Prctica No.

3: Prueba de alcaloides en Hygrophyla tyttha

Daniel Felipe Victoria Muoz 125355, Aida Johanna Rivera Hurtado 125336 Fitoqumica y Farmacognosia, Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias Universidad Nacional de Colombia _____________________________________________________________________

Objetivo general
Determinar la presencia de alcaloides en Hygrophyla tyttha

Objetivos especficos
Comparar los mtodos de identificacin de alcaloides. Determinar en las semillas de Malus domestica la presencia de glicsidos cianogenicos.

Marco terico
No existe una definicin exacta para los alcaloides, pero se ha llego al consenso de que son compuestos orgnicos de origen natural, nitrogenado, encontrndose generalmente intraciclico, derivados de los aminocidos, de carcter ms o menos bsico, de distribucin restringida, con propiedades farmacolgicas importantes a dosis bajas que responden a reacciones comunes de precipitacin1. De acuerdo a las caractersticas de esta definicin, algunos autores han divido a los alcaloides en cuatro clases: 1. Alcaloides Verdaderos: Cumplen estrictamente con las caractersticas de la definicin de alcaloides: son formados de aminocidos, tienen siempre un nitrgeno intraciclico, son de carcter bsico y existen en la naturaleza normalmente en estado de sal. 2. Protoalcaloides: Son aminas simples con nitrgeno extraciclico, de carcter bsico y son pero son productos del metabolismo de los aminocidos. 3. Pseudoalcaloides: Presentan algunas de las caractersticas de la definicin de alcaloide, pero son derivados de aminocidos. 4. Alacaloides Imperfectos: Son derivados de bases puricas, no precipitan con los reactivos especficos para alcaloides.

No son alcaloides aminocidos, las betalainas, los pptidos, los aminoaucares, las vitaminas nitrogenadas, porfirinas, algunas bases como la tiamina ampliamente distribuida en los seres vivos y los alkil aminas de bajo peso molecular, en la siguiente tabla se muestra la ruta sinttica de las clases de alcaloides:

Fig 1. Ruta sinttica de los alcaloides1 La funcin de los alcaloides en las plantas no es aun clara, existen algunas sugerencias sobre el papel que poseen estos compuestos en las sustancias vegetales como: Desecho o almacenamiento del nitrgeno sobrante en la planta Sirven como transporte del nitrgeno no metabolizado dentro de la planta Cumplen funciones de proteccin de la planta, por el mal sabor que poseen estos Reguladores del crecimiento en la planta

Se ha demostrado que la perdida de los alcaloides no impide el desarrollo de la planta, lo cual sugiere que los alcaloides no son esenciales para la vida de la planta, sin embargo estos deben participar en secuencias metablicas y no son solamente producto de desecho del metabolismo. La propiedades fisicoqumicas varan dependiendo del alcaloide de que se est hablando, las masas de estos pueden varan entre 100 y 900 (conina C8H17N=127, vincristina C46H56N4O10=824), la mayora son incoloros a excepcin de los altamente conjugados como la berberina (amarillo), la sanguinarina (rojo), la urabaina (verde) y las oxoaporfinas que van de amarillo a rojo, son normalmente solidos a temperatura ambiente, solo las bases no oxigenadas como la o la conina, la nicotina y la esparteina que son lquidas2.

Las tcnicas de reconocimiento estn basadas en la capacidad que tienen los alcaloides en estado de sal, que pueden ser fcilmente precipitados con reactivos de yodo, metales pesados como el bismuto, mercurio, tungsteno, etc., los principales reactivos de precipitacin se describen a continuacin3: REACTIVO Mayer Hager Valser cido Tanico Bouchardat Dragendorff Reineckato de amonio COMPOSCION HgCl2 + KI COLOR DE PRECIPITADO Crema Amarillo Crema Amarillo Rojo Pardo Anaranjado Crema o Blanco
3

C6H3N3O7 (acido pcrico)

HgI2 + KI

C76H52O46
I2 + KI Bi(NO3) + HNO3 + KI NH4[Cr(NH3)2(SCN)4].H2O Tabla 1: reactivos de precipitacin

