Validacion de Dexa Sodio Fosfato

CAPTULO 2
Desarrollos Analticos
Captulo2-Desarrollos Analticos
2.1. DETERMINACIN DE DEXAMETASONA FOSFATO DE SODIO EN INYECTABLES 2.1.1. DEXAMETASONA FOSFATO DE SODIO. CARACTERSTICAS Y ANTECEDENTES ANALTICOS La dexametasona fosfato de sodio (DEX), [21-fosfato disdico (9-fluor-11, 17,21-trihidroxi-16methilpregna-1,4-dieno-3,20-diona)] (Esquema 2.1), es un glucocorticoide sinttico que posee una potente accin antiinflamatoria y prcticamente nula la potencia para retener Na(I). Se usa en el tratamiento del edema cerebral, por diferentes causas como tumores o traumatismos. Se emplea en administracin parenteral en las unidades de terapia intensiva y en emergencias. Acta como principio activo en distintos tipos de preparaciones farmaceticas, como inyectables en forma intramuscular, endovenoso o intra-articular. Se aplica tambin en tratamientos locales para enfermedades de la piel, en gotas oftlmicas, y por inhalacin para controlar los sntomas de asma y broncoespasmos (Godman Gilman, 1996).
O HO Me F O H H Me OH
ONa
O Me
ONa
Esquema 2.1: Frmula estructural de la dexametasona fosfato de sodio Cuando se usa en soluciones inyectables, esta acompaada por excipientes tales como metil y propilparabeno, creatinina, sulfito cido de sodio, citrato de sodio e hidrxido de sodio (Martindale, 1993). La Farmacopea Norteamericana USP XXIV (USP, 2000) y la Farmacopea Britnica (BP, 1998) proponen la determinacin de dexamentasona mediante el empleo de cromatografa lquida de alto rendimiento (HPLC), con deteccin a 254 nm. Se han publicado trabajos cientficos para la determinacin en diferentes preparaciones farmaceticas mediante espectroscopia UV (Chen, 1991; Xi, 1991), HPLC (Santos Montes, 1994; Liu, 1994; Gagne, 1980; Das-Gupta, 1979; Yao, 1988),
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combinacin de espectrofotometra derivada y mtodos multivariados (Lemus-Gallego, 2001), espectrometra de masa mltiple (de-Wasch, 2000), cromatografa micelar electrocintica capilar (Lemus-Gallego, 2001), quimioluminiscencia mediante inyeccin de flujo (Wu, 2001) y cromatografa en capa delgada (Datta, 1993; Das, 1986). Tambin se ha determinado en suero y orina empleando cromatografa lquida de alto rendimiento (HPLC) (McWhinney, 1996), y en plasma por HPLC y derivatizacin fluorescente (Wu, 1995). 2.1.2. OPTIMIZACIN Y VALIDACIN DE UN MTODO ESPECTROFOTOMTRICO PARA LA DETERMINACIN DE DEXAMETASONA FOSFATO DE SODIO EN INYECTABLES 2.1.2.1. MTODO ANALTICO En el presente trabajo se utiliz un mtodo analtico espectrofotomtrico para la determinacin de fsforo, que puede adaptarse a diferentes muestras. El mismo, es un mtodo colorimtrico basado en la reaccin entre el grupo fosfato, obtenido en este caso por calcinacin y el molibdato de sodio para dar fosfomolibdato. Luego, este ltimo es reducido con cido ascrbico a azul de molibdeno, leyndose la absorbancia a una longitud de onda de 702 nm (Vanderlinde, 1971). El procedimiento analtico seguido, tanto para las muestras comerciales como para las soluciones patrones, se detalla a continuacin:
En un tubo de vidrio de capacidad adecuada, se coloc 20.0 l de muestra y 80.0 l de solucin de cloruro de magnesio. Este ltimo se utiliza para evitar la volatilizacin del fsforo. Se sec el tubo en estufa a 100 C durante 20 minutos. Se calcin la muestra, colocando el tubo en la llama de un mechero durante dos minutos. Se realiz la reaccin de color, agregando en el mismo tubo: 1.0 ml de reactivo A, 1.0 ml de reactivo B y 1.5 ml de reactivo C (Las composiciones de los reactivos A, B y C se detallan ms adelante).
Se homogeneiz el contenido colocando el tubo en un agitador vortex. Se incub durante 15 minutos a 37 C, colocando el tubo en bao termostatizado. Se transfiri de manera cuantitativa el contenido del tubo a un matraz aforado de 5.00 ml, agregando agua destilada hasta la marca. Se ley la absorbancia a 702 nm.
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2.1.2.1.1. EQUIPAMIENTO Las lecturas de absorbancia se realizaron en un espectrofotmetro marca Perkin Elmer, modelo Lamba 20, usando celdas de cuarzo de 1.00 cm de camino ptico. Los datos obtenidos fueron transferidos a una PC Pentium 1 GHz, para su tratamiento posterior. Las determinaciones por HPLC se realizaron en un cromatgrafo marca Shimadzu equipado con dos bombas, detector UV (215 nm) e inyector manual (20 l). Los programas utilizados para diseo experimental y para las pruebas estadsticas fueron: Unscrumbler 7.6, Matlab 5.3 y Sigma Plot 5.0. 2.1.2.1.2. REACTIVOS Los reactivos necesarios para llevar a cabo el procedimiento analtico, se prepararon a partir de drogas calidad para anlisis y de acuerdo a lo que se detalla a continuacin: a- Reactivo A: se disolvieron 605 mg de molibdato de sodio dihidrato en 50.0 ml de agua destilada, se agregaron 10.7 ml de cido clorhdrico concentrado y finalmente se ajust el volumen a 100.0 ml. b- Reactivo B: se disolvieron 2.50 g de cido ascrbico en 50.0 ml de agua destilada y luego se llev a un volumen final de 100.0 ml. c- Reactivo C: se disolvieron 3.56 g de xido de arsnico (III), 1.70 g de hidrxido de sodio y 3.00 g de citrato de sodio en 150 ml de agua destilada. Se ajust el pH a 10.7 con cido sulfrico 2 mol l1 y se llev a un volumen final de 200 ml. d- Solucin de cloruro de magnesio: se prepar en agua destilada con una concentracin de 1.5 103 mol l1. Se prepar adems una solucin stock de dexametasona fosfato de sodio y un blanco de matriz a partir de los excipientes ms usados en las preparaciones farmacuticas, siguiendo el procedimiento que se detalla a continuacin: a- Solucin stock: se disolvi dexametasona fosfato de sodio (sal disdica) en agua bidestilada, de manera de lograr una concentracin de 1000.00 g ml1. b- Blanco de matriz: se prepar en agua destilada una solucin de 800.00 g ml1 de creatinina, 300.00 g ml1 de propylparabeno, 2.02 mg ml1 de sulfito cido de sodio, 1.13 mg ml1 de citrato de sodio y 1.60 mg ml1 de hidrxido de sodio. Las muestras comerciales del inyectable que se analizaron, tenan un contenido declarado de dexametasona fosfato de sodio de 4 mg ml1 juntamente con los excipientes antes mencionados. Se
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trabaj con dos marcas comerciales: Dexametasona Larjan (Laboratorios Larjan, Argentina) y Dexametasona Biocrom (Laboratorios Biocrom, Argentina). 2.1.2.2. OPTIMIZACIN En el presente trabajo, se eligi como funcin objetivo una cifra de mrito: la precisin, y se trabaj para minimizar el coeficiente de variacin (CV%) del mtodo analtico. En primer lugar se seleccionaron las variables ms importantes, es decir los factores que tenan un efecto significativo sobre la respuesta elegida, utilizando un diseo experimental de Plackett-Burman (Morgan, 1995; Sanz, 1999). Los factores estudiados fueron: Factor A: tiempo de calcinacin Factor B: cantidad de solucin de cloruro de magnesio agregada Factor C: uso o no de material volumtrico para obtener el volumen final de reaccin Factor D: posicin para el calentamiento durante la etapa de calcinacin Para calcular el coeficiente de variacin, se realizaron cuatro replicados para cada experiencia. En la Tabla 2.1 se muestran los niveles seleccionados para cada factor y la respuesta (CV%)obtenida.
Tabla 2.1: Anlisis de los efectos con un diseo Plackett-Burman Experimento 1 2 3 4 5 6 7 8

a b
Factor Aa + + + +
Factor Bb + + + +
Factor Cc + + + +
Factor Dd + + + +
Respuesta: (CV%) 0.52 0.90 1.30 0.79 1.08 0.77 0.15 1.60
Tiempo de calcinacin: +, 2 min.; , 1 min. Cantidad de cloruro de magnesio agregada (ml de solucin 1.5 103 mol l1): +, 0.050 ml; , 0.030 ml. o no de material volumtrico para obtener el volumen final: +, si; , no. Posicin en que se hizo el calentamiento en el paso de la calcinacin: +, superior; , inferior.
c Uso d
109
Para analizar los resultados obtenidos se aplic una prueba de ANOVA y se determin que los factores que tenan un efecto significativo, con una probabilidad asociada menor a 0.05 (p<0.05), eran el tiempo de calcinacin y la cantidad de solucin de cloruro de magnesio agregada. Por lo tanto, estos fueron los factores estudiados, a los fines de encontrar sus valores ptimos. Para esto, se trabaj con un diseo factorial completo a tres niveles (32) y a partir de los datos obtenidos se obtuvo una superficie de respuesta, utilizando una funcin polinmica de segundo orden. En la Tabla 2.2 se muestran los niveles seleccionados para cada factor y la respuesta (CV%) obtenida.
Tabla 2.2: Diseo factorial completo a tres niveles para aplicar la metodologa de superficie de respuesta Experimento 1 2 3 4 5 6 7 8 9
a b
Factor Aa +1 +1 +1 0 0 0 1 1 1
Factor Bb 1 0 +1 1 0 +1 1 0 +1
Respuesta (CV%) 0.68 1.30 1.13 7.70 1.12 5.28 4.20 5.40 0.70
Niveles para tiempo de calcinacin: +1 = 4 min, 0 = 3 min y 1 = 2 min. Niveles para la cantidad de cloruro de magnesio agregada (ml de solucin 1.5 103 mol l1):
+1 = 0.100, 0 = 0.060 y 1 = 0.020.
En la ecuacin (2.1) se puede observar el modelo matemtico polinmico utilizado: y = o + 1 x 1 + 2 x2 + 3 x 1 x 2 + 4 x 1 2 + 5 x 2 2 + la ecuacin 2.1 incluye interacciones (3) y trminos cuadrticos (4 y 5). (2.1)
donde xi son los factores analizados (A y B) y i son los coeficientes de regresin. Como se puede ver,
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Mediante un ajuste por cuadrados mnimos se obtuvieron los siguientes parmetros: y = 0.332 + 0.111 x1 0.213 x2 + 0.444 x1 x2 + 0.108 x12 + 0.425 x22 (2.2)
De acuerdo al ajuste realizado y mediante la derivacin de la ecuacin 2.2, se encontr que los valores de los factores correspondientes a la mnima respuesta (CV%=0.077) y consecuentemente a la mxima precisin eran: tiempo de calcinacin, 2 min (nivel: 1), y cantidad de solucin de cloruro de magnesio, 0.080 ml (nivel: 0.8). En la Figura 2.1 se puede observar la superficie de respuesta obtenida y en la Figura 2.2 las correspondientes grficas de contorno.
1.5
1.2
Respuesta
0.9
0.6
0.3
0.0 -1.0 -0.5
-1.0 0.0 -0.5 0.5 0.0 0.5 1.0 1.0
Fac
t or
Fact
or A
Figura 2.1: Superficie de respuesta estimada con un diseo factorial completo (32) para tiempo de calcinacin (Factor A) y cantidad de solucin de cloruro de magnesio (Factor B)
111
1.0
0.08 0.16
0.5
1.04 0.96 0.88 0.80 0.72 0.64 0.56 0.24
Factor B
0.32
0.0
0.40 0.48
-0.5
0.56 0.64 0.72
-1.0 -1.0
0.960.88 1.04 1.12 1.20 1.28

