CAPITULO II

FERMENTACIONES MICROBIANAS
2.1. VA DE EMBDEN-MEYERHOF-PARNAS

La gluclisis, tambin denominada gliclisis o ruta de Embden-Meyerhoff, es la secuencia metablica en la que se oxida la glucosa. Consiste de nueve reacciones enzimticas que producen dos molculas de piruvato y dos equivalentes reducidos de NADH, los que, al introducirse en la cadena respiratoria, producirn cuatro molculas de ATP. Cuando hay ausencia de oxgeno, la gluclisis es la nica va que produce ATP en los animales. Los organismos primitivos se originaron en un mundo cuya atmsfera careca de O2 y, por esto, la gluclisis se considera como la va metablica ms primitiva. Est presente en todas las formas de vida actuales. Es la primera parte del metabolismo energtico y en las clulas eucariotas ocurre en el citoplasma. En esta fase, por cada molcula de glucosa se forman 2 ATP y 2 NADH.

La reaccin global de la gluclisis es: Glucosa + 2 NAD+ + ADP + 2 Pi 2 NADH + 2 Piruvato + 2 ATP + 4 H+

2.1.1. Proceso Bioqumico de la Gluclisis

La degradacin escalonada de la glucosa se denomina gluclisis y puede ser dividida en dos partes principales. La primera parte es una serie de reacciones preparatorias que no implican oxido reduccin y que conducen a la produccin del intermediario clave, el gliceraldehdo3-fosfato. En la segunda parte tienen lugar reacciones de oxidacin-reduccin, se produce energa originada en el enlace fosfato rico en energa en forma de ATP, y son liberados los productos de fermentacin, el etanol y el C02. (Figura N 2.1).

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Figura N 2.1 Va de Embden-Meyerhoff dividida en dos partes principales

Fuente: (Gmez G.J. y C. Nieto., 2002).

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Esta va bioqumica se denomina a veces va de Embden-Meyerhoff, del nombre de dos de sus descubridores. Inicialmente, la glucosa es fosforilada por el ATP, produciendo glucosa-6-fosfato. A menudo, previamente a la oxidacin tienen lugar reacciones de fosforilacin de este tipo. Cuando el ATP se convierte en ADP, se disipa energa porque el enlace orgnico del fosfato en la glucosa-6-fosfato se encuentra a un nivel energtico inferior al que estaba el enlace fosfato del ATP, (la energa utilizada en este paso ser recuperada posteriormente en la secuencia de la reaccin). La fosforilacin inicial de la glucosa activa la molcula para posteriores reacciones.

Una isomerizacin y otra fosforilacin conducen a la produccin de la fructosa-1,6difosfato, que es un producto intermediario clave en el proceso de degradacin. La enzima aldolasa cataliza ahora la escisin de la fructosa-1,6-difosfato en dos molculas tricarbonadas, el gliceraldehdo-3-fosfato y el fosfato de dihidroxiacetona. Ntese que todava no ha habido ninguna oxidacin, puesto que todas las reacciones se han realizado sin ninguna transferencia electrnica, aunque se han utilizado dos enlaces fosfato ricos en energa procedentes del ATP.

La primera reaccin de oxidacin se produce en la conversin del gliceraldehdo-3fosfato en cido 1,3-difosfoglicrico. En esta reaccin, la coenzima NAD acepta dos electrones y queda convertido en NADH, mientras el fosfato inorgnico se convierte en una forma orgnica. Al contrario que el enlace fosfato orgnico de los fosfatos de hexosa, el nuevo enlace fosfato del cido difosfoglicrico representa la sntesis de un nuevo enlace fosfato rico en energa. La energa que de otra manera se habra liberado como calor en esta oxidacin es as conservada.

Las reacciones posteriores mostradas conducen ltimamente a la sntesis de cido piruvico y a la transferencia de la energa de los enlaces fosfato ricos en energa al ADP, formando ATP. Inicialmente se utilizan dos molculas de ATP para fosforilar el azcar, sintetizndose despus cuatro molculas (dos por cada fragmento tricarbonado), de tal modo que la ganancia neta es de dos molculas de ATP por molcula oxidada de glucosa.

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2.1. 2. Regulacin de la Va de Embden-Meyerhof-Parnas

La gluclisis se regula enzimticamente en los tres puntos irreversibles de esta ruta, esto es, en la primera reaccin (G -->G-6P), por medio de la hexoquinasa; en la tercera reaccin (F-6P --> F-1,6-BP) por medio de la PFK1 y en el ltimo paso (PEP --> Piruvato) por la piruvato quinasa.

