NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 2736
1990-06-20

INDUSTRIAS AGRCOLAS. CAF. DETERMINACIN DEL CONTENIDO DE CAFENA (MTODO DE REFERENCIA)

E:

AGRICULTURAL INDUSTRIES. COFFEE. DETERMINATION OF CAFFEINE CONTENT (REFERENCE METHOD)

CORRESPONDENCIA:

DESCRIPTORES:

industrias agrcolas; determinacin de cafena; caf; producto agrcola.

I.C.S.: 67.140.20
Editada por el Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin (ICONTEC) Apartado 14237 Bogot, D.C. Tel. 6078888 Fax 2221435

Prohibida su reproduccin

Editada 2004-05-10

PRLOGO

El Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin, ICONTEC, es el organismo nacional de normalizacin, segn el Decreto 2269 de 1993. ICONTEC es una entidad de carcter privado, sin nimo de lucro, cuya Misin es fundamental para brindar soporte y desarrollo al productor y proteccin al consumidor. Colabora con el sector gubernamental y apoya al sector privado del pas, para lograr ventajas competitivas en los mercados interno y externo. La representacin de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalizacin Tcnica est garantizada por los Comits Tcnicos y el perodo de Consulta Pblica, este ltimo caracterizado por la participacin del pblico en general. La NTC 2736 fue ratificada por el Consejo Directivo de 1990-06-20. Organismo de estudio: Comit Tcnico 150003 Caf. Esta norma est sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en todo momento a las necesidades y exigencias actuales.

ICONTEC cuenta con un Centro de Informacin que pone a disposicin de los interesados normas internacionales, regionales y nacionales. DIRECCIN DE NORMALIZACIN

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NTC 2736

INDUSTRIAS AGRCOLAS. CAF. DETERMINACIN DEL CONTENIDO DE CAFENA (MTODO DE REFERENCIA)

0.

INTRODUCCIN

Esta norma contempla el mtodo escogido despus de un estudio comparativo que se realiz debido a su aplicabilidad general, reproducibilidad, especificacin, facilidad de aplicacin y rapidez. Sin embargo, el mtodo es particularmente sensitivo a las variaciones en su aplicacin, por consiguiente es esencial seguir las instrucciones con todo detalle. 1. ALCANCE Y CAMPO DE APLICACIN

Esta norma tiene por objeto establecer el mtodo de referencia para la determinacin del contenido de cafena en el caf. El mtodo es aplicable a caf verde, caf verde descafeinado, caf tostado, caf tostado descafeinado, extractos de caf tanto secos como lquidos y extractos descafeinados, tanto secos como lquidos. El lmite inferior de deteccin es 0,02 % de cafena con base seca. 2. REFERENCIAS

NTC 2323, Caf verde en sacos. Muestreo. NTC 2325, Caf verde. Determinacin de la prdida de masa a 105 C. ISO 1447, Caf verde. Determinacin del contenido de humedad. (Mtodo de rutina). ISO 3726, Caf instantneo. Determinacin de la prdida de masa a 70 C bajo presin reducida. ISO 6670, Caf instantneo. Caf instantneo en cajas con recubrimiento. Muestreo 1).

1)

Actualmente se encuentra en estado de draft.

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3. PRINCIPIO

NTC 2736

Extraccin de cafena de una muestra en un medio amoniacal. Purificacin sucesiva, con ter dietlico, en dos columnas cromatogrficas, la primera en un medio alcalino, la segunda en un medio cido, seguido por elusin de la cafena en cloroformo. Medicin espectromtrica del eluyente a la longitud de onda de mxima absorbancia (en la regin ultravioleta). 4. REACTIVOS

Todos los reactivos sern de conocida calidad analtica. El agua utilizada ser destilada o de por lo menos pureza equivalente. 4.1 4.2 cido sulfrico 200 g/l solucin [c (H2SO4) 2 mol/1)]. Hidrxido de sodio, 80 g/l solucin [c(NaOH) 2 mol/1)]

4.3 Tierra diatomcea. El producto usado (clite 545 o el ms apropiado) garantizar por lo menos 98 % de recuperacin de la cafena de la muestra ensayada. 4.4 Amonio 70 g/l solucin (1 volumen de solucin amonaco concentrado 20 = 0,9 g/ml + 2 volmenes de agua). 4.5 ter dietlico, puro o repurificado (vase el numeral 7.5) por cromatografa y saturado con agua, de la siguiente forma: Se pesan 800 ml de ter dietlico a travs de una columna que contiene 100 g de xido de aluminio bsico de grado 1 de actividad. El ter dietlico as repurificado ser guardado en botellas oscuras hasta ser usado. (Alternativamente) el ter dietlico recin destilado y libre de perxidos, puede ser usado en lugar del ter dietlico repurificado por cromatofrafa). 4.6 Cafena [1, 3, 7 trimetil 2,6 dioxopurina (CaH10N4O2)] puro, anhidro.