-0.5
0.80
0.0
0.5
1.0
Factor A
Figura 2.2: Grfica de contorno correspondiente la Figura 2.1
2.1.2.3. VALIDACIN Una vez determinados los valores ptimos de los factores con efecto significativo sobre la respuesta, se procedi a la validacin del mtodo analtico. Para esto se evaluaron los siguientes parmetros de funcionamiento: Linealidad: Se trabaj analizando soluciones patrones de cinco concentraciones diferentes, por triplicado. Se prepararon quince soluciones con: 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 y 6.0 g l1 de dexametasona fosfato de sodio, correspondientes a un intervalo que va del 50 al 150 % de las concentraciones usualmente presentes en las muestras comerciales (Green, 1996). Para describir la relacin entre la absorbancia y la concentracin de dexametasona fosfato de sodio, se utiliz regresin lineal ordinaria y los resultados obtenidos fueron: Absorbancia = 123.8 + 84.7 x Concentracin Dado que el valor del estadstico r2 fue 0.9982, se concluy que el modelo explica el 99.82 % de la variabilidad en la absorbancia. Adems se realiz la prueba de anlisis de la varianza residual para evaluar linealidad y se determin un rango lineal de 2.0 6.0 g l1, siendo los lmites de deteccin y de cuantificacin los siguientes: LOD = 0.19 g l1 y LOQ = 0.65 g l1 respectivamente.
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Por otra parte, se determin que la sensibilidad analtica es: 1 = 0.065 g l1, lo que representa un parmetro razonablemente bueno, si se tiene en cuenta que representa aproximadamente un 1.5 % de la concentracin que dara un medicamento cuya dosis es del 100 %. Precisin Para evaluar precisin se trabaj con muestras comerciales marca Biocrom. A los fines de evaluar repetibilidad y precisin intermedia, se realizaron diez determinaciones durante tres semanas consecutivas. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 2.3, donde puede observarse que el CV% esta por debajo de 2 % para ambos tipos de imprecisin analizados.
Tabla 2.3: Resultados obtenidos en muestras comerciales en un estudio de precisin realizado durante tres semanas consecutivas Muestras 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Promedio Desviacin estndar CV% Promedio general Desviacin estndar general CV% general Dexametasona fosfato de sodio encontrado (g l1) Semana 1 3.72 3.66 3.57 3.68 3.70 3.77 3.55 3.66 3.73 3.64 3.67 0.067 1.88 Semana 2 3.66 3.68 3.57 3.56 3.73 3.57 3.66 3.67 3.62 3.65 3.64 0.056 1.53 3.66 0.062 1.69 Semana 3 3.75 3.72 3.57 3.65 3.66 3.74 3.60 3.71 3.70 3.62 3.67 0.062 1.68
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Exactitud La exactitud del mtodo analtico se evalu de dos maneras: a) por medio de un experimento de recuperacin y b) comparando los resultados obtenidos sobre muestras comerciales, con los de un mtodo cromatogrfico propuesto en la Farmacopea Americana (USP). Para realizar el experimento de recuperacin, se agreg una cantidad de dexametasona fosfato de sodio al blanco de matriz, correspondiente al 100 % de la concentracin en las muestras comerciales. Luego, se realizaron diez determinaciones y se calcul el porcentaje de recuperacin promedio, que result R = 100.3 0.5 %. Para realizar la comparacin de mtodos, se trabaj sobre cuatro muestras comerciales, las que se analizaron por triplicado con el mtodo cromatogrfico y el presente mtodo espectrofotmtrico. Los valores medios se compararon mediante una prueba t y se determin que no haba diferencias estadsticamente significativas entre ellos. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 2.4.
Tabla 2.4: Anlisis comparativo con el mtodo cromatogrfico propuesto la USP. Resultados obtenidos sobre cuatro muestras comerciales mediante aplicacin de ambos mtodos Muestras (lotes diferentes) 1 2 3 4
a b c
Mtodo Espectrofotomtricoa (g l1) 3.80 (0.05) 3.78 (0.04) 3.72 (0.08) 3.59 (0.07)
Mtodo Cromatogrficob 3.71 (0.04) 3.87 (0.04) 3.69 (0.05) 3.72 (0.06)
t student
2.44 (DENS)c 2.74 (DENS)c 0.55 (DENS)c 2.44 (DENS)c
Tres replicados. Valores entre parntesis corresponden a desviacin estndar. Tres replicados. Valores entre parntesis corresponden a desviacin estndar. DENS: diferencia estadsticamente no significativa considerando que el valor tabulado del estadstico es 2.78
para un nivel de significancia igual a 0.05.
114
2.1.2.4. CONCLUSIONES En el presente trabaj se optimiz un mtodo simple y rpido para la determinacin de dexametasona fosfato de sodio en inyectables, basado en la reaccin del grupo fosfato obtenido por calcinacin con molibdato de sodio y cido ascrbico para dar azul de molibdeno. Posteriormente se lo valid y se determin que los parmetros de funcionamiento respecto a exactitud y precisin eran muy buenos. Con respecto al anlisis convencional por HPLC, el presente mtodo tiene la ventaja de que es ms adecuado para el caso en que se debe analizar una gran cantidad de muestras, por la reduccin sustancial del tiempo de anlisis, siendo, por otra parte mucho ms econmico. Por esta razn, se concluye que el mismo puede ser utilizado en el laboratorio para el control de calidad del inyectable estudiado. 2.1.3. DETERMINACIN SIMULTNEA DE DEXAMETASONA FOSFATO DE SODIO Y DE DOS EXCIPIENTES (CREATININA Y PROPILPARABENO) EN INYECTABLES 2.1.3.1. MTODO ANALTICO En el presente trabajo se desarroll un mtodo analtico basado en la combinacin de una espectrofotometra UV y un mtodo de calibracin multivariada, para realizar la determinacin simultnea de dexametasona fosfato de sodio y de dos excipientes: creatinina y propilparabeno, presentes en inyectables. Como mtodo de calibracin multivariada se utiliz PLS-1. El procedimiento analtico seguido, tanto para las muestras comerciales como para las muestras de calibracin y validacin, se detalla a continuacin: a- Se realiz una dilucin de las muestras, tomando un volumen de 1.00 ml y llevando con agua bidestilada a 500.00 en matraz aforado. b- Se obtuvieron los espectros de absorcin electrnica en el rango 200-350 nm. 2.1.3.1.1. EQUIPAMIENTO Las lecturas de absorbancia se realizaron en un espectrofotmetro marca: Perkin Elmer, modelo: Lamba 20, usando celdas de cuarzo de 1.00 cm de camino ptico. Los espectros de absorcin electrnica fueron convertidos a formato ASCII y se transfirieron a una PC Pentium 550, para su tratamiento posterior. Las determinaciones por HPLC se realizaron en un cromatgrafo marca Shimadzu equipado con dos bombas, detector UV (215 nm) e inyector manual (20 l).
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El mtodo PLS-1 se aplic utilizando el programa MULTIVAR (Goicoechea, 2000). Para el anlisis de regresin y el tratamiento estadstico de los datos, se utiliz el programa Sigma Plot 5.0. Programa MULTIVAR El programa MULTIVAR esta escrito en Visual Basic 5.0 y tiene las siguientes funciones: 1. General: funciones generales y procesamiento de datos. 1) Seleccin del mtodo: permite seleccionar el mtodo multivariado de trabajo (PCR, PLS-1, HLA, etc.). 2) Tipo de datos utilizados (Data Type): los datos pueden ser tipo ASCII_X,Y, correspondientes a archivos en formato ASCII conteniendo dos columnas, una con las longitudes de onda y otra con los valores de respuesta (absorbancias), y tipo ASCII_X, correspondientes a una columna con las respuestas. 3) Centrado de los datos (Center Data): se activa por defecto y permite realizar el centrado de los datos. 4) Rango de los sensores (Range of sensors): se pueden definir hasta tres diferentes rangos de los sensores. Estos deben ser especificados en trminos del nmero de entrada en el archivo formato ASCII correspondiente y no del valor especfico del sensor. Por ejemplo, cuando el rango es 210-300 nm, corresponde asignar 1-91. 5) Salir (Quit Program): permite terminar con la aplicacin del programa y volver a Windows. 2. Validacin cruzada (Cross Validation) 1) Archivo de calibracin (Calibration File): permite seleccionar el disco, directorio y archivo de trabajo. Este ltimo archivo debe ser de formato ASCII y contener la informacin relativa a las muestras de calibracin, concentraciones y nombres de los archivos con los espectros correspondientes. 2) Clculo del PRESS en funcin del nmero de factores (PRESS Factors): permite asignar el nmero mximo de factores utilizados para realizar la validacin cruzada.
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3) Nombre del archivo para grabar los resultados del clculo del PRESS (Filename for saving PRESS results): se debe colocar el nombre del archivo donde se guardarn los resultados de la validacin cruzada. El nombre por defecto es PRESS.TXT, pero puede ser cambiado. 4) Validacin cruzada (Cross Validation): botn que permite iniciar los clculos de validacin cruzada. Los resultados aparecen en una nueva ventana, desde la que se puede regresar a la ventana principal con el botn men principal (main menu). 5) Ventana PRESS (PRESS Screen): botn que permite ver la ventana con los resultados de validacin cruzada. 3. Calibracin y prediccin (Calibration and Prediction) 1) Nmero de factores (Number of Factors): se coloca el nmero ptimo de factores obtenido por validacin cruzada. 2) Scores de PLS o PCR (PCR or PLS Scores): esta opcin permite guardar los scores en un archivo (en PCR son llamados T1.TXT, T2.TXT, etc., mientras que en PLS son llamados TA1.TXT, TA2.TXT, etc.). Estos nombres no pueden ser cambiados. En los mtodos basados en clculos de NAS no hay scores. 3) Coeficientes de regresin (Regresion Coefficients): permite guardar los coeficientes de regresin (archivo BF.TXT, cuyo nombre puede ser cambiado). 4) Archivo de informe (Report File): nombre del archivo para guardar el informe de la prediccin (por defecto es REPORT.TXT y puede ser cambiado). 5) Calibracin (Calibrate): permite realizar la calibracin. En este caso, se crean archivos llamados R1, R2, etc. La informacin guardada depende del mtodo de trabajo seleccionado: en PCR contienen factores espectrales de la matriz de datos, en PLS contienen residuos en seales y concentraciones, weight loading factors y loading factors, y en mtodos basados en clculos de NAS, contienen factores espectrales de la matriz R-k. Tambin se crean archivos llamados BNAS1, BNAS2, etc., que contienen factores espectrales de la matriz R-k (para PCR y PLS), cuyos nombres no pueden ser cambiados. Los resultados concernientes a sensibilidad y selectividad aparecen en una nueva ventana, desde la que se puede volver accionando main menu. 6) Pantalla con los resultados (Results Screen): permite volver a ver la pantalla con los resultados de calibracin.
117
7) Nombre del archivo de la muestra (Sample Filename): se tienen dos opciones. Simple (Single), que permite seleccionar el archivo conteniendo el espectro de una muestra desconocida y Mltiple (Multiple), que permite la seleccin de un archivo de texto conteniendo una lista de archivos correspondientes a espectros de muestras incgnitas. 8) Archivo con los residuos (Residues File): nombre del archivo donde se guardan los residuos espectrales. El nombre por defecto es RESIDUES.TXT puede ser cambiado. 9) Archivo NASRP (NASRP file): nombre del archivo donde se guardan los datos para la construccin de las NASRP (que contiene dos columnas, la primera es la NAS del analito puro 10) y la segunda es la NAS de la muestra). El nombre por defecto es NAS.TXT y puede ser cambiado. 11) Prediccin (Predict): botn para realizar la prediccin. Los resultados aparecen en una nueva ventana desde la que se puede regresar accionando main menu. 12) Pantalla de resultados (Results Screen): permite volver a observar la ventana con los resultados de la prediccin. 4. Seleccin de variables (Variable Selection) 1) Ventana espectral (Spectral Window): se especifica el mnimo tamao de la ventana utilizada para calcular el error indicador (EI). 2) Seleccin de factores (Selection Factors): se especifica el nmero mximo de factores para calcular EI. 3) Archivo para seleccin de PRESS (PRESS Select file): nombre del archivo para guardar los resultados de la seleccin del PRESS. El nombre por defecto es SELPRESS.TXT y puede ser cambiado. 4) Archivo para el error indicador (EI) de la muestra (Sample EI file): nombre del archivo para guardar los valores de EI para una muestra dada en funcin del primer sensor y la ventana. El archivo EI.TXT contiene cinco columnas: primer sensor, ventana espectral, EI, nmero ptimo de factores y concentracin predicha. El nombre puede ser cambiado. 5) Seleccin de la muestra (Sample Select): botn para comenzar la seleccin para una muestra dada. Esta operacin puede ser lenta, dependiendo del ancho espectral elegido. Los resultados correspondientes al EI mnimo aparecen en una nueva pantalla, desde la que se puede regresar a la pantalla principal apretando main menu.
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6) Seleccin del PRESS (PRESS Select): comienza la seleccin basada en la bsqueda del PRESS mnimo. Esta operacin puede ser lenta, dependiendo del ancho espectral elegido. Los resultados correspondientes al PRESS mnimo aparecen en una nueva pantalla, desde la que se puede regresar a la pantalla principal apretando main menu. 7) Pantalla de seleccin (Select Screen): permite volver a ver la pantalla con los resultados de la seleccin. La pantalla del programa esta est dividida en cuatro regiones horizontales, como puede observarse en la Figura 2.3.
Figura 2.3: Pantalla del programa MULTIVAR
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2.1.3.1.2. REACTIVOS Los reactivos necesarios para realizar el procedimiento analtico, se prepararon a partir de drogas calidad para anlisis y de acuerdo a lo que se detalla a continuacin: a) Solucin stock de dexametasona fosfato de sodio: se disolvi dexametasona fosfato de sodio (sal disdica) en agua bidestilada, de manera de lograr una concentracin de 600.00 mg l1. b) Solucin stock de creatinina: se prepar una solucin de 800.00 mg l1por disolucin de la droga slida en agua bidestilada. c) Solucin stock de propilparabeno: se prepar una solucin de 300.00 mg l1por disolucin de la droga slida en agua bidestilada. d) Solucin stock de excipientes restantes: se prepar por una solucin conteniendo 2.02 mg ml1 de sulfito cido de sodio, 1.13 mg ml1 de citrato de sodio y 1.60 mg ml1 de hidrxido de sodio en agua destilada. Se trabaj adems, con una muestra comercial: Dexametasona Larjan (Laboratorios Veinfar, Argentina), con un contenido (por ml) de 4.0 mg de dexametasona fosfato de sodio, 6.4 mg de creatinina y 1.4 mg de propilparabeno. 2.1.3.1.3. DISEO DEL JUEGO DE MUESTRAS DE CALIBRACIN Para la calibracin, se prepar un juego de 15 muestras siguiendo un diseo central compuesto. Las muestras se prepararon por dilucin de una cantidad adecuada de las soluciones stock, de manera que la concentracin de los componentes en las muestras abarque el intervalo: 80 a 120 % de las cantidades presentes en las muestras comerciales (Green, 1996). Adems, se verific que las concentraciones seleccionadas se encuentren dentro del rango de respuesta lineal. En la Tabla 2.5 se puede observar la composicin de estas muestras.
120
Tabla 2.5: Composicin del juego de muestras de calibracin de acuerdo a un diseo central compuesto para la aplicacin del mtodo PLS-1 Muestras de calibracin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