La hexoquinasa es un punto de regulacin poco importante, ya que se inhibe cuando hay mucho G-6P en msculo. Es un punto poco importante ya que el G-6P se utiliza para otras vas. HQ: Inhibe G-6P

La PFK1 es la enzima principal de la regulacin de la gluclisis, acta como una llave de agua, si est activa cataliza muchas reacciones y se obtiene ms Fructosa 1,6 bifosfato, lo que permitir a las enzimas siguientes transformar mucho piruvato. Si est inhibida, se obtienen bajas concentraciones de producto y por lo tanto se obtiene poco piruvato. Esta enzima es controlada por regulacin alostrica de la siguiente forma:

Por un lado se activa gracias a niveles energticos elevados de ADP y AMP, inhibindose en abundancia de ATP y citrato,

Por otro se activa en presencia de un regulador generado por la PFK2 que es la Fructosa-2,6-Bisfosfato (F-2,6-BP), que no es un metabolito ni de la glucolisis ni de la gluconeognesis, sino un regulador de ambas vas que refleja el nivel de glucagn en sangre.

La lgica de la inhibicin y activacin son las siguientes: ATP: Inhibe esta enzima pues si hay una alta concentracin de ATP entonces la clula no necesita generar ms. Citrato: Si la concentracin de citrato es alta el Ciclo de Krebs va ms despacio de lo que el sustrato (Acetil-CoA) llega para degradarse, y la concentracin de glucosa ser ms alta.

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En el Ciclo de Krebs se produce mucho NADH y FADH2, para que funcionen se han de reoxidar en la cadena de transporte electrnico creando gradiente de protones, si el gradiente no se gasta las coenzimas no se reoxidan y el Ciclo de Krebs se detiene. AMP, ADP: La alta concentracin de estas molculas implica que hay una carencia de ATP, por lo que es necesario realizar gluclisis, para generar piruvato y energa. PFK1: Inhibe: ATP - Activa: ADP, AMP y F-2,6-BP.

La piruvatoquinasa se regula distintamente segn el tejido en el que trabaje, pero en hgado se inhibe en presencia de ATP y Acetil Coenzima-A (Acetil-CoA), y se activa gracias de nuevo ante la F-2,6-BP y la concentracin de fosfoenolpiruvato. PQ: Inhibe: ATP, A-CoA - Activa: PEP y F-2,6-BP. 2.1.3. Fenmenos que caracterizan a la va EMP

Fosforilacin preliminar; se consumen 2 ATP Rompimiento de la molcula. Oxidacin y formacin de enlace fosfatdico de alta energa; se produce NADH y ATP.

Reordenamiento molecular par la formacin de un enlace fosfatdico de alta energa, se genera otro ATP. (Figura N 2.2).

Por otra parte, hay que considerar tres tipos de reacciones fundamentales:

1. Transferencia de grupos fosfato. 2. Transferencias de H+. 3. Roturas del enlace CC.

La enzima caracterstica de la va de Embden-Meyerhof es la fosfofructoquinasa.

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Figura N 2.2. Va de Embden-Meyerhof

1. Glucoquinasa; 2. Fosfohexosa isomerasa; 3. Fosfofructoquinasa; 4. Aldolasa; 5. Gliceraldehido-3 -Fosfato Deshidrogenasa; 6. Fosfogliceroquinasa; 7. Fosfoglicero mutasa; 8. Enolasa; 9. Piruvico quinasa; 10 Descarboxilasa Piruvica;11. Deshidrogenasa Alcohlica; 12 Deshidrogenasa Lctica. Fuente: (Nelson D.L., M.M. Cox y C.M. Cuchillo., 2005).

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2.2. FERMENTACIN ALCOHLICA

Es la transformacin cuantitativa de la glucosa en etanol y CO2. Se la encuentra en levaduras, otros hongos y algunas bacterias. Proceso de fermentacin llevado a cabo por Saccharomyces. El piruvato se reduce para formar etanol y CO2: La fermentacin alcohlica es la base de las siguientes aplicaciones en la alimentacin humana, pan, cerveza, vino y otras bebidas fermentadas. Aparte la levadura, solamente se ha encontrado en Zymomonas mobilis, aunque este microorganismo sigue una ruta metablica completamente distinta. La fermentacin alcohlica (denominada tambin como fermentacin del etanol o incluso fermentacin etlica) es un proceso biolgico de fermentacin en plena ausencia de aire (oxgeno - O2), originado por la actividad de algunos microorganismos que procesan los hidratos de carbono (por regla general azcares: como pueden ser por ejemplo la glucosa, la fructosa, la sacarosa, el almidn, etc.) para obtener como productos finales: un alcohol en forma de etanol (cuya frmula qumica es: CH3-CH2OH), dixido de carbono (CO2) en forma de gas y unas molculas de ATP que consumen los propios microorganismos en su metabolismo celular energtico anaerbico. El etanol resultante se emplea en la elaboracin de algunas bebidas alcohlicas, tales como el vino, la cerveza, la sidra, el cava, etc. Aunque en la