Los reactivos de precipitacin utilizados en esta prctica fueron Dragendorff, Mayer, Valser, Reineckato de amonio, los reactivos yodados (Dragendorff, Mayer, Valser) precipitan a los alcaloides como poliyodatos complejos, mientras que los reactivos organonitrados (Reineckato de amonio) forman precipitados cristalinos que se descomponen por alcalisis. Su preparacin se describe a continucacion3 Reactivo de Dragendorff: se prepara mezclando 8g de nitrato de bismuto pentahidratado en 20 ml de acido ntrico al 30% con una solucin de 27.2g de yoduro de potasio en 50ml de agua, se deja reposar durante 24 h, se decanta y se afora a 100ml. Reactivo de Mayer: se prepara mezclando 1.3g de bicloruro de mercurio en 60ml de agua y 5g de yoduro de potasio, luego se afora a 100ml. Reactivo de Valser: se prepara mezclando 50ml de una solucin al 10% de yoduro de potasio a la que se le aade 10g de yoduro de mercurio, luego se afora a 100ml Reineckato de Amonio: una solucin acuosa al 4% de reineckato de amonio se acidula ligeramente con HCl y se trata con 0.1% p/v de clorhidrato de hidroxilamina. Es muy comn utilizar tambin cromatografas en capa delgada, para realizar la identificacin de los alcaloides, en estas tambin se utilizan los reactivos de precipitacin,

principalmente el reactivo de Dragendorff o uno organonitrado, ya que estos generan una coloracin que nos permite indicar la presencia de cualquiera estos. En la Brugmansia spp podemos identificar alcaloides de tipo tropanico como la

hiocsiamina, atropina, apoescopolamina y 6 hidroxi 3 tigloiloxitropano4, estos alcaloides se encuentran principalmente en las flores y poseen las mismas propiedades farmacolgicas, aunque generalmente la hiosciamina es entre 10 y 50 veces ms activa que la atropina, pero esta es mucho ms estable; sus efectos estn dados principalmente en el sistema nervioso, tanto en el central como en el autnomo, generando sntomas como: midriasis, una aceleracin a nivel del corazn, vasocontriccion de los vasos capilares, relajamiento del peristaltismo y una accin espasmolitica neurotopica, todo esto debido a su accin antagonista sobre la acetilcolina. Los glucsidos cianognicos son cianohidrinas unidas a un azcar cuya hidrlisis enzimtica libera cianuro; este acta inhibiendo al citocromo oxidasa, enzima de la cadena respiratoria, que impide la respiracin celular, ellos se encuentran ampliamente distribuidos en los vegetales, pero tambin los podemos encontrar en hongos, bacterias y animales, en plantas se encuentran los glucsidos cianognicos en la raz de mandioca principalmente; aunque tambin en semillas de Malus domestica (manzana), almendras, duraznos, cerezas, ciruelas, etc., pero en concentraciones muy bajas5 La prueba de identificacin ms utilizada para los glucsidos cianogenicos es la reaccin de Guinard (para cido cianhdrico), la cual consiste en que el HCN gaseoso se encuentre con una tira de papel absorbente impregnada con cido pcrico y carbonato de sodio, si se llegase a presentar un viraje desde el color amarillo original a un color rojo ladrillo podemos indicar la presencia de los glucsidos, entre ms fuerte sea el color rojo ladrillo ms cantidad de cido cianhdrico liberado por lo tanto hay una mayor cantidad de glucsidos cianogenicos6.

Resultados
En las tablas 2 y 3, se observa las pruebas de tubo, que se realizaron con los reactivos de Dragendorff, Valser, Meyer y Reinekato de sodio a los extractos de Hygrophila Tytta y Brugmansia spp. Cada imagen tiene dos tubos de ensayo a la izquierda e extracto sin ninguna prueba. Con esta imagen se realiza la comparacin entre antes de la prueba y despus de la misma.

Reactivo

Pruebas de tubo en comparacion con patron

Resultado

Dragendorff

No precipitado NEGATIVO

Valser

No precipitado NEGATIVO

Meyer

No precipitado NEGATIVO

Reinekato de sodio

No precipitado NEGATIVO

Tabla 2: Pruebas de tubo y resultado del precipitado del extracto de Brugmansia spp

Reactivo

Pruebas de tubo en comparacion con patron

Resultado

Dragendorff

No precipitado NEGATIVO

Valser

No precipitado NEGATIVO

Meyer

No precipitado NEGATIVO

Reinekato de sodio

No precipitado NEGATIVO

Tabla 3: Pruebas de tubo y resultado del precipitado del extracto de Hygrophila Tytta.