a
DEX (mg L1) 2.50 2.50 2.50 2.50 9.50 9.50 9.50 9.50 0.00 12.00 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00
CRE (mg L1) 4.00 4.00 15.00 15.00 4.00 4.00 15.00 15.00 9.50 9.50 0.00 19.20 9.50 9.50 9.50
PRO (mg L1) 0.85 3.20 0.85 3.20 0.85 3.20 0.85 3.20 2.00 2.00 2.00 2.00 0.00 4.00 2.00
Excipientes (%)a 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
El % es relativo al blanco usual del inyectable comercial.
2.1.3.1.4. DISEO DE LOS JUEGOS DE MUESTRAS DE VALIDACIN Se trabaj con dos juegos de muestras de validacin. Para el juego nmero uno, se prepararon tres grupos de 15 muestras cada uno, los que fueron analizados en tres semanas consecutivas de trabajo. Estas muestras contenan tres niveles diferentes de los compuestos estudiados, en concentraciones similares a la de las muestras comerciales 20% y un nivel de los otros excipientes correspondiente al 100% (ver Tabla 2.6). Las muestras se prepararon por dilucin de cantidades adecuadas de las soluciones stock. Esta experiencia permiti determinar la exactitud y la precisin intra e inter-ensayo del mtodo analtico.
121
Tabla 2.6: Composicin del juego nmero uno de muestras de validacin
Muestras de validacin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
a
DEX (mg l1) 6.40 6.40 6.40 6.40 6.40 8.00 8.00 8.00 8.00 8.00 9.60 9.60 9.60 9.60 9.60
CRE (mg l1) 12.80 12.80 12.80 12.80 12.80 12.80 12.80 12.80 12.80 12.80 12.80 12.80 12.80 12.80 12.80
PRO (mg l1) 2.70 2.70 2.70 2.70 2.70 2.70 2.70 2.70 2.70 2.70 2.70 2.70 2.70 2.70 2.70
Excipientes (%)a 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
El % es relativo al blanco usual del inyectable comercial.
El juego nmero dos, consisti en quince muestras preparadas con concentraciones de dexametasona fosfato de sodio comprendidas en el intervalo: 50 a 150%, de la cantidad usualmente presente en las muestras comerciales. A partir de esta experiencia, se calcul el % de recuperacin y se construy un grfico de cantidad predicha versus cantidad adicionada, con el correspondiente intervalo de confianza conjunto para la pendiente y la ordenada al origen. 2.1.3.2. RESULTADOS En la Figura 2.4, se muestran los espectros de dexametasona, creatinina y propilparabeno en soluciones acuosas. Como puede observarse, existe un fuerte solapamiento de los componentes, lo que impide el anlisis por espectroscopia convencional.
122
En el presente trabajo se aplic PLS-1, que como se discuti en el Captulo Introduccin, es uno de los mtodos de calibracin multivariada ms comnmente utilizados para resolver este tipo de mezclas.
1 .6
1 .2
Absorbancia
0 .8
0 .4
0 .0
200 225 250 275 300
L o n g it u d d e o n d a ( n m )
Figura 2.4: Espectros de absorcin electrnica en solucin acuosa para: dexametasona (8.0 mg l1 (rojo)), creatinina (12.8 mg l1(negro)) y propilparabeno (2.7 mg l1 (blanco)) La seleccin del nmero ptimo de factores a usar con el algoritmo de PLS-1 durante la etapa de calibracin, es un aspecto fundamental para alcanzar un mejor funcionamiento en la etapa de prediccin. Esto permite modelar el sistema con la cantidad ptima de informacin, evitando el sobreajuste. Para esto se utiliz el procedimiento de validacin cruzada y el criterio de Haaland y Thomas (Haaland, 1988). La seleccin de la regin espectral de trabajo, tambin es un punto crtico en el anlisis multivariado, ya que permite disminuir los errores de prediccin al eliminar zonas sin informacin y/o datos altamente correlacionados. En el presente trabajo, se aplic una estrategia de ventana mvil a los fines de encontrar la regin ptima para la calibracin. Mediante esta estrategia, se determin la zona del
123
espectro con mayor cantidad de informacin, por localizacin del PRESS mnimo (Collado, 2000; Luis, 2001). La Tabla 2.7 muestra: el nmero ptimo de factores encontrado, la regin espectral ptima y los parmetros estadsticos indicadores de la calidad del ajuste realizado.
Tabla 2.7: Nmero ptimo de factores, regin espectral ptima y parmetros estadsticos indicadores de la calidad del ajuste realizado con PLS-1
Dexametasona Regin espectral (nm) N de Factores PRESS (mg l1 105)2 RMSECV (mg l1 105) REP% r2 220-320 4 0.0796 0.075 1.311 0.9995
Creatinina 240-280 4 0.0716 0.0691 0.97 0.9998
Propilparabeno 260-340 4 0.0242 0.0402 0.97 0.9997
Este modelo de calibracin ptimo para PLS-1, se aplic para predecir las concentraciones de los componentes en las muestras reales y en las muestras sintticas. En las Tablas 2.8 y 2.9, se presentan los resultados obtenidos para el juego de muestras de validacin nmero uno.
124
Tabla 2.8: Resultados del anlisis por PLS-1 para dexametasona en el juego de muestras de validacin nmero uno Dexametasona
Muestra de validacin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Semana 1 Cantidad adicionada Cantidad Recuperacin (mg l1) encontrada (%) (mg l1) 100.0 6.40 6.40 6.40 6.40 6.40 6.40 8.00 8.00 8.00 8.00 8.00 9.60 9.60 9.60 9.60 9.60 6.59 6.51 6.56 6.57 8.03 8.08 8.11 8.05 8.10 9.64 9.68 9.65 9.75 9.66 103.0 101.7 102.5 102.6 100.4 101.0 101.4 100.6 101.2 100.4 100.8 100.5 101.6 100.6 Semana 2 Cantidad Recuperacin encontrada (%) (mg l1) 6.36 99.4 6.54 6.51 6.57 6.47 8.19 8.12 8.15 8.21 8.20 9.79 9.78 9.83 9.89 9.88 102.2 101.7 102.6 101.1 102.4 101.5 101.9 102.6 102.5 102.0 101.9 102.4 103.0 102.9 Semana 3 Cantidad Recuperacin encontrada (%) (mg l1) 6.57 102.7 6.53 6.58 6.57 6.60 8.31 8.22 8.25 8.30 8.18 9.91 9.87 9.88 9.80 9.92 102.0 102.8 102.7 103.1 103.9 102.7 103.1 103.7 102.2 103.2 102.8 102.9 102.1 103.3
Tabla 2.9: Resultados del anlisis por PLS-1 para creatinina y propilparabeno en el juego de muestras de validacin nmero uno
Creatinina Semana 1 Cantidad adicionada (mg l1) Cantidad encontradaa (mg l1) % Recuperacin promedio 100.5 102.1 101.7 102.1 106.0 105.0 12.80 Semana 2 12.80 Semana 3 12.80 Semana 1 5.40 Propilparabeno Semana 2 5.40 Semana 3 5.40
12.87(0.06)
13.07 (0.03)
13.01 (0.03)
5.51 (0.05)
5.72 (0.07)
5.67 (0.05)
CV %
a
intra-ensayo 0.50 0.31 0.24 0.97 1.17 0.94
Intra-assay Los valores entre parntesis corresponden a desviacin estndar. (n = 15). 125
Como puede apreciarse, analizando el juego de validacin nmero uno se obtuvieron porcentajes de recuperacin aceptables para dexametasona, creatinina y propilparabeno, con un promedio de 102.0, 101.4 y 104.3 respectivamente. Adems, se aplic una prueba de ANOVA y se determin que no exista una diferencia estadsticamente significativa entre las medias obtenidas en las tres semanas consecutivas. Los resultados obtenidos para dexametasona en el juego de muestras de validacin nmero dos y en una muestra comercial marca Larjan , se presentan en la Tabla 2.10.
Tabla 2.10: Resultados del anlisis por PLS-1 para dexametasona en el juego de muestras de validacin nmero dos y en una muestra comercial del inyectable Muestraa Cantidad adicionada 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Larjanb
a b
Dexametasona (mg ml1) Cantidad encontrada 9.37 8.49 8.01 7.49 7.10 6.67 6.50 6.01 5.68 5.46 5.11 4.77 4.23 3.64 3.04 4.01 103.5 101.1 101.8 103.4 101.9 100.9 102.5 99.2 99.6 100.5 99.0 99.4 99.5 100.5 101.7 100.3 Recuperacin (%)
9.05 8.40 7.87 7.24 6.97 6.61 6.34 6.06 5.70 5.43 5.16 4.80 4.25 3.62 2.99 4.00
Se realizaron cinco replicados. La recuperacin obtenida por HPLC (USP XXIV) fue 99.5 %.
126
Como puede verse, los porcentajes de recuperacin obtenidos en el juego de muestras de validacin nmero dos fueron muy buenos para todos los niveles estudiados. Por otra parte, cuando se trabaj con una muestra comercial, se obtuvo un resultado comparable al de la muestra analizada por HPLC (USP XXIV, 2000). A partir de los resultados obtenidos al analizar el juego de muestras de validacin anterior, se construy un grfico de cpredicha vs. cadicionada. Los resultados obtenidos fueron: pendiente = 1.015 y ordenada al origen = 0.05. La Figura 2.5 muestra la regin elptica de confianza conjunta (EJCR) para la pendiente y la ordenada al origen, la que contiene el valor (1,0) tericamente esperado. Esto permite concluir que no hay evidencia de error sistemtico en la determinacin de la dexametasona, cuando se usa la metodologa propuesta en la presente tesis.
0.15
0.10
Ordenada al origen
0.05
0.00
-0.05
-0.10
-0.15
-0.20 0.98 0.99 1.00 1.01 1.02 1.03 1.04 1.05
Pendiente
Figura 2.5: Regin elptica de confianza conjunta para la pendiente y la ordenada al origen, para la dexametasona en el juego de muestras de validacin nmero dos
127
2.1.3.3. CONCLUSIONES Mediante la aplicacin del mtodo desarrollado en el presente trabajo a muestras sintticas y comerciales, se obtuvieron porcentajes de recuperacin y coeficientes de variacin muy buenos desde el punto de vista analtico. Adems la aplicacin de una prueba estadstica rigurosa como lo es la regin elptica de confianza conjunta para la pendiente y la ordenada al origen, mostr que no hay evidencias de error sistemtico para la determinacin de dexametasona. Un hecho para destacar es la reduccin sustancial que se alcanza en el tiempo de anlisis y en los costos, en comparacin con el mtodo basado en HPLC. Por todo lo expuesto, se concluye que el presente mtodo puede utilizarse en el laboratorio de control de calidad, para el anlisis de las muestras del inyectable estudiado, como una alternativa vlida al HPLC.
128
2.2. DETERMINACIN DE DEXTROPROPOXIFENO Y DIPIRONA EN INYECTABLES 2.2.1. DEXTROPROPOXIFENO Y DIPIRONA. CARACTERSTICAS Y ANTECEDENTES ANALTICOS La dipirona (DIP) (sodio N-(2,3_dimetil-5-oxo-1fenil-3-pirazolin-4-yl)-N-metilaminometanosulfonato monohidrato), es un analgsico-antipirtico del grupo pirazolnico, usado para el tratamiento del dolor agudo (Goodman-Gilman, 1996) en casos de cefaleas, neuralgias, dolores reumticos, clico renal y del perodo postoperatorio. Este frmaco puede ser administrado va oral, intramuscular o intravenosa y va rectal. Usualmente la forma inyectable es una solucin que contiene adems de dipirona, dextropropoxifeno (DEX) ((+)-(1S, 2R)-1-Bencil-3-dimetilamino-2-metill-1-fenil-propil propionato). Las frmulas estructurales de ambos principios activos se presentan en el Esquema 2.2.
CH 3 C 6H 5 CH 3
CH3 O.CO.CH2 .CH3 (CH3 ) 2 N.CH2 C H C CH2 .C6 H5
H 2O
O N .CH 2 .SO3Na CH 3 Dipirona
C6 H5
Dextropropoxifeno
Esquema 2.2: Frmula estructural de la Dipirona y el dextropropoxifeno La cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) es la tcnica ms utilizada para la determinacin de estos compuestos (Fadnavis, 2001). Sin embargo, los trabajos publicados en la literatura cientfica se refieren a la determinacin de los mismos en forma separada, es decir en preparaciones farmacuticas independientes, o bien en mezclas diferentes, no existiendo un antecedente analtico para la determinacin simultnea. 2.2.2. MTODO ANALTICO En el presente trabajo se desarroll un mtodo analtico para la determinacin simultnea de dextropropoxifeno y dipirona en inyectables, basado en el tratamiento de datos espectrofotomtricos con mtodos no lineales de calibracin multivariada. Los ingredientes activos mencionados, se presentan en el preparado farmacutico analizado en proporciones altamente diferentes (Relacin Dipirona/Dextropropoxifeno = 32:1). Por esta razn, al intentar una determinacin espectrofotomtrica simultnea de estos componentes, se puede postular
129
que el analito presente en mayor concentracin originara seales con desviaciones de la ley de Beer, mientras que el analito presente en menor concentracin proporcionara seales cercanas al nivel de ruido. En el presente trabajo de tesis se solucion la dificultad planteada mediante la aplicacin de una herramienta quimiomtrica poderosa: las redes neuronales artificiales (ANNs). El procedimiento analtico seguido para las muestras comerciales se detalla a continuacin: c- Se realiz una dilucin 1/2500 de las muestras, utilizando cido HCl 0.01 mol l1. d- Se obtuvieron los espectros de absorcin electrnica en el rango 200-350 nm. 2.2.2.1. EQUIPAMIENTO Las lecturas de absorbancia se realizaron en un espectrofotmetro marca: Perkin Elmer, modelo: Lamba 20, usando celdas de cuarzo de 1.00 cm de camino ptico. Los espectros de absorcin electrnica fueron convertidos a formato ASCII y se transfirieron a una PC Pentium 550, para su tratamiento posterior. Los clculos se realizaron utilizando el programa MATLAB 5.3 (MATLAB 5.3, 1999), con rutinas para aplicacin de PLS-1, NL-PLS, SPL-PLS y ANNs escritas en el laboratorio sobre la base de algoritmos conocidos y toolboxes de MATLAB (Haaland, 1988; Zupan, 1999). La seleccin de la regin espectral ptima se realiz aplicando la estrategia de ventana mvil-mnimo PRESS (Collado, 2000), mediante una rutina de MATLAB. Las determinaciones por HPLC se realizaron en un cromatgrafo marca Shimadzu con las siguientes caractersticas tcnicas: dos bombas, detector UV (215 nm) e inyector manual (20 l). Se utiliz una columna LiChrospher 100, C18, 5 m, 250 x 4 mm ID., Merck. La temperatura de la columna se fij en 35 C y se trabaj con una fase mvil de la siguiente composicin: bomba A, (60%) NaClO4 0.20 mol l1, trietanolamina 0.20% (v/v), pH2.3 y bomba B, (40%) acetonitrilo. 2.2.2.2. REACTIVOS Los reactivos necesarios para realizar el procedimiento analtico, se prepararon a partir de drogas calidad para anlisis y de acuerdo a lo que se detalla a continuacin: e) Solucin stock de dipirona: se disolvi la droga slida en agua bidestilada, de manera de lograr una concentracin de 5.00 g l1.
130
f) Solucin stock de dextropropoxifeno: se disolvi la droga slida en agua bidestilada, de manera de lograr una concentracin de 5.00 g l1. Se trabaj adems con un inyectable comercial marca Klosidol (Laboratorios Bag, Argentina), con un contenido (por 5 ml) de 50 mg de dextropropoxifeno y 1500 mg de dipirona. Como se especific anteriormente al describir el procedimiento analtico, esta muestra se diluy 1/2500 con cido clorhdrico 0.01 mol l1 antes de realizar su medicin espectrofotomtrica. Las concentraciones de trabajo resultantes fueron: dextropropoxifeno, 4 mg l1 y dipirona , 120 mg l1. 2.2.2.3. DISEO DE LOS JUEGOS DE MUESTRAS DE CALIBRACIN Para la calibracin se prepararon dos juegos de doce muestras cada uno, es decir que en total se trabaj con veinticuatro muestras. La concentracin de los componentes en estas muestras corresponde a un diseo central compuesto con cuatro muestras centrales. Estos juegos fueron preparados en diferentes das, a los fines de tener en cuenta la mxima variabilidad posible en los datos. En la Tabla 2.11 se muestra la composicin de las muestras de calibracin. 2.2.2.4. DISEO DE LOS JUEGOS DE MUESTRAS DE VALIDACIN Para la validacin se prepararon dos juegos de doce muestras cada uno, es decir que en total se trabaj con veinticuatro muestras. La concentracin de los componentes de estas muestras corresponde a un diseo factorial completo, con cuatro niveles para dextropropoxifeno y tres de dipirona. Cuando se trabaj con los modelos lineales y no lineales de PLS, se us uno de estos juegos para la validacin, mientras que cuando se trabaj con redes neuronales, se us uno de estos juegos para monitoreo y el otro para validacin. En la Tabla 2.12 se muestra la composicin de las muestras de validacin.
