5cm). A rea desse retngulo ser igual a 0,19cm2. Como a rea da cmara de Sedgwick-Rafter de 10cm2 e a rea examinada de 0,19cm2, dividindo-se a primeira pela segunda, obter-se- o fator de contagem para esse microscpio. F=A/a Onde: F = fator de contagem A = rea da cmara a = rea de faixa horizontal Exemplo: F = 10/0,19 = 52,63 Para a contagem de organismos numa faixa vertical, utiliza-se o mesmo raciocnio. Neste caso, o fator de contagem obtido da seguinte forma:

F=A/a Onde: a = rea da faixa vertical

Exemplo: F = 10/2 x 0,038 = 131,58

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Multiplicando-se o nmero de clulas ou organismos de um mesmo gnero ou espcie encontrados em uma faixa da cmara, pelo fator de contagem, obter-se- o nmero de clulas ou organismos deste gnero ou espcie contidas em 1mL da amostra preservada com lugol. Se a amostra foi concentrada 10 vezes, o fator de contagem ser dividido por 10 antes de se calcular o nmero de organismos por mL. O fator de contagem de organismos em 1 ou mais campos obtido dividindo-se a rea da cmara pela rea total dos campos delimitados pelo retculo de Whipple. Assim, por exemplo, para 10 campos, o fator ser:

F = A/10a

Onde: a = rea do retculo de Whipple Exemplo: F = 10/10 x (0,038)2 = 692,52 Quando se tem uma densidade muito elevada de organismos por campo (10 ou mais), a contagem por campos aleatrios, utilizando-se uma rea menor, mais indicada do que por transectos, que demanda maior tempo e esforo. O nmero de campos ir depender da densidade da amostra e da acuracidade desejada. O nmero de organismos/mL ou clulas/mL calculado multiplicando-se o nmero de unidades contadas pelo fator. Quando a amostra fixada com formol 2%, este representa 5% do volume total da amostra, e nesse caso, o fator deve ser dividido por 0,95.

5.3.4 - Clculo dos organismos em cmara de Utermhl Em microscpio invertido, pode-se fazer a contagem da cmara por transectos, correspondentes ao dimetro da cmara e multiplicar pelo fator de concentrao, obtendo-se o nmero de organismos. A determinao do fator de concentrao feita dividindo-se a rea da cmara pela rea total dos transectos lidos. Exemplo: Um invertoscpio com objetiva de 40X e ocular de 10X, equipado com retculo de Whipple que mede 192m de lado. A rea interna de uma cmara de invertoscpio corresponde de um crculo cujo dimetro interno igual a 2,6cm.

Portanto: A= R2 Onde: A= rea da cmara de Utermhl R= raio da cmara de Utermhl

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= 3,1416 Exemplo: A= 3,1416 x (1,3)2= 5,3093cm2 O transecto ter 0,0192cm de largura (lado do retculo de Whipple) por 2,6cm de comprimento (dimetro da cmara). Assim: F=
A / a' ' v

A = rea do transecto = 0,0192 x 2,6 = 0,0499cm2 a'' = rea de dois transectos = 0,0998cm2 Em uma cmara com volume de 2mL teremos: F=
A / a' ' 5,3093 / 0,0998 = = 26,5997= 26,60 v 2