actualidad se empieza a sintetizar tambin etanol mediante la fermentacin a nivel industrial a gran escala para ser empleado como biocombustible. Sobre la Fermentacin Alcohlica, Mesas, J. M. y M. T. Alegre (1999) estudiaron los principales microorganismos implicados en la elaboracin del vino y de las posibles alteraciones del mismo. Muestran los principales grupos de microorganismos y los mecanismos bioqumicos por los que se llevan a cabo las distintas alteraciones. Finalmente tratan las tendencias actuales de la microbiologa enolgica destacando algunos de las principales tcnicas empleadas en la manipulacin gentica de los microorganismos del vino y los factores que influyen en las fermentaciones y enfermedades anaerbicas del vino. Al respecto Cotillas, P. E. (2004) menciona que las clarificaciones en vinos se acompaan de cambios como la disminucin general de los compuestos fenolicos y del color, disminucin de partculas de los compuestos poco o muy fuertemente polimerizados con una reduccin de la astringencia. Informan adems que segn las

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dosis de clarificante y del equilibrio clarificante-vino se nota una suavizacin que puede conllevar a una prdida de volumen del cuerpo y a una cierta seguridad gustativa.

Por su parte, Nelson D. L. y M.M. Cox (2005), refieren que la cerveza se prepara por fermentacin etanolica de los glucidos presentes en los granos de cebada por parte de enzimas glucoliticas de la levadura. Los glucidos, bsicamente polisacaridos, deben ser previamente degradados a mono y disacridos por enzimas tales como la amilasa y la maltasa. Las clulas de levadura pasan a metabolizar el azcar de forma anaerbica, fermentan los azucares a etanol y C02. Una vez que se ha detenido la fermentacin se separan las clulas y la cerveza cruda esta lista para el tratamiento final. 2.2.1. Proceso Bioqumico de la Fermentacin Alcohlica La fermentacin alcohlica tiene como finalidad biolgica proporcionar energa anaerbica a los microorganismos unicelulares (levaduras) en ausencia de oxgeno para ello disocian las molculas de glucosa y obtienen la energa necesaria para sobrevivir, produciendo el alcohol y CO2 como desechos como consecuencia de la fermentacin. Las levaduras y bacterias causantes de este fenmeno son microorganismos muy habituales en las frutas y cereales y contribuyen en gran medida al sabor de los productos fermentados. Una de las principales caractersticas de estos microorganismos es que viven en ambientes completamente carentes de oxgeno (O2), mxime durante la reaccin qumica, por esta razn se dice que la fermentacin alcohlica es un proceso anaerbico.

En las Figuras N 2.3 y 2.4 se presentan las distintas etapas comprendidas en la fermentacin alcohlica de la glucosa por la levadura. Desde la glucosa hasta la sntesis de piruvato, se trata de una va metablica idntica a la gluclisis muscular, denominada va de las triosas o de Embden-Meyerhof. Las etapas fundamentales de la misma son:

1. Formacin de hexosas fosfato. 2. Formacin de triosas fosfato. 3. Oxidacin del gliceraldehdo-3

P

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4. Formacin del piruvato. 5. Descarboxilacin del piruvato. 6. Reduccin del acetaldehdo. Figura N 2.4. Reacciones comprendidas en la fermentacin alcohlica de la levadura

Fuente: (Pares I.F. y A. Jurez, 1997).

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En ms detalle durante la fermentacin etlica en el interior de las levaduras, la va de la gluclisis es idntica a la producida en el eritrocito (con la excepcin del piruvato que se convierte finalmente en etanol). En primer lugar el piruvato se descarboxila mediante la accin de la piruvato descarboxilasa para dar como producto final acetaldehdo liberando por ello dixido de carbono (CO2) a partir de iones del hidrgeno (H+) y electrones del NADH. Tras esta operacin el NADH sintetizado en la reaccin bioqumica catalizada por el GADHP se vuelve a oxidar por el alcohol deshidrogenasa, regenerando NAD+ para la continuacin de la gluclisis y sintetizando al mismo tiempo etanol.

Se debe considerar que el etanol va aumentando de concentracin durante el proceso de fermentacin y debido a que es un compuesto txico, cuando su concentracin alcanza aproximadamente un 12% de volumen las levaduras tienden a morir. Esta es una de las razones fundamentales por las que las bebidas alcohlicas (no destiladas) no alcanzan valores superiores a los 20% de concentracin de etanol.

Figura N 2.4. Conversin del Piruvato a Etanol

Fuente: (Gmez G.J. y C. Nieto., 2002).