131
Tabla 2.11: Composicin del juego de muestras de calibracin para los mtodos: PLS-1, NL-PLS, SPLPLS y ANNs
Nmero de muestra de calibracin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Dipirona (mg l1) 120.00 110.00 115.00 125.00 130.00 115.00 125.00 120.00 120.00 120.00 120.00 120.00 Dextropropoxifeno (mg l1) 3.00 4.00 3.50 3.50 4.00 4.50 4.50 5.00 4.00 4.00 4.00 4.00
Tabla 2.12: Composicin del juego de muestras de validacin para los mtodos: PLS-1, NL-PLS, SPL-PLS y ANNs
Nmero de muestra de calibracin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 115.00 125.00 115.00 125.00 115.00 125.00 115.00 125.00 120.00 120.00 120.00 120.00 Dipirona (mg l1) Dextropropoxifeno (mg l1) 3.50 3.50 3.80 3.80 4.00 4.00 4.30 4.30 3.50 3.80 4.00 4.30
132
2.2.3. RESULTADOS En la Figura 2.6A se pueden observar los espectros de dipirona y dextropropoxifeno, en solucin acuosa a pH 2.0 y en concentraciones iguales (10 mg l1). En la Figura 2.6B se muestran los espectros para ambos componentes, pero con las concentraciones correspondientes a la muestra diluida 1/2500: dextropropoxifeno, 4 mg l1, y dipirona, 120 mg l1.
0.6
Absorbancia
0.4
DIP
0.2
DEX
0.0
Absorbancia
DIP
B
2
DEX
0 210 240 270 300
Longitud de onda (nm)
Figura 2.6A: Espectros de dextropropoxifeno (DEX) y dipirona (DIP) en solucin acuosa a pH 2.0 (ambos a 10 mg l1). B: Espectros de dextropropoxifeno (DEX) y dipirona (DIP) en concentraciones iguales a las obtenidas por dilucin 1/2500 de la muestra: DEX, 4 mg l1, y DIP, 120 mg l1
Como puede verse, el componente mayor (dipirona) alcanza un nivel de concentracin que se desva de la ley de Beer (rango de absorbancia entre 2 y 3), mientras que la concentracin del analito menor (dextropropoxifeno) es cercana al nivel de ruido (absorbancias por debajo de 0.05). Por lo tanto, para poder obtener una sensibilidad razonable para el componente menor, es necesario trabajar con una concentracin muy alta del componente mayor.
133
Esto conduce, en principio, a desviaciones en la linealidad de la relacin seal/concentracin para el analito mayor, pero tambin puede introducir no linealidades en el componente menor, en el caso de que ocurran interacciones qumicas entre l y el ms concentrado. En primer lugar, se realiz un anlisis de los datos espectrales obtenidos mediante aplicacin del mtodo PLS-1. Se determin la regin espectral ptima de trabajo por aplicacin de la estrategia de ventana mvil ya descripta. Es decir, se encontr la zona del espectro con la mxima informacin y la mnima variancia de calibracin (Collado, 2000) y se verific que la regin seleccionada coincida con la localizacin de los picos espectrales, con mnimo solapamiento. Posteriormente, se seleccion el nmero ptimo de factores, aplicando el procedimiento de validacin cruzada y usando el criterio de Haaland y Thomas (Haaland, 1988). El nmero ptimo de factores puede observarse en la Tabla 2.13, junto a la regin espectral de trabajo y parmetros estadsticos indicadores de la calidad del ajuste. En una siguiente etapa, se aplic esta calibracin (ptima) para PLS-1, con el objeto de predecir las concentraciones de los componentes en las muestras reales y en las muestras sintticas de validacin . En las Tablas 2.15 y 2.16, se presentan los resultados obtenidos.
Tabla 2.13: Datos correspondientes a la calibracin del modelo PLS-1 Dipirona Regin (nm) Factores RMSECV (mg l1) RMSEP (mg l1) 205 350 4 2.22 3.67 Dextropropoxifeno 214 231 4 0.31 0.18
Como puede observarse, los parmetros de calibracin son razonablemente buenos para ambos analitos, pero es necesario trabajar con cuatro factores, dos ms de lo esperado tericamente (dos factores). Esto puede estar causado por las no linealidades, las que son tenidas en cuenta en el modelo por inclusin de factores adicionales.
134
Como ya se vio con anterioridad, el modelo de calibracin PLS permite estudiar componentes cuyo comportamiento se desve ligeramente de la linealidad, introduciendo ms factores en el anlisis (Centner, 1998; Gemperline, 1991; Sekulic, 1993). Pero, cuando la no linealidad es significativa, los errores de prediccin se vuelven importantes y se hace necesario recurrir a modelos ms adecuados. Para detectar la presencia de no linealidades, varias herramientas han sido descriptas en la literatura cientfica (Centner, 1998; Despagne, 1998; Hadjiiski, 1999). En el presente trabajo, se recurri a una de las herramientas ms simples, construir una grfica de concentraciones adicionadas vs. predichas y hacer un anlisis de los residuos obtenidos. La Figura 2.7 muestra esta grfica construida, pudindose observar en la misma que las predicciones del modelo PLS lineal para dipirona presentan una fuerte desviacin de la linealidad.
126 124
DIP Predicha (mg l )
-1
122 120 118 116 114 112 110 110
112
114
116
118
120
122
-1
124
126
DIP Adicionada (mg l )
Figura 2.7: Grfica de concentraciones adicionadas vs. predichas obtenidas por PLS-1 para dipirona en el juego de muestras de validacin
Para resolver este problema, los datos espectrales obtenidos se trataron con dos modelos no lineales de PLS y con redes neuronales artificiales. Se aplic NL-PLS (Wold, 1989) y SPL-PLS (Wold, 1992). Las predicciones obtenidas con estos modelos para las muestras del juego de validacin y para las muestras reales, se presentan en las Tablas 2.15 y 2.16. Las redes neuronales son mtodos de calibracin especialmente creados para modelar informacin no lineal, sin embargo se pueden usar tambin en casos donde la relacin es lineal, y pueden llegar a mejorar los resultados obtenidos con los modelos lineales.
135
En el presente trabajo se utiliz una ANN construida con un diseo de tres capas de neuronas o nodos, como unidades bsicas de cmputo: a- Capa de entrada con un nmero de neuronas activas correspondiente a las variables de prediccin en la regresin. b- Capa escondida. c- Capa de salida con una sola neurona. Se trabaj con una red donde las neuronas estn conectadas de manera jerrquica, es decir las salidas de una capa se usan como entradas de la capa siguiente y el nmero de neuronas de la capa de entrada y de la capa escondida se optimiz durante el entrenamiento de la red. En la capa escondida se us la funcin sigmoidea f ( x ) = 1 1 + e x escondida j, Oj, se calcul como:
y la salida de la neurona
nd O j = f (xi wij + ) i =1
(2.3)
Donde xi es la entrada a la neurona j de la capa escondida, desde la neurona i de la capa anterior, wij son los pesos de conexin entre las neuronas i y j, ' es el bias para la neurona j y nd es el nmero total de neuronas de la capa anterior. En las capas de entrada y de salida se usaron funciones lineales. En la red neuronal utilizada, el aprendizaje o entrenamiento se realiza mediante un procedimiento iterativo de retroalimentacin (Zupan, 1999; Werbos, 1982), no siendo necesario especificar la forma de la funcin analtica de calibracin y el nmero de parmetros del modelo. Para el entrenamiento de la ANN se utilizaron las 24 muestras de calibracin, uno de los juegos de 12 muestras de validacin se uso como muestras de monitoreo y el otro como muestras de validacin. El nmero de neuronas de las capas de entrada y de la capa escondida se optimiz mediante prueba y error y se aplic anlisis de componentes principales (PCA) a los datos originales para ajustar el nmero de neuronas con los correspondientes scores. La arquitectura seleccionada finalmente para ambos componentes se muestra en la Tabla 2.14, donde los nmeros entre parntesis indican las neuronas empleadas en cada capa. Para dipirona se usaron tres neuronas de entrada, cuatro escondidas y una de salida, mientras que para dextropropoxifeno se usaron cinco neuronas de entrada, tres escondidas y una de salida.
136
Tabla 2.14: Datos correspondientes a la calibracin de ANN Dipirona Regin (nm) Modelo ANN RMSETrain (mg l1) RMSEP (mg l1) 205 310 (3, 4, 1) 2.93 1.5 Dextropropoxifeno 214 231 (5, 3, 1) 0.28 0.10
A los fines de encontrar el mejor modelo, cada una de las redes se entren con el juego de muestras de calibracin, pero teniendo en cuenta la evolucin de los errores de calibracin y de los de prediccin en el juego de monitoreo, en funcin del nmero de iteraciones o ciclos. Se busc el valor mnimo para el error de prediccin (RMSEMonit) y por ejemplo, para la dipirona, se encontr un punto de corte en 40 iteraciones. Este punto de corte corresponde a un error para la calibracin de RMSETrain = 2.93 mg l1 y un error en la prediccin del juego de muestras de monitoreo de RMSEMonit = 2.80 mg l1. En la Figura 2.8 se observa la evolucin de los errores y el punto de corte encontrado.
RMSETrain y RMSEMonit
punto de corte
5
Juego de monitoreo
3
juego de entrenamiento
2 0 20 40 60 80 100
Iteraciones
Figura 2.8: Evolucin de los errores de calibracin y monitoreo en funcin del nmero de iteraciones
Por otra parte, es importante considerar el hecho de que la ANN no debe ser sobre-entrenada y para esto se debe tener en cuenta que el nmero de objetos debe exceder al de los pesos ajustables.
137
En las Tablas 2.15 y 2.16, se muestran los resultados obtenidos para el juego de 12 muestras de validacin y para la muestra comercial marca Klosidol, con los modelos PLS-1, NL-PLS, SPL-PLS y ANN, para dipirona y dextropropoxifeno respectivamente.
Tabla 2.15: Resultados obtenidos para dipirona por aplicacin de PLS-1, NL-PLS, SPL-PLS y ANNs al juego de muestras de validacin y a muestras comerciales
Muestra de validacin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Concentracin adicionada (mg l1) 115.0 125.0 115 .0 125 .0 115.0 125 .0 115 .0 125.0 120.0 120.0 120 .0 120.0 120.0 Concentracin predicha (mg l1) PLS-1 113.5 121.7 113.5 121.5 115.5 119.8 112.3 120.7 116.0 115.9 115.9 115.8 3.7 107.0 (0.9) NL-PLS 118.8 121.6 118.7 121.8 118.7 121.9 118.8 121.1 121.9 122.1 121.6 121.1 3.1 113.8 (1) SPL-PLS 119.3 124.0 119.0 124.8 118.9 123.8 119.3 123.7 121.9 122.1 121.9 121.7 2.7 118.6 (0.1) ANNs 117.6 124.0 117.2 124.6 117.2 124.2 116.9 123.3 121.0 121.0 120.6 119.6 1.5 121.6 (0.6)
RMSEP
Klosidola
a Los
valores entre parntesis corresponden a la desviacin estndar para cuatro replicados.
Valor de referencia (mtodo UV) = 126.0 (0.4) mg l1 (cuatro replicados).
138
Tabla 2.16: Resultados obtenidos para dextropropoxifeno por aplicacin de PLS-1, NL-PLS, SPL-PLS y ANNs al juego de muestras de validacin y a muestras comerciales
Muestra de validacin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Concentracin adicionada (mg l1) 3.5 3.5 3.8 3.8 4.0 4.0 4.3 4.3 3.5 3.8 4.0 4.3 4.0 Predicha (mg l1) PLS-1 3.4 3.3 3.7 3.6 3.9 4.0 4.2 3.8 3.5 3.6 3.8 4.1 0.18 4.15 (0.18) NL-PLS 4.0 3.8 4.0 3.9 4.0 3.8 4.0 3.9 3.9 3.9 3.9 3.9 0.28 4.10 (0.20) SPL-PLS 3.8 3.8 3.8 3.8 3.7 3.8 3.8 3.9 3.8 3.8 3.9 3.9 0.27 3.70 (0.07) ANNs 3.4 3.4 3.7 3.7 4.0 4.0 4.3 4.0 3.5 3.7 4.0 4.1 0.10 4.06 (0.08)
RMSEV
Klosidola
a Los
valores entre parntesis corresponden a desviacin estndar para cuatro replicados.
Valor de referencia (mtodo por HPLC) = 4.03 (0.03) mg l1 (cuatro replicados).
Como puede observarse, los resultados obtenidos mejoran al aplicar el anlisis por los modelos no lineales de PLS y ANNs, sobre todo para la dipirona, cuya concentracin se sospecha en una relacin no lineal con la seal. El mtodo SPL-PLS muestra un precisin excelente y una prediccin razonablemente buena, cuando se analiza dipirona en la muestra comercial. En la Figura 2.9 se presenta la grfica de concentraciones predichas vs. concentraciones adicionadas, para la dipirona utilizando el mtodo de ANNs, y como puede observarse la curvatura esta significativamente disminuida. Esto nos permite concluir que la no linealidad es considerable, especialmente para la dipirona y que el anlisis con ANNs es capaz de tener en cuenta esta no linealidad de manera ms eficiente, en comparacin con los modelos lineales y no lineales de PLS.
139
126
DIP ANNs/Predicha (mg l )
124 122 120 118 116 114 112 110 110
-1
112
114
116
118
120
122
-1
124
126
DIP Adicionada (mg l )
Figura 2.9: Grfica de concentraciones adicionadas vs. predichas obtenidas por ANNs para dipirona en el juego de muestras de validacin
En el caso del dextropropoxifeno, el anlisis de las muestras sintticas y comerciales con los modelos no lineales de PLS, no muestra resultados tan buenos como para la dipirona. Esto podra deberse a que los errores causados por la baja relacin seal/ruido en este tipo de muestras con baja concentracin, son ms importantes en presencia de no linealidades. En cambio, s se observa un mejoramiento en la prediccin cuando se aplica ANNs, lo que demuestra el poder de este mtodo no slo para modelar no linealidades, sino tambin en el mejoramiento de los resultados, en comparacin con los modelos lineales. 2.2.4. CONCLUSIONES En el presente trabajo se demostr que la combinacin de una espectroscopia UV con una tcnica quimiomtrica adecuada, constituye una estrategia analtica vlida para la determinacin simultnea de dos ingredientes activos, presentes en concentraciones muy diferentes en un inyectable. A pesar de existir un alto grado de solapamiento espectral y de la ocurrencia de no linealidades, se consigui realizar el anlisis simultneo de dipirona y dextropropoxifeno en inyectables, con exactitud y precisin razonablemente buenas. Los resultados fueron comparables con los obtenidos con los mtodos utilizados para la comparacin: cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) y espectroscopia UV.
140
2.3. DETERMINACIN DE CARBAMAZEPINA EN MUESTRAS DE SUERO HUMANO 2.3.1. CARBAMAZEPINA. CARACTERSTICAS Y ANTECEDENTES ANALTICOS. La carbamazepina (CBZ) es una droga muy utilizada para el tratamiento de la epilepsia y otros desrdenes psiquitricos (Goodman Gilman, 2001). La misma se metaboliza completamente en el cuerpo, siendo muy pequea la cantidad que se elimina por la orina sin modificaciones (Goodman Gilman, 2001). Generalmente la carbamazepina se usa en combinacin con otras drogas antiepilpticas, tales como la fenitona o el cido valproico y las concentraciones en suero publicadas como teraputicas van de 6 a 12 g ml1. La determinacin de los niveles de carbamazepina en el suero del paciente es sumamente importante para minimizar la toxicidad del tratamiento.
N O NH2
Esquema 2 3: Frmula estructural de la carbamazepina Su principal metabolito es el epxido de carbamazepina (CBZ-EP), que tambin posee actividad farmacolgica como anticonvulsivante (He, 1992), alcanzando niveles de concentracin inferiores a los de carbamazepina. En la literatura se han propuesto varios mtodos para la determinacin de carbamazepina, fundamentalmente basados en tcnicas cromatogrficas (Bhatti, 1998; Das-Gupta, 1999; Ashy, 1986; Raggi, 2000; Franceschi, 2005; Chelberg, 1988; Hartley, 1986). La cromatografa lquida de alta resolucin y el inmunoensayo por fluorescencia polarizada (FPIA), se usan comnmente como mtodos de rutina para la determinacin de CBZ y de otros anticonvulsivantes (Snchez, 1999). Tambin se usan otros mtodos basados en tcnicas como la cromatografa micelar electrocintica capilar (MECC) (Lancas, 2003) y la quimioluminiscencia (Lee, 2003). Recientemente, se ha publicado un trabajo para determinacin simultnea de CBZ y fenitona, usando espectrofotometra y calibracin multivariada (Rezaei, 2005) y otro que utiliza la fluorescencia de la CBZ sobre una membrana de nylon, con tratamiento de los datos de segundo orden (excitacin-emisin) con el modelo PARAFAC (Escandar, 2004).