Multiplicando-se o fator assim obtido pelo nmero de organismos ou clulas encontrados em dois transectos, ter-se- o nmero de organismos ou clulas por mL de amostra preservada com lugol. A localizao de um transecto na cmara para a contagem de transectos feita pelo retculo de Whipple, superpondo-o a borda da cmara. A partir deste ponto, inicia-se o exame at que o retculo atinja o outro lado da cmara. Quando a amostra preservada com formol 2%, este passa a representar 5% do volume total da amostra. Neste caso, para o clculo do fator, deve-se subtrair 5% do volume da cmara. 5.3.5 - Estimativas de biomassa a) Clculo de UPA Em exames de gua para abastecimento, alm da contagem e identificao, pode ser calculada a rea de cada organismo, tendo sido adotada para isso uma unidade padro de rea (UPA), cujo valor 4002. Utiliza-se um fator de correo para o retculo de Whipple do microscpio, para a unidade padro 4002. Se o quadrado menor do retculo de Whipple medisse 20 de lado, sua rea seria exatamente a de 1UPA. Como difcil adaptar o microscpio de tal forma que a rea do quadrado menor seja de 1UPA, calcula-se o fator de correo da seguinte maneira: para um retculo que possua 380 de lado, o quadrado menor ter 7,60 de lado. A rea deste quadrado menor ser de 57,762. Dividindo-se 4002 por 57,762 verifica-se que a rea deste quadrado 6,93 vezes menor que 1UPA, portanto 6,93 ser o fator de correo. Durante o exame, cada alga superposta aos quadrados pequenos do retculo de Whipple, anota-se o nmero de quadrados que ela ocupa, supondo que cada um eqivale a 1UPA. Este nmero suposto de UPA est superestimado pois na realidade, cada quadrado tem uma rea 6,93 vezes menor que 1UPA. Dividindo-se o nmero de quadrados ocupados por uma alga, por 6,93, tem-se o nmero de UPA que ela realmente ocupa. b) Clculo de biovolume Em estudos ecolgicos e tambm para atendimento Portaria n 518/2004 do Ministrio da Sade (BRASIL, 2004) e Resoluo CONAMA n 357 (BRASIL, 2005), a estimativa de biomassa mais aceita o biovolume.
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No clculo do biovolume celular, contam-se as clulas e o resultado multiplicado pelo volume celular mdio de cada espcie. O volume mdio determinado com base na figura geomtrica mais prxima, por exemplo, esferas para clulas esfricas e cilindros para filamentos. Dependendo da variabilidade, 10 a 30 clulas devem ser medidas. Exemplo: Ao se medirem 20 clulas de Microcystis, foi estimado um dimetro mdio de 5m. Assumindo que a forma da clula aproxima-se de uma esfera, cujo volume 4/3 r3 = 65,4m3, ao se quantificar 1 milho de clulas por mL, o biovolume ser 65,4 x 106m 3 /mL. 5.4 - Estimativa do erro na contagem O objetivo da contagem dos organismos fitoplanctnicos assegurar que o nmero quantificado represente o mais prximo possvel, o tamanho da populao natural. Em funo dos erros inerentes ao mtodo, nunca alcanado o valor real, mas avaliada a probabilidade de que o valor medido se encontre, dentro de certos limites, em torno do valor verdadeiro. Ao se iniciar a contagem, essencial avaliar o nvel de preciso requerido. importante verificar se a distribuio dos organismos no fundo da cmara aleatria, e caso no seja, os dados necessitam ser normalizados antes da estimativa de erro ou limites de confiana. Para um limite de confiana de 95%, o erro de contagem expresso em porcentagem pode ser estimado pela frmula: erro de contagem (%) = 2 x 100% N

Onde: N o nmero de unidades contadas. 5.5 - Identificao dos organismos fitoplanctnicos: O nvel de identificao depende dos objetivos e do treinamento dos analistas. O treinamento de tcnicos para a contagem de fitoplncton, mesmo com experincia anterior em microscopia e conhecimento prvio de morfologia celular, muito demorado, mesmo para identificao apenas em nvel de gnero. As espcies dominantes ou problemticas devem ser avaliadas em nvel especfico. Para estudos mais gerais e monitoramento de estaes de tratamento pode-se utilizar identificao em nvel de gnero, porm estudos ecolgicos requerem identificao em nvel especfico. Para identificao de espcies de cianofceas filamentosas e flagelados, importante a observao prvia da amostra no preservada, pois o movimento pode ser carter taxonmico e a forma e colorao podem ser alteradas na preservao. Aps reconhecimento da amostra viva, procede-se preservao, identificao e contagem dos organismos. Para a identificao dos organismos deve ser utilizada bibliografia especializada. (item 11.1). 6. Expresso dos Resultados 6.1 - Exame qualitativo e semi-quantitativo O resultado do exame da comunidade fitoplanctnica de um manancial pode ser expresso qualitativamente, por meio da listagem dos txons observados na amostra analisada, ou semi
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quantitativamente, pela freqncia ou abundncia relativa dos organismos presentes na amostra, quando no se tm condies de avaliar o volume da amostra. A quantidade de organismos presentes na alquota contada convertida para freqncia de ocorrncia, segundo a expresso:

% Sp i =

N i x100 N

Onde: Spi = espcie i Ni = nmero de organismos da espcie i N = nmero total de organismos na alquota. 6.2 - Exame quantitativo O resultado do exame de fitoplncton em mananciais expresso geralmente em nmero de organismos/mL. O resultado do exame de fitoplncton em guas para abastecimento expresso, alm do nmero de organismos/mL, em nmero de UPA/mL ou cls./mL. Observao 5: Certos tipos de organismos, quando excedem determinado nmero de UPA/mL ou nmero de clulas, podem causar problemas de sabor e/ou odor, obstruo de filtros e toxicidade na gua. 7. Controle Laboratorial e Estocagem Aps a anlise, uma subamostra mantida em um frasco devidamente etiquetado. A etiqueta deve conter todas as informaes necessrias para a pronta identificao da amostra. recomendado manter um registro de todas as amostras analisadas e estocadas. A estocagem, especialmente de amostras preservadas com lugol, deve ser no escuro, com reposio peridica do conservante com durao de at 3 meses. O prazo de estocagem de 6 meses a vrios anos para amostras preservadas com formol.

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8. Equipamentos de Coleta e Anlise do Fitoplncton de gua Doce

Figura 1 - Garrafa de van Dorn

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Figura 2 - Rede de Plncton

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Figura 3 - Retculo de Whipple

Figura 4 - Cmaras de Utermhl

Figura 5 - Cmara de Sedgwick-Rafter

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9. Modelo de Ficha de Anlise do Fitoplncton de gua Doce FICHA DE LEITURA - FITOPLNCTON LOCAL DE COLETA_____________________________________DATA DA COLETA_______ PONTO/RPLICA____________________DATA DA ANLISE____/____/____ N DA AMOSTRA _____________ NOME DO CLIENTE________________________________ FATOR DE CONCENTRAO_____________ CIANOFCEAS N ORGANISMOS FATOR DE CORREO _______________ N UPA

CLOROFCEAS

N ORGANISMOS

N UPA

DIATOMCEAS

N ORGANISMOS

N UPA

EUGLENOFCEAS

N ORGANISMOS

N UPA

FITOFLAGELADOS

N ORGANISMOS

N UPA

XANTOFCEAS

N ORGANISMOS

N UPA

OBSERVAES: clulas de cianobactrias (cls./mL)=

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10. Exemplo de Boletim Tcnico BOLETIM DE ANLISE FITOPLNCTON DE GUA DOCE N Amostra: Data Coleta: Dados do Cliente : Nome: Municpio: Dados de Campo : Manancial: Local: Coletor: Fator de Concentrao: 2,12 RESULTADOS GRUPO CIANOFCEAS Microcystis aeruginosa Pseudanabaena mucicola CLOROFCEAS Scenedesmus bicaudatus Chlorella sp. DIATOMCEAS Nitzschia palea Cyclotella sp. FITOFLAGELADOS Strombomonas sp. Cryptomonas sp. N ORG/mL N UPA/mL

Data Entrada:

Data Emisso:

U.F:

Fator de Correo: 27,04

20 15

15,0 07,5

05 12

02,5 04,0

30 25

12,0 06,0

05 10 Total:122

02,5 08,0 35,0

Observao: Metodologia: Nota: __________________________ Bilogo Responsvel

CRBio n.
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11. Referncias Bibliogrficas AGUDO, E. G. (Coord.). Guia de coleta e preservao de amostras de gua . So Paulo: CETESB, 1988. APHA. Standard methods for the examination of water and wastewater. 20th ed. New York: APHA:AWWA:WEF, 1998. BOX, J. D. Enumeration of cell concentration in suspension of colonial freshwater microalgae, with particular reference to Microcystis aeruginosa. Br. Phycol. J., v. 16, p. 153-164, 1981. BRASIL. Ministrio da Sade. Portaria n 518, de 03/2004. Dirio Oficial [da] Repblica Federativa do Brasil, Poder Executivo, Braslia, DF, 26 mar. 2004. Seo 1, p. 266-270. BRASIL. Ministrio do Meio Ambiente. Resoluo CONAMA n 357 de 03/2005. Dirio Oficial [da] Repblica Federativa do Brasil, Poder Executivo, Braslia, DF, 17 mar. 2005. Seo 1, p. 58-63. CETESB (So Paulo ). L5.303: determinao de fitoplncton de gua doce mtodos qualitativo e quantitativo: mtodo de ensaio. So Paulo, 1991. HOPKINS, G. J.; STANDLKE, S. J. Phytoplankton methods manual with special emphasis on waterworks operation internal. Ontario: Ministry of the Environment, 1992. HTZEL, G. J.; CROOME, R. A phytoplankton methods manual for australian freshwaters . Camberra, Australia: Land and Water Resources Research and Development, 1999. JARDIM, F. A. et al. Metodologia para a contagem de cianobactrias em clulas/mL: um novo desafio para o analista de laboratrio. Revista Engenharia Sanitria e Ambiental, Rio de Janeiro, v. 7, n. 3/4, p. 109-111, 2002. LAWTON, L. et al. Determination of cyanobacteria in the laboratory. In: CHORUS I.; BARTRAM, J. Cyanobacteria in water: a guide to their public health consequences, monitoring and management. London: E&FN Spon, 1999. 416 p. REYNOLDS, C. S.; JAWORSKI, G. H. M. Enumeration of natural microcystis populacions. Br. Phycol. J., v. 13, p. 269-277, 1978.

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11.1 - Referncias Bibliogrficas para Identificao do Fitoplncton de gua Doce ANAGNOSTIDIS, K.; KOMREK, J. Modern approach to the classification system of cyanophytes: 1 introduction. Arch. Hydrobiol.: algological studies, v. 38/39, p. 291-302, 1985. Suppl. 71. _____. Modern approach to the classification system of cyanophytes: 3 oscillatoriales. Arch. Hydrobiol.: algological studies, v. 50-53; p. 327-472, 1988. Suppl. 80. BOURRELLY, P Les algues deau douce: initiation la systematique. Paris: N. Boube, 1968. Tome 2: Les algues jaunes et brunes. 438 p. _____. Les algues deau douce: initiation la systematique. Paris: N. Boube, 1970. Tome 3: Les algues bleues et rouges. 512 p. _____. Les algues deau douce: initiation la systematique. Paris: N. Boube, 1972. Tome 1: Les algues vertes. 569p. DILLARD, G. E. Common freshwater algae of the United States: an illustrated key to the genera (excluding the diatoms). Berlin; Stuttgart: J. Cramer, 1999. 173 p. ETTL, H. Xantophyceae. Stuttgart: Gustav Fischer, 1978. 530 p. (Swasserflora von Mitteleuropa Band 3, Teil 1) GEITLER, L. Cyanophyceae. In. Rabenhorsts Kryptogamen-Flora von Deutschland, sterreich und der Schweiz 14. Leipizig: Akademische Verlagsgesellchaft, 1932. v. 1, p. 1356. HUBBER-PESTALOZZI, G. Das phytoplankton des swassers: systematik und biologie. Unter Mitwirkung von Fachgenossen herausgegeben von Dr. August Thienemann. Stuttgart: E. Schweizerbartsche, 1938. 342 p. (Die Binnengewsser: Einzeldarstellungen aus der Limnologie und ihren Nachbargebieten, Band 16, Teil 1). _____. Das phytoplankton des swassers: cryptophyceae, chloromonadophyceae, dinophyceae. Unter Mitwirkung von Fachgenossen herausgegeben von Dr. August Thienemann. Stuttgart: E. Schweizerbartsche, 1968. 322 p. (Die Binnengewasser: Einzeldarstellungen aus der Limnologie und ihren Nachbargebieten, Band 16, Teil 3. Auflage 2). _____. Das phytoplankton des swassers: euglenophyceen. Unter Mitwirkung von Fachgenossen herausgegeben von Dr. August Thienemann. Stuttgart: Schweizerbartsche, 1955. 606 p. (Die Binnengewasser: Einzeldarstellungen aus der Limnologie und ihren Nachbargebieten, Band 16, Teil 4.). _____. Das phytoplankton des swassers: chlorophyceae (Grnalgen) ordnung: volvocales. Unter Mitwirkung von Fachgenossen herausgegeben von Dr. August Thienemann. Stuttgart: Schweizerbartsche, 1961. 744 p. (Die Binnengewasser: Einzeldarstellungen aus der Limnologie und ihren Nachbargebieten, Band 16, Teil 5.). _____. Das phytoplankton des swassers: chrysophyceen. Unter Mitwirkung von Fachgenossen herausgegeben von Dr. August Thienemann. Stuttgart: E. Schweizerbartsche, 1976. 365 p. (Die Binnengewsser: Einzeldarstellungen aus der Limnologie und ihren Nachbargebieten, Band 16, Teil 2, Hlfte 1). JOHN, D. M.; WHITTON, B. A; BROOK, J. A. (Eds.) The freshwater algal flora of the british isles: an identification guide to freshwater and terrestrial algae. United Kingdon: Cambridge University, 2002. 702 p.