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2.2.2. Asimilacin Oxidativa y Fermentativa de la Glucosa

Las levaduras, tanto cuando metabolizan oxidativamente como fermentativamente la glucosa, pueden asimilar una parte de la misma, acumulndola en la biomasa celular en forma de glucgeno, grasa, etc. La asimilacin de la glucosa puede tener lugar tambin en sistemas no proliferantes, donde se excluye la utilizacin de una parte del sustrato para la biosntesis. En un sistema no proliferante de clulas de levadura, puede obtenerse una fermentacin activa de la glucosa con concentraciones de 5 al 10% a 30C y pH 3-4. En soluciones ms diluidas de azcar es tambin fcil obtener un rpido consumo aerobio. La fermentacin alcohlica y el proceso respiratorio permiten esperar, respectivamente, una produccin de 44,8 ml de CO2 o un consumo de 134,4 ml de O2 por milimol de glucosa utilizada. Cuando Saccharomyces cerevisiae utiliza glucosa aerobiamente tambin consume solamente el 50% del O2 necesario para la respiracin del azcar tomado del medio. Durante la fermentacin con exceso de sustrato slo se produca el 35% del CO2 terico. En los sistemas no proliferantes, siempre y cuando el sustrato se encuentre en exceso, las levaduras dan lugar a una asimilacin oxidativa o fermentativa de una fraccin de la glucosa que se incorpora del medio. Se ha demostrado citolgica y qumicamente que esta glucosa se transforma en una sustancia muy parecida al glucgeno del msculo.

La formacin de glucgeno tiene lugar a partir de la Glucosa-1-P C6 H12 O6 + ATP G-6-P + ADP Hexoquinasa

G-6-P

G-1-P Fosfohexosaisomerasa

G-1-P + UTP

UDP-Glucosa + PPi UTP-glucosa fosforilasa

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La UDP-glucosa se polimeriza formndose un -1,4-glucano con la UDP-glucano sintasa. Posteriormente se ramifica rompindose enlaces 1,4 y unindose de nuevo por enlaces 1,6, por efecto de una amilo-1,6-glucosidasa. Algunas levaduras acumulan tambin grasa como consecuencia de la asimilacin de la glucosa. La grasa de las levaduras est constituida por una mezcla de lpidos.

2.2.3. Fermentacin Endgena Las reservas formadas por asimilacin de la glucosa pueden utilizarse en ausencia de sustrato exterior. La produccin de CO2 por una suspensin de clulas lavadas a pH 34 despus de diferentes tiempos de incubacin en glucosa al 10% depende de la intensidad de la fermentacin aumenta con el tiempo de incubacin y, en consecuencia, en funcin de la cantidad de reserva acumulada.

En condiciones basales se consumen por fermentacin endgena 60 mg de glucgeno/h por cada 1000 g de peso seco. Despus de 1 h de incubacin en glucosa al 10%, se pasa a 200 mg/h por cada 100 g. Esta diferente velocidad de fermentacin de glucgeno basal (previamente acumulado) y del de nueva sntesis ha hecho pensar que quizs se trate de dos tipos de glucgeno diferentes. De hecho, hay evidencias que indican que las levaduras pueden sintetizar dos tipos diferentes de molculas de glucgeno.

El carcter endgeno de la fermentacin puede ponerse de manifiesto mediante el uso de inhibidores. El nitrato de uranilo a concentracin de 4x10-5 M no penetra en la clula, pero inhibe en un 80% la utilizacin de la glucosa exterior. No obstante, no afecta en absoluto a la fermentacin endgena. En cambio, el fluoruro sdico, que a una concentracin 10-2 M penetra en la clula impidiendo la formacin de piruvato, inhibe un 80% tanto la utilizacin de la glucosa exterior como la fermentacin endgena. El DNP (dinitrofenol) a una concentracin 3x10-4 M, como la azida sdica o la aureomicina, inhiben tanto la asimilacin oxidativa de la glucosa como la fermentativa.

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El sistema no proliferante, ya est en una fase metablica oxidativa o fermentativa, no se halla ni mucho menos restringido a la oxidacin de la glucosa hasta CO2 o a su fermentacin hasta etanol y CO2, sino que pueden existir de forma alternativa o concomitante a estos procesos otras actividades metablicas que provocan la aparicin en el medio externo de diferentes tipos de metabolitos o incluso la

acumulacin intracelular de reservas.

2.3. VA DE ENTNER-DOUDOROFF

La ruta de Entner-Doudorof es una ruta metablica alternativa que cataboliza glucosa a piruvato usando una serie de enzimas distintos a la gluclisis y a la ruta de la pentosa fosfato. Es exclusiva de un nmero reducido de microorganismos carentes de la ruta EmbdenMeyerhof. El 6-fosfogluconato puede deshidratarse a 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato. Este compuesto puede desdoblarse luego en piruvato y gliceraldehido-3-fosfato mediante una aldolasa. Mediante esta ruta se produce menos NADPH que en situacin en la que el 6-fosfogluconato es descarboxilado a ribulosa-5-fosfato. Adicionalmente, el gliceraldehido-3-P se oxida a piruvato por la va de Embden-Meyerhof,

descarboxilndose en ambos casos el piruvato y originando acetato.