141
2.3.2. MTODO ANALTICO En el presente trabajo se desarroll un mtodo analtico para la determinacin de carbamazepina en muestras de sueros de pacientes, basado en la combinacin de una espectroscopia de absorcin ultravioleta, posterior a una extraccin con solvente orgnico, y un tratamiento de los datos obtenidos por aplicacin de un mtodo de calibracin multivariada. La determinacin de carbamazepina (CBZ) en una muestra compleja como el suero humano, no es posible por espectroscopia convencional, debido al alto grado de solapamiento espectral existente y a la variabilidad intrnseca basal de los sueros. Por esta razn, la construccin de un modelo de calibracin multivariada necesitara un nmero muy importante de muestras de calibracin para cubrir todas las fuentes de variabilidad (Goicoechea, 1999). En el procedimiento analtico del presente trabajo se realiza un paso previo de extraccin de la CBZ, para solucionar el problema de las interferencias originadas por los componentes endgenos y exgenos del los sueros. De esta manera se logra que el modelo quimiomtrico necesite menor cantidad de muestras en el paso de la calibracin. La optimizacin de la extraccin la CBZ es un aspecto crtico, dado que es necesario alcanzar una recuperacin importante. Para seleccionar las mejores condiciones en este paso, se utiliz un diseo de mezclas asociado con una metodologa de superficie de respuesta (Myers, 1995). Finalmente se realiz el tratamiento quimiomtrico de los datos espectrofotomtricos obtenidos, por aplicacin del mtodo PLS-1 a la segunda derivada de los espectros UV, para eliminar de esta manera un efecto de corrimiento de la lnea de base originado en el paso de la extraccin. El procedimiento analtico seguido para las muestras de suero de pacientes tratados con CBZ y las preparadas artificialmente para calibracin y validacin, se detalla a continuacin: e- Se mide un volumen de 500 l de la muestra de suero y se coloca en un tubo de vidrio con tapa, de 2 ml de capacidad. f- Se adiciona un volumen de 500 l de solvente, se agita el tubo durante 3 minutos y se centrfuga 5 minutos a 2000 rpm. g- Se toma una alcuota de 300 l de fase orgnica, se transfiere a una microcubeta y se obtienen los espectros de absorcin electrnica en el rango 280-350 nm.
142
2.3.2.1. MTODOS DE REFERENCIA Para la validacin del mtodo analtico desarrollado se realizaron determinaciones de CBZ por HPLC (Raggi, 2000; Franceschi, 2005; Chelberg, 1988; Hartley, 1986) y por immunofluorescencia polarizada (FPIA) (Snchez, 1999). Para la separacin cromatogrfica se trabaj a temperatura ambiente y con una fase mvil consistente en una mezcla filtrada y desgasificada de metanol, agua y acetonitrilo (25/65/10). El anlisis se realiz bajo condiciones isocrticas, a una velocidad de flujo de 1 ml min1 y el efluente se monitore mediante mediciones UV a 214 nm. Se us estndar interno, preparado por adicin de 0.30 ml de una solucin de 10 g l1 de metilcarbamazepina en acetonitrilo a 0.20 ml de muestra. Todas las soluciones se filtraron antes de la inyeccin, usando filtros Millipore de 0.22 m de tamao de poro. Las determinaciones por FPIA se realizaron en el Hospital Provincial Cullen, usando un equipo Abbott FPIA-TDx. 2.3.2.2. EQUIPAMIENTO Las mediciones de absorbancia se realizaron en un espectrofotmetro marca: Perkin Elmer, modelo: Lamba 20, usando celdas de cuarzo de 1.00 cm de camino ptico, 2 nm de ancho de banda, una velocidad de escaneo de 860 nm min1 y registrando cada 1 nm. Los espectros UV de las soluciones de trabajo se registraron en el rango 280-350 nm, fueron convertidos a formato ASCII y se transfirieron a una PC Athlon 2.2, para su tratamiento posterior. El mtodo PLS-1 se aplic utilizando la herramienta MVC1 del programa MATLAB (Olivieri, 2004), que representa una versin mejorada del programa MULTIVAR ya presentado. Los espectros derivados se obtuvieron aplicando el filtro Savitzky-Golay, usando un polinomio de segundo orden y una ventana de 11 puntos. Para diseo experimental y optimizacin se utiliz el programa Design_Expert 6.0.10. Las determinaciones por HPLC se realizaron en un cromatgrafo Lachrom-Hitachi equipado con detector UV L 7400, una pre-columna de 5 m LiChrocart 4-4, RP-18 y una columna de 5 m LiChrocart 1254, RP-18.
143
Programa MVC1 En la Figura 2.10 se observa la pantalla del programa. La misma est dividida en dos regiones verticales, cuyas funciones se describen a continuacin:
Figura 2.10: Pantalla del programa MVC1.
Funciones: 1. Columna izquierda: ingreso de datos y seleccin de las condiciones de trabajo. 1) Seleccin del mtodo (working method): permite seleccionar el mtodo multivariado de trabajo (PCR, PLS-1, HLA/GO, HLA/XS, etc.). 2) Nmero de factores (number of factors): consta de tres ventanas. En la primera ventana, segn el criterio de Haaland y Thomas, se ingresa la mitad del nmero de mezclas de calibracin ms uno, y se realiza la validacin cruzada. Una vez obtenido el nmero ptimo de factores, se ingresa este valor para realizar la prediccin. La segunda y tercer ventana se utilizan en mtodos que requieren de ms de un factor, como los basados en correccin ortogonal de la seal (OSC).
144
3) Regin espectral (spectral regions): permite seleccionar la regin de longitudes de onda de trabajo. En caso de dejar el espacio en blanco el programa realiza los clculos con todos los datos del espectro. 4) Tipo de muestra (sample type): presenta dos opciones de trabajo: a) juego de validacin (test set) o b) (unknowns) para muestras desconocidas. 5) Datos de calibracin (calibration data) y datos de prediccin (prediction data): estas dos ventanas presentan tres opciones: a) x_vectors, b) x, y_vectors, o c) matrix. Se selecciona una, de acuerdo al tipo de arreglo que tengan los datos. 6) Nombre de los archivos de datos (filenames): consta de una columna de siete ventanas donde se ingresan los nombres de los archivos de datos. Calibration y: vector de datos (concentraciones del juego de calibracin) Calibration x vectors: vector de datos (seales de calibracin) Calibration X matriz: matriz de datos (seales del juego de calibracin) Unknown y: vector de datos (concentraciones de la muestra) Unknown x vectors: vector de datos (seales de la muestra) Unknown X matrix: matriz de datos (seales de las muestras) Single unknown x: vector de datos (seal de una muestra) 2. Columna derecha: funciones que realiza el programa. 1) Exclusin de muestras de calibracin (Cal. samples excluded): permite excluir muestras anmalas (outliers) del juego de calibracin, y trabajar con las restantes. En la ventana se coloca el nmero correspondiente de la muestra a excluir. 2) Muestras de validacin excluidas (Unk. samples excluded): permite excluir muestras anmalas (outliers) del juego de validacin, y trabajar con las restantes. En la ventana se coloca el nmero correspondiente de la muestra a excluir. 3) Mtodos de preprocesamiento de datos, que consta de cinco ventanas. Se proponen varias opciones, en algunos casos permiten eliminar el ruido o en otros darles el mismo peso a todas las variables. Estas ventanas son: a) Centrado de los datos (Mean centering): se activa por defecto. b) Multiplicative scatter correction (MSC). c) Different variations of estndar normal variate (SNV).
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d) Escalado (Min/Max). e) Derivada de la seal (derivate): para esta opcin existen tres ventanas, donde se puede ingresar el orden de la derivada (order), el grado del polinomio de Savitzky-Golay (degree), y el nmero de puntos a usar en el suavizado (points). 4) Errores (uncertainly): consta de tres ventanas, sc, sR y level %, correspondientes a la estimacin de errores en concentracin y en seal. Estos datos son utilizados para el calculo de cifras de merito. 5) Guardar resultados (save results): consta de una ventana que permite la opcin de archivar los resultados. Se crean archivos en el directorio en el que se est trabajando. 6) Validacin cruzada (Tecla CV): al apretar esta tecla el programa realiza los clculos de la validacin cruzada. Los resultados se informan en la pantalla del programa MATLAB. 7) Grficos de la validacin cruzada (Tecla CV plots): mediante esta tecla se pueden visualizar los grficos de la validacin cruzada en una pantalla que se abre automticamente: 1) PRESS vs. A, 2) log(PRESS) vs. A, 3) SEP vs. A, 4) log(SEP) vs. A. 8) Muestras anmalas del juego de calibracin (Tecla CV outliers): al apretar esta tecla en una nueva pantalla el programa pide que se ingrese el nmero de factores de calibracin (set number factor). Una vez ingresado este nmero se presiona GO y el programa grafica (abriendo otra pantalla): N0 de mezcla vs. Fpract/ Fcrit (sample vs. Fpract/ Fcrit). 9) Prediccin (Tecla PREDICT): al presionar esta tecla el programa realiza la prediccin de las muestras desconocidas, el resultado se informa en la pantalla del programa MATLAB. 10) Estadsticos de la prediccin (Tecla RMSEP Plots): al presionar esta tecla se abre una pantalla en la que el programa grafica algunos estadsticos de la prediccin: 1) Error vs. Nmero de factores (RMS vs. A), 2) Resultados predichos vs. Concentraciones nominales (Predicted vs. Actual), 3) Residuos vs. Muestra (Residuals: Residuals vs. Sample), 4) Intervalo elptico conjunto para la pendiente y la ordenada al origen de la regresin del punto 2 [EJCR (Elliptical joint confidence regions): Intecept vs. Slope]. 11) Grficos del modelo (Tecla Model plots): al presionar esta tecla en una nueva pantalla el programa realiza los siguientes grficos: 1) Sensibilidad vs. Nmero de factores (Sensitivity vs. A), 2) Coeficientes de regresin (Regresin coeficients: bk vs. Sensor), 3) Selectividad vs. Nmero de factores (Selectivity vs. A), y 4) Seal neta (Net sensitivity: sk vs. Sensor).
146
12) Grficos de los espectros (Tecla Spectral plots): apretando esta tecla se obtienen, en una nueva pantalla, los siguientes grficos: 1) Grfico de los espectros de calibracin vs. Sensores (Raw calibration), 2) Grfico de los espectros de las muestras desconocidas vs. Sensores (Raw unknowns) 3) y 4) Espectros de calibracin y de prediccin preprocesados segn opciones ya descriptas vs. sensores (Preprocessed calibration y Preprocessed unknowns). 13) Grficos de regresin de la NAS (Tecla NASRP Plots): al presionar esta tecla el programa abre una pantalla en la que pide que se ingrese el nmero de la muestra con la que se desea realizar los grficos. A continuacin se aprieta la tecla GO, y el programa abre una pantalla con los siguientes grficos: 1) re* y se* vs. Sensores (rk* and sk* vs. Sensor), 2) NASRP (rk* vs. sk* ), 3) y 4) Residuos vs. Sensores (Net residual vs. Sensor y Residual vs sensor). 14) Muestras anmalas de la prediccin (Tecla Outliers Plots): al presionar esta tecla el programa abre una pantalla con el grfico: Muestra vs. Fprac./Fcrit. (sample number vs. Fpract/Fcrit) 15) Grficos del PRESS y del Error indicador en funcin del primer sensor y de la ventana mvil (Teclas 3D-PRESS y 3D-EI). Junto a estas teclas aparece una ventana donde debe ingresarse el nmero de sensores con el que se realiza el clculo. El programa informa los resultados numricos en la pantalla MATLAB, y adems abre una ventana en cada caso, con un grafico 3D y un diagrama de contorno. 2.3.2.3. REACTIVOS Los reactivos necesarios para realizar el procedimiento analtico, se prepararon a partir de drogas calidad para anlisis y de acuerdo a lo que se detalla a continuacin: g) Solucin stock de carbamazepina (CBZ): se disolvi la droga slida en metanol, de manera de lograr una concentracin de 500 g ml1. h) Solucin stock de epxido de carbamazepina (CBZ-EP): se disolvi la droga slida en metanol, de manera de lograr una concentracin de 100 g ml1. Se trabaj adems con sueros de pacientes tratados con carbamazepina y sueros de personas sanas. 2.3.2.4. OPTIMIZACIN En una primera etapa, se analiz la extraccin del analito estudiado desde el suero humano usando tres solventes diferentes, elegidos sobre la base de resultados publicados (Escandar, 2004). Para realizar la
147
optimizacin experimental del paso de extraccin, se utiliz un diseo de mezclas simplex centroide aumentado con experimentos axiales. Se realizaron 15 experimentos para probar tres solventes puros y combinaciones de dos o tres de ellos. La Tabla 2.17 muestra este diseo y los valores de recuperacin obtenidos en cada experimento.
Tabla 2.17: Diseo experimental usado para la optimizacin del paso de extraccin
Experimento 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Benceno (%) 0.0 0.0 0.0 50.0 50.0 50.0 0.0 66.7 100.0 0.0 16.7 0.0 100.0 16.67 33.3 Tolueno (%) 50.0 0.0 0.0 50.0 50.0 0.0 100.0 16.7 0.0 100.0 16.7 50.0 0.0 66.67 33.3 1-Pentanol (%) 50.0 100.0 100.0 0.0 0.0 50.0 0.0 16.7 0.0 0.0 66.7 50.0 0.0 16.7 33.3 Recuperacin (%) 48.0 12.0 13.0 93.6 91.8 38.0 89.9 75.8 103.0 87.5 34.9 46.0 108.0 66.5 70.0
Como ya se vio, en este tipo de diseo experimental los factores son los componentes de la mezcla y la respuesta es una funcin de la proporcin de cada componente (Myers, 1995). El diseo simplex centroide comprende (2q-1) experimentos, donde q es el nmero de factores a ser analizados. En este caso q = 3, por lo tanto el nmero de experimentos es 7. Este diseo se aument con 3 experimentos axiales y se realizaron adems 5 replicados, dando lugar a un total de 15 experimentos. Este diseo permiti obtener una superficie de respuesta, por ajuste de los datos al modelo polinomial siguiente representado por la ecuacin 2.4: y = 1 x1 + 2 x2 + 3 x3 + 4 x1 x2 + 5 x1 x3 + 5 x2 x3 + coeficientes de regresin.
148
(2.4)
Donde xi son los factores analizados (x1 = benceno, x2 = tolueno, x3 = 1-pentanol) y i son los
Siguiendo el procedimiento analtico anteriormente especificado, se realiz la extraccin de una muestra de suero adicionado con CBZ, se transfiri la fase orgnica a una cubeta de lectura y se obtuvo el espectro UV usando como blanco el correspondiente solvente (o mezcla). Este procedimiento se repiti para cada uno de los 15 experimentos. La lectura de absorbancia obtenida a 290 nm se compar con la correspondiente a una solucin patrn preparada con el mismo solvente (o mezcla) usado en la extraccin. Esta lectura de absorbancia se consider como el 100 % y a partir de los datos obtenidos se calcul la recuperacin. Los parmetros obtenidos despus del ajuste fueron: y = 1.05 x1 + 0.87 x2 + 0.13 x3 0.12 x1 x2 0.66 x1 x3 0.07 x2 x3 (2.5) Los valores de las variables correspondientes a la mxima respuesta (recuperacin = 104.9 %) fueron: Benceno = 100 %, tolueno = 0 % y 1-pentanol = 0 %. En la Figura 2.11 se muestra la superficie de respuesta obtenida y en Figura 2.12 la grfica de contornos correspondiente.
D ESIG N - EXPER T Plot R e c u pe r ac i n X1 = A: Ben c e no X2 = B: Tolue no X3 = C : 1- Pen ta no l
113.00 87.84 62.68
Recuperacin
37.51 12.35
X 1 (100.00) X 3 (0.00) X 2 (100.00) X 2 (0.00) X 1 (0.00)
X 3 (100.00)
Figura 2.11: Superficie de respuesta para el modelo cuadrtico de Scheff