4.7 Cloroformo puro o repurificado (vase el numeral 7.5) por cromatografa, como est descrita en el numeral 4.5, y saturado con agua.

5.

APARATOS

5.1 Columnas cromatogrficas (vase la Figura 1), 250 mm de longitud, 21 mm de dimetro (columna I) y 17 mm de dimetro interior (columna II) con llaves de paso preferiblemente PTFE. 5.2 Espectrmetro ultravioleta, exactitud dentro de 0,004 unidades de absorbancia dentro del intervalo usado. 5.3 5.4 Celdas de slice de 10 mm de longitud de trayectoria ptica. Equipo usual de laboratorio.

5.4.1 Vaso de precipitado de 100 ml de capacidad. 2

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21mm COLUMNA I (Alcalina) 250 mm. long.

Algodn o lana de vidrio

Mezcla de tierra diatomcea y muestra

3 g de tierra diatomcea y 2 ml de NaOH (5,16g)

Lana de virio o algodn Llave de paso preferiblemente PFTE.

17mm

COLUMNA II (cido) 250 mm. long.

Lana de vidrio

3 g de tierra diatomcea y 3 ml de H2SO4 (6,36 g) Lana de virio Llave de paso preferiblemente PFTE.

Figura 1. Columna de cromatografa

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5.4.2 Bao de agua hirviendo.

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5.4.3 Frascos volumtricos aforados de 50 ml, 100 ml y 1 000 ml de capacidad. 5.4.4 Pipetas aforadas de capacidades 2 ml y 5 ml 5.4.5 Balanza analtica. 5.5 Molino de caf, apropiado para granos de caf tostado.

5.6 Molino de disco dentado con camisa de enfriamiento o molino analtico, con cortadora disponible y camisa de enfriamiento o molino similar apropiado para granos de caf verde. 5.7 Tamiz de tejido de alambre. Con apertura nominal de 600 m 630 m y que cumpla con el requisito de la norma ISO 3310/1. 6. MUESTREO

Muestra de acuerdo con el mtodo especificado en la norma correspondiente.

Nota. Para caf verde, el muestreo se efecta de acuerdo con lo establecido en la NTC 2323. Para caf instantneo en cajas de recubrimiento vase la norma ISO 6670. Los mtodos para otros tipos y productos de caf todava no han sido elaborados.

7. 7.1

PROCEDIMIENTO PREPARACIN DE LA MUESTRA

Si es necesario se muele la muestra usando los aparatos especificados en los numerales 5.5 5.6 hasta que pasen por el tamiz (vase el numeral 5.7). 7.2 DETERMINACIN DEL CONTENIDO DE MATERIA SECA

Se calcula el contenido de materia seca despus de determinar el contenido de humedad sobre una parte de la muestra de ensayo (vase el numeral 7.1) de acuerdo con el mtodo especificado en la norma correspondiente.
Nota. Para determinar la humedad en caf verde, vase la norma ISO 1447 y para la prdida de masa a 105 C de caf verde, vase la NTC 2325; para la determinacin de la prdida de masa a 70 C bajo presin reducida en caf instantneo, vase la norma ISO 3726. Los mtodos para otros tipos y productos de caf todava no han sido elaborados.

7.3

TAMAO DE MUESTRA

7.3.1 Caf verde y caf tostado Se pesa con una tolerancia de 0,1 mg alrededor de 1 g de la muestra (vase el numeral 7.1). Se transfiere a un vaso de precipitado de 100 ml (vase el numeral 5.4.1), se agregan 5 ml de solucin de amonaco (vase el numeral 4.4) y se calientan por 2 min en un bao de agua hirviendo (vase el numeral 5.4.2). Se deja enfriar y luego se transfiere a un frasco volumtrico 4