El resultado general de la va de Etner Doudoroff es el siguiente: Glucosa (C6)+ADP + NAD+ + NADP+ 2 Piruvato (C3) + ATP + NADH + NADPH + 2H+

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En Gluconobacter oxydans y Melanogenes, el 6-fosfogluconato puede deshidratarse a 2ceto-3-desoxi-6-fosfogluco neto. Este compuesto puede desdoblarse luego en piruvato y gliceraldehido-3-P mediante una aldolasa. Mediante esta ruta se produce menos NADPH que en la situacin en la que el 6-fosfogluconato es descarboxilado a ribulosa-5-P Adicionalmente, el gliceraldehdo-3-P se oxida a piruvato por la va de Embden-Meyerhof, descarboxilndose en ambos casos el piruvato y originando acetato tal como ha sido descrito anteriormente. Esta va se conoce como va de Entner-Doudoroff, y es la misma utilizada por Zymonomas mobilis para llevar a cabo una fermentacin alcohlica con una estequiometria similar a la de las levaduras (Figura N 2.5 y Figura N 2.6).

Comienza con las mismas reacciones de las pentosas fosfato. Se forma 2-ceto-3desoxi-6-fosfogluconato o KDPG. Desde GAL-3P hasta Piruvato es catalizado por enzimas comunes a la va Glicoltica. Se produce 1NADPH y 1 NADH por molcula de glucosa metabolizada. (Figura N 2.7).

Figura N 2.5. Reacciones comprendidas en la via de Entner-Doudoroff

Fuente: (Mathews, C.K., K.E. Van Holde y K.G. Ahern., 2002).

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La mayora de las bacterias tienen las vas glucoltica y de las pentosas fosfato, pero algunas sustituyen la gluclisis por la Va Entner-Doudoroff. Ejemplo: Pseudomonas G(-), Streptococcus faecalis G(+), Rhizobium Agrobacterium G(-) y Azotobacter G(-).Pseudomonas. Muy pocos Gram(+). G(-),

Figura N 2.6 Las dos vas del 6-P-gluconato. (a) sistema de la 6-Pgluconato deshidrogenasa (b) reaccin clave de la va de Entner Doudoroff (c) origen de los tomos de C de las molculas de CO 2 formadas en la fermentacin alcohlica de la glucosa por las levad uras (va de Embden-Meyerhorf) y Zymononas mobilis (va de Entner Doudoroff).

Fuente: (Pares I.F. y A. Jurez, 1997).

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Figura N 2.7. Esquema comparativo de la va de Embdem Meyerhoff y la va Etner Doudoroff como estrategias microbianas de fermentacin alcohlica.

Fuente: (Pares I.F. y A. Jurez, 1997).

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2.4. VA DE HEXOSA MONOFOSFATO

Tambin llamada Va del Monofosfato de Hexosa (Warburg -Dickens) o Pentosa fosfato. Figura 2.8.

La glucosa 6-P puede convertirse en diversos azcares, producindose NADPH al mismo tiempo. Esta Va que permite usar pentosas como fuente de energa por organismos que carecen de la enzima fosfocetolasa.

Permite la sntesis de hexosa (en bacterias) cuando crecen en pentosas y sintetiza H7P y E-4P. Producen precursores para biosntesis de: cidos nucleicos, pentosas, aminocidos aromticos, vitaminas, ATP.

Es fuente de NADPH para reacciones de sntesis y como una ruta de nterconversin de azucares para dar cadenas de carbono de 3, 4, 5, 6 y 7 C para reacciones biosintticas,

Un ejemplo es la formacin de Eritrosa-4 P que puede llevar a la sntesis de cido Shikimico y de aminocidos aromticos, y adems, el NADPH es requerido para la produccin de cidos graso y esteres a partir de Acetil-CoA. Ej. Acetobacter xilinum.

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Figura N 2.8. Transformaciones de la Ribulosa-5-P

Fuente: (Pares I.F. y A. Jurez, 1997).

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Si la degradacin de la glucosa utilizando el sistema de la glucosa-6-Pdeshidrogenasa conduce a la formacin de ribulosa-5-P, la misma puede convertirse en xilulosa-5-P y ribosa-5-P. A partir de la xilulosa-5-P, algunas bacterias del cido lctico pueden producir acetilfosfato y gliceraldehdo-3-P. El gliceraldehdo-3-P es transformado en lactato siguiendo la va de Embden Meyerhof. Esta va metablica, anaerobia, que fermenta la glucosa produciendo Lactato y Etanol, es conocida como va de la pentosa, y se caracteriza por la presencia de la pentosa fosfocetolasa que cataliza la transformacin de la xilulosa-5-P en acetilfosfato y gliceraldeldo-3-P. La ribosa-5-P es importante como precursor para la biosntesis de las purinas, las pirimidinas y los aminocidos aromticos, pera en el contexto del metabolismo de hexosas y pentosas por las bacterias del cido actico se utiliza en su mayor parte juntamente con xilulosa-5-Ppara generar gliceraldehdo-3-P y sedoheptulosa-7-.P a travs de la transcetolasa. Posteriormente, una serie de transformaciones llevan a producir bien una triosa-P que puede ser degradada por la va de Embden Meyerhoff o una hexosa-P que entra nuevamente en el ciclo. (Figuras N 2.9. y 2.10)

Figura N 2.9. Va de Pentosa fosfato.