D E S IG N - E X P E R T P lo t R e c u p e r a c i n D e s ig n P o in ts
A: B en ce no 20 .0 0 10
R e c u p e r a c i n = 1 0 4 .9 R un #13 X 1 : A : B e n c e n o = 1 0 0 .0 0 X 2 : B : T o lu e n o = 0 .0 0 X 3 : C : 1 - P e n ta n o l = 0 .0 0
9 6 .5 3 7 2
8 8 .1 5 5 3
0 .0 0
0 .0 0 7 1 .3 9 1 7 7 9 .7 7 3 5 6 3 .0 0 9 9 5 4 .6 2 8 1 4 6 .2 4 6 3 3 7 .8 6 4 4 2 9 .4 8 2 6
2 1 .1 0 0 8
1 0 0 .0 0 B : T olueno
0 .0 0
1 0 0 .0 0 C : 1 - P e n ta n o l
Re c u p er a c i n
Figura 2.12: Grfica de contornos para el diseo de mezclas simplex centroide
149
2.3.2.5. DISEO DEL JUEGO DE MUESTRAS DE CALIBRACIN Se prepar un juego de nueve muestras siguiendo un diseo central compuesto, adicionando a una mezcla de sueros de personas sanas diferentes volmenes de las soluciones stock de CBZ y de CBZEP. Se obtuvieron de esta manera niveles de concentracin dentro de un rango de 0 a 14 .0 g ml1 para CBZ y de 0 a 4.2 g ml1 para CBZ-EP. La Figura 2.11 muestra las concentraciones de los analitos para este juego. El CBZ-EP fue tenido en cuenta en la preparacin del juego de muestras de calibracin ya que es el principal metabolito de la CBZ y est siempre presente en el suero del paciente tratado, siendo adems extrado junto con la CBZ. El intervalo de concentraciones seleccionado para la CBZ es levemente ms amplio que el rango teraputico (4.0-12.0 g ml1) (Goodman Gilman, 2001) y previamente se verific la linealidad de la respuesta dentro del mismo. 2.3.2.6. DISEO DE LOS JUEGOS DE MUESTRAS DE VALIDACIN Se prepararon tres juegos de muestras para validacin: 1- Juego N 1: se prepar de la misma manera que el juego de muestras de calibracin, pero con concentraciones diferentes a las indicadas para este ltimo. En la Figura 2.13 se pueden ver las concentraciones de los analitos para este juego. 2- Juego N 2: se prepararon tres muestras a partir de tres mezclas diferentes de sueros de personas sanas, adicionados con diferentes volmenes de la solucin stock de CBZ, de manera de tener las siguientes concentraciones: 3.0, 9.9 y 13.8 g ml1. Este juego se us para el estudio de precisin. 3- Juego N 3: se prepararon cuatro muestras a partir de cuatro mezclas diferentes de sueros de personas sanas, adicionados con diferentes volmenes de la solucin stock de CBZ, de manera de tener concentraciones dentro del rango 3.0-14.3 g ml1. Este juego se us para realizar un estudio de recuperacin.
150
5
Carbamazepina epoxido (g ml )
-1
0 -2 0 2 4 6 8 10
-1
12
14
Carbamazepina (g ml )
Figura 2.13: Diseo experimental para el juego de muestras de calibracin (cuadrados) y para el juego N 1 de e validacin (crculos). (crculos).
2.3.3. RESULTADOS En la Figura 2.14 se pueden observar varios espec espectros tros de sueros humanos de personas sanas y de soluciones acuosas de CBZ y de CBZ-EP, ambos en una concentracin de 10 g ml1. Como puede apreciarse, el sistema presenta un fuerte grado de solapamiento espec espectral, tral, complejidad que se suma a la considerable variabilidad basal intrnseca de los sueros.
2.5
2.0
Absorbancia
1.5
Suero
1.0
0.5
CBZ-EP CBZ
0.0 220 240 260 280 300 320 340
Figura 2.14: Espectros de sueros humanos y de soluciones acuosas de CBZ y de CBZ-EP
151
Para realizar la determinacin de la CBZ en este complejo sistema analtico, se aplic el mtodo PLS-1 a los datos espectrales de orden cero y a los obtenidos al aplicar la segunda derivada a los mismos. A los fines de trabajar con una cantidad de informacin ptima y evitar el sobreajuste, se seleccion el nmero ptimo de factores utilizando el procedimiento de validacin cruzada. Como puede verse en la Tabla 2.18, el nmero de variables latentes para el caso de los espectros de orden cero es igual a tres, siendo esto indicativo de las fuentes de variabilidad en este sistema. Por otra parte, cuando se trabaja con la segunda derivada de los datos espectrales, el nmero de factores decrece a dos, ya que se elimina el problema del corrimiento de la lnea de base. Esto sugiere entonces, que la tercer fuente de variabilidad encontrada al analizar los espectros de orden cero corresponde a este fenmeno y que el mismo se corrige usando la seal derivada. En la Figura 2.15A se muestran los espectros de calibracin de orden cero y en la Figura 2.15B los espectros de calibracin correspondientes a la segunda derivada.
0.6 0.5
Absorbancia
0.4 0.3 0.2 0.1 0.0
280
290
300
310
320
330
340
350