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KOMREK, J.; ANAGNOSTIDIS, K. Modern approach to the classification system of cyanophytes. 2 Chroococcales. Arch. Hydrobiol.: algological studies, v. 43, p. 157-266, 1996. Suppl. 73. KOMREK, J.; ANAGNOSTIDIS, K. Cyanoprokaryota: chroococcales. Jena: Gustav Fischer, 1999. 548 p. (Swasserflora von Mitteleuropa, Band 19, Teil 1.). KOMREK, J.; FOTT, B. Chlorophyceae (Grnalgen) ordnung chlorococcales. das phytoplankton des swassers. Stuttgart: E. Schweizerbartsche, 1983. 1044 p. (Die Binnengewsser, Band 16, Teil 7.Hlfte 1). KRAMMER, K.; LANGE-BERTALOT, H. Bacillariophyceae: naviculaceae. Jena; Stuttgart; Lbeck; Ulm: Gustav Fischer, 1997. 876 p. (Swasserflora von Mitteleuropa Band 2, Teil 1). _____. Bacillariophyceae: bacillariaceae, epithemiaceae, surirellaceae. Jena; Stuttgart: Lbeck; Ulm: Gustav Fischer, 1997. 610 p. (Swasserflora von Mitteleuropa Band 2, Teil 2). _____. Bacillariophyceae: centrales, fragilariaceae, eunotiaceae. Stuttgart; Jena: Gustav Fischer, 1991. 576 p. (Swasserflora von Mitteleuropa Band 2, Teil 3). _____. Bacillariophyceae: achnanthaceae. Stuttgart; Jena: Gustav Fischer, 1991. 437 p. (Swasserflora von Mitteleuropa Band 2, Teil 4). _____. Bacillariophyceae. Heidelberg; Berlim: Spektrum Akademischer Verlag, 2000. 311 p. (Swasserflora von Mitteleuropa Band 2, Teil 5). PASCHER, A. Volvocales -Phytomonadinae. Flagellatae IV -Chlorophyceae. 1 In: HUBERPESTALOZZI. Swasser flora deutschland, osterreichs und der schwweiz. Jena: Gustav Fischer, 1927. 506 p. SMITH, G.M. The freshwater algae of the United States. New York: McGraw-Hill, 1950. 719 p. WEST, W.; WEST, G.S. A monograph of the british desmidiaceae . New York; London: Johnson Reprint, 1971. 5 v.

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