Fuente: (Devlin, T. M. 2004).

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Figura N 2.10. Reacciones de la transcetolasa y la transandolasa del metabolismo microbiano de hexosas y pentosas

Fuente: (C.K. Mathews, K.E. Van Holde y K.B. Ahern, 2002.

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El ciclo de !a hexosa monofosfato puede mineralizar la glucosa, siempre que a travs de las cadenas respiratorias se reoxide el NADPH + H+ y se regenere el ATP. para verificar este proceso de acuerdo con el balance global: 6 Glucosa (C6) + 1ATP + 12 NADP+ + 6 H2O 5 G-6-P + 1 ADP + 12 NADPH + H+ + 6 CO2 + Pi 2.4.1. Formacin de Gluconato

La glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) cataliza una oxidacin irreversible de la glucosa-6-fosfato a 6-fosfogluconolactona en una reaccin dependiente de NADP+ como coenzima. La hexosa monofosfato est regulada primeramente por la G6PD. El NADPH es un potente inhibidor competitivo de la enzima y bajo muchas condiciones metablicas, la relacin NADPH/NADP+ es lo suficientemente elevada para inhibir la actividad

cataltica de la enzima. Lo anterior incrementa la demanda de NADPH, por tanto la relacin NADPH/NADP+ decrece y la actividad del ciclo aumenta en respuesta a la actividad cataltica de la G6PD. La 6-fosfogluconolactona es hidrolizada por la 6-fosfogluconolactona hidrolasa formando gluconato. La reaccin es irreversible, pero no es el paso limitante de la va. Gluconobacter oxydans ssp. Suboxydans presenta dos Glucosa deshidrogenasas:

Que aparentemente es idntica a la glucosa oxidasa que trabaja con DPI (2,6dinitrofenol indofenol) como aceptor de hidrgeno en lugar de O2, y:

En ambos casos, la gluconolactona se hidroliza a gluconato. (Figura N 2.11).

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Figura N 2.11. Transformaciones de la Ribulosa-5-P

Fuente: (Campbell, M.K. y S.O. Ferrel, 2004). 2.4.2. Utilizacin del Gluconato

La descarboxilacin subsiguiente del 6-fosfogluconato es catalizada por la 6fosfogluconato deshidrogenasa. Esta reaccin irreversible produce una azcar pentosa-fosfato, la ribulosa 5-fosfato, CO2 (del C1 de la glucosa) y una segunda molcula de NADPH. En algunos casos el gluconato se oxida con NADP a 2-cetagluconato o a 5cetogluconato y luego, a 2.5-dicetogluconato. Gluconobacter oxydans ssp. suboxydans. puede transformar el 2,5-dicetogluconato en -cetoglutarato, previa descarboxilacin y pasando por una sede de intermediarios que no estn caracterizados.

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Acetobacter aceti ssp. xylilum tiene una glucoquinasa que permite pasar el gluconato a fosfogluconato con ATP. De este modo puede continuar la va de Warburg-Dickens cortocircuitando la reaccin de la glucosa-6-P-deshidrogenasa. Esta glucoquinasa tambin se ha encontrado en Bifidobacterium.

2.4.3. Sistema de la Fosfocetolasa Acetobacter aceti y A. xylimun puede formar acetil-P a partir de fosfato inorgnico y fructosa-6-P. Esto es debido a la accin de la fosfohexosa fosfocetolasa. Este enzima slo se ha encontrado adems en Bifidobacterium.

El acetil-P genera ATP mediante la acetil-P quinasa:

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En conjuncin con la fosfopentosa fosfocetolasa, enzima mucho ms difundida, la fosfohexosa fosfocetolasa permite una conversin de la fructosa-6-P en tres molculas de acetato con la formacin de tres de ATP. Figura N 2.12. Figura N 2.12. Sistema de las fosfocetolasas en las bacterias del cido actico.

Fuente: (Alvarez, B. 1993). Las alternativas consideradas permiten resumir el metabolismo de los glcidos en las bacterias del cido actico mediante el esquema que se muestra en la Figura N 2.13.

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Figura N 2.13. Resumen del metabolismo de los glcidos en las bacterias del cido actico.