8.0e-4
B
4.0e-4 0.0
D2
-4.0e-4
-8.0e-4
-1.2e-3 280
290
300
310
320
330

Figura 2.15: (A) Espectros de calibracin de orden cero. (B) Espectros de calibracin correspondientes a la segunda derivada.
152
En la Tabla 2.18 se presentan adems otros parmetros estadsticos importantes y las cifras de mrito para el modelo de calibracin multivariada aplicado a los dos tipos de espectros.
Tabla 2.18: Regin espectral, nmero de factores y parmetros estadsticos correspondientes a ambos modelos PLS-1
Parmetros estadsticos Regin (nm) Factores RMSECV (g ml1) REP (%) Datos espectrales de orden cero 285350 3 0.34 5.00 0.13 0.73 Datos de la segunda derivada de los espectros 285350 2 0.24 3.90 0.00043 1.00 0.12 0.40 1.21
SEN SEL
1 (g ml1)
LOD (g ml1) LOQ (g ml1)
0.08 0.25 0.77
Los resultados obtenidos con estos modelos, en la prediccin de la concentracin de CBZ en las muestras del juego de validacin nmero uno, se presentan en la Tabla 2.19.
Tabla 2.19: Resultados obtenidos por aplicacin de ambos modelos de PLS-1 al juego de validacin N 1
Muestra de validacin 1 2 3 4 5 6 7 8 Recup. media REP (%) CBZ adicionada (g ml1) Espectro de orden cero CBZ encontrada (g ml1) 1.91 2.24 9.68 9.78 5.17 5.21 8.01 7.54 Recuperacin (%) 66.41 75.78 96.19 94.44 94.39 94.36 104.55 97.80 90.49 8.64 Segunda derivada CBZ encontrada (g ml1) 2.75 2.71 10.36 10.15 5.42 4.87 7.74 7.38 Recuperacin (%) 95.84 91.75 102.97 97.93 98.99 88.21 101.05 95.76 96.56 5.35
2.87 2.95 10.06 10.36 5.48 5.52 7.66 7.71
153
Para analizar la precisin del mtodo analtico desarrollado, se trabaj sobre el juego de muestras de validacin nmero dos. Se analiz la repetibilidad del ensayo, mediante la realizacin de cinco replicados, para cada uno de los niveles de concentracin estudiados y se obtuvieron los resultados que se presentan en la Tabla 2.20.
Tabla 2.20: Resultados del estudio de precisin
Concentracin adicionada (g ml1) Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 3.0 9.9 13.8 Concentracin predicha (g ml1) 3.2 9.4 13.7 Desviacin estndar 0.083 0.17 0.17 Coeficiente de variacin (%) 2.6 1.8 1.2
Para el anlisis de la exactitud se calcularon los porcentajes de recuperacin en las muestras adicionadas con CBZ, correspondientes al juego de validacin nmero 3. Para cada nivel de concentracin se realizaron triplicados y los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 2.21. Como puede verse los porcentajes de recuperacin obtenidos son cercanos al 100 % para todos los niveles analizados. Por otra parte, se realiz una prueba t-student para comparar el valor medio de CBZ encontrado con la concentracin adicionada.
Tabla 2.21: Resultados obtenidos para el estudio de recuperacin realizado con el juego de validacin nmero 3.
Concentracin carbamazepina (g ml1) Nivel 1 Adicionada Encontrada Replicado 1 2.97 Replicado 2 2.97 Replicado 3 2.97 Promedio Desviacin estndar Probabilidad t de student (p)a Recuperacin promedio
a
Nivel 2 Adicionada Encontrada 8.74 8.74 8.74 8.65 8.78 8.48 8.64 0.15 0.300 DENS 101.7
2.88 3.03 2.97 2.96 0.08 0.829 DENS 99.7
DENS: Diferencia estadsticamente no significativa.
154
Con los datos de esta experiencia, se construy una grfica de concentraciones adicionadas vs. concentraciones predichas, usando para el ajuste regresin lineal ordinaria (Gonzlez, 1999) y se compar el valor de la pendiente y de la ordenada al origen, con sus valores ideales de 1 y 0 usando la prueba de la regin elptica de confianza conjunta (EJCR). En la Figura 2.16 se puede ver el grfico correspondiente a esta regin.
1.0
Ordenada al origen
0.5
0.0
-0.5
-1.0 0.95 1.00
Pendiente
Figura 2.16: Regin elptica de confianza conjunta para la pendiente (b) y para la ordenada al origen (a), correspondiente al anlisis por regresin de las concentraciones adicionadas vs. las concentraciones predichas de CBZ. La marca en forma de cruz corresponde al punto terico (a = 0, b = 1).
Finalmente, se realiz una comparacin de los resultados obtenidos con el mtodo analtico desarrollado y los obtenidos por aplicacin de dos mtodos de referencia: HPLC y FPIA. Para esto se trabaj con un juego de 10 muestras de sueros de pacientes tratados con CBZ, las que fueron analizadas en paralelo. Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 2.22.
155
Tabla 2.22: Estudio comparativo de los resultados obtenidos por aplicacin de HPLC o FPIA y PLS-1 sobre muestras reales de pacientes
Carbamazepina predicha (g ml1) Muestra Paciente 1 Paciente 2a Paciente 3 Paciente 4 Paciente 5 Paciente 6 Paciente 7 Paciente 8 Paciente 9 Paciente 10
a
HPLC 4.67 6.02 9.12 3.70 6.92 8.32 4.88 7.41 6.40 8.37
FPIA 6.18 9.34 3.88 8.52 4.93 7.60 6.56 8.54
Mtodo desarrollado 4.65 6.34 9.66 4.06 6.12 8.86 4.82 8.56 6.48 8.14
Se determin que el valor de la fenitona era 10.0 g ml1 por aplicacin del mtodo FPIA.
2.3.4. DISCUSIN Durante la optimizacin del paso de extraccin, se determin que el solvente ms conveniente era el benceno. Como se sabe, el benceno es un solvente altamente txico, pero dado que se trabaja con volmenes muy pequeos del mismo, se puede considerar que este aspecto se ve minimizado. Como puede verse en las Tablas 2.18 y 2.19, al utilizar el espectro derivado se ve incrementada la habilidad predictiva del modelo quimiomtrico, siendo menores los errores estimados para la calibracin y la prediccin. Por otra parte, se observa tambin que al trabajar con el espectro derivado hay una prdida en la sensibilidad y consecuentemente un aumento en los lmites de deteccin y cuantificacin. En cambio, la selectividad se ve incrementada, y esto se puede entender si se observa la Figura 2.15. Aqu se ve que pequeas diferencias entre los espectros estn magnificadas, obtenindose de esta manera mayor informacin de los datos espectrales. Si se analizan los resultados obtenidos en el estudio de la precisin, se ve que la misma mejora cuando aumenta la concentracin de la CBZ, pero en todos los niveles estudiados resulta comparable con las
156
de los mtodos de referencia. Por otra parte, a partir de los resultados del experimento de recuperacin se determin que no hay evidencia de error sistemtico, mientras que en la comparacin con los mtodos de HPLC y FPIA se obtuvo una buena concordancia entre los valores de concentracin predichos con el presente mtodo, para las muestras de pacientes analizadas y los obtenidos con los mtodos de referencia. Para casi todas las muestras, se tiene un error relativo comprendido en el rango de 0.4 a 6 % (slo la muestra n 8 presenta un error relativo de 15.5 %). La muestra n 2 contiene tambin fenitona (10 mg ml1, determinada por FPIA) y el resultado obtenido para la CBZ con el presente mtodo, no difiere significativamente del obtenido con los mtodos de referencia. Este hecho, sumado a la ausencia de absorbancia para el cido valproico en la regin espectral estudiada, permite concluir que las otras drogas antiepilticas usadas comnmente en combinacin con la CBZ, no resultan interferentes cuando se aplica esta metodologa. Finalmente, tambin es importante sealar que una vez realizada la calibracin, las mediciones de las muestras pueden ser hechas en unos pocos minutos, presentando beneficios tanto en trminos econmicos como en la reduccin de tiempos de implementacin, sobre los otros mtodos convencionales. 2.3.5. CONCLUSIONES En el presente trabajo se demuestra que la combinacin de una espectrofotometra UV acoplada con una extraccin optimizada del analito y un mtodo de calibracin multivariada (PLS-1), constituye una herramienta poderosa para ser aplicada al monitoreo de drogas teraputicas. Mediante la aplicacin del mtodo desarrollado en muestras reales de pacientes, se determin la concentracin de CBZ de manera exacta, precisa, simple, rpida y econmica.
157
2.4 DETERMINACIN DE PERMETRINA E IMIDACLOPRID EN PREPARADOS FARMACUTICOS DE USO VETERINARIO 2.4.1. PERMETRINA E IMIDACLOPRID. CARACTERSTICAS Y ANTECEDENTES ANALTICOS La permetrina es un agente insecticida altamente efectivo, que pertenece a la clase de los piretroides sintticos (Esquema 2.4). Se trata de un insecticida de contacto, que afecta el sistema nervioso central de los insectos, provocando su muerte. Se utiliza para el control de insectos plaga masticadores de los cultivos de invernadero agrcolas y hortcolas. Tambin se usa para combatir los insectos voladores y trepadores que afectan a la salud pblica, utilizndose en diferentes formulaciones farmacuticas para el tratamiento de la pediculosis humana. En veterinaria se utiliza como ectoparasiticida para combatir pulgas, garrapatas, mosquitos y jejenes, que afectan a los animales. Generalmente las formulaciones contienen permetrina y otro agente insecticida, el imidacloprid, a los fines de aumentar la eficacia del producto. La combinacin de estos dos principios activos acta sinrgicamente, mejorando su funcionamiento en la prevencin y tratamiento de las infecciones. Estos compuestos se usan bajo la forma de soluciones tpicas, junto a otros excipientes, y son retenidos en la grasa de la piel y en los folculos del pelo del animal, no son absorbidos por el cuerpo y por lo tanto no circulan por el sistema sanguneo.
Esquema 2.4: Frmula estructural de la permetrina En la bibliografa se publican mtodos analticos para la determinacin de estos compuestos en formulaciones farmacuticas, basados fundamentalmente en tcnicas de cromatografa lquida de alto rendimiento (Garca, 2001) y en espectroscopia UV derivada (Kazemipour, 2002).
158
2.4.2. MTODO ANALTICO En el presente trabajo se desarroll un mtodo analtico para la determinacin simultnea de permetrina e imidacloprid en pipetas pulguicidas, basado en el anlisis de datos espectrales obtenidos con espectroscopia ultravioleta mediante calibracin multivariada. La medida espectral se realiz entre 200 y 350 nm y como mtodo de calibracin multivariada se utiliz PLS-1. Los ingredientes activos mencionados, se presentan en el preparado farmacutico analizado junto a los siguientes excipientes: aceite de almendra, propilencarbonato, alcohol benclico y butilhidroxitolueno. El procedimiento analtico seguido para las muestras comerciales, se detalla a continuacin: h- Se realiz una dilucin 1/10000 de las muestras, tomando un volumen de 10.0 l y llevando con metanol a 100.00 en matraz aforado. iSe obtuvieron los espectros de absorcin electrnica en el rango 200-350 nm.
2.4.2.1. EQUIPAMIENTO Las lecturas de absorbancia se realizaron en un espectrofotmetro marca: Perkin Elmer, modelo: Lamba 20, usando celdas de cuarzo de 1.00 cm de camino ptico. Los espectros de absorcin electrnica fueron convertidos a formato ASCII y se transfirieron a una PC Pentium 550, para su tratamiento posterior. Las determinaciones por HPLC se realizaron en un cromatgrafo marca Shimadzu, equipado con dos bombas, detector UV (215 nm) e inyector manual (20 l). El mtodo PLS-1, se aplic utilizando la herramienta MVC1 del programa MATLAB 5.3 (MATLAB 5.3, 1999). Para el anlisis de regresin y el tratamiento estadstico de los datos, se utiliz el programa Sigma Plot 5.0. 2.4.2.2. REACTIVOS Los reactivos necesarios para realizar el procedimiento analtico, se prepararon a partir de drogas calidad para anlisis y de acuerdo a lo que se detalla a continuacin: i) j) Solucin stock de permetrina: se disolvi la cantidad necesaria de droga slida en metanol, de manera de lograr una concentracin de 400 mg l1. Solucin stock de imidacloprid: se disolvi la cantidad necesaria de droga slida en metanol, de manera de lograr una concentracin de 2000 mg l1.
159
k) Blanco de muestra: se prepar a partir de los excipientes usados en la formulacin de la pipeta y siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras comerciales analizadas fueron las elaboradas por el Laboratorio Zoovet (Santa Fe), con un contenido de permetrina de 24.0 g % y de imidacloprid de 6.0 g %. 2.4.2.3. DISEO DEL JUEGO DE MUESTRAS DE CALIBRACIN Se trabaj con un juego de 17 muestras preparadas siguiendo un diseo central compuesto, con cinco niveles de concentracin diferentes para ambos principios activos y para los excipientes, comprendidos dentro del rango: 80 a 120 % de las concentraciones indicadas por el fabricante para las muestras comerciales. Como se ve, se tuvieron en cuenta niveles variables de los excipientes presentes en la preparacin, de manera de contemplar probables variaciones en la composicin de las muestras analizadas. Adems, se verific que las concentraciones seleccionadas se encuentren dentro del rango de respuesta lineal. La Tabla 2.23 muestra las concentraciones de los analitos para este juego.
Tabla 2.23: Composicin del juego de muestras de calibracin de acuerdo a un diseo central compuesto para la aplicacin del mtodo PLS-1
N de muestra de calibracin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
a
Permetrina (mg l1) 27.0 53.0 40.0 40.0 40.0 40.0 32.0 48.0 32.0 48.0 32.0 48.0 32.0 48.0 40.0 40.0 40.0
Imidacloprid (mg l1) 9.0 9.0 6.0 12.0 9.0 9.0 7.2 7.2 10.8 10.8 7.2 7.2 10.8 10.8 9.0 9.0 9.0
Excipientes %a 100.0 100.0 100.0 100.0 67.0 134.0 80.0 80.0 80.0 80.0 120.0 120.0 120.0 120.0 100.0 100.0 100.0
El % es relativo al blanco usual de la muestra comercial.
160
2.4.2.4. DISEO DE LOS JUEGOS DE MUESTRAS DE VALIDACIN Se trabaj con un juego de 11 muestras preparadas siguiendo un diseo central compuesto, con cinco niveles de concentracin diferentes para ambos principios activos, comprendidos dentro del rango: 90 a 110 % de las concentraciones indicadas por el fabricante para las muestras comerciales. Los excipientes fueron agregados en un nivel de concentracin del 100 %. La Tabla 2.24 muestra las concentraciones de los analitos para este juego.
Tabla 2.24: Composicin del juego de muestras de validacin de acuerdo a un diseo central compuesto
N de Muestra de validacin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
a
Permetrina (mg l1) 34.0 46.0 40.0 40.0 36.0 44.0 36.0 44.0 40.0 40.0 40.0
Imidacloprid (mg l1) 9.0 9.0 8.0 10.0 8.1 8.1 9.9 9.9 9.0 9.0 9.0
Excipientes %a 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0
El % es relativo al blanco usual de la muestra comercial.
2.4.3. RESULTADOS En la Figura 2.17 se pueden observar los espectros de absorcin electrnica de permetrina e imidacloprid, ambos en metanol y en concentraciones iguales (20 mg l1), adems del espectro obtenido para una pipeta pulguicida comercial conteniendo ambos componentes y luego de diluir 1/10000. Los datos espectrales obtenidos se analizaron con el mtodo PLS-1 y en primer lugar se realiz la seleccin del nmero ptimo de factores por aplicacin del procedimiento de validacin cruzada, usando el criterio propuesto por Haaland y Thomas (Haaland, 1988), como se hiciera en los casos antes desarrollados en la presente tesis. Se encontr un nmero ptimo de factores de 4 para la permetrina y de 3 para el imidacloprid. Como los parmetros estadsticos de la calibracin no resultaron del todo satisfactorios, se decidi implementar una seleccin de regiones usando el mtodo de ancho de ventana mvil para encontrar la regin de mnimo PRESS. Se trabaj con dos anchos de ventana diferentes y se encontraron dos
161
rangos de sensores para cada componente, sobre los cuales se realiz la calibracin. Los parmetros estadsticos obtenidos se presentan en las Tablas 2.25 y 2.26. Como puede observarse, los parmetros estadsticos de calibracin resultan mejores en ambos rangos de sensores seleccionados, respecto a los obtenidos cuando se usa el rango completo.
4.0 3.5 3.0
absorbancia
2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360
longitud de onda
Figura 2.17: Espectros correspondientes a la permetrina (azul) y el imidacoprid (rojo), en concentraciones iguales a 20 mg l1 (solucin metanlica) y espectro para una pipeta pulguicida comercial (dilucin 1/10000 en metanol) conteniendo ambos componentes (negro) Tabla 2.25: Parmetros estadsticos de la calibracin por PLS-1 para la permetrina utilizando distintas regiones de trabajo
PRESS Regin espectral (nm): 200 - 350 N de factores: 4 Regin espectral (nm): 269 - 289 N de factores: 5 Regin espectral (nm): 269 - 284 N de factores: 5 27.74 2.99 2.63
REP 3.19 1.05 0.98
R2 0.9674 0.9965 0.9969
162
Tabla 2.26: Parmetros estadsticos de la calibracin por PLS-1 para el imidacloprid utilizando distintas regiones de trabajo
PRESS Regin espectral (nm): 200 - 350 N de factores: 3 Regin espectral (nm): 239 - 279 N de factores: 4 Regin espectral (nm): 269 - 294 N de factores: 3 12.50 1.30 0.85
REP 9.53 3.20 2.58
R2 0.7155 0.9622 0.9753
Se realiz la prediccin de la concentracin de ambos componentes activos en las muestras de validacin, trabajando con el rango completo de sensores y en ambas regiones seleccionadas, y los resultados obtenidos se presentan en las Tablas 2.27 y 2.28. Tabla 2.27: Resultados obtenidos para permetrina por aplicacin de PLS-1 al juego de muestras de validacin, utilizando distintas regiones para la calibracin
Muestra Concentracin de adicionada validacin mg l1 Regin (nm): 200-350 N de factores: 4 33.99 45.74 40.32 40.43 36.40 46.39 36.70 45.71 40.94 41.30 42.60 3.44 Concentracin predicha mg l1 Regin (nm): 269-289 N de factores: 5 33.55 46.08 42.00 42.89 39.18 48.27 39.94 49.78 46.50 46.09 46.83 11.62 Regin (nm): 269-284 N de factores: 5 33.12 45.85 41.49 42.30 38.69 47.46 38.74 48.53 45.50 45.03 46.01 9.59
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 REP %
34.00 46.00 40.00 40.00 36.00 44.00 36.00 44.00 40.00 40.00 40.00
163
Tabla 2.28: Resultados obtenidos para imidacloprid por aplicacin de PLS-1 al juego de muestras de validacin, utilizando distintas regiones para la calibracin Muestra Concentracin adicionada de mg l1 validacin Concentracin predicha mg l1 Regin (nm): 200-350 N de factores: 3 8.77 9.11 8.20 9.84 8.08 8.21 8.86 9.413 8.67 8.43 8.47 5.20 Regin (nm): 239-279 N de factores: 4 8.98 9.16 8.40 10.24 8.76 8.82 10.06 10.47 9.78 9.47 9.42 5.64 Regin (nm): 269-294 N de factores: 5 9.40 10.75 10.50 12.89 11.84 12.29 14.11 15.37 14.66 14.38 14.67 49.32
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 REP %
9.00 9.00 8.00 10.00 8.10 8.10 9.90 9.90 9.00 9.00 9.00
Como puede observarse, los resultados obtenidos para la prediccin son mejores cuando se utiliza el rango completo de sensores. Es decir que al realizar una seleccin de regiones se logra mejorar los parmetros estadsticos de la calibracin, pero no se obtiene mejora en la prediccin. Los espectros de absorcin obtenidos para las muestras de calibracin y para las muestras de validacin se presentan en las Figuras 2.18 y 2.19 respectivamente.
164
absorbancia
0 200 220 240 260 280 300 320 340
longitud de onda
Figura 2.18: Espectros de absorcin obtenidos entre 200 y 350 nm para el juego de muestras de calibracin
165
absorbancia
0 200 220 240 260 280 300 320 340
longitud de onda
Figura 2.19: Espectros de absorcin obtenidos entre 200 y 350 nm para el juego de muestras de validacin En la Tabla 2.29 se presentan los parmetros de calibracin y las cifras de mrito obtenidos para ambos componentes activos cuando se trabaja en el rango completo de sensores. Tabla 2.29: Parmetros de calibracin y cifras de mrito obtenidos para la calibracin con PLS-1, cuando se trabaja con el rango completo de sensores
Permetrina Regin (nm) N de factores RMSECV (mg l-1) REP % 200 - 350 4 1.28 3.19 16.60 0.01 6.02 10-2 2.92 10-1 0.17 0.50 1.66 Imidacloprid 200 - 350 3 0.86 9.53 3.72 0.01 2.69 10-1 6.54 10-1 0.04 0.11 0.37
bk
SEN SEL -1 (mg l-1)
LOD (mg l-1) LOQ (mg l-1)
166
Se construy una grfica de concentraciones adicionadas vs. concentraciones predichas, usando para el ajuste cuadrados mnimos ponderados (Massart, 1997), para ambos componentes y se compar el valor de la pendiente y de la ordenada al origen, con sus valores ideales de 1 y 0, usando la prueba de la regin elptica de confianza conjunta (EJCR). En la Figura 2.20 se puede ver el grfico correspondiente a esta regin para la permetrina y en la Figura 2.21 para el imidacloprid.
8 6 4
Ordenada al origen
2 0 -2 -4 -6 -8 -10 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3
Pendiente
Figura 2.20: Regin elptica de confianza conjunta para la pendiente (b) y para la ordenada al origen (a), correspondiente al anlisis por regresin de las concentraciones adicionadas vs. las concentraciones predichas para permetrina. La marca en forma de cruz corresponde al punto terico (a = 0, b = 1)
167
Ordenada al origen
-2
-4
-6 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
Pendiente
Figura 2.21: Regin elptica de confianza conjunta para la pendiente (b) y para la ordenada al origen (a), correspondiente al anlisis por regresin de las concentraciones adicionadas vs. las concentraciones predichas para imidacloprid. La marca en forma de cruz corresponde al punto terico (a = 0, b = 1)
Sobre las pipetas comerciales se obtuvieron los resultados que se presentan en la Tabla 2.30: Tabla 2.30: Resultados obtenidos en las pipetas comerciales marca Zoovet para ambos ingredientes activos
Pipeta comercial Mtodo cromatogrfico 1 2 3 23.7 24.7 23.8 Mtodo espectrofotomtrico 22.6 (0.9) 23.7 (0.8) 22.9 (0.9) Mtodo cromatogrfico 6.55 6.46 6.59 Mtodo espectrofotomtrico 6.5 (0.5) 6.2 (0.5) 6.8 (0.6) Permetrina g % Imidacloprid g %
Los valores entre parntesis corresponden a la desviacin estndar para tres replicados.
168
2.4.4. CONCLUSIONES La combinacin de tcnicas que producen seales de primer orden como los espectros de absorcin electrnica, y herramientas computacionales como los mtodos de calibracin multivariada, puede ser una alternativa sencilla a los mtodos cromatogrficos en el anlisis rutinario de las muestras que contienen frmacos. La permetrina y el imidacloprid son principios activos utilizados solos o en forma conjunta, unidos a distintos excipientes en preparaciones de uso veterinario. Frente a la separacin temporal conseguida en cromatografa, el presente trabajo se bas en el aislamiento matemtico de las seales de los distintos componentes de la muestra, a los fines de realizar la determinacin simultnea de ambos principios activos. Se estudi la optimizacin del modelo de calibracin mediante la seleccin de regiones y se puede concluir que esta estrategia debe ser manejada con cuidado, ya que una rigurosa seleccin de regiones, si bien conduce al mejoramiento de los parmetros estadsticos de la calibracin, como se vio en los casos estudiados con anterioridad, en algunos (como en el presente), tambin conduce a la prdida de habilidad predictiva.
169