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de 100 ml (vase el numeral 5.4.3) se diluye hasta volumen con agua y se mezcla. Se deja reposar la solucin turbia y despus, usando una pipeta (numeral 5.4.4), se transfieren 5,0 ml de solucin en un vaso de precipitado de 100 ml (vase el numeral 5.4.1), se aaden 6 g de tierra diatomcea (vase el numeral 4.3) y se mezcla cuidadosamente. 7.3.2 Extracto de caf seco Se procede de acuerdo con el numeral 7.3.1, pero usando una muestra de 0,5 g y una alcuota de la solucin turbia de 2 ml y 3 g de tierra diatomcea. 7.3.3 Extracto de caf lquido Se procede de acuerdo con el numeral 7.3.1, pero usando una muestra entre 1 g y 2,5 g correspondientes a aproximadamente 0,5 g de caf slido y una alcuota de la solucin turbia de 2 ml y 3 g de tierra diatomcea. 7.3.4 Caf verde descafeinado y caf tostado descafeinado Se pesa con aproximacin a 0,1 mg un gramo de muestra (vase el numeral 7.1). Se transfiere a un vaso de precipitado (vase el numeral 5.4.1), se adicionan 5 ml de solucin de amonaco (vase el numeral 4.4) y se calienta por 2 min en un bao de agua hirviendo (vase el numeral 5.4.2). Se aaden 6 g de tierra diatomcea (vase el numeral 4.3) y se mezcla cuidadosamente. 7.3.5 Extracto de caf descafeinado seco Se procede de acuerdo con el numeral 7.3.4, pero usando un tamao de muestra 0,5 g. 7.3.6 Extracto de caf lquido descafeinado Se procede de acuerdo con el numeral 7.3.4, pero usando un tamao de muestra entre 1 g y 2,5 g correspondiente a aproximadamente 0,5 g de caf slido y 7 g a 8 g de tierra diatomcea. 7.4 DETERMINACIN

7.4.1 Llenado de columnas 7.4.1.1 Columna I (columna alcalina).

Capa A. Se mezclan cuidadosamente, con una esptula de hoja flexible, 3 g de tierra diatomcea (numeral 4.3) y 2 ml de solucin de hidrxido de sodio (numeral 4.2) hasta homogeneizar (vase nota). Se obtiene un polvo ligeramente hmedo y se transfieren 2 g de ste dentro de una columna de 21 mm de dimetro (numeral 5.1), la parte inferior de ste, est empacada con un tapn de algodn o lana de vidrio. Se tapona la mezcla despus de cada adicin sin fuerza excesiva, usando una vara de vidrio con un extremo aplanado hasta obtener una capa compacta. Un pequeo tapn de algodn o lana de vidrio se puede colocar en la parte superior de la capa A.

Nota. El material de empaque de la columna se puede preparar en grandes cantidades y almacenarlo en envases cerrados. Se requiere una masa de 5,16 g para cada columna alcalina.

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-

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Capa B. Se transfiere la mezcla de tierra diatomcea y el tamao de muestra (vase el numeral 7.3) dentro de la columna, sobre la capa A. Se seca el vaso de precipitado dos veces con una porcin de aproximadamente 1 g de tierra diatomcea (vase el numeral 4.3) transfirindola a esta columna. Se tapona para obtener una capa homognea y se coloca un tapn de algodn o lana de vidrio sobre la parte superior de la capa B.

7.4.1.2 Columna II (columna cida). Se coloca en la parte inferior de la columna cromatogrfica de 17 mm de dimetro (numeral 5.1) un tapn de lana de vidrio 3 g de tierra diatomcea (numeral 4.3) y 3 ml de cido sulfrico (numeral 4.1). Cuidadosamente, se mezcla y se empaca en la columna, como est descrito para la capa A de la columna I en el numeral 7.4.1.1. Se coloca un tapn de fibra de vidrio arriba de esta capa.
Nota. El material de empaque de la columna se puede preparar en grandes cantidades y almacenarlo en envases cerrados. Se requiere una masa de 6,36 g para cada columna cida.

7.4.2 Cromatografa Se montan las columnas una encima de otra, para que el efluente de la columna I pueda gotear directamente en la columna II. Se pesan 150 ml de ter dietlico (numeral 4.5) a travs de las dos columnas. Se ajusta la llave de cierre de la columna II para que la cantidad del lquido flotante permanezca encima de la capa. Se remueve la columna I. Sse pasan 50 ml de ter dietlico (numeral 4.5) a travs de la columna II usando la porcin inicial para mojar el extremo de la columna I y se pasa esta porcin tambin en la columna II desechando esta efluencia.
Nota. El ter dietlico usado se puede recuperar por agitacin con sulfato de hierro (II).

