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EMATOLOGIA
direttori della collana Franco Mandelli, Giuseppe Avvisati
DIAGNOSI E CLASSIFICAZIONE DELLE MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE

Anna Guarini, Francesca R. Mauro, Alessandro Pulsoni
Dipartimento di Biotecnologie Cellulari ed Ematologia, Universit degli Studi La Sapienza - Roma
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EMATOLOGIA
DIRETTORI DELLA COLLANA Franco Mandelli, Giuseppe Avvisati Dipartimento di Biotecnologie Cellulari ed Ematologia Universit La Sapienza, Roma
ACCADEMIA NAZIONALE DI MEDICINA
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2000 Forum Service Editore s.c.a r.l. P.zza della Vittoria, 15/1 - 16121 Genova Tutti i diritti sono riservati. Nessuna parte del libro pu essere riprodotta o diffusa senza il permesso scritto dell'editore
INDICE
LAPPROCCIO DIAGNOSTICO LEUCEMIA LINFATICA CRONICA LEUCEMIA PROLINFOCITICA CRONICA LEUCEMIA A CELLULE CAPELLUTE LINFOMA SPLENICO A LINFOCITI VILLOSI LEUCEMIA A LINFOCITI GRANULARI LEUCEMIA LINFATICA CRONICA T SINDROME DI SZARY LINFOMI INDOLENTI MIELOMA MULTIPLO MACROGLOBULINEMIA DI WALDENSTRM BIBLIOGRAFIA LE DIAPOSITIVE 1 2 3 4 5
6
7 8 9 10 11 12
ABBREVIAZIONI
ATLL BCR B-LPC EORTC FAB FICTION adult T-cell leukemia lymphoma B-cell receptor leucemia prolinfocitica cronica a cellule B European Organization for Research and Treatment of Cancer French-American-British Fluorescence immunophenotyping and Interphase Cytogenetics as a Tool for Investigation Of Neoplasms FISH fluorescence in situ hybridization FL linfoma follicolare (follicular lymphoma) HCL leucemia a cellule capellute (hairy cell leukemia) Ig immunoglobuline IL interleuchina LDH lattico deidrogenasi LGL linfociti granulari LLA leucemia linfoide acuta LLC leucemia linfoide cronica LPC leucemia prolinfocitica MALT mucosa associated lymphoid tissue MCL linfoma mantellare (mantle cell lymphoma) MF micosi fungoide MIF median intensity fluorescence NCI-WG-CLL National Cancer Institute-Sponsored Working Group Guidelines for Chronic Lymphocytic Leukemia NK natural killer PCR polymerase chain reaction PHA fitoemagglutinina RMN risonanza magnetica nucleare SLVL linfoma splenico a linfociti villosi SS sindrome di Szary TC tomografia computerizzata TCR T-cell receptor TdT terminal deossinucleotidil transferasi T-LPC leucemia prolinfocitica cronica a cellule T TNF tumor necrosis factor TRAP fosfatasi acida resistente allacido tartarico
LAPPROCCIO DIAGNOSTICO
Lampliamento delle conoscenze sui linfociti ha permesso in questi ultimi anni di caratterizzare in modo pi specifico le patologie neoplastiche che originano da queste popolazioni cellulari e di classificare pi accuratamente questi disordini (Catovsky et al., 1990). In particolare, un corretto inquadramento nosologico dei diversi disordini linfoproliferativi cronici non riveste solo un interesse accademico, ma ha importanti implicazioni sia prognostiche che terapeutiche. Infatti, a una corretta diagnosi differenziale tra i vari disordini linfoproliferativi cronici a cellule B e T segue oggigiorno un iter terapeutico differenziato per le diverse patologie. Va in questo senso ricordato come fino a non molti anni addietro sotto la stessa definizione di malattia linfoproliferativa cronica venivano raggruppate patologie molto differenti per caratteristiche biologiche, andamento clinico, risposta alla terapia e, in ultimo, prognosi, che venivano, per, trattate nello stesso modo. Le diverse patologie neoplastiche linfoidi che riconosciamo attualmente rispecchiano leterogeneit del sistema linfoide e tutti i disordini linfoproliferativi, sia acuti sia cronici, originano da cellule bloccate nei vari stadi di differenziazione linfocitaria B e T. La definizione diagnostica dei disordini linfoproliferativi cronici si avvale di diverse metodiche che permettono una pi precisa caratterizzazione delle cellule neoplastiche. Possiamo dire che alcune di queste metodologie sono indispensabili alla definizione diagnostica, come ad esempio losservazione morfologica e la caratterizzazione immunofenotipica con anticorpi monoclonali di superficie e intracitoplasmatici valutati al citofluorimetro, mentre altre metodologie, come ad esempio lanalisi dei geni che codificano per le immunoglobuline (Ig) e per il T-cell receptor (TCR), si rivelano utili quando la malattia in uno stadio iniziale e la massa neoplastica non ancora significativamente espansa, oppure ancora quando vi un dubbio tra una patologia maligna e un'espansione reattiva. Altre metodologie aggiungono utili informazioni per un inquadramento pi accurato, come ad esempio studi di citogenetica o di genetica molecolare e losservazione al microscopio elettronico delle cellule neoplastiche. Nella Figura 1 riportato un algoritmo che suggerisce la sequenzialit dellutilizzo delle varie metodologie per linquadramento delle diverse malattie linfoproliferative croniche.
Figura 1
Proposta di un percorso diagnostico razionale nelle malattie linfoproliferative croniche leucemizzate
Emocromo Osservazione microscopica sangue periferico Immunofenotipo sangue periferico
Diagnosi
Sospetto diagnostico
Piccolo numero cellule LGL (CD3+)
LNH
HCL
Biologia molecolare
Biopsia ossea Biopsia linfonodale Biopsia ossea
LLC LPC HCL HCL variante Szary Waldenstrom
Microscopia elettronica Ricerca componente sierica
1.1
LEMOCROMO
Nelliter diagnostico la valutazione dellemocromo svolge un importante ruolo perch nei disordini linfoproliferativi cronici accanto a pazienti che mostrano una sintomatologia clinica vi un numero elevato di pazienti in cui il reperto del tutto occasionale, e assai spesso lunico dato alterato rappresentato dalla presenza di una linfocitosi assoluta e persistente. Il valore del numero assoluto di linfociti al di sopra del quale legittimo porre il sospetto di una patologia linfoproliferativa cronica leucemica oggetto di dibattito, anche se la maggior parte degli autori fissa questo limite tra i 35000 linfociti/m l. La stessa cosa si pu dire per il tempo di persistenza della linfocitosi fissato al di sopra dei 26 mesi (Catovsky et al., 1990; Catovsky 1997). Tuttavia la disponibilit di metodiche di biologia molecolare rende possibile la dimostrazione della clonalit di una popolazione linfoide, sia B che T, anche quando presente in quantit numericamente contenuta. Bisogna anche ricordare che i disordini linfoproliferativi cronici non sono sempre accompagnati da un aumentato numero circolante di cellule linfoidi. In questi casi, losservazione morfologica, lo studio del
fenotipo immunologico, le caratteristiche della biopsia ossea e/o della biopsia linfonodale, nel caso dei linfomi, indirizzano la diagnosi. Un esempio paradigmatico rappresentato dalla leucemia a cellule capellute (HCL) (vedi oltre).
1.2
LASPIRATO MIDOLLARE E LA BIOPSIA OSSEA
Laspirato midollare la procedura consigliata per la valutazione dellinfiltrazione da parte delle cellule neoplastiche del tessuto midollare nella maggior parte dei disordini linfoproliferativi cronici, in particolare nella HCL, nel mieloma multiplo, nei linfomi, patologie in cui le cellule della malattia spesso non sono circolanti. Oltre allosservazione morfologica delle cellule dopo colorazione con May-Grnwald/Giemsa o con colorazioni citochimiche, possibile procedere alla tipizzazione fenotipica con anticorpi monoclonali delle cellule neoplastiche. Ancora pi importante per la definizione diagnostica, indispensabile per alcuni disordini, la biopsia ossea con la quale possibile anche valutare la distribuzione delle cellule neoplastiche nel tessuto osseo che spesso patognomonica delle singole patologie. Di nuovo caratteristica la HCL, patologia in cui laspirato midollare spesso infruttuoso (puntio sicca), cos pure nei linfomi per definire lo stadio di malattia. Oggi si possono utilizzare su preparati freschi di biopsie ossee, tecniche di tipizzazione fenotipica e molecolare che consentono una accurata definizione diagnostica.
1.3
LA BIOPSIA LINFONODALE
La biopsia linfonodale una procedura che si impone quando il paziente presenta una massa linfonodale persistente da oltre quattro settimane e nel sangue periferico non si osserva un numero aumentato di linfociti con un fenotipo anomalo oppure quando nel sangue periferico o nel midollo osseo si osserva un numero aumentato di linfociti che presentano un fenotipo suggestivo per la diagnosi di linfoma. Oggi suggerito di processare il linfonodo a fresco o dopo congelamento in azoto liquido, senza che il preparato venga fissato in formalina, per favorire la tipizzazione con anticorpi monoclonali di superficie che permettono di identificare le cellule mantenendo larchitettura del tessuto. anche possibile tipizzare e criopreservare le cellule ottenute dal linfonodo dopo averle messe meccanicamente in sospensione unicellulare. In ogni caso, possibile anche sul linfonodo eseguire tecniche di colorazione citochimica, caratterizzazione immunofenotipica e molecolare (Harris et al.).
1.4
LA MORFOLOGIA
La valutazione al microscopio ottico dello striscio di sangue periferico o, nel caso di infiltrazione, del midollo osseo dopo colorazione MayGrnwald/Giemsa pu dare suggerimenti assai utili alla classificazione diagnostica per la presenza di alcune caratteristiche cellulari tipiche, sia citoplasmatiche sia nucleari (Catovsky et al., 1990; Matutes et al.). Losservazione della taglia cellulare, della forma del nucleo, la presenza di incisure, la distribuzione della cromatina, levidenza dei nucleoli, cos pure la quantit e la basofilia del citoplasma, la presenza o meno di granulazioni, la presenza di villi o estroflessioni citoplasmatiche, sono tutti elementi utili. Vanno, inoltre, segnalati: la percentuale, rispetto ai linfociti, dei prolinfociti, cellule di media-grande taglia, con citoplasma basofilo e nucleolo evidente e la presenza o assenza delle ombre di Gumprecht, macchie cellulari tipiche della leucemia linfatica cronica. Nella Tabella 1 sono riportate le caratteristiche morfologiche di alcuni disordini linfoproliferativi cronici.
Tabella 1
Caratteristiche morfologiche dei disordini linfoproliferativi B leucemizzati (TdT )