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Validacion de Dexa Sodio Fosfato

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CAPTULO 2

Tabla 2.1: Anlisis de los efectos con un diseo Plackett-Burman Experimento 1 2 3 4 5 6 7 8

+1 = 0.100, 0 = 0.060 y 1 = 0.020.

0.0 -1.0 -0.5

-1.0 0.0 -0.5 0.5 0.0 0.5 1.0 1.0

1.04 0.96 0.88 0.80 0.72 0.64 0.56 0.24

0.56 0.64 0.72

0.960.88 1.04 1.12 1.20 1.28

Figura 2.2: Grfica de contorno correspondiente la Figura 2.1

2.44 (DENS)c 2.74 (DENS)c 0.55 (DENS)c 2.44 (DENS)c

para un nivel de significancia igual a 0.05.

Figura 2.3: Pantalla del programa MULTIVAR

El % es relativo al blanco usual del inyectable comercial.

Tabla 2.6: Composicin del juego nmero uno de muestras de validacin

El % es relativo al blanco usual del inyectable comercial.

Creatinina 240-280 4 0.0716 0.0691 0.97 0.9998

Propilparabeno 260-340 4 0.0242 0.0402 0.97 0.9997

intra-ensayo 0.50 0.31 0.24 0.97 1.17 0.94

-0.20 0.98 0.99 1.00 1.01 1.02 1.03 1.04 1.05

Longitud de onda (nm)

DIP Predicha (mg l )

122 120 118 116 114 112 110 110

DIP Adicionada (mg l )

valores entre parntesis corresponden a la desviacin estndar para cuatro replicados.

Valor de referencia (mtodo UV) = 126.0 (0.4) mg l1 (cuatro replicados).

valores entre parntesis corresponden a desviacin estndar para cuatro replicados.

Valor de referencia (mtodo por HPLC) = 4.03 (0.03) mg l1 (cuatro replicados).

DIP ANNs/Predicha (mg l )

124 122 120 118 116 114 112 110 110

DIP Adicionada (mg l )

Figura 2.10: Pantalla del programa MVC1.

113.00 87.84 62.68

X 1 (100.00) X 3 (0.00) X 2 (100.00) X 2 (0.00) X 1 (0.00)

Figura 2.11: Superficie de respuesta para el modelo cuadrtico de Scheff

Figura 2.12: Grfica de contornos para el diseo de mezclas simplex centroide

0.0 220 240 260 280 300 320 340

Longitud de onda (nm)

Figura 2.14: Espectros de sueros humanos y de soluciones acuosas de CBZ y de CBZ-EP

0.4 0.3 0.2 0.1 0.0

Longitud de onda (nm)

Longitud de onda (nm)

0.08 0.25 0.77

2.87 2.95 10.06 10.36 5.48 5.52 7.66 7.71

2.88 3.03 2.97 2.96 0.08 0.829 DENS 99.7

DENS: Diferencia estadsticamente no significativa.

-1.0 0.95 1.00

FPIA 6.18 9.34 3.88 8.52 4.93 7.60 6.56 8.54

El % es relativo al blanco usual de la muestra comercial.

El % es relativo al blanco usual de la muestra comercial.

4.0 3.5 3.0

REP 3.19 1.05 0.98

R2 0.9674 0.9965 0.9969

REP 9.53 3.20 2.58

R2 0.7155 0.9622 0.9753

0 200 220 240 260 280 300 320 340

0 200 220 240 260 280 300 320 340

SEN SEL -1 (mg l-1)

LOD (mg l-1) LOQ (mg l-1)

2 0 -2 -4 -6 -8 -10 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3

-6 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

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