Tabla 4 se observa imgenes de la CCD una revelada con reactivo de dragendorff y otra vista a luz UV, con el reactivo de dragendorff se evidencia la presencia de alcaloides es la Brugmansia spp. Revelado Imagen de Cromatografa de capa delgada

Brugmansia spp Luz UV 365nm Banisteriopsis Caapi (yage) Hygrophila Tytta

Brugmansia spp Reactivo de dragendorff Banisteriopsis Caapi (yage) Hygrophila Tytta

Tabla 4: Cromatografa de capa delgada de los extractos de Hygrophila Tytta, Brugmansia spp y Banisteriopsis Caapi como patrn. La capa es revelada con luz UV y reactivo de dragendorff.

En la figura 2 se observa papel de cido pcrico con viraje naranja, lo cual evidencia la presencia de glicsidos cianogenicos en las semillas de Malus domestica (manzana).

Fig 2. Observacin de cido pcrico en presencia de glicsidos cianogenicos de las semillas de Malus domestica (manzana).

Discusin de resultados

En las pruebas de tubo para identificacin de alcaloides que utilizan los reactivos de Dragendorff, Mayer, Valser y Reineckato de amonio no se genero el precipitado en el extracto de Brugmansia spp; en el caso del reineckato de amonio es esperado que no de un precipitado ya que este reactivo sirve para la identificacin de nitrgenos cuaternarios o N-oxidos5, y segn Molina e.t en la Brugmansia spp encontramos alcaloides derivados del tropano, los que estn caracterizados por tener el nitrgeno metilado lo que impide la formacin de un N-oxido y se dificulta su cuaternizacion por el impedimento estrico. En la CCD revelada con reactivo de Dragendorff se observa manchas naranjas en la muestra patrn Banisteriopsis Caapi (yage) y en el extracto de Brugmansia spp lo que demuestra la presencia de alcaloides. Contrastado con las pruebas de tubo, que dieron un resultado negativo para alcaloides. Esta diferencia entre los mtodos de identificacin puede ser explicada por la siguiente hiptesis, en al cual se plantea que los reactivos utilizados en la prctica pudieron estar alterados o contaminados, ya que son de uso comn por todos los integrantes del laboratorio. Se observa para Hygrophyla tyttha en la CCD la ausencia de alcaloides, lo que es confirmado con las pruebas tubo, aunque en la CCD revelada a la luz UV de longitud de 365 nm, se identifica una mancha de color rojo (Tabla 4) la cual se cree que es un compuesto cromforo el cual no necesariamente es un alcaloide ya que las pruebas anteriores dieron negativas. Los RFs obtenidos en la CCD revelada con reactivo de Dragendorff son diferentes para los extractos de Brugmansia spp y de Banisteriopsis Caapi, aunque las dos muestran manchas que nos indican la presencia de alcaloides, esta diferencia de RFs es generada a que no son los mismos tipos de alcaloides. El viraje de un color amarillo inicial a un color naranja en la tira de papel absorvente con cido pcrico, despus de 24 horas, nos indica la presencia de glucsidos cianogenicos, aunque por ser de color naranja no existe una gran cantidad de estos glucsidos en las semillas de Malus domstica, estos resultados tienen correlacin con los resultado mostrados en la literatura6.

Conclusiones
En Hygrophyla tyttha se evidencio la ausencia de alcaloides, estos fue confirmado por las diferentes pruebas de tubo y por la CCD revelada con Dragendorff y luz UV El mtodo de identificacin de CCD es menos susceptible a errores por parte del experimentador, aunque las pruebas de tubo resultan ser mas tiles a la hora de identificar la estructura de un alcaloide, es importante tener cuidado en la pureza de los reactivos requeridos. En Malus domstica se evidencio la presencia de glucsidos cianogenicos, en bajas concentraciones, en concordancia con la reaccin de Guinard.

Bibliografa
1. Arango G., alcaloides y compuestos nitrogenados, prcticas de laboratorio de farmacognosia, Universidad de Antioquia, Facultad de Qumica Farmacutica. 2008, pp.1-8. 2. Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco. Facultad de ciencias naturales. Departamento de farmacia. Ctedra de farmacognosia. Libro de trabajo practico N8 alcaloides. pp. 110-115 3. Marcanno D., Hasegawa M.; Fitoquimica Organica, 2 ediccion, Editorial Torinio, Caracas, 2002, pp. 384-385 4. Molina Y., Estudio etnobotnico y etnofarmacolgico de plantas medicinales de Tambopata, Madre de Dios, Per, journal of medecine, 1995. 5. Valle P., Florentino B., Toxicologa de Alimentos, Instituto Nacional de Salud Pblica, Mexico, D.F.,2000, pp 73-75 6. Cuello J., Didctica de la Genetica, 1 edicin, publicacions edicions universitat de Barcelona, Barcelona, 1983, pp 150-151