Taglia LLC* LPC HCL HCL variante SLVL FL MCL piccola media media media piccola piccola media Nucleo regolare regolare nucleolo regolare indentato regolare nucleolo regolare clivato irregolare indentato Cromatina a zolle addensata mediamente addensata addensata addensata addensata indentata Citoplasma scarso regolare medio regolare abbondante capelluto abbondante capelluto medio villoso molto scarso
addensata medio irregolarmente
* Esistono forme con fenotipo classico e morfologia atipica, con numerosi prolinfociti.
assai importante la buona esecuzione dello striscio, possibilmente con sangue appena prelevato, e della colorazione stessa. La valutazione
di un vetrino non adeguatamente allestito pu essere causa di artefatti morfologici. possibile anche utilizzare colorazioni citochimiche per la definizione di alcune patologie, anche se questi metodi sono stati superati dalla disponibilit di una vasta gamma di anticorpi monoclonali coniugati a opportuni agenti rivelatori. quindi possibile osservare al microscopio ottico o a fluorescenza, la reazione specifica in piccole quote cellulari osservando anche la morfologia. corretto sottolineare che lintroduzione di citofluorimetri pi sofisticati e, soprattutto, la possibilit di elaborare i risultati mediante programmi computeristici pi appropriati e capaci di identificare anche piccole popolazioni, ha ridotto moltissimo ai fini diagnostici lutilizzo della caratterizzazione ottica, soprattutto del sangue periferico, e della biopsia midollare.
1.5
GLI ANTICORPI MONOCLONALI
Nella caratterizzazione dei disordini linfoproliferativi cronici lelemento pi utile alla definizione diagnostica sicuramente lanalisi del fenotipo eseguita con gli anticorpi monoclonali che possono reagire sia contro gli antigeni esposti sulla membrana cellulare che contro quelli espressi a livello citoplasmatico e nucleare (Catovsky, 1997; Jennings et al., 1997; Knuutila, 1997; Matutes et al., 2000). La disponibilit degli anticorpi monoclonali ha offerto un vantaggio sia per la velocit di esecuzione che per laccuratezza della valutazione di un notevole numero di cellule. Il citofluorimetro permette di quantizzare lintensit, come MIF (median intensity fluorescence), e la densit, utilizzando biglie coniugate con quantit note di fluorescina, di espressione degli antigeni. possibile la caratterizzazione degli antigeni espressi in membrana su cellule ottenute da sangue intero o dopo separazione su gradiente di densit; inoltre, la disponibilit di anticorpi coniugati con differenti fluorocromi permette la valutazione contemporanea di pi antigeni con una maggiore accuratezza nella definizione delle popolazioni. cos possibile fissare e lisare delicatamente le cellule mononucleate e marcarle per gli antigeni citoplasmatici e nucleari utilizzando anticorpi fluorescinati e anche combinarli con quelli che marcano gli antigeni di superficie. La contemporanea marcatura di pi antigeni si rivela utile nel follow-up del paziente per il monitoraggio della malattia residua. Considerando lelevato numero di anticorpi monoclonali a disposizione, necessario operare una scelta per definire il pannello di reagenti minimo ma sufficiente per garantire una accurata diagnosi differenziale senza ricorrere a un uso esagerato di anticorpi, che devono essere utilizzati solo nel contesto di programmi di ricerca intesi a valutare lespressione e lutilit di un numero pi allargato di antigeni.
Un approccio metodologico corretto in presenza di un sospetto clinico di disordine linfoproliferativo cronico quello di una tipizzazione in due fasi: inizialmente un pannello di orientamento diagnostico (B, T, clonalit B) che in un secondo tempo potr essere ampliato per arrivare a una diagnosi definitiva e a un corretto inquadramento etiopatogenetico. Nel primo approccio devono essere compresi gli antigeni che definiscono la filiera di appartenenza delle cellule esaminate, ad esempio il CD22 di membrana o citoplasmatico per la filiera B, e il CD3 di membrana o citoplasmatico per la filiera T; devono, inoltre, essere valutati il CD19 o il CD20, le catene leggere delle Ig, espresse in membrana o nel citoplasma, che possono definire la clonalit della patologia e orientano la definizione diagnostica a seconda della loro densit di espressione sulla membrana cellulare. Cos pure vanno valutati in prima battuta gli antigeni CD2, indicativo dei precursori T e NK, e CD5 che caratterizza i linfociti T come pure una piccola quota, nel normale, di linfociti B ed caratteristicamente positivo nelle cellule di leucemia linfatica cronica a cellule B (LLC), il disordine linfoproliferativo (cronico e non) pi frequente. Nella diagnosi differenziale si pu rivelare utile, in alcuni casi, lanticorpo contro lantigene nucleare TdT, terminal desossinucleotidil transferasi, che evidenzia una cellula linfoide immatura. La TdT infatti presente nelle cellule di leucemia linfoblastica acuta (LLA) mentre sempre negativa in tutti i disordini linfoproliferativi cronici. Unaltra informazione utile per la scelta terapeutica, pu essere lindice dello stato proliferativo cellulare che pu essere valutato con lanticorpo monoclonale che riconosce lantigene nucleare Ki-67 e suggerisce indirettamente lo stato di aggressivit della malattia. Dopo aver esaminato i risultati della marcatura di questi antigeni, identificando lorigine della popolazione si proseguir nella sua caratterizzazione ampliando il numero di anticorpi.
1.5.1
I MARCATORI DELLE CELLULE B
Sono numerosi gli anticorpi che riconoscono le cellule B e caratterizzano antigeni che si esprimono a stadi differenziativi diversi e poich le neoplasie B derivano da cellule congelate in un certo stadio maturativo possibile definire le patologie e il momento della loro espansione. Come precedentemente riportato, tra gli anticorpi che reagiscono con la maggior parte delle cellule B devono essere ricordati il CD22 che caratterizza la linea linfoide B nei suoi diversi momenti maturativi. Il CD22 si trova nel citoplasma delle cellule B pi indifferenziate e successivamente durante la maturazione cellulare viene esposto sulla membrana. Lantigene CD79b rappresenta una delle due catene polipeptidiche, l'altra il CD79a, unite sulla superficie delle cellule alle Ig di membrana a formare il complesso recettoriale B (B-cell receptor,
BCR). Sia il CD22 sia il CD79b sono presenti nel citoplasma a testimoniare l'origine B della malattia, ma sono poco espressi sulla membrana di cellule di LLC, mentre al contrario sono generalmente espressi nei linfomi leucemizzati e molto intensamente espressi in alcuni linfomi come ad esempio il linfoma mantellare. Altra caratteristica delle neoplasie croniche B la positivit nel citoplasma e sulla membrana cellulare delle Ig. La densit di espressione di membrana si rivela assai utile nella diagnostica differenziale tra la LLC e gli altri disordini linfoproliferativi cronici a cellule B. Infatti, nelle cellule di LLC vi caratteristicamente una bassa espressione di Ig di superficie che contrasta con quanto osservato nelle altre patologie croniche B. Normalmente presenti sulla cellula B sono gli antigeni CD19 e il CD20; quest'ultimo antigene ha un diverso livello di espressione nelle diverse patologie, basso nella LLC ed elevato in alcuni linfomi, particolarmente nel linfoma follicolare, e nella HCL. Un altro antigene molto studiato per la definizione della cellula B, soprattutto in passato, l'HLA-DR, cos come lFMC7 che di solito assente nella LLC mentre fortemente espresso nella leucemia prolinfocitica cronica B (B-LPC) e nella HCL. Molto utile nelliter diagnostico il CD23, essendo sempre positivo nella LLC. Altro antigene che caratterizza lo stadio della cellula il CD10, essendo espresso in cellule B immature, e risultando tipicamente presente sulle cellule del linfoma follicolare. Molta rilevanza da attribuire a un altro antigene il CD5 che non caratteristico della cellula B, ma ne evidenzia, nell'individuo normale, una piccola popolazione in associazione con gli antigeni CD19 o CD20; considerando che la LLC tipicamente CD5 positiva, intuitivo l'importante impatto diagnostico di questo antigene, che tra le diverse patologie B risulta positivo solamente nelle cellule del linfoma mantellare, che per sono CD23 negative. Vi sono poi alcuni antigeni caratteristici e quindi diagnostici di determinate patologie, quali il DB44 e il CD103, positivi nelle cellule di HCL, e il CD11c che per anche positivo nel linfoma splenico a linfociti villosi (SLVL). Va altres ricordato lantigene CD25 (catena a del recettore dellinterleuchina 2, IL-2) che tipicamente positivo, con unelevata densit di espressione, nella HCL classica, mentre la forma variante CD25 negativa. Lantigene CD38 pur non essendo un antigene di linea ed esprimendo lo stato di attivazione cellulare si rivelato assai prezioso nella diagnostica in quanto caratterizza la cellula plasmocitoide anche in assenza di altri marcatori della cellula B. Inoltre, nella LLC lespressione del CD38 stata associata a un decorso clinico pi aggressivo e a una configurazione non mutata delle catene variabili delle Ig. Alla luce di quanto qui sinteticamente riassunto, nella Tabella 2 riportata la risposta a un numero selezionato di antigeni caratterizzanti
Tabella 2
Marcatori immunologici nei disordini linfoproliferativi B leucemizzati (TdT )

CD22 LLC LPC HCL HCL variante SLVL FL MCL
CD79b
CD23 ++

FMC7 ++ ++ ++ ++ ++ ++
CD5 ++

slg
+ ++ ++ ++ ++ ++
++ + + ++ ++ ++
++ ++ + ++ ++ ++
++
negativo o positivo in meno del 10% dei casi; positivo nel 1025% dei casi, + positivo nel 2575% dei casi; ++ positivo in oltre il 75% dei casi.
alcune patologie B. Alcuni autori hanno anche proposto uno score, cio un sistema con cui viene dato un punteggio, che pu essere positivo o negativo sulla base dellespressione/non-espressione di un numero relativamente limitato di antigeni, per arrivare a un pi preciso inquadramento dei disordini linfoproliferativi cronici B, soprattutto per la LLC e per i casi in cui la definizione diagnostica si presenta complessa (vedi oltre).
1.5.2
I MARCATORI DELLE CELLULE T E NK
Lanalisi dellimmunofenotipo dei disordini T non pu avvalersi di anticorpi monoclonali capaci di discriminare le differenti patologie n di marcatori immunologici in grado di definirne la monoclonalit come la restrizione delle catene leggere delle Ig per i disordini linfoproliferativi cronici B. Le patologie croniche T sono sempre CD3 positive e TdT negative. Gli altri antigeni pi frequentemente studiati sono il CD2, quasi sempre espresso, e il CD7, spesso negativo nei disordini linfoproliferativi cronici T. Fatta eccezione per le espansioni di linfociti granulari (LGL) CD3 + , il CD4 espresso in tutti i disordini linfoproliferativi cronici T, leucemia prolinfocitica cronica a cellule T (T-LPC), sindrome di Szary, linfomi cutanei a cellule T e la adult T-cell leukemia lymphoma (ATLL) non presente nel nostro paese. In alcuni casi di T-LPC le
cellule patologiche mostrano la coespressione degli antigeni CD4/CD8, come osservato nelle ultime fasi della differenziazione intratimica. Le espansioni LGL CD3 + sono normalmente CD8 + . Va ancora ricordato che possibile valutare lespressione delle catene ab , pi frequentemente espresse, oppure gd del TCR. Oltre alle pi frequenti forme CD3 + /CD8 + , possono essere diagnosticate patologie LGL a fenotipo (e spesso funzione) NK. Queste proliferazioni sono caratterizzate dallespansione di linfociti granulari CD3 negativi, di solito CD2 positivi, e che esprimono gli antigeni CD16, CD56, CD57.
1.6
LA BIOLOGIA MOLECOLARE
Le tecniche di biologia molecolare hanno rappresentato un salto di qualit nello studio delle malattie linfoproliferative, non solo perch hanno spesso chiarito la filiera di origine della neoplasia, ma anche perch hanno evidenziato lorigine clonale di alcuni disordini linfoproliferativi (Langerak et al., 1997). Lutilizzazione delle tecniche di biologia molecolare non pu essere definito necessario alla diagnosi dei disordini linfoproliferativi, ma sicuramente di supporto in molti casi (Tabella 3) . Lo studio del riarrangiamento dei geni delle Ig per le cellule B e del TCR per le cellule T permette di chiarire un dubbio diagnostico in casi incerti, quando per esempio il numero delle cellule da esaminare piccolo. Lindicazione certamente pi frequente per i disordini cronici T dove il fenotipo non sempre suggestivo per la diagnosi.
Tabella 3
Indicazioni diagnostiche dello studio molecolare del riarrangiamento delle Ig e del TCR nei disordini linfoproliferativi cronici
Conferma della filiera cellulare di appartenenza (cellule B o T) Dimostrazione di espansione monoclonale Dimostrazione di un clone neoplastico nonostante la presenza di un piccolo numero di cellule Possibilit di identificare e sequenziare il riarrangiamento del singolo paziente
Le molecole delle Ig consistono di due catene pesanti (IgH) unite da un ponte disolfuro e da due catene leggere (Ig k o Ig l ); il dominio variabile di IgH codificato da un singolo esone che origina dai segmenti riarrangiati V (variable), D (diversity) e J (joining), mentre una combinazione di segmenti genici V e J codifica i domini variabili di Igk e Ig l ; il dominio costante codificato da segmenti genici della regione C (constant). Nei disordini linfoproliferativi cronici B sempre possibile documentare un riarrangiamento clonale sia delle catene pesanti sia delle catene leggere delle Ig, a conferma che le patologie sono caratterizzate dallespansione di cellule B bloccate a un livello relativamente maturo di differenziazione. Negli anni passati lo studio della configurazione dei geni delle Ig ha permesso di dimostrare inequivocabilmente lorigine B delle cellule di HCL, fino ad allora motivo di dibattito scientifico. Lo studio del riarrangiamento dei geni del TCR un poco pi complesso. Per la cellula T sono infatti conosciuti due tipi di recettore, TCR ab e TCR gd , differenti per i due tipi di catene codificate in diversi segmenti genici (V, D J, C) che riarrangiano durante il processo di differenziazione cellulare. Le catene gd riarrangiano pi precocemente dei segmenti genici che governano le catene ab durante lontogenesi cellulare. In tutti i casi di disordini linfoproliferativi cronici T CD4+ si osserva il riarrangiamento delle catene b e g del TCR. Le analisi molecolari sono state di primaria importanza per dimostrare che molte delle espansioni a LGL CD3 + /CD8 + sono in realt patologie neoplastiche caratterizzate dalla proliferazione abnorme di elementi granulari monoclonali. Contestualmente, sono state altres documentate patologie con un fenotipo quasi sovrapponibile ma con una configurazione policlonale o, in alcuni casi, oligoclonale dei geni del TCR, a dimostrare la natura reattiva, probabilmente secondaria, dellespansione. Accurate indagini clinico-laboratoristiche spesso permettono di identificare patologie autoimmuni, infettive o neoplastiche alla base della proliferazione di elementi granulari reattivi. Fino allavvento delle analisi molecolari del TCR vi erano persino dei dubbi che le espansioni di LGL potessero essere tutte di natura benigna. Queste indagini non sono estensibili alle rare espansioni granulari a fenotipo NK, cio CD3 , CD16 + , CD56 + , che essendo appunto CD3 non presentano riarrangiamenti molecolari. Questo da un lato conferma che le cellule NK hanno unorigine cellulare diversa e dallaltro comporta lassenza di un marcatore molecolare che permetta di definire la clonalit delle espansioni LGL a fenotipo NK. Vi sono, inoltre, alterazioni molecolari che accompagnano pi specificatamente alcuni disordini linfoproliferativi cronici. Questo per esempio il caso del riarrangiamento del gene Bcl-1 nelle cellule del linfoma mantellare oppure del riarrangiamento del gene Bcl-2 nelle cellule del linfoma follicolare.
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Le tecniche di analisi molecolare, utilizzabili nella diagnostica, sono rappresentate dal metodo del Southern blot e della PCR (polymerase chain reaction). Il primo ha una sensibilit fino a circa l1% della popolazione studiata, si dimostra estremamente affidabile e se correttamente eseguita non conosce falsi positivi. Deve per essere testato su popolazioni cellulari numericamente consistenti (> 3x106 ) e necessita di alcuni giorni per ottenere una risposta. Le analisi in PCR sono pi rapide, hanno una sensibilit molto maggiore (1100 cellule per milione), possono essere effettuate su quote cellulari ridotte e, oggigiorno, possono essere anche quantitative, cio possono misurare la quantit di espressione di un determinato gene. La metodica ha il limite di possibili false positivit (Tabella 4) . Oltre che utile per un accurato inquadramento diagnostico, va infine ricordato come la presenza di un marcatore molecolare possa essere utilizzato per il monitoraggio della malattia minima residua nellambito dei sempre pi frequenti programmi terapeutici che mirano alleradicazione del clone neoplastico. Per un monitoraggio pi specifico della patologia, pu essere altres sequenziato il riarrangiamento genico di ogni singolo paziente utilizzando quindi sonde individualizzate.
Tabella 4
Confronto tra le tecniche Southern blot e PCR per la diagnosi del riarrangiamento dei geni Ig e del TCR
Southern blot Campione cellulare Quantit di DNA Tempi di esecuzione Limiti di sensibilit Falsa negativit Falsa positivit Campioni freschi o congelati 1015 mg/reazione 12 settimane > 5% della popolazione Rara Rara PCR Campioni freschi, congelati, fissati 0.1 mg/reazione 13 giorni 15% della popolazione (103106) Frequente per i geni Ig Frequente per problemi di standardizzazione
1.7
LO STUDIO CITOGENETICO
Le alterazioni citogenetiche sono oggetto di studio e di valorizzazione nelle malattie linfoproliferative croniche sia per il miglioramento dei
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risultati ottenibili con le tecniche di citogenetica convenzionale che per la disponibilit di nuove tecniche, come la FISH (fluorescence in situ hybridization), e di numerose sonde specifiche (Popescu et al., 1997). A un miglioramento delle conoscenze ha anche contribuito lottimizzazione delle tecniche di coltura che utilizzano stimoli pi specifici che consentono la messa in ciclo della cellula linfoide neoplastica, ad esempio per le cellule di leucemia linfatica cronica il CD40 ligando e lIL4. Precedentemente, la possibilit di mettere in ciclo le cellule neoplastiche delle malattie linfoproliferative era particolarmente difficile e luso di stimoli aspecifici come la fitoemoagglutinina (PHA) o lIL2 finiva per stimolare i linfociti T e B normali riducendo di molto la possibilit di ottenere informazioni sulle cellule patologiche. In questi ultimi anni sono state acquisite numerose nuove conoscenze sulle alterazioni cromosomiche in corso di diversi disordini linfoproliferativi cronici, particolarmente a carico delle LLC (Dohner H et al., 1993). Tra le anomalie cromosomiche che si presentano con una elevata frequenza nei disordini linfoproliferativi cronici e caratterizzano determinate patologie si possono ricordare la trisomia del cromosoma 12 e le aberrazioni del braccio lungo del cromosoma 13 nella LLC, la traslocazione t(14;18) in circa l85% dei linfomi follicolari che porta alleccessiva espressione delloncogene Bcl-2, e aberrazioni a carico del cromosoma 14 nelle cellule mielomatose. Oltre ad aprire importanti interrogativi biologici, alcune di queste informazioni hanno anche rilevanti implicazioni prognostiche. La FISH pu essere applicata non solo sui cromosomi in metafase e sui nuclei in interfase, ma anche su preparazioni citologiche e su sezioni di tessuto criopreservate o fissate in paraffina. Naturalmente, questo ha permesso di ottenere informazioni in un numero maggior di casi. Per esempio nella LLC, la trisomia del cromosoma 12 stata evidenziata nel 30% dei casi analizzati, contro il 1015% segnalato con le tecniche di studio del cariotipo precedentemente utilizzate (Kobayashi et al., 1994). Utilizzando tecniche di FISH, anomalie cromosomiche sono riscontrabili nel 6070% dei casi di LLC. Una modificazione ulteriore di questa tecnica ha portato alla cosiddetta FICTION (Fluorescence immunophenotyping and Interphase Cytogenetics as a Tool for Investigation Of Neoplasms) che consiste in una FISH associata a tecniche di riconoscimento immunofenotipico delle cellule esaminate e consente di comprendere in quale cellula presente una determinata alterazione (Weber-Matthiesen et al., 1993) (Tabella 5) . stato cos possibile dimostrare che la trisomia del cromosoma 12 caratteristica delle cellule neoplastiche e non di linfociti B o T normali nella LLC. Le indagini citogenetiche non sono strettamente necessarie per una corretta diagnosi di un disordine linfoproliferativo cronico, ma possono risolvere casi in cui vi siano dubbi diagnostici ed esistano alterazioni citogenetiche caratteristiche di una determinata patologia.
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Tabella 5
Tecnica FICTION, una nuova tecnologia diagnostica per lo studio delle anomalie citogenetiche: scopi di utilizzo
Caratterizzazione immunofenotipica di cloni cellulari tumorali con definite aberrazioni cromosomiche Definizione degli stadi di differenziazione delle cellule tumorali Identificazione dei precursori cellulari da cui si origina la popolazione neoplastica Caratterizzazione immunofenotipica delle cellule che circondano il tumore e hanno cariotipo normale Caratterizzazione di piccole masse tumorali allinterno di un tessuto normale
1.8
LA MICROSCOPIA ELETTRONICA
Lo studio morfologico con tecniche di microscopia elettronica pu fornire ulteriori conferme di un sospetto diagnostico di alcuni disordini linfoproliferativi cronici. La microscopia elettronica permette, infatti, di mettere in evidenza caratteristiche della cellula patologica che la microscopia ottica pu solo suggerire, oppure che limmunofenotipo pu far ipotizzare. Ad esempio, permette di dimostrare lesistenza dei villi sulle cellule neoplastiche nella diagnosi di un SLVL oppure pu confermare le protrusioni filamentose citoplasmatiche delle cellule della HCL, come pure evidenziare il nucleo cerebriforme delle cellule della sindrome di Szary. In microscopia elettronica possono essere altres utilizzate anche tecniche di citochimica o di immunocitochimica per una migliore caratterizzazione delle cellule patologiche. Certamente, le indagini in microscopia elettronica di un preparato cellulare non sono necessarie per un corretto inquadramento etiopatogenetico di un disordine linfoproliferativo cronico, ma possono, in alcuni casi, offrire una pi precisa documentazione per la diagnosi.
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LEUCEMIA LINFATICA CRONICA