Fuente: (Pares I.F. y A. Jurez, 1997). 2.5. FERMENTACIN GLICRICA CON SULFITO

2.5.1. Formacin de Glicerina

En sus estudios sobre el vino y la cerveza, Pasteur encontr que en la fermentacin alcohlica siempre se produce una pequea cantidad de glicerina. Este proceso puede aumentarse, tal como realiz Neuberg, aadiendo sulfito al sistema a fin de fijar el acetaldehdo, lo que provoca que se produzca un mol de glicerina por cada mol de glucosa fermentada:

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En estas condiciones, al no poder utilizar el acetaldehdo como aceptor de hidrgeno, la re oxidacin del NADH se hace a partir de la dihidroxiacetona fosfato, generndose entonces glicerina:

2.5.2. Fermentacin Aceto-Glicrica

En medio alcalino varan los productos finales de la fermentacin de la glucosa por la levadura, producindose por cada dos moles de glucosa fermentados, dos moles de glicerina, uno de cido actico y uno de etanol:

En estas condiciones, la fermentacin de dos moles de glucosa genera tres moles de NADH, dos de ellos formados en la oxidacin del gliceraldehdo-3P y uno en la transformacin de un mol de acetaldehdo a acetato:

La reoxidacin de los tres moles de NADH tiene lugar con la formacin de glicerina (2 moles) y etanol (1mol). Figura N 2.14.

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Figura N 2.14. Fermentacin Aceto-Glicrica

2.6. FERMENTACIN PIRUVICO GLICRICA

Si la fermentacin se realiza con extracto seco redisuelto en solucin de glucosa, los productos finales obtenidos son piruvato y glicerina:

En estas condiciones, el piruvato no se decarboxila y, de este modo, no genera acetaldehdo, por lo que la re oxidacin del NADH se lleva a cabo en la reaccin anteriormente ya comentada de la dihidroxiacetona fosfato, que es transformada en glicerina. (Figura N 2.15).

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Figura N 2.15. Conversin de la Dihidroxiacetona fosfato en Glicerina.

Fuente: (Murray, R. K. et. al., 2005).

2.7. FERMENTACIN ACTICA 2.7.1. MODELOS DEL METABOLISMO OXIDATIVO DE LAS BACTERIAS DEL CIDO ACTICO El gnero Acetobacter fue dividido por pasteur en tres grupos: Peroxydans (A. peroxydans y A. paradoxum ); Oxydans (A. pasteurianus, levanicux, A. ascendens y A. rauceus) y Mesoxydans (A. aceti, A. xylinum y A. mesoxydans). Actualmente se aceptan slo tres especies A. aceti, A. pasteurianus y A. peroxydans. Las dems seran subespecies.

Con el gnero Gluconobacter y con las tres especies de Acetobacter pueden hacerse cuatro modelos metablicos dstanos los detalles de las transformaciones comprendidas en los mismos pueden encenderse fcilmente con lo que se ha

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descrito ms arriba. La acetoina (CH3-CHOH-CO-CH3) se forma a partir del piruvato acetaldehdo por la acetoina sintasa de forma semejante a lo que realizan algunas bacterias del cido lctico. Figura N 2.16. Modelos metablicos los cuatro tipos principales de bacterias del cido actico.

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Fuente: (Pares I.F. y A. Jurez, 1997).

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2.7.2. Fermentacin del Acido Actico

En las fermentaciones aerobias de las que nos hemos ocupado hasta el momento la cadena 6 C de la hexosa que serva como sustrato era degradada hasta cido pirvico a travs de la va de Embden-Meyerhoff, el cual se converta en acetil-CoA por desecarboxilacin oxidativa, esta ingresaba en el ciclo del citrato y finalmente los productos de la fermentacin se obtenan como resultado de una respiracin incompleta debida a la interrupcin del ciclo; pero existen una serie de fermentaciones en las que el esqueleto carbonado del sustrato permanece inalterado, cambiando solamente, por va oxidativa, uno o varios grupos funcionales. Fermentaciones de este tipo de importancia para la tecnologa de los alimentos son las siguientes: Etanol, cido actico, glicerina, dihidroxiacetona, sorbita, sorbosa, glucosa --> cido isoascrbico y glucosa cido L-ascrbico. glucosa -->

cido glucnico, glucosa, cido 2-cetoglutrico, glucosa cido 5-cetoglutrico,

En estos procesos el sustrato pierde tomos de hidrgeno oxidndose a travs de la cadena respiratoria y la fosforilacln oxidativa con formacin de agua y acumulacin de energa en forma de ATP. La energa obtenida de esta forma por los microorganismos correspondientes es muy inferior a la que se produce en la respiracin total a travs del ciclo ctrico, pero supera, no obstante, a la que se obtiene en las fermentaciones. Las fermentaciones del tipo al que nos estamos refiriendo se llaman tambin reacciones directas, transformaciones o sntesis intermedias.