La leucemia linfatica cronica (LLC) rappresenta la forma di leucemia di pi frequente riscontro nell'adulto rappresentando da sola il 30% circa di tutte le leucemie dell'adulto nellEuropa orientale e nell'America del nord.
2.1
QUADRO CLINICO
La maggioranza dei pazienti ha pi di 55 anni mentre circa un quinto dei pazienti ha < 55 anni. La LLC pi frequente tra i soggetti di sesso maschile essendo il rapporto maschi/femmine di 2:1. Nella maggior parte dei casi la LLC asintomatica e la diagnosi del tutto occasionale, posta quindi in pieno benessere in presenza di un esame emocromocitometrico che mostra la presenza di una linfocitosi. Solo nelle forme pi avanzate il quadro clinico caratterizzato dalla presenza di sintomi sistemici quali l'astenia, il dimagramento, la sudorazione notturna e la febbre. Anche l'esame clinico estremamente variabile potendo comprendere quadri del tutto negativi e quadri in cui sono apprezzabili organomegalie anche importanti. L'obiettivit clinica l'espressione del progressivo accumulo dei linfociti leucemici nelle linfoghiandole, nella milza e nel fegato. Pertanto nei pazienti affetti da LLC possibile osservare adenomegalie superficiali e profonde, splenomegalia ed epatomegalia. Gli stadi avanzati di malattia sono frequentemente caratterizzati da quadri di pancitopenia dovuti a un'insufficiente attivit mielopoietica correlata direttamente alla infiltrazione leucemica o a meccanismi di tipo autoimmune.
2.2
CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE E IMMUNOFENOTIPICHE
La diagnosi di LLC piuttosto semplice poich si basa essenzialmente sulla valutazione citomorfologica e immunologica dei linfociti presenti nel sangue periferico. I criteri per la definizione di diagnosi di LLC cui si far riferimento sono quelli stabiliti nel 1996 dal National Cancer
15
Institute-Sponsored Working Group Guidelines for Chronic Lymphocytic Leukemia (NCI-WG-CLL) (Cheson et al., 1996). Il primo criterio su cui si basa la diagnosi di LLC un incremento del numero dei linfociti nel sangue periferico e che questo sia persistente nel tempo. I linfociti hanno l'aspetto prevalente dei linfociti piccoli e maturi, presentano scarso citoplasma e cromatina nucleare addensata a zolle. Un aspetto caratteristico degli strisci di sangue di pazienti affetti da LLC la presenza di ombre nucleari dette ombre di Gumprecht (Figura 2) . Accanto ai piccoli linfociti, possono essere osservati linfociti pi grandi nucleolati, i prolinfociti, linfociti a citoplasma pi ampio, linfociti con nucleo clivato, linfociti con le caratteristiche degli immunoblasti e dei linfoblasti (Catovsky et al., 1990). Secondo la classificazione proposta dal FrenchAmerican-British Figura 2 LLC (FAB) Cooperative Group (Bennett et al., 1989) la diagnosi citomorfologica di LLC "tipica" si pone in presenza del 90% o pi di piccoli linfociti. Secondo questa classificazione quadri citomorfologici in cui sono rappresentati pi del 10% di linfociti con aspetti diversi dal piccolo linfocito non sono compatibili con la diagnosi di LLC tipica. Dal punto di vista morfologico risulta ben definita la leucemia prolinfocitica (LPC) (Melo et al., II , III, 1986) in cui l'aspetto dei linfociti periferici quello del prolinfocito e che si identifica anche con un proprio quadro immunofenotipico e clinico. Accanto a questa forma, ve ne sono altre in cui possibile osservare una quota superiore al 10% di linfociti con aspetti diversi dal piccolo linfocito. In queste condizioni appropriata la diagnosi di LLC a citomorfologia "atipica". In rapporto alle caratteristiche citomorfologiche dei linfociti del sangue periferico sono state definite da alcuni autori delle varianti della LLC, le cosiddette forme atipiche: la LLC/LPC, la LLC di tipo misto a large lymphocytes o a cleaved lymphocytes (Criel et al., 1997). La presenza di un quadro citomorfologico "atipico" sembra correlarsi generalmente a una prognosi pi sfavorevole (Oscier et al., 1997).
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La popolazione dei linfociti coinvolti nella LLC esprime antigeni di membrana propri della linea B: CD19, CD20 e CD23. Pur appartenendo alla linea B, i linfociti leucemici esprimono sulla loro membrana un antigene espresso dai linfociti T, il CD5. La popolazione coinvolta nella LLC monoclonale, esprime infatti catene leggere di un solo tipo, k oppure l . Un altro aspetto importante che contraddistingue i linfociti leucemici la bassa densit di espressione delle Ig di superficie. Questa caratteristica, cos come la infrequente espressione degli antigeni FMC7 (Catovsky et al., 1991) e CD79b (Zomas et al., 1996) di pi comune osservazione in altre malattie linfoproliferative come la LPC e le fasi leucemiche di linfomi non-Hodgkin, importante e va considerata quando si pone un problema di dia gnosi differenziale (Tabella 1) . Per una corretta identificazioTabella 6 LLC: sistema score ne delle diverse dellimmunofenotipo malattie linfoproliferative stata proposta Marker LLC una valutazione del fenotipo immunologiCD5 + co dei linfociti seconCD23 + do uno score. Questo sistema attriCD79b buisce un punteggio FMC7 di uno in presenza di kol una delle seguenti Punteggio: 5/5 = LLC classica; condizioni: CD5 posi4/5 = quadro compatibile con LLC. tivit, CD23 positiModificato da: Matutes et al., vit, FMC7 negativit, Leukemia, 1994, 8: 1640. CD79b negativit, debole intensit di espressione delle SmIg (Tabella 6) (Matutes et al., 1994). Recentemente, stata segnalato il significato prognostico sfavorevole della espressione dellantigene CD38, marker di attivazione linfocitaria (Damle et al., 1998).
2.3
BIOPSIA OSTEOMIDOLLARE E LINFONODALE
Il midollo presenta costantemente un'infiltrazione di piccoli linfociti, la cui entit variabile in rapporto all'entit della malattia. La biopsia osteomidollare un esame che permette, sulla base del tipo di modalit di infiltrazione linfocitaria, una valutazione diagnostica differenziale nei
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confronti di altri disordini linfoproliferativi anch'essi caratterizzati da linfocitosi periferica. Inoltre, la biopsia osteomidollare offre informazioni prognostiche poich ai diversi tipi di modalit di infiltrazione linfocitaria del midollo, diffuso e non diffuso (Rozman et al., 1984), si correlano non solo stadi diversi di malattia ma anche differenti probabilit di sopravvivenza. La biopsia linfonodale non necessaria nelliter diagnostico della LLC qualora siano gi chiaramente diagnostiche le indagini citomorfologiche e immunologiche condotte sulla popolazione dei linfociti presenti nel sangue periferico. La biopsia linfonodale necessaria nei casi in cui non possibile un chiaro inquadramento diagnostico sulla base dellesame del sangue periferico e quando nel decorso della malattia si presenti un quadro clinico suggestivo per trasformazione in linfoma ad alto grado di malignit (sindrome di Richter) (Giles et al., 1998). Il quadro istologico che appare alla biopsia di un linfonodo in corso di LLC non sostanzialmente differente da quello che viene osservato in caso di linfoma linfocitico.
2.4
DIAGNOSI DIFFERENZIALE
Un problema di diagnosi differenziale si pone nei confronti di altre sindromi linfoproliferative leucemiche quali la LPC, il SLVL, la fase leucemica di alcuni linfomi non-Hodgkin: il linfoma linfocitico, il linfoma follicolare, il linfoma mantellare. Ognuna di queste differenti malattie linfoproliferative caratterizzata da un proprio quadro clinico e da proprie caratteristiche citomorfologiche e immunofenotipiche che consentono agevolmente di distinguere queste forme leucemiche dalla LLC. Quando possibile sempre indicata per un corretto inquadramento diagnostico la valutazione istologica su tessuto infiltrato da malattia. La biopsia linfonodale e quella osteomidollare consentono generalmente la definizione della diagnosi. Nella tabella 2 sono riportate le caratteristiche immunofenotipiche che caratterizzano alcune malattie linfoproliferative croniche con cui pu porsi il problema di una diagnosi differenziale.
2.5
CARATTERISTICHE CITOGENETICHE E MOLECOLARI
Lo studio citogenetico e quello molecolare, per l'impegno e il costo che comportano non costituiscono attualmente esami di routine da richiedere nella valutazione dei pazienti affetti da LLC. Questi esami solitamente eseguiti nell'ambito di programmi di ricerca, hanno dato finora contributi importanti di ordine patogenetico ed hanno anche offerto informazioni di utilit prognostica. L'analisi citogenetica rivela una altera-
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zione del cariotipo in circa la met dei pazienti affetti da LLC (Juliusson et al., 1990). La presenza di alcune alterazioni del cariotipo identifica infatti sottogruppi di pazienti a diversa prognosi (Dohner et al., 1995). Osservando il decorso clinico e la sopravvivenza dei pazienti in rapporto alle caratteristiche citogenetiche stato infatti attribuito un significato prognostico sfavorevole alla presenza di alterazioni quali la 17q e la 17p , mentre pazienti con 13q e +12q possono essere considerati a prognosi pi favorevole. Non stato finora identificato un marker molecolare specifico per la LLC. Bench nella LLC non vi siano alterazioni strutturali del gene Bcl-2 la proteina Bcl-2 risulta eccessivamente espressa nell 85% dei casi (Hanada et al., 1993) e questo potrebbe avere un ruolo nellalterare i meccanismi che regolano il processo di apoptosi. Il gene del retinoblastoma, il c-myc, l'espressione della proteina p-53, l'eccessiva espressione della p27 sono state osservati in pazienti con prognosi sfavorevole (Cordone et al., 1998; Vrhovac et al., 1998). Dati recentissimi di due studi concordano nellindicare che pazienti con configurazione germline dei geni per la sintesi delle catene pesanti delle Ig (geni IgV) hanno una prognosi significativamente peggiore rispetto a quelli che presentano invece la presenza di mutazioni somatiche (Damle et al., 1998; Hamblin et al., 1998). In uno dei due studi stata, inoltre, riportata una correlazione tra lespressione dellantigene CD38 e la configurazione germline non mutata dei geni IgV.
2.6
ALTRE INDAGINI DA CONSIDERARE ALLA DIAGNOSI
In una piccola percentuale dei casi di LLC la linfocitosi si associa ad anemia e/o piastrinopenia. Queste possono essere espressione di una insufficiente attivit mielopoietica secondaria all'infiltrazione leucemica del midollo o anche essere su base autoimmune. Nel caso che lanemia sia associata a segni di emolisi quali un incremento dei valori della bilirubina indiretta, della lattico deidrogenasi (LDH), della conta dei reticolociti, importante la esecuzione del test di Coombs, affinch sia possibile identificare la eventuale presenza di autoanticorpi antieritrocitari che quasi sempre sono delle IgG e molto pi raramente delle IgM. Unaltra condizione da considerare in presenza di citopenia lipersplenismo che pu essere presente nelle forme di LLC caratterizzate da importante splenomegalia. Lelettroforesi proteica con l'ausilio dell'immunofissazione permette di dimostrare in una piccola percentuale dei casi la presenza di una paraproteina che pu essere di tipo IgG o IgM. Una ipogammaglobulinemia frequente soprattutto nei pazienti con malattia pi estesa e tende a essere pi spiccata nel decorso della malattia. Utili alla diagnosi, per il significato prognostico ad esse correlato, sono la deter-
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minazione del valore della LDH e della b 2-microglobulinemia. Una corretta valutazione dell'entit dell'estensione della malattia non pu prescindere da una valutazione di tipo radiologico. Per una valutazione di base possono essere sufficienti anche la sola radiografia del torace e un'ecografia dell'addome, tuttavia, una valutazione mediante esame TC offre informazioni di maggiore dettaglio sulle dimensioni delle adenomegalie profonde.
2.7
VALUTAZIONE DELLO STADIO
La definizione dello stadio di malattia si propone di dare una misura dell'entit della massa leucemica. Questa viene "misurata" tenendo conto non solo della linfocitosi, ma soprattutto dell'eventuale presenza di adenomegalie, di splenomegalia, di epatomegalia, di anemia, di trombocitopenia. Nella pratica attuale sono due i sistemi di stadiazione comunemente impiegati: quello proposto da Rai e collaboratori nel 1975 (Tabella 7) e quello proposto da Binet e collaboratori nel 1977 (Tabella 8) .
Tabella 7
Stadio 0 I II III IV
Classificazione della LLC in stadi secondo Rai

Stadiazione secondo Rai Aumento dei linfociti nel sangue (> 5000/mL) e nel midollo (> 40%) Come stadio 0 associato a linfoadenomegalia Come stadio 0 associato a splenomegalia epatomegalia con o senza linfoadenomegalia Come stadio 0 + anemia (Hb < 11 g/dL) con o senza epato-spleno-adenomegalia Come stadio 0 + trombocitopenia (Plt < 100000/mL) con o senza anemia (Hb < 11 g/dL) ed epato-spleno-adenomegalia
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Tabella 8
Classificazione della LLC in stadi secondo Binet

Stadio A B C Stadiazione secondo Binet Linfocitosi (> 5000/mL) e < 3 aree linfonodali coinvolte Linfocitosi (> 5000/mL) e 3 aree linfonodali coinvolte Linfocitosi (> 5000/mL) + anemia (Hb < 10 g/dL) e/o trombocitopenia (Plt < 100000/mL) indipendentemente dal numero di aree linfonodali coinvolte
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LEUCEMIA PROLINFOCITICA CRONICA

La leucemia prolinfocitica cronica (LPC) una malattia linfoproliferativa che nel 80% dei casi sostenuta dalla proliferazione monoclonale di linfociti B e nel 20% dei casi di linfociti T aventi le caratteristiche morfologiche del prolinfocita. Per la diagnosi morfologica di LPC viene richiesto che almeno il 55% dei linfociti abbiano le caratteristiche del prolinfocita (Bennett et al., 1989).
3.1
QUADRO CLINICO
Let mediana dei pazienti pi elevata che per la LLC essendo di 70 anni; i pazienti sono pi frequentemente di sesso maschile, essendo anche per la LPC il rapporto maschi:femmine di 2:1. La LPC si presenta di solito con le caratteristiche di una malattia in fase avanzata sin dalla diagnosi (Melo et al., I, 1986; IV, 1987). Nella maggior parte dei pazienti, presente una splenomegalia importante spesso associata a epatomegalia, mentre pi rara l'osservazione di linfoadenomegalie. Nelle forme di T-LPC possibile osservare la presenza di infiltrati cutanei di tipo papuloso.
3.2
CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE, IMMUNOFENOTIPICHE E CITOGENETICHE
Il quadro ematologico caratterizzato da una linfocitosi periferica in genere importante con valori anche superiori a 200000/m l che si associa ad anemia e piastrinopenia di entit variabile. Nella Tabella 9 sono confrontate le caratteristiche cliniche e biologiche della LLC e della B-LPC. Nella B-LPC i linfociti sono di taglia maggiore del piccolo linfocito che caratterizza la LLC, hanno un citoplasma relativamente pi abbondante e tenuemente basofilo, e allinterno del nucleo presentano cromatina meno addensata e un nucleolo ben evidente (Bennett et al., 1989; Melo et al., IIIII, 1986; Catovsky et al., 1990). I linfociti esprimono
23
elevata densit di Ig di superficie ed esprimono fortemente gli antigeni CD20, CD22 e FMC7, mentre il CD5 risulta espresso in circa un terzo dei casi e gli antigeni CD23, CD11c, CD103 risultano negativi (Melo et al., 1986). In circa il 60% dei casi di B-LPC lo studio citogenetico mostra una trisomia del cromosoma 14 (Pitmann et al., 1983). Nella T-LPC i prolinfociti hanno meno citoplasma e quindi maggior rapporto nucleo/citoplasma. Il nucleolo pu essere pi facilmente messo in evidenza alla microscopia elettronica e in alcuni casi il nucleo assume aspetto convoluto. I linfociti risultano essere CD2 positivi con fenotipo CD4 positivo nel 75% dei casi, mentre pi rara la espressione del CD8 o lespressione combinata del CD4 e CD8. Di solito espresso il CD7 mentre sono negativi CD1, HLA-DR e la TdT.
Tabella 9
Caratteristiche cliniche e biologiche della B-LLC e della B-LPC

B-LLC Caratteristiche morfologiche Caratteristiche immunologiche Piccoli linfociti con scarso citoplasma e nucleo a cromatina addensata SmIg + CD5 + 95% CD20 + CD23 + FMC7 Et mediana 65 Rapporto maschi/femmine 2:1 Splenomegalia Linfocitosi < 100000/ml Anemia e trombocitopenia < 15% B-LPC Linfociti con abbondante citoplasma, nucleo con cromatina fine e nucleolato SmIg ++++ CD5 CD20 ++++ CD23 FMC7 ++++ Et mediana 70 Rapporto maschi/femmine 2:1 Splenomegalia ++++ Linfocitosi > 100000/ml Anemia e trombocitopenia > 80%
Caratteristiche cliniche
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LEUCEMIA A CELLULE CAPELLUTE

La leucemia a cellule Figura 3 HCL capellute o tricoleucemia, conosciuta con lacronimo HCL (hairy cell leukemia) una entit clinicopatologica ben definita caratterizzata dalla proliferazione di cellule B mature con lunghe protrusioni citoplasmatiche riconoscibili al microscopio ottico, ma molto pi evidenti al microscopio a contrasto di fase e al microscopio elettronico (Catovsky et al., 1990, Matutes et al., 1994a) (Figura 3) .
4.1
QUADRO CLINICO
La HCL una patologia che colpisce ladulto e il sesso maschile in proporzione maggiore (4:1). Presenta sintomi non-specifici, quali astenia, in alcuni casi emorragie o infezioni; quasi sempre presente splenomegalia, alcune volte accompagnata da epatomegalia.
4.2
CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE, IMMUNOFENOTIPICHE E MOLECOLARI
Lemocromo evidenzia sempre una citopenia, molto spesso a carico di tutte le filiere cellulari, causata sia dallinvasione midollare da parte delle cellule neoplastiche che soprattutto dalla fibrosi midollare dovuta, probabilmente, anche a fattori rilasciati dalle cellule stesse, quali citochine con attivit mielotossica.
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La diagnosi, sospettata alla luce del quadro clinico-ematologico, deve essere posta sulla base della biopsia ossea. Questa mostra una diffusa infiltrazione da parte delle cellule capellute con un caratteristico aspetto lasso e un ben definito anello citoplasmatico che determinano una zona chiara attorno alle cellule. Allosservazione microscopica questa immagine risulta patognomonica della malattia e permette la diagnosi differenziale. Nella maggior parte dei casi, presente un limitato numero di cellule capellute circolanti; mentre una linfocitosi di riscontro poco frequente. Anche laspirato midollare non sufficiente per la diagnosi, soprattutto perch pu risultare spesso in una puntio sicca, dovuta oltre che all'infiltrazione leucemica, alle fibre di reticolina che derivano dalla fibronectina prodotta dalle cellule stesse che invadono il midollo. Un aspetto caratteristico della distribuzione delle cellule pu essere spiegato dalla presenza dei recettori di adesione sulla membrana che possono interagire con le cellule dellendotelio e condizionare la disseminazione. Infatti, il numero delle cellule circolanti di regola basso e anche il coinvolgimento dei linfonodi molto raro. Morfologicamente, le cellule presentano dimensioni medio-grandi con un diametro compreso tra 10 e 20 m m, citoplasma abbondante e i caratteristici villi. Il nucleo eccentrico con una forma rotondeggiante o indentata, il citoplasma basofilo con rare granulazioni azzurrofile; raramente presente un nucleolo. Le cellule di HCL hanno la propriet di reagire in modo specifico a una reazione citochimica, denominata fosfatasi acida resistente allacido tartarico (TRAP), che visualizza piccoli granuli irregolari distribuiti in modo diffuso nel citoplasma cellulare. La tipizzazione immunofenotipica mostra una positivit agli antigeni della cellula B, CD22, CD19 e CD20, CD79a. Inoltre, le cellule sono positive per le Ig, ristrette per le catene leggere, espresse in superficie ad alta densit, e per lFMC7. Ma gli antigeni che possono essere definiti specifici sono il CD11c, il CD25, il DB44 e il CD103. Le cellule sono ovviamente negative per la TdT, ma anche per CD10, CD23 e normalmente per il CD5 (Matutes et al., 1994a; Robbins et al., 1993; de Totero et al., 1993). Morfologicamente, si pu porre il quesito di una diagnosi differenziale con il SLVL, ma in questultimo le cellule sono negative per gli antigeni CD25, DB44 e CD103, anche se sono positive per lantigene CD11c (Matutes et al., 1994b). Non ci sono molti dati di citogenetica che riguardano lHCL, anche se sono segnalate alcune alterazioni tra cui il coinvolgimento del cromosoma 5 descritto in circa il 30% dei pazienti (Cuneo et al., 1994). Lo studio molecolare non ha unindicazione diagnostica nella HCL; in ogni caso, evidente che le cellule hairy mostrano un riarrangiamento clonale dei geni delle Ig (Hagland et al., 1994). Esiste una rara forma variante di HCL che rappresenta circa il 10%
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delle HCL (Cawley et al., 1980; Dunphy et al., 1996; Zinzani et al., 1990). Le caratteristiche generali sono simili, anche se frequentemente i pazienti sono pi anziani ed meno marcata lincidenza nei maschi. I pazienti presentano una importante splenomegalia che d spesso sintomi clinici, hanno alla diagnosi un numero di globuli bianchi circolanti nella maggioranza dei casi >10000/ m l. sempre possibile aspirare il midollo osseo, che presenta uninfiltrazione variabile tra il 580%. La biopsia ossea mostra sempre la presenza di uninfiltrazione nella maggior parte dei casi interstiziale. La diagnosi differenziale con la classica HCL basata fondamentalmente sull'osservazione morfologica e sulle differenze di positivit ai marcatori di membrana. Infatti, le cellule neoplastiche si presentano con una morfologia simile a quella dei prolinfociti, un nucleo rotondo con nucleolo evidente e un citoplasma abbondante con numerosi villi. Limmunofenotipo ricalca quello della HCL classica, eccetto che per la negativit per il CD25. Lo studio della biologia molecolare mostra lespressione del trascritto del gene c-myc, che qualcuno mette in relazione con la resistenza della HCL variante alla terapia con IFN a (Sainati et al., 1990; Lehn et al., 1986). Le conoscenze sulla citogenetica di questa patologia sono scarse; sono state segnalate anomalie numeriche e strutturali, anche se raro il coinvolgimento del cromosoma 5 a differenza di quanto osservato nella HCL classica.
27
LINFOMA SPLENICO A LINFOCITI VILLOSI

Il linfoma splenico a linfociti villosi (SLVL) rappresenta una patologia linfoproliferativa la cui identit stata definita solo recentemente (Catovsky et al., 1990; Melo et al., 1987). Ha unincidenza che stata valutata essere il 10% delle malattie linfoproliferative B leucemiche ed classificato tra i linfomi non-Hodgkin a basso grado di malignit.
5.1
QUADRO CLINICO
Sono interessati dal SLVL soggetti adulti di et generalmente superiore a 60 anni (Mulligan et al., 1991). Il quadro clinico dominato da una splenomegalia associata ad alterazioni dellemocromo. La splenomegalia di solito piuttosto importante, ma in rari casi pu essere anche modesta e apprezzabile solo ecograficamente. Se presenti, lepatomegalia e le adenomegalie non sono comunque di entit rilevante. Alla linfocitosi, di solito non molto importante, e che varia tra 1040000/ m l, pu associarsi frequentemente anemia e trombocitopenia talvolta su base anche autoimmune. Circa la met dei pazienti mostra la presenza di una componente monoclonale di tipo IgG o IgM.
5.2
CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE, IMMUNOFENOTIPICHE E CITOGENETICHE
Una quota dei linfociti periferici, generalmente superiore al 25%, caratterizzata dalla presenza ai poli cellulari di estroflessioni citoplasmatiche che danno a questi elementi un aspetto villoso. I linfociti sono di media taglia, presentano citoplasma basofilo, hanno un nucleo tondo con cromatina addensata e frequentemente apprezzabile un piccolo nucleolo. Allesame dellimmunofenotipo il quadro quello di una popolazione monoclonale di tipo B che nella maggioranza dei casi risulta essere fortemente CD22 positiva, ma CD5 e CD23 negativa, con positivit del CD79b e del FMC7 (Tabella 2) . In casi meno frequenti con positivit del CD5 o del CD23 (2030%) si pu porre il problema di una diagnosi differenziale con la LLC, mentre in quelli con positivit del CD25 (25%)
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si pone un problema di diagnosi differenziale con la HCL. Finora non stato dimostrato un quadro specifico di alterazioni citogenetiche. In una minoranza di casi stata documentata la presenza di alterazioni citogenetiche osservate in altri tipi di patologia linfoproliferativa, quali la trisomia 3 (17%), la t(11;14) (15%) e la trisomia 12 (3%).
5.3
ISTOLOGIA SPLENICA E BIOPSIA OSTEOMIDOLLARE
tipico il quadro di un interessamento splenico, prevalentemente a carico della polpa bianca, di tipo nodulare con componente a piccole cellule al centro e cellule pi grandi nella periferia del nodulo. Nella polpa rossa possibile osservare un interessamento nodulare simile di entit variabile. La biopsia osteomidollare rivela un'infiltrazione linfocitaria non molto importante, di solito di tipo nodulare e intrasinusoidale con aspetti talvolta di tipo paratrabecolare.
30
LEUCEMIE A LINFOCITI GRANULARI

Secondo quanto suggerito da Loughran (Loughran et al., 1993) e anche recentemente dalla "Revised European-American Lymphoma Classification" (Harris et al., 1994) delle leucemie a linfociti granulari, anche denominate come large granular lymphocyte (LGL) leukemias, vanno considerate due diverse entit in rapporto al tipo di derivazione cellulare: LGL a fenotipo T CD3 + e LGL a fenotipo NK.
6.1
6.1.1
ESPANSIONI LGL CD3 +