La fermentacin actica, es decir la preparacin de vinagre de mesa a partir de lquidos alcohlicos, como por ejemplo el vino, se emplea desde hace miles de aos, En la actualidad con el empleo de los modernos procedimientos de generador: y sumersin, han cado en desuso los antiguos mtodos de obtencin del vinagre separando el velo que las bacterias acticas (especies de Acetobacter) formados sobre la superficie del vino. En el procedimiento del generador la solucin alcohlica discurre sobre virutas de madera de haya en las que se han

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desarrollado las bacterias acticas ("mtodo de fessel"). Despus de que el lquido a fermentar ha recorrido este camino puede separarse de l el vinagre. Sin embargo, la tcnica ms moderna la constituyen los procedimientos de sumersin, en los cuales las bacterias acticas se cultivan en un medio alcohlico agitado e intensamente aireado, en un fermentador que en este caso recibe el nombre de acetator. Despus de filtrar el lquido fermentado se obtiene un vinagre con un elevado contenido en cido actico.

En las destileras de frutas la infeccin de las maltas fermentadas con bacterias acticas, que hacen disminuir el contenido alcohlico y empeoran la calidad de los licores, constituye una fermentacin desviada muy frecuente. Al destilar el cido actico pasa de la malta al licor, a causa de su volatilidad, comunicando un sabor cido.

Adems el cido actico forma con el etanol de los licores ester actico voltil, que se percibe por el olor y por el gusto en concentraciones muy inferiores a las del propio cido actico. Mientras que trazas de estos esteres contribuyen a aromatizar los licores, su presencia en cantidades mayores les hace inaceptables. Puesto que la formacin aerobia de cido actico, al contrario que la fermentacin actica por las bacterias lcticas heterofermentativas, solamente se realiza en presencia del oxgeno del aire, se puede controlar en gran parte eliminando este ltimo. Con esta finalidad es conveniente llenar lo ms posible los recipientes de la fermentacin y dotarlos de obturadores seguros, as como tratar el mosto, vino y recipientes coc anhdrido sulfuroso.

La fermentacin bioqumica del cido actico puede representarse:

CH3 CH2OH + O2

CH3COOH + H2O + 6 ATP

Los pasos intermedios de la formacin de cido actico y agua a partir del etanol. La cadena de reacciones comienza con la deshidrogenacin del etanol a acetaldehdo (Reaccin I) mediada por la alcohol-deshidrogenasa. Esta enzima puede

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tener como coenzima al NAD, o al NADP, especficas segn el tipo de Acetobacter. En el Acetobacter peroxydans se ha caracterizado una alcohol-deshidrogenasa NADP-especfica. La reaccin 2 no es ms que la incorporacin de agua al acetaldehdo para formar hidrato de acetaldehdo. En la reaccin 3 el hidrato de acetaldehdo se convierte en cido actico por accin de una aldehdo-deshidrogenasa NADP-especfica. En las reacciones 4a 4d se representan los pasos ya conocidos de la cadena respiratoria en los que el hidrgeno ligado a las coenzimas reacciona Finalmente con el oxgeno del aire y la energa liberada queda convertida en ATP a travs de la fosforilacin oxidativa.

En la Figura N 2.17 se observa que se forman dos molculas de agua ms que las que corresponderan de acuerdo con la reaccin global de la fermentacin actica. Esto se explica por el hecho de que en una reaccin intermedia se incorpora agua para convertir al acetaldehdo en su hidrato, cuya posterior deshidrogenacin proporciona dos equivalentes de reduccin adicionales.

En ausencia de oxgeno las bacterias acticas pueden catalizar la siguiente transformacin:

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Figura N 2.17. Pasos intermedios de la formacin de cido actico y agua a partir del etanol.

Fuente: (Moat, A. G., Foster, J. W., Spector, M. P., 2002).

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Esta transformacin puede representarse corno una deshidrogenacin del hidrato de acetaldehdo en la que acta como aceptor de hidrgeno una molcula de acetaldehdo no hidratada. Como producto de la reaccin se obtiene tambin etanol, por lo que el rendimiento en cido actico es la mitad del que se obtiene en presencia de oxgeno.

La formacin de agua en la fermentacin actica se realiza:

Algunas bacterias tambin forman perxido de hidrogeno:

Al que inmediatamente descompone la catalasa de las acetobacterias aerobias: La oxidacin del etanol a cido actico no es la nica produccin de las aceto Bacterias de importancia para la tecnologa de los alimentos. En especial la oxidacin de D-sorbita a L-sorbosa (Figura N 2.18).

Por el Acetobacter suboxydans, representa una sntesis intermediaria microbiolgica industrial para la preparacin de cido L-ascrbico (vitamina C). La sntesis de vitamina C consiste en la combinacin de diversas reacciones qumicas parciales con la reaccin bioqumica antes dicha.

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El Acetobacter suboxydans oxida tambin a otros polialcoholes, siempre que posean la siguiente disposicin estructural Figura N 2.18. Oxidacin de D-Sorbita a L-Sorbosa por acetobacterias.

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