QUADRO CLINICO
la forma pi comune di espansione LGL (Lamy et al., 1998) e si osserva in soggetti non giovani, essendo l'et media di 60 anni. Il decorso solitamente indolente e la diagnosi del tutto occasionale, anche se in alcuni pazienti viene posta in occasione di infezioni secondarie alla granulocitopenia presente in circa un terzo dei casi (Dhodapkar et al., 1994). Pu essere presente epatomegalia e/o splenomegalia. possibile documentare la presenza di unaltra patologia in circa il 40% dei casi: frequentemente un'artrite reumatoide, ma anche altre patologie di tipo autoimmune come l'anemia emolitica autoimmune. Un'espansione LGL pu anche essere associata a patologie diverse di tipo ematologico: mieloma multiplo, gammopatia monoclonale, mielodisplasia e malattie linfoproliferative. Infine, espansioni LGL possono essere osservate anche in corso di tumori solidi.
6.1.2
CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE E IMMUNOFENOTIPICHE
La diagnosi di queste patologie si basa sull'osservazione di una linfocitosi persistente, sostenuta dalla presenza di linfociti con nucleo rotondo o reniforme e ampio citoplasma contenente granuli azzurrofili (Figura 4) . Il numero assoluto di queste cellule si attesta di solito su valori superiori a 2000/ m l, ma sono descritti anche casi caratterizzati da un numero inferiore di linfociti granulari (Semenzato et al., 1997). Il fenotipo immunologico delle LGL pi comunemente osservato
31
caratterizzato dalla positivit per gli antigeni CD3, CD8, CD16, CD57, TCR ab . In alcuni casi, stata osservata la positivit per l'antigene CD4 in assenza o in presenza della positivit per l'antigene CD8 e in casi ancora pi rari sono state osservate forme a fenotipo CD3+, CD8, CD4. La natura clonale delle LGL dimostrabile mediante analisi molecolare (Southern blot o PCR) che mette in evidenza la presenza del riarrangiamento dei geni TCRb o TCR g . Il quadro ematologico pu essere caratterizzato frequentemente da granulocitopenia grave (45%), piastrinopenia (20%), anemia (48%). In alcuni casi, anemia e piastrinopenia possono riconoscere un'eziologia di tipo autoimmune. Granulocitopenia e piastrinopenia possono essere anche lespressione di una condizione di mielodisplasia. Quote variabili d'infiltrazione midollare da parte di LGL sono documentabili all'aspirato midollare e alla biopsia osteomidollare. Lo studio proteico pu rilevare la presenza di una proteina monoclonale o anche di una ipergammaglobulinemia di tipo policlonale.
Figura 4 LGL
6.1.3
DIAGNOSI DIFFERENZIALE
Espansioni di linfociti granulari di tipo non clonale, e quindi con configurazione germinale dei geni del TCR, sono state descritte in associazione a patologie di tipo diverso; tra queste, soprattutto le infezioni di tipo virale, in particolare le infezioni da virus dell'epatite B e C. Non infrequenti le forme non clonali secondarie a malattie autoimmuni, a malattie linfoproliferative e di tipo neoplastico.
6.2
ESPANSIONI LGL A FENOTIPO NK
Sono state descritte due condizioni diverse aventi fenotipo NK, la linfocitosi cronica a fenotipo NK e la leucemia a linfociti granulari a fenotipo NK.
32
6.2A LINFOCITOSI CRONICA A FENOTIPO NK

6.2A.1 QUADRO CLINICO piuttosto rara e interessa prevalentemente i soggetti non giovani essendo l'et mediana di 60 anni (Tefferi et al., 1994). una malattia a decorso indolente in cui rara la presenza di organomegalia. Talvolta stata osservata in corso di vasculiti (poliarterite nodosa, glomerulonefrite, vasculiti orticarioidi) di aplasia eritroide pura, di granulocitopenia e piastrinopenia. Anche per questa forma stata postulata una possibile eziologia di tipo virale (Zambello et al., 1995).
6.2A.2 CARATTERISTICHE IMMUNOFENOTIPICHE Il numero mediano di cellule granulose non generalmente elevato attestandosi su valori di 2000/ m l. Il fenotipo immunologico pi comunemente osservato CD2 + , CD16 + , CD56 + , CD3 , CD4 , CD8 con debole espressione del CD57. Nella maggior parte dei casi studiati, stata suggerita la clonalit della popolazione NK poich questa esprimeva un solo tipo dei recettori espressi dalle cellule a fenotipo NK (Moretta et al., 1994).
6.2B LEUCEMIA A LINFOCITI GRANULARI A FENOTIPO NK

6.2B.1 QUADRO CLINICO Questo tipo di leucemia interessa i pazienti pi giovani essendo l'et mediana di 39 anni. Si presenta in forma di una malattia linfoproliferativa aggressiva con linfocitosi di solito superiore a 10000/ m l associata ad anemia e piastrinopenia gravi, sintomatologia emorragica da coagulopatia intravascolare disseminata, epatosplenomegalia, ascite, interessamento gastroenterico e talvolta anche del sistema nervoso centrale (Fernandez et al., 1986).
6.2B.2 CARATTERISTICHE IMMUNOFENOTIPICHE Generalmente, il fenotipo immunologico delle cellule granulose CD3 , TCR ab , TCR gd , CD4 , CD8 + , CD16 + , CD56 + e CD57 variabilmente espresso. Nella met dei casi studiati stato possibile documentare la presenza di un'infezione da EBV, ed stata postulata una responsabilit eziologica diretta del virus poich mediante analisi di tipo molecolare allinterno delle cellule granulose sono stati documentati EBV-RNA e antigeni nucleari EBV correlati (Kawa-Ha et al., 1989).
33
LEUCEMIA LINFATICA CRONICA T

La leucemia linfatica cronica a T linfociti (T-LLC) una forma estremamente rara di cui si solo recentemente ammessa l'esistenza (Hoyer et al., 1995; Wong et al., 1996). Rappresenta l1% delle leucemie linfatiche croniche a linfociti piccoli e maturi.
7.1
QUADRO CLINICO
Il quadro clinico frequentemente caratterizzato da organomegalie, talvolta anche importanti, associate a linfocitosi il cui valore mediano si attesta su valori di 45000/ m l. In alcuni pazienti stato osservato un interessamento cutaneo sotto forma di lesioni di tipo eritematoso.
7.2
CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE, IMMUNOFENOTIPICHE E MOLECOLARI
Nella T-LLC vi sono nel sangue periferico linfociti apparentemente maturi di piccola taglia, nucleo tondo od ovale con modeste irregolarit del suo contorno del tipo di una piccola incisura. La cromatina nucleare addensata e talvolta pu essere riconoscibile un piccolo nucleolo. Il citoplasma scarso, leggermente basofilo e soprattutto privo di granulazioni. La percentuale di infiltrazione linfocitaria a livello midollare risultata variabile dal 15 al 90%. Limmunofenotipo dei linfociti corrisponde a quello di linfociti maturi CD3 + , CD4 + talvolta anche CD8 + con negativit del CD16, CD56 e CD57. Indagini molecolari hanno mostrato la costante presenza del riarrangiamento del gene TCR b . Dal punto di vista citogenetico stata osservata in alcuni casi un'alterazione a livello del 14q32.
35
LA SINDROME DI SZARY
La sindrome di Szary (SS) descritta per la prima volta nel 1948 da Szary e da Bouvrain (Szary et al., 1948) rappresenta una condizione clinica che si riassume nella triade: eritrodermia, adenomegalie, linfocitosi. una malattia sistemica dovuta alla compromissione da parte di linfociti neoplastici a immunofenotipo T dellepidermide, dei linfonodi, del sangue. Questa sindrome classificata tra i linfomi a derivazione dai T linfociti (Willemze et al., 1997; Harris et al., 1994) ed inquadrata come un linfoma cutaneo di stadio avanzato in considerazione dell'estesa compromissione cutanea e leucemica avente caratteristiche biologiche e cliniche comuni con la micosi fungoide (MF) essendo dovute entrambe alla proliferazione neoplastica di linfociti a fenotipo T helper.
8.1
QUADRO CLINICO
La SS una patologia rara che interessa soggetti prevalentemente di sesso maschile e di et adulta. Il quadro clinico dominato dall'eritrodermia diffusa, intensamente pruriginosa con esfoliazione cutanea importante a cui possono aggiungersi gradi variabili di ipercheratosi palmare e plantare, distrofia ungueale, alopecia. Frequentemente possibile documentare anche adenomegalie ed epatosplenomegalia (Wieselthier et al., 1990).
8.2
CARATTERISTICHE CITOMORFOLOGICHE, IMMUNOFENOTIPICHE E MOLECOLARI
possibile osservare nel sangue periferico due tipi di cellule leucemiche: cellule pi grandi denominate cellule di Szary e cellule di dimensioni pi piccole dette cellule di Lutzner (Catovsky et al., 1990). Le cellule mostrano scarso citoplasma e nucleo indentato spesso convoluto con aspetto cerebriforme soprattutto nella variante cellulare di dimensioni maggiori. Questi aspetti della morfologia nucleare possono essere pi facilmente documentabili alla microscopia elettronica. L'infiltrazione midollare di solito limitata. Lesame istologico delle lesioni cutanee rivela la presenza di infiltrati linfocitari tipicamente epi-
37
dermotropi sotto forma di clusters che sono denominati microascessi di Pautrier. I linfociti mostrano fenotipo di tipo T helper: CD2+ ; CD3 + , CD5 + , CD4 + CD8 . Solo in rarissimi casi la popolazione leucemica esprime il CD8. possibile dimostrare la clonalit della popolazione leucemica mediante analisi molecolare che permette di documentare il riarrangiamento dei geni del TCR. Secondo i criteri EORTC, per la diagnosi di SS richiesta la presenza nel sangue periferico di una popolazione T clonale con incremento significativo del rapporto CD4/CD8 (>10) (Willemze et al., 1983). Non sono state identificate finora alterazioni specifiche del cariotipo da correlare alla SS.
38
LINFOMI INDOLENTI
I linfomi a piccole cellule, solitamente caratterizzati da un decorso clinico indolente, rappresentano circa il 40% di tutti i linfomi nonHodgkin. Comprendono un gruppo eterogeneo di entit clinico-patologiche sempre meglio definite negli ultimi anni grazie al miglioramento delle tecniche immunologiche, citogenetiche e molecolari.
9.1
QUADRO CLINICO
Nella maggior parte dei casi il sintomo di presentazione la comparsa di tumefazioni linfonodali non dolenti, prevalentemente nelle stazioni del collo. Sintomi sistemici della malattia (febbre, dimagrimento, sudorazione profusa) sono presenti in meno del 25% dei casi; quando presenti, sono solitamente associati con stadi avanzati di malattia. Meno frequentemente la malattia si presenta con sintomi legati a specifiche sedi di localizzazione: nelle localizzazioni al tratto gastroenterico vi pu essere dolore addominale, nel 30% dei casi un sanguinamento franco, pi raramente ostruzione o perforazione intestinale. Citopenie significative si manifestano solo in caso di infiltrazione midollare estesa. La leucemizzazione non infrequente (4070%) e pu costituire il primo segno della malattia.
9.2
PROCEDURE DIAGNOSTICHE
La biopsia linfonodale rappresenta la procedura diagnostica principale. Agobiopsie e agoaspirati delle tumefazioni linfonodali sono da scoraggiare in quanto il campione limitato pu non comprendere lesioni focali, non consente lesame dell'architettura del linfonodo e limita la possibilit di utilizzare procedure diagnostiche pi elaborate. Nel caso di malattie caratterizzate allesordio da infiltrazione midollare o del sangue periferico, utili indicazioni diagnostiche possono venire dallesame citomorfologico, immunofenotipico e molecolare su campioni ottenuti in queste sedi. Lestensione della malattia deve essere valutata con un accurato esame fisico, con luso di una diagnostica per immagini (ecografia, TC, RMN, ecc.) e con una biopsia osteomidollare. Un'accurata stadiazione della malattia di importanza fondamentale in quanto latteggiamento terapeutico e la prognosi sono differenti negli stadi localizzati rispetto agli stadi pi avanzati. Nella Tabella 10 sono elencate le pro-
39
cedure di stadiazione indicate nei linfomi a basso grado di malignit; nella Tabella 11 sono indicati i criteri di stadiazione dei linfomi secondo Ann-Arbor, tuttora comunemente utilizzati (Carbone et al., 1971).
Tabella 10
Accertamenti indicati per la stadiazione dei linfomi indolenti
Anamnesi accurata ed esame obiettivo con particolare attenzione alla presenza o meno di sintomi B, fattori di rischio per HIV, infezioni, terapia immunosoppressiva, malattie autoimmuni Emocromo con piastrine e formula leucocitaria Esami ematochimici di routine, comprendenti LDH, acido urico, creatinina, VES, b2-microglobulina, ecc. Ecografia delle stazioni linfonodali superficiali e delladdome, TC total body Esame citologico, immunofenotipo, citogenetica, ricerca di specifici riarrangiamenti genici sul materiale patologico ove indicato Agoaspirato e biopsia osteomidollare Esofagogastroduodenoscopia nei pazienti con interessamento dellanello del Waldayer o sintomi addominali Esame citologico e immunofenotipico su eventuali liquidi del terzo spazio (pleura, peritoneo) Procedure radiologiche specifiche se indicate (scintigrafia con gallio, Rx o RM di segmenti scheletrici, ecc.)
Tabella 11
Criteri di stadiazione dei linfomi non-Hodgkin secondo Ann Arbor

Stadio I II Definizione Interessamento di una singola stazione linfonodale o di una singola sede extranodale (IE) Interessamento di due o pi stazioni linfonodali dalla stessa parte del diaframma o di una sede extranodale (IIE) e una o pi stazioni linfonodali dalla stessa parte del diaframma Interessamento di stazioni linfonodali sia sopra che sottodiaframmatiche, che possono essere accompagnate da localizzazioni extranodali (IIIE), da interessamento splenico (IIIS), o da ambedue (IIIES) Interessamento diffuso o disseminato di uno o pi organi extralinfonodali, con o senza interessamento linfonodale associato
III
IV
Sintomi sistemici (B): Febbre > 38, sudorazione notturna, perdita di peso del 10% negli ultimi 6 mesi
40
9.3
CLASSIFICAZIONE
La recente classificazione WHO (Harris et al., 1999) (Tabella 12) aggiorna le classificazioni precedentemente elaborate (REAL Classification-1994; Updated Kiel Classification-1992; Working Formulation-1982) (Harris et al., 1994; Lennert et al., 1992) tenendo conto del progressivo affinamento delle tecniche diagnostiche e della correlazione con la clinica. Nei linfomi maligni possibile riconoscere stretti rapporti con i vari compartimenti e stati funzionali del sistema immunitario.
Tabella 12
Classificazione WHO dei linfomi indolenti

Leucemia linfoide cronica/Linfoma a piccoli linfociti Leucemia prolinfocitica B Linfoma linfoplasmocitoide Linfoma splenico della zona marginale (con o senza linfociti villosi) Leucemia a cellule capellute Mieloma/Plasmocitoma Linfoma della zona marginale extranodale (MALT) Linfoma della zona marginale nodale (con o senza cellule B monocitoidi) Linfoma follicolare (gradi IIII) Linfoma follicolare cutaneo Linfoma centrofollicolare diffuso Linfoma mantellare
9.4
LINFOMA B A PICCOLI LINFOCITI
la variante linfonodale, non leucemica, della LLC. Dal punto di vista clinico interessa let avanzata, caratterizzata da un decorso indolente e pu coinvolgere linfonodi, milza, fegato, midollo osseo. Istologicamente costituito da piccoli linfociti con cromatina addensata, anche se possibile incontrare clusters di cellule di pi grandi dimensioni (prolinfociti e paraimmunoblasti). Lo studio dellimmunofenotipo (debole sIgM + , IgD , marker pan B + , CD5 + , CD23 + , CD43 + , FMC7 ) molto utile nei casi con morfologia atipica, e per la conferma della diagnosi. Dal punto di vista molecolare le cellule sono caratterizzate dal riarrangiamento dei geni per le immunoglobuline. Alterazioni citogenetiche sono incostanti e generalmente coinvolgo-
41
no i cromosomi 11, 12 e 13 con delezioni e traslocazioni. La progressione della malattia si pu verificare per lincremento della quota prolinfocitaria, o per la trasformazione in un linfoma ad alto grado di malignit (sindrome di Richter).
9.5
LINFOMA LINFOPLASMOCITICO/IMMUNOCITOMA
Dal punto di vista clinico poco frequente (12% dei linfomi nodali), caratteristico dellet avanzata, pu coinvolgere il midollo osseo, i linfonodi, la milza e talvolta il sangue periferico. Pu essere associato a produzione di una paraproteina IgM nel siero e in tal caso possono essere presenti le manifestazioni cliniche della macroglobulinemia di Waldenstrm (sindrome da iperviscosit, vedi oltre). Pu essere accompagnato da anemia emolitica autoimmune o crioglobulinemia. Soprattutto in alcune regioni italiane stata riportata una frequente associazione con linfezione da virus dellepatite C, tanto da far ipotizzare un possibile ruolo patogenetico del virus in questa variet di linfoma (Mazzaro et al., 1996). Il quadro istologico caratterizzato da un'infiltrazione di tipo diffuso, senza pseudofollicoli, o talvolta proliferazione nellarea interfollicolare. Gli elementi patologici sono rappresentati da linfociti linfoplasmocitoidi (con abbondante citoplasma basofilo), ma sono presenti anche piccoli linfociti e plasmacellule. Talvolta possono essere osservati anche rari immunoblasti, cellule epitelioidi e mastociti. Limmunofenotipo si caratterizza per la forte espressione citoplasmica e di membrana delle Ig (usualmente IgM, raramente IgA o IgD), positivit dei marker pan-B, negativit del CD5, CD10 e CD23, CD43 . Lo studio dellimmunofenotipo importante per distinguerlo da altre forme di linfoma a piccole cellule che possono talvolta presentare una maturazione in senso plasmocitico (linfoma a piccoli linfociti, linfoma follicolare). Dal punto di vista molecolare sono presenti il riarrangiamento dei geni per le Ig e mutazioni somatiche. Nel LLP stata descritta la t(9;14) (p13;q32) coinvolgente il fattore di trascrizione specifico delle cellule B, PAX-5 e il locus delle catene pesanti delle Ig. Nel corso della malattia si pu raramente osservare una trasformazione in linfoma a grandi cellule B (solitamente immunoblastico).
9.6
LINFOMA MANTELLARE
Clinicamente il linfoma mantellare si presenta soprattutto nel paziente anziano, prevalentemente nei maschi. Rappresenta il 56% di tutti i linfomi. Nella classificazione di Kiel veniva compreso nella categoria del linfoma centrocitico. L'identificazione del linfoma mantellare tanto pi
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rilevante in quanto caratterizzato da una prognosi che si discosta, per la maggiore aggressivit, da quella delle altre variet di linfomi indolenti. La maggior parte dei pazienti si presenta infatti con una malattia disseminata (stadio III o IV): linfoadenopatie multiple, con coinvolgimento dellanello del Waldayer, frequente interessamento midollare e della milza. Non sono rare localizzazioni extranodali, in particolare a livello del tratto gastroenterico. Dal punto di vista istologico vi sovvertimento della normale architettura linfonodale con infiltrazione di tipo diffuso o vagamente nodulare da parte di elementi cellulari di piccola-media taglia con nucleo indentato, cromatina moderatamente dispersa, rari nucleoli. Lindice mitotico variabile, abitualmente basso, talvolta elevato. Possono essere distinte diverse varianti istologiche (Zucca E et al., 1994): variante blastica: cellule simili a centroblasti con cromatina finemente dispersa e alto indice mitotico, frequente aspetto a cielo stellato variante pleiomorfa: predominanza di cellule di taglia medio-grande talvolta con nucleo inciso, di aspetto centroblastico variante a piccole cellule: predominanza di cellule di piccola-media taglia con nucleo tondo e cromatina pi addensata. Limmunofenotipo si caratterizza per positivit delle sIgM (con espressione intensa), generalmente IgD + , CD5 + , CD10 , CD23 , solitamente CD43 + , CD11c , ciclina D1 + . Nei casi con immunofenotipo atipico (CD5 o CD23 + ), oltre alla tipica morfologia occorre ricorrere alla dimostrazione dellespressione della ciclina D1 (Zucca E et al., 1994). Dal punto di vista molecolare e citogenetico nel linfoma mantellare si osserva il riarrangiamento dei geni delle Ig e lassenza di mutazioni relative alla zona variabile delle Ig; nella maggior parte dei casi presente la t(11;14)(q13;q32) coinvolgente il locus per le catene pesanti delle Ig e il locus Bcl-1. Questa traslocazione risulta nell'aumentata espressione del gene CCND1/PRAD1, che codifica per la ciclina D1: una proteina che interviene nella regolazione del ciclo cellulare, non espressa nelle cellule linfoidi normali. La possibilit di identificare quest'alterazione dipende dalla metodica impiegata: impiegando tecniche quali PCR, Southern blot o citogenetica classica, la possibilit di identificarla va dal 35 al 70%, mentre viene rilevata nel 100% dei casi usando la FISH. A livello proteico o dellRNA, lespressione della ciclina D1 viene rilevata nel 90% dei casi. difficile fare diagnosi di linfoma mantellare con il solo criterio morfologico: nelle forme tipiche la diagnosi differenziale va posta con il linfoma a piccoli linfociti e con il linfoma follicolare, nella variante blastica con il linfoma linfoblastico, nella variante pleiomorfa con i linfomi diffusi o follicolari a grandi cellule B, nella variante a piccole cellule con il linfoma della zona marginale. Da queste considerazioni emerge la fondamentale importanza di uti-
43
lizzare tecniche quali lo studio dellimmunofenotipo, analisi di citogenetica e biologia molecolare per una corretta diagnosi.
9.7
LINFOMI FOLLICOLARI
Rappresenano la variet pi frequente fra i linfomi indolenti e comprendono circa il 30% di tutti i linfomi non-Hodgkin. Clinicamente si presentano soprattutto in individui anziani, ma non sono infrequenti anche nel giovane adulto. Nella maggior parte dei casi alla diagnosi la malattia si presenta gi in stadio avanzato, con interessamento linfonodale, della milza, del midollo osseo; raramente coinvolge sedi extranodali. Il decorso estremamente indolente, ma, con le strategie terapeutiche attualmente a disposizione, tuttora incurabili. La mediana di sopravvivenza di 79 anni. Nel corso della malattia la trasformazione in linfoma B a grandi cellule frequente (fino al 60% dei casi). La diagnosi morfologica relativamente semplice per il tipico aspetto follicolare (nodulare). Gli elementi cellulari possono essere di piccolamedia taglia con nucleo inciso e scarso citoplasma (centrociti) o di grandi dimensioni con nucleo rotondo, nucleoli, e citoplasma basofilo (centroblasti). Gli elementi di piccole dimensioni sono di solito predominanti. In base alla percentuale di cellule di grandi dimensioni i linfomi follicolari (FL) possono essere suddivisi in 3 gradi; pur essendo tale suddivisione discutibile per la scarsa riproducibilit fra diversi osservatori (sarebbe probabilmente pi opportuna una suddivisione in 2 soli gradi), nella recente classificazione WHO stata conservata cos come era stata introdotta nella precedente REAL classification per non introdurre elementi di confusione:

Grado I: 05 centroblasti per campo, ad alto ingrandimento Grado II: 615 centroblasti per campo, ad alto ingrandimento Grado III: > 15 centroblasti per campo, ad alto ingrandimento.
Lo studio dellimmunofenotipo mostra: positivit per le Ig di superficie, positivit per i marker pan-B, CD5 , CD10 + , CD23 , CD43 , positivit per la proteina espressa dal Bcl-2 e dal Bcl-6. La proteina Bcl-2 pu essere presente in altre variet di linfomi indolenti, ma non nelle forme reattive. Dal punto di vista citogenetico e molecolare la t(8;14)(q32;q21) presente nel 7095% dei casi di linfomi follicolari; in questa traslocazione il locus Bcl-2 viene a trovarsi giustapposto al gene che codifica per le catene pesanti delle Ig. Ne consegue l'iperespressione della proteina Bcl-2, che verosimilmente gioca un ruolo nella trasformazione neoplastica del clone cellulare in quanto dotata di azione anti-apoptotica. Altri eventi genetici sono comunque necessari per la trasformazione neoplastica. Oltre alla t(8;14) si osserva il riarrangiamento dei geni per le Ig, con
44
mutazione delle regioni variabili. Possono essere osservate anche mutazioni della p53, e riarrangiamento o iperespressione del c-myc in caso di trasformazione in variet pi aggressive. Il linfoma follicolare primitivo della cute presenta caratteristiche cliniche e biologiche che lo distinguono dalle forme nodali. Si presenta spesso come unica lesione a livello del dorso anche se sono possibili lesioni cutanee multiple e in altre sedi. La prognosi migliore con un decorso pi lento rispetto alle forme nodali, e una buona risposta a terapie locali. Laspetto istologico simile ma non presente la t(14;18) n il riarrangiamento del Bcl-2.
9.8
LINFOMA DELLA ZONA MARGINALE
La definizione di questa variet di linfoma relativamente recente. Inizialmente stato considerato nella variet associata alle mucose ("mucosa associated lymphoid tissue", MALT type) identificata negli anni 80 da Isaacson (Isaacson et al., 1983). Successivamente sono state identificate le variet nodali (Sheibani et al., 1988) e splenica (Schimdt et al., 1992). Queste ultime, considerate entit provvisorie nella REAL classification, figurano come entit riconosciute nella classificazione WHO. I linfomi tipo MALT sono relativamente frequenti (7% di tutti i linfomi), mentre pi rare sono le altre variet. Dal punto di vista clinico il linfoma della zona marginale extranodale tipo MALT pu originare dal tratto gastroenterico (stomaco, pi raramente intestino) dalle ghiandole salivari, dalle vie respiratorie, dalla tiroide, dagli annessi oculari, dalle ghiandole mammarie, dal fegato, dalle vie urinarie, dal timo e dalla cute. Vi spesso una preesistente patologia infiammatoria cronica con componente autoimmune (gastrite da Helicobacter pilori , sindrome di Sjgren, tiroidite di Hashimoto, borreliosi). I linfomi tipo MALT originano solitamente in sedi normalmente prive di tessuto linfoide, in cui un infiltrato linfoide stato indotto dalle patologie suddette. Almeno in una fase iniziale il processo linfomatoso sostenuto dalla patologia di base e pu regredire con la risoluzione di questultima. La malattia tipicamente indolente e spesso localizzata. Tuttavia non raro un aspetto disseminato gi alla diagnosi e linfiltrazione midollare (presente nel 17% dei casi) (Thieblemont et al., 2000). Dal punto di vista istologico , laspetto citologico eterogeneo con elementi cellulari diversi associati in proporzioni variabili: piccole cellule con nucleo irregolare tipo centrociti (pi frequenti nelle forme MALT), piccole cellule con nucleo pi regolare e citoplasma chiaro (cellule B monocitoidi), cellule simili a piccoli linfociti, piccole cellule con diffe-
45
renziazione plasmocitoide, plasmacellule, una variabile proporzione di cellule di dimensioni medio-grandi tipo centroblasti o immunoblasti; sono inoltre sempre presenti cellule dendritiche follicolari. Linfiltrazione inizia nella zona marginale per poi estendersi all'area interfollicolare o ai follicoli. Limmunofenotipo si caratterizza per la positivit per le Ig di membrana ristrette per le catene leggere. La catena pesante IgM con o senza coespressione delle IgD o IgG, mostra marker pan-B + , CD5 , CD10 , CD23 , CD43 , Bcl-2 + , ciclina D1 . Lo studio dellimmunofenotipo essenziale per la diagnosi differenziale con altri tipi di linfoma non-Hodgkin indolenti. Dal punto di vista citogenetico e molecolare sono presenti il riarrangiamento dei geni per le Ig, nonch mutazioni somatiche. Le pi frequenti alterazioni citogenetiche comprendono la trisomia 3 (60% dei casi), la trisomia 18 e anomalie strutturali di 1q. Il linfoma della zona marginale nodale, con o senza cellule B monocitoidi stato inizialmente descritto in donne anziane, spesso affette da sindrome di Sjgren, come malattia localizzata, verosimilmente originata dalle ghiandole salivari. Nella forma nodale tuttavia la malattia pi spesso disseminata e la prognosi meno buona che nelle forme MALT o splenica. Il linfoma splenico a linfociti villosi stato precedentemente descritto.
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MIELOMA MULTIPLO
Il mieloma multiplo una patologia relativamente frequente: rappresenta l12% di tutte le malattie tumorali e circa il 15% delle emopatie maligne. Lincidenza in Italia di 5.7 casi ogni 100000 abitanti nei maschi e 5.0 nelle femmine. una malattia dellanziano, con una et mediana alla diagnosi riportata fra i 6570 anni. Origina dalla trasformazione neoplastica di una cellula B attraverso una serie di eventi solo in parte noti, fra cui lattivazione di oncogeni o linattivazione di geni oncosoppressori.
10
10.1 QUADRO CLINICO

La presentazione della malattia allesordio estremamente variabile: in circa il 30% dei casi la diagnosi casuale, mentre negli altri casi la malattia viene rivelata dalla presenza di dolori ossei con fratture patologiche, dalla comparsa di anemia, meno frequentemente da una insufficienza renale acuta, infezioni, ipercalcemia (Tabella 13) . La sintomatologia clinica del mieloma origina sostanzialmente dai seguenti elementi che possono assumere un ruolo estremamente variabile nei diversi pazienti: sintomi legati allinfiltrazione midollare, alla componente monoclonale, al riassorbimento osseo. Linfiltrazione midollare da parte delle cellule mielomatose pu comportare: anemia, leucopenia, piastrinopenia. La componente monoclonale pu essere responsabile di emodiluizione e di aumento della viscosit ematica e della sintomatologia che ne consegue: cefalea, vertigini, sindrome emorragica, microemorragie retiniche, sonnolenza, obnubilamento. Il riassorbimento osseo, dovuto all'infiltrazione da parte del tessuto
Tabella 13

Sintomi di esordio nel mieloma multiplo

Riscontro casuale in paziente asintomatico Dolori ossei, fratture patologiche Anemia Insufficienza renale acuta Infezioni Sindrome ipercalcemica Altro 30 % 35 % 20 % 15 %
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tumorale e alla produzione di fattori umorali capaci di stimolare lattivit osteoclastica (IL-1 b , linfotossina, TNF a ), responsabile delle caratteristiche lesioni osteolitiche visibili con la radiologia convenzionale. Possono essere isolate, multiple, talora disseminate a tutte le sedi ossee contenenti midollo rosso. Limpiego della RMN rende inoltre visibili lesioni pi fini, con aspetti tipo sale e pepe, e rimaneggiamento diffuso della matrice ossea. La demineralizzazione ossea diffusa e le lesioni osteolitiche possono essere complicate da fratture patologiche con conseguente dolore osseo, deformit, limitazioni funzionali talora notevolissime. Conseguenza del riassorbimento osseo anche lipercalcemia: se lieve (<12 mg/dl), generalmente asintomatica; se moderata (1215 mg/dl), comporta astenia, adinamia, nausea; se grave (>15 mg/dl), lipercalciuria provoca insufficienza renale acuta e disidratazione potenzialmente fatali se non trattate prontamente. Altri sintomi possono essere conseguenza di complicanze diverse: sintomi neurologici possono derivare da compressioni sul midollo spinale o altre strutture nervose a seguito di crolli vertebrali; una neuropatia pu presentarsi in caso di amiloidosi secondaria a mieloma: la sindrome del tunnel carpale generalmente legata ad amiloidosi del retinacolo fibroso dei flessori del polso con compressione del nervo mediamo. descritta anche una polineuropatia sensitivo-motoria progressiva nel 35% dei pazienti con mieloma. Nella Tabella 14 sono riportate le indagini necessarie per un corretto inquadramento diagnostico del mieloma. I criteri diagnostici proposti dal South Western Oncology Group nel 1975 sono tuttora utilizzati (Tabella 15) .
10.2 CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE E IMMUNOFENOTIPICHE

Gli elementi cellulari possono variare da forme anaplastiche altamente immature a elementi di aspetto identico alle plasmacellule mature. Il grado di differenziazione cellulare sembra essere correlato con la prognosi. Dal punto di vista immunofenotipico sia le plasmacellule normali che quelle mielomatose sono caratterizzate dalla intensa espressione dellantigene CD38 (il pi tipico antigene plasmacellulare). Oltre al CD38 le cellule mielomatose esprimono in modo variabile altri antigeni legati alla differenziazione B cellulare (Ig di superficie e intracitoplasmatiche, CD10, CD19, CD20, CD23), possono esprimere in modo variabile alcuni antigeni mieloidi o cellulari T (CD33, CD14, CD2, CD4), molecole di superficie legate ai meccanismi di adesione delle cellule fra loro e alle strutture stromali (integrine e selectine, fra cui CD56, CD54, CD49e,
48
Tabella 14
Procedure diagnostiche nel mieloma multiplo

Anamnesi ed esame obiettivo Ricerca precedente MGUS, valutazione del performance status Valutazione qualitativa e quantitativa della componente monoclonale
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Studio proteico Elettroforesi sierica Immunofissazione Dosaggio Ig Elettroforesi e immunofissazione urine Emocromo Chimica clinica Albumina Creatinina Calcemia b2 microglobulina LDH Proteina C reattiva Agoaspirato e biopsia osteomidollare Diagnostica per immagini Rx dello scheletro RMN
Ricerca citopenie periferiche Valutazione della funzionalit renale, della calcemia, dellattivit della malattia
Valutazione della plasmocitosi midollare Ricerca lesioni osteolitiche
Tabella 15
Criteri maggiori
Criteri diagnostici nel mieloma multiplo
Diagnosi istologica di plasmocitoma Plasmocitosi midollare > 30% Componente monoclonale IgG > 3.5 g/dl IgA > 2.0 g/dl CM urinaria k o l > 1.0 g/24 ore Criteri minori Plasmocitosi midollare 1030 % Componente monoclonale (livelli inferiori) Lesioni osteolitiche Riduzione delle Ig normali IgM < 50 mg/dl IgA < 100 mg/dl IgG < 600 mg/dl
La diagnosi richiede la combinazione di un criterio maggiore e uno minore (nel caso che lunico criterio maggiore sia la diagnosi istologica il criterio minore deve essere diverso dal primo), o la combinazione di tre criteri minori che debbono includere sia la plasmocitosi midollare sia la presenza della componente monoclonale.
49
CD49d), e antigeni coinvolti nei segnali fra cellula e cellula (HLA-DR, CD28, CD40, CD80, CD100, B7, ecc). Nella Tabella 16 sono elencati i pi tipici antigeni espressi sulle plasmacellule normali e mielomatose. A scopo diagnostico, al fine di differenziare le plasmacellule maligne da quelle normali utile valutare alcune specifiche associazioni antigeniche: lanalisi contemporanea del CD19 e del CD56 sembra in grado di differenziare le plasmacellule normali (CD19 + , CD56 ) da quelle patologiche (CD19 , CD56 + ) (Harada et al., 1993).
Tabella 16
Antigeni espressi sulle plasmacellule normali e sulle cellule di mieloma

Antigene sIg cIg CD10 CD19 CD20 CD23 CD38 B-B4 CD56 CD54 CD49e (VLA5) CD49d (VLA4) HLA-DR CD44 Han PC1 Plasmacellule normali + + + + + + + + + Mieloma + + + + + + + +
10.3 ANOMALIE PROTEICHE

Una componente monoclonale (proteina M) e/o la presenza di catene leggere libere (proteina di Bence-Jones) presente virtualmente nella totalit dei casi di mieloma. Raramente la componente M costituita da frammenti di Ig o da mezze molecole. La distribuzione delle varie classi di Ig nelle varie forme di mieloma riflette pi o meno la concentrazione delle Ig normali nel siero (Tabella 17) . Nell1125% dei casi non possibile evidenziare un picco allelettroforesi proteica: nelle forme a catene leggere un piccolo picco raramente identificabile, mentre frequente una ipogammaglobulinemia. Nelle forme IgG, IgA e micromolecolari (Bence-Jones) le catene leggere k e l sono omoge-
50
Tabella 17
Distribuzione delle varie classi di Ig in 632 pazienti con mieloma e confronto con la concentrazione delle Ig normali nel siero
Mieloma IgG IgA IgD IgE Catene leggere 61 % 19 % 2% 17 % Ig normali nel siero 52 % 37 % 0.6 % 0.03 %
10
neamente distribuite, mentre nel pi raro mieloma IgD sono prevalenti le forme a catena leggera l . Nelle forme micromolecolari lescrezione urinaria delle catene leggere influenzata da una serie di fattori legati anche alla funzionalit renale e pu variare da pochi milligrammi fino a 3040 grammi nelle 24 ore. Nell1% circa dei pazienti con mieloma non possibile identificare una componente M serica n urinaria. Generalmente in questi casi studi di immunofluorescenza consentono di dimostrare la capacit di produrre Ig o parti di esse da parte delle cellule, ma lincapacit di secernerle (mieloma non secernente) (Ameis et al., 1976).
10.4 CARATTERISTICHE CITOGENETICHE

Un cariotipo anormale si osserva nel 3050% dei casi (Luc Lai et al. 1995). Tuttavia lanalisi della aneuploidia effettuata con tecniche citofluorimetriche e la ricerca di anomalie citogenetiche effettuata mediante FISH rivelano la presenza di anomalie citogenetiche nell8090% dei pazienti (Tabernero et al., 1996). Feinman et al., hanno riportato la presenza di anomalie cromosomiche nel 27% dei casi, un cariotipo normale nel 31%, mentre il 42% non era valutabile (Feinman et al. 1997). Tra le anomalie cromosomiche numeriche o strutturali riportate, particolare interesse rivestono quelle che coinvolgono il cromosoma 13 (presenti nel 43% dei pazienti con anomalie citogenetiche). La completa o parziale delezione del 13 infatti pi comunemente osservata in pazienti con malattia in stadio avanzato ed associata a prognosi sfavorevole (Facon et al. 1999).
10.5 DIAGNOSI DIFFERENZIALE

Una componente monoclonale pu essere presente in altre condizioni patologiche come la gammopatia monoclonale di significato incerto
51
(MGUS), la macroglobulinemia di Waldenstrm e la malattia delle catene pesanti. Plasmocitosi reattive si possono osservare in patologie infettive o flogistiche croniche, situazioni allergiche, epatopatie croniche, patologie autoimmuni. Lesioni osteolitiche possono essere osservate in tumori ossei primitivi, linfomi, metastasi ossee di neoplasie solide (mammella, prostata, polmone, ecc.).
10.6 STADIAZIONE
Tuttora utilizzata la stadiazione di Durie e Salmon (Durie et al., 1975) che si propone di calcolare la massa tumorale in base a semplici parametri clinici (Tabella 18) identificando 3 stadi di diverso significato prognostico.
Tabella 18
Stadio Criteri
Stadiazione secondo Durie e Salmon

Massa cellulare stimata (x 1012/m2) < 0.6
tutti i seguenti: Emoglobina > 10.5 mg/dl Calcemia < 12 mg/dl Assenza di lesioni osteolitiche o unica lesione CM ridotta: IgG < 5.0 g/dl IgA < 3.0 g/dl BenceJones < 4g/24 ore casi che non rientrano in I e III almeno 1 dei seguenti: Emoglobina < 8.5 mg/dl Calcemia > 12mg/dl Presenza di 3 o pi lesioni litiche CM elevata: IgG > 7.0 g/dl IgA > 5.0 g/dl BenceJones > 12g/24 ore Creatinina < 2 mg/dl Creatinina > 2 mg/dl
II III

0.61.2 > 1.2
A B
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10.7 FORME SOLITARIE (PLASMOCITOMA LOCALIZZATO)

Forme localizzate di plasmocitoma si possono presentare a livello osseo (plasmocitoma solitario dellosso) o a livello dei tessuti molli (plasmocitoma extramidollare). Per definizione non presente in queste forme plasmocitosi midollare; una modesta componente monoclonale prodotta dalle cellule tumorali pu invece essere presente. In uno studio su 54 pazienti con plasmocitoma localizzato, la CM era presente nel 47% delle forme ossee e soltanto nel 9% di quelle extraossee (Galieni et al., 1995). Nelle forme ossee la lesione pi spesso localizzata a livello del rachide, delle coste o del bacino, anche se possibile a qualunque livello scheletrico. Let di insorgenza pi giovanile rispetto al mieloma e vi un pi frequente interessamento del sesso maschile. La sintomatologia di esordio solitamente legata al dolore osseo o a sintomi compressivi. La diagnosi necessariamente istologica, su biopsia della lesione. importante escludere con certezza altre lesioni osteolitiche a distanza mediante RMN. La prognosi migliore rispetto alle forme sistemiche, anche se nel corso della malattia una evoluzione in mieloma multiplo si verifica nel 6070% dei casi. Le forme extraossee, anchesse pi frequenti nei maschi e in et pi giovanile rispetto al mieloma, si presentano soprattutto a livello delle vie aeree superiori (seni paranasali o mascellari, rinofaringe, laringe), ma si possono osservare anche a livello linfonodale, tonsillare, gastrico e cutaneo. La sintomatologia legata alleffetto di massa e a compressione sulle strutture circostanti. La prognosi migliore rispetto alle forme ossee e levoluzione in mieloma multiplo pi rara (1015%).
10
53
MACROGLOBULINEMIA DI WALDENSTRM
La macroglobulinemia di Waldenstrm (MW) deriva dalla proliferazione clonale di un elemento cellulare B con maturazione in senso plasmacellulare capace di sintetizzare IgM, le cui attivit biologiche sono responsabili della maggior parte dei caratteristici sintomi clinici. La macroglobulinemia di Waldenstrm corrisponde a livello linfonodale al linfoma linfoplasmocitico/immunocitoma della REAL classification e al linfoma linfoplasmocitico della classificazione WHO (vedi sopra). Lincidenza della malattia circa un sesto di quella del mieloma. Lincidenza aumenta progressivamente con let (Groves et al., 1998). Sono stati descritti numerosi casi di aggregazione familiare della malattia, o associazione con altre malattie linfoproliferative (Linet et al., 1993) tanto da far ipotizzare una qualche forma di predisposizione genetica. Tuttavia legami con specifiche alterazioni genetiche non sono a tuttoggi noti.
11
11.1 QUADRO CLINICO

I principali sintomi e segni alla diagnosi sono indicati nella Tabella 19 (Mc Callister et al., 1967). Le manifestazioni cliniche della macroglobulinemia di Waldenstrm sono dovute a due componenti: linfiltrazione dei tessuti da parte delle cellule tumorali e gli effetti della paraproteina IgM (Tabella 20) . Linfiltrazione midollare da parte delle cellule neoplastiche responsabile dell'anemia e della possibile pancitopenia. A livello di altri organi produce effetti assimilabili a quelli di altre forme di linfoma indolente. Le lesioni osteolitiche caratteristiche del mieloma sono eccezionali nella MW. Le manifestazioni cliniche pi tipiche della MW sono quelle derivanti dalle propriet fisico-chimiche e immunologiche delle IgM monoclonali che inducono: una sindrome da iperviscosit (astenia, cefalea, disturbi visivi, sanguinamento, disturbi mentali fino al coma, alterazioni dei vasi retinici) una sindrome emorragica legata allinterferenza con fattori coagulativi (V, VII, VIII) (Farhangi et al., 1986) e allinterferenza con le funzioni piastriniche una sindrome di tipo autoimmune tra cui la pi frequente la neu-
55
Tabella 19
Frequenza di sintomi e segni presenti alla diagnosi in pazienti affetti da macroglobulinemia di Waldenstrm
Sintomi Astenia Emorragie Dimagrimento Sintomi neurologici Disturbi visivi Fenomeno di Raynaud % 44 44 23 11 8 3 Segni Epatomegalia Splenomegalia Anomalie del fundus oculi Adenopatie Anomalie neurologiche Porpora % 38 37 37 30 17 15
ropatia periferica (presente nel 17% circa dei casi) dovuta in circa la met dei casi a una attivit anticorpale diretta contro una glicoproteina associata alla mielina (MAG) (Ropper et al., 1998) crioglobulinemia di tipo I : si riscontra nel 729% dei pazienti, ma sintomatica solo nel 50% di essi. La precipitazione nei piccoli vasi soprattutto in seguito allesposizione al freddo produce il fenomeno
Tabella 20
Manifestazioni cliniche della macroglobulinemia di Waldenstrm

Infiltrazione di organi e tessuti da parte delle cellule tumorali Midollo osseo Fegato Milza Linfonodi Polmoni Tratto gastroenterico Reni Cute CNS Fundus oculi

Effetti legati alle caratteristiche fisico-chimiche e immunologiche della componente monoclonale IgM Sindrome da iperviscosit Crioglobulinemia tipo I Sindrome emorragica Polineuropatia Anemia da crioagglutinine Amiloidosi AL Deposizione tissutale di IgM

56
di Raynaud, acrocianosi, porpora, ulcere malleolari, fino a lesioni necrotiche delle estremit crioglobulinemia di tipo II dovuta all'attivit anticorpale anti-Ig (fattore reumatoide) della componente monoclonale. spesso associata a infezione da HCV; la precipitazione degli immunocomplessi a bassa temperatura produce effetti che vanno dalla semplice porpora benigna alle vasculiti sistemiche gravi complicate da artralgie, fenomeno di Raynaud, glomerulonefrite membrano-proliferativa e insufficienza renale (Brouet JC et al., 1974) crioagglutininemia : si verifica quando la componente monoclonale ha attivit diretta contro antigeni eritrocitari (frequentemente I/i) (Pruzanski et al., 1977) producendo una anemia emolitica cronica prevalentemente extravascolare che pu esacerbarsi con lesposizione alle basse temperature deposizione in organi e tessuti : la deposizione di aggregati amorfi a livello della membrana basale cutanea produce una patologia bollosa, a livello della lamina propria o sottomucosa della cute produce lesioni cutanee papulo-nodulari. A livello dellintestino pu provocare diarrea, malassorbimento, emorragie. Lamiloidosi rara nella MW, ma se presente pu manifestarsi con miocardiopatia, epatomegalia, sindrome nefrosica, neuropatia periferica, ecc.
11
Nella Tabella 21 sono sintetizzate le procedure diagnostiche utili per linquadramento diagnostico della MW.
11.2 CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE E IMMUNOFENOTIPICHE

Linfiltrazione midollare comprende piccoli linfociti, cellule linfoplasmacitoidi e una proporzione variabile di plasmacellule mature. Il clone cellulare B implicato nella MW presenta la possibilit di maturazione intraclonale fino allo stadio di plasmacellula. Tutti questi elementi cellulari esprimono le stesse IgM di superficie o intracitoplasmatiche; una porzione variabile esprime anche sIgD. La maggior parte di esse esprime CD19 e CD20; una intensa espressione del CD38 presente sugli elementi a morfologia plasmacellulare e sugli elementi intermedi. Il CD23 e il CD43 sono solitamente assenti. Il CD5 espresso in circa la met dei casi (Jensen et al., 1991).
11.3 CARATTERISTICHE CITOGENETICHE E MOLECOLARI

A causa della rarit della malattia i dati disponibili sono limitati. La fre-
57
Tabella 21
Procedure diagnostiche utili nella macroglobulinemia di Waldenstrm

Emocromo Esame microscopico del sangue periferico Elettroforesi serica e urinaria Immunofissazione serica Viscosimetria Fondo dellocchio Ricerca e tipizzazione crioglobuline Fattore reumatoide PT, PTT Agoaspirato e biopsia osteomidollare Immunofenotipo su midollo o sangue TC total body Biopsia linfonodale RMN del rachide / segmenti scheletrici PCR (primer specifici per la regione variabile)

Anemia, piastrinopenia Rouleaux, elementi patologici circolanti Ricerca CM TipizzazioneCM Ricerca iperviscosit Alterazioni microcircolatorie Ricerca crioglobuline tipo I e II Frequente nella crioglobulinemia tipo II Ricerca anomalie coagulative Ricerca infiltrazione midollare Ricerca/tipizzazione cellule neoplastiche Ricerca organomegalie, linfomegalie Diagnosi istologica Ricerca lesioni osteolitiche Monitorizzazione della malattia
quenza di anomalie citogenetiche varia fra il 15 e il 90% dei casi. Sono state riportate anomalie cromosomiche diverse, ma nessuna specifica (Palka et al. 1987). In singoli casi stata osservata la t(14;18)(q32;q21) coinvolgente il gene Bcl-2 e la t(8;14)(q24.1;q32) coinvolgente il gene c-myc. La t(9;14)(p13;q32) si riscontra nel 50% dei casi di linfoma linfoplasmocitico, soprattutto nei casi associati a MW; ne pu conseguire la deregolazione del gene PAX-5, che svolge un ruolo importante nel controllo della proliferazione e differenziazione cellulare B (Iida et al., 1986).
11.4 DIAGNOSI DIFFERENZIALE

Una paraproteinemia IgM pu essere riscontrata in altre situazioni patologiche quali MGUS IgM, linfomi e altre malattie linfoproliferative, LLC, amiloidosi primaria, crioagglutininemia, mieloma IgM. I confini fra MGUS IgM e macroglobulinemia di Waldenstrm non sono definiti in modo univoco: sono stati proposti livelli variabili tra i diversi autori sulla concentrazione della componente monoclonale e sull'infiltrazione linfoplasmocitoide midollare come soglia tra una forma e laltra.
58
Di fatto la distinzione fra MGUS e macroglobulinemia di Waldenstrm affidata alla presenza o meno di sintomi clinici e alla evolutivit del quadro laboratoristico e clinico nel tempo.
11
59
BIBLIOGRAFIA
12
Cap. 1 - Lapproccio diagnostico

Catovsky D et al., The Lymphoid Leukaemias, Butterworths, London, 1990 Catovsky D, Rev Clin Exp Hematol, 1: 3, 1997 Dohner H et al., Leukemia 7: 516, 1993 Jennings D et al., Blood 90: 2863, 1997 Harris NL et al., Blood 84: 1361, 1994 Knuutila S, Br J Haematol 96: 2, 1997 Kobayashi H et al., Blood 84: 3473, 1994 Langerak AW et al., Rev Clin Exp Hematol 3: 3, 1997 Matutes E et al., Rev Clin Exp Hematol 4: 22, 2000 Popescu NC et al., Cancer Genet Cytogenet 97: 73, 1997 WeberMatthiesen K et al., Cytogenet Cell Genet 63: 123, 1993
Cap. 2 - Leucemia linfatica cronica

Bennett JM et al., J Clin Path 42: 567, 1989 Binet JL et al., Cancer 48: 198, 1981 Catovsky D et al., The Lymphoid Leukaemias, London, Butterworths, 1990 Catovsky D et al., Blood 58: 406, 1991 Cheson B et al., Blood 87: 4990, 1996 Criel A et al., Br J Haematol 97: 383, 1997 Cordone I et al., Blood 91: 4342, 1998 Damle RN et al., Blood 92: 431a, 1998 Dohner H et al., Blood 89: 2516, 1995 Giles FJ et al., Sem Oncol 25: 117, 1998 Hamblin TJ et al., Blood 92: 515a, 1998 Hanada M et al., Blood 82: 1820, 1993 Juliusson G et al., N Engl J Med 323: 720, 1990 Matutes E et al., Leukemia 8: 1640, 1994 Matutes E et al., Blood 535a (abstr. 2394), 1997 Mauro FR et al., Blood 94: 448, 1999 Melo JV et al., (I) Br J Haematol 63: 377, 1986 Oscier DG et al., Br J Haematol 98: 934, 1997 Rai KR et al., Blood 46: 219, 1975 Rozman C et al., Blood 64: 642, 1984 Vrhovac R et al., Blood 91: 4694, 1998 Zomas AP et al., Leukemia 10: 1966, 1996
61
Cap. 3 - Leucemia prolinfocitica cronica

Catovsky D et al., Lancet 2: 232, 1973 Melo JV et al., (I) Br J Haematol, 63: 377, 1986 Melo JV et al., (II) Br J Haematol, 64: 77, 1986 Melo JV et al., (III) Br J Haematol, 64: 469, 1986 Melo JV et al., (IV) Br J Haematol, 65: 23, 1987 Pittman S et al., Cancer Genet Cytogenet 9: 355, 1983 Tsai LM et al., Cancer 54: 463, 1984
Cap. 4 - Leucemia a cellule capellute

Catovsky D et al., The Lymphoid Leukaemias, Butterworths, London, 1990 Cawley JC et al., Leuk Res 4: 547, 1980 Cuneo A et al., Leuk Lymphoma 15: 167, 1994 de Totero D et al., Blood 82: 528, 1993 Dunphy CH et al., Am J Hematol 53: 121, 1996 Hagland U et al., Blood 83: 2637, 1994 Lehn P et al., Blood 68: 967, 1986 Matutes E et al., Blood 83, 1558, 1994a Matutes E et al., Leuk Lymphoma 14 (suppl1): 57, 1994b Robbins BA et al., Blood 82: 1277, 1993 Sainati L et al., Blood 76: 157, 1990 Zinzani PL et al., Haematologica 75, 54, 1990
Cap. 5 - Linfoma splenico a linfociti villosi

Catovsky D et al., Semin Hematol 36: 148, 1999 Melo JV et al., Leukemia 1: 294, 1987 Mulligan SP et al., Br J Haematol 78: 206, 1991
Cap. 6 - Leucemia a linfociti granulari

Dhodapkar MV et al., Blood 84: 1620, 1994 Fernandez LA et al., Blood 67: 925, 1986 Harris NL et al., Blood 84: 1361, 1994 KawaHa K et al., J Clin Invest 84: 51, 1989 Lamy T et al., Cancer Control 5: 25, 1998 Loughran TP et al., Blood 82: 1, 1993 Moretta L et al., Adv Immunol 55: 341, 1994 Semenzato G et al., Blood 89: 256, 1997 Tefferi A et al., Blood 84: 2721, 1994. Zambello R et al., Leukemia 9: 1207, 1995
Cap. 7 - Leucemia linfatica cronica T

Hoyer JD et al., Blood 86: 1163, 1995 Wong KF et al., Br J Haematol 93: 157, 1996
62
Cap. 8 - Sindrome di Szary

Catovsky D et al., The Lymphoid Leukaemias, Butterworths, London, 1990 Harris NL et al., Blood, 84: 1361, 1994 Sezary A et al., Bull Soc Fr Dermatol Syph, 45: 254, 1948 Wieselthier JS et al., J Am Acad Dermatol 22: 381, 1990 Willemze R et al., Blood 90: 354, 1997 Willemze R et al., J Invest Dermatol 81: 392, 1983
12
Cap. 9 - Linfomi indolenti

Carbone PP et al., Cancer Res 31: 1860, 1971 Harris NL et al., J Clin Oncol 17: 3835, 1999 Harris NL et al., Blood 84: 1361, 1994 Iacsson P et al., Cancer 52: 1410, 1983 Lennert K et al., Histopathology of NHL. New York: SpringerVerlag, 1992 Mazzaro C et al., Cancer 77: 2604, 1996 Sheibani K et al., Cancer 62: 1531, 1988 Schmid C et al., Am J Surg Pathol 16: 455, 1992 Thieblemont C et al., Blood 95: 802, 2000 Zucca E et al., Ann Oncol 5: 507, 1994
Cap. 10 - Mieloma multiplo

Ameis A et al., Can Med Assoc J 114: 889, 1976 Durie BGM et al., Cancer 36: 842, 1975 Feinman et al., Hematol Oncol Cl N Am 11: 1, 1997 Facon T et al., VII Int. Multiple Myeloma Workshop Abst. 17, 1999 Harada H et al., Blood, 81: 2658, 1993 Galieni P et al., Ann Oncol 6: 687, 1995 Luc Lai J et al., Blood 85: 2490, 1995 Tabernero D et al., Am J Pathol 149: 153, 1996 Teoh G et al., Hematol Oncol Cl N Am 11: 27, 1997
Cap. 11 - Macroglobulinemia di Waldenstrm

Brouet JC Am J Med 57: 775, 1974 Farhangi M et al., Semin Oncol 13: 366, 1986 Groves FD et al., Cancer 82: 1078, 1998 Iida S et al., Blood 88: 4110, 1996 Jensen JS et al., Am J Hematol 37: 20, 1991 Linet MS et al., Leukemia 7: 1363, 1993 McCallister BD et al., Am J Med 43: 394, 1967 Palka G et al., Cancer Genet Cytogenet 29: 261, 1987 Pruzanski W et al., N Engl J Med 297: 538, 1977 Ropper AH et al., N Engl J Med 338: 1601, 1998
63
Si ringrazia Schering-Plough S. p. A. Divisione di Biologia Molecolare per il sostegno offerto per la realizzazione del volume Depositato Min. San. 24/10/2000 MATERIALE PROMOZIONALE VIETATA LA VENDITA Finito di stampare nel mese di dicembre 2000 Servizio Stampa EFFE di Ugo Fraccaroli - Verona

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EMATOLOGIA

direttori della collana Franco Mandelli, Giuseppe Avvisati

DIAGNOSI E CLASSIFICAZIONE DELLE MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE

ACCADEMIA NAZIONALE DI MEDICINA

DIAGNOSI E CLASSIFICAZIONE DELLE MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE

Proposta di un percorso diagnostico razionale nelle malattie linfoproliferative croniche leucemizzate

Emocromo Osservazione microscopica sangue periferico Immunofenotipo sangue periferico

Biopsia ossea Biopsia linfonodale Biopsia ossea

LLC LPC HCL HCL variante Szary Waldenstrom

Microscopia elettronica Ricerca componente sierica

LASPIRATO MIDOLLARE E LA BIOPSIA OSSEA

DIAGNOSI E CLASSIFICAZIONE DELLE MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE

Caratteristiche morfologiche dei disordini linfoproliferativi B leucemizzati (TdT )

addensata medio irregolarmente

GLI ANTICORPI MONOCLONALI

DIAGNOSI E CLASSIFICAZIONE DELLE MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE

I MARCATORI DELLE CELLULE B

DIAGNOSI E CLASSIFICAZIONE DELLE MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE

Marcatori immunologici nei disordini linfoproliferativi B leucemizzati (TdT )

I MARCATORI DELLE CELLULE T E NK

DIAGNOSI E CLASSIFICAZIONE DELLE MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE

DIAGNOSI E CLASSIFICAZIONE DELLE MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE

DIAGNOSI E CLASSIFICAZIONE DELLE MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE

LEUCEMIA LINFATICA CRONICA

CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE E IMMUNOFENOTIPICHE

DIAGNOSI E CLASSIFICAZIONE DELLE MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE

BIOPSIA OSTEOMIDOLLARE E LINFONODALE

DIAGNOSI E CLASSIFICAZIONE DELLE MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE

CARATTERISTICHE CITOGENETICHE E MOLECOLARI

ALTRE INDAGINI DA CONSIDERARE ALLA DIAGNOSI

DIAGNOSI E CLASSIFICAZIONE DELLE MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE

VALUTAZIONE DELLO STADIO

Classificazione della LLC in stadi secondo Rai

Classificazione della LLC in stadi secondo Binet

DIAGNOSI E CLASSIFICAZIONE DELLE MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE

LEUCEMIA PROLINFOCITICA CRONICA

CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE, IMMUNOFENOTIPICHE E CITOGENETICHE

DIAGNOSI E CLASSIFICAZIONE DELLE MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE

Caratteristiche cliniche e biologiche della B-LLC e della B-LPC

LEUCEMIA A CELLULE CAPELLUTE

CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE, IMMUNOFENOTIPICHE E MOLECOLARI

DIAGNOSI E CLASSIFICAZIONE DELLE MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE

DIAGNOSI E CLASSIFICAZIONE DELLE MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE

LINFOMA SPLENICO A LINFOCITI VILLOSI

CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE, IMMUNOFENOTIPICHE E CITOGENETICHE

DIAGNOSI E CLASSIFICAZIONE DELLE MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE

ISTOLOGIA SPLENICA E BIOPSIA OSTEOMIDOLLARE

LEUCEMIE A LINFOCITI GRANULARI

ESPANSIONI LGL CD3 +

CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE E IMMUNOFENOTIPICHE

DIAGNOSI E CLASSIFICAZIONE DELLE MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE

ESPANSIONI LGL A FENOTIPO NK

6.2A LINFOCITOSI CRONICA A FENOTIPO NK

6.2B LEUCEMIA A LINFOCITI GRANULARI A FENOTIPO NK

DIAGNOSI E CLASSIFICAZIONE DELLE MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE

LEUCEMIA LINFATICA CRONICA T

CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE, IMMUNOFENOTIPICHE E MOLECOLARI

DIAGNOSI E CLASSIFICAZIONE DELLE MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE

CARATTERISTICHE CITOMORFOLOGICHE, IMMUNOFENOTIPICHE E MOLECOLARI

DIAGNOSI E CLASSIFICAZIONE DELLE MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE

DIAGNOSI E CLASSIFICAZIONE DELLE MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE

Accertamenti indicati per la stadiazione dei linfomi indolenti