Se pasa el flujo de aire desde la parte superior a la parte inferior de la columna II (por ejemplo, usando un soplador de goma inflado hasta que deje de gotear ter dietlico de la columna I y el flujo de aire de la llave de cierre slo conduzca un dbil olor a ter dietlico. (Ver la advertencia) se eluye la columna II con 45 ml a 50 ml de cloroformo, se rene el eluyente en un frasco volumtrico aforado de 50 ml (numeral 5.4.1) se diluye a volumen con el cloroformo (numeral 4.7) mezclando cuidadosamente. El flujo del ter dietlico y el cloroformo bajo las condiciones de flujo natural debern estar dentro de 1,5 ml/min y 3 ml/min. Si ste excede la canalizacin, se reinicia la determinacin. ADVERTENCIA: las adiciones de ter dietlico y cloroformo se deben realizar en un lugar bien ventilado para prevenir la posibilidad de inhalacin de vapores de los solventes y una posibilidad de explosin. 7.4.3 Medicin espectromtrica (vase la Figura 2) 7.4.3.1 Medicin de la solucin de la muestra. Para evitar una falla de evaporacin del cloroformo. Se mide la absorbancia de la solucin de cafena en cloroformo (vase el numeral 7.4.2) usando celdas de slice (vase el numeral 5.3), contra el mismo (vase el numeral 4.7) para obtener la longitud de onda de mxima absorbancia (alrededor 276 nm). Una longitud de onda de 30 nm por encima o por debajo de esta lectura verifica la pureza de la cafena obtenida. 6

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Si la mxima absorcin excede el lmite de la medicin exacta del instrumento usado, se repite la medicin sobre la alcuota diluida de la solucin de cafena en el cloroformo (vase el numeral 7.4.2). En este caso, se tiene en cuenta la dilucin en el clculo. Los factores apropiados de la frmula de los numerales 8.1.1, 8.1.2 y 8.1.3 se tendr que ajustar convenientemente. Si la mxima absorcin medida es menor que 0,2, se repite la determinacin usando un tamao de muestra mayor en masa.

Celdas: Silicio de nm de longitud de trayectoria ptica. Solvente: Cloroformo. Blanco: Cloroformo. Absorbancia 0,276 nm 12

10

0,8 Absorbancia Absorbancia corregida 0,6

0,4 Absorbancia 0,246 nm 0,2

0,0

Absorbancia 0,306 nm 220 240 260 280 300 320

Longitud de onda nm.

Figura 2. Ejemplo de medicin espectromtrica

7.4.3.2 Preparacin y medicin de la solucin de referencia. Se prepara una solucin de referencia de cafena, de la siguiente manera: Se pesan 100 mg 20 mg de anhidro puro de cafena (vase el numeral 4.6) se colocan en un frasco volumtrico aforado de 1 000 ml (vase el numeral 5.4.3), se disuelven en cloroformo y se diluyen a volumen. Usando una pipeta (vase el numeral 5.4.4) se transfieren 5,0 ml de esta solucin a un frasco volumtrico aforado de 50 ml (vase el numeral 5.4.3) y se diluyen hasta volumen con cloroformo.

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Se mide la absorbancia de esta solucin, como est descrito en el numeral 7.4.3.1. La absorbancia correcta de la solucin de referencia (vase el numeral 8.1.1 y Figura 2) deber estar en 0,4. 7.4.4 Nmero de determinaciones Se realizan dos determinaciones sobre el tamao de muestras separadas, tomadas de la misma muestra. 7.5 ENSAYO EN BLANCO

Se realiza un ensayo en blanco sobre los reactivos, usando el procedimiento descrito, pero omitiendo el tamao de muestra. Antes de usar reactivos repurificados (vanse los numerales 4.5 y 4.7), y se repite ensayo en blanco y se verifica su pureza.

8. 8.1

EXPRESIN DE LOS RESULTADOS MTODO DE CLCULO Y FRMULAS

8.1.1 Caf verde y caf tostado El contenido de cafena de la muestra, expresada en gramos por 100 g de material seco, es igual a:
10 x C x A1 A2 x m x P

Donde: C = concentracin en gramos por ml de cafena en la solucin de referencia (numeral 7.4.3.2). absorbancia corregida del extracto purificado (numeral 7.4.2) obtenido en el numeral 7.4.3.1 por ejemplo.

A1

A1 =

(A1 ) 30 nm + (A1 ) + 30 nm
2

Donde el sufijo se refiere a la longitud de onda de mxima absorbancia, (aproximadamente 276 nm)

A2

absorbancia corregida de la solucin de referencia de cafena (numeral 7.4.3.2). Por ejemplo:

(A2 ) = (A2 ) 30 nm + (A2 ) + 30 nm

2

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m P = =

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masa en gramos del tamao de muestra. material seco contenido, expresado como un porcentaje de masa de la muestra (vase el numeral 7.2)

8.1.2

Extracto de caf seco y extracto de caf lquido

El contenido de cafena de la muestra expresada en gramos por 100 g de materia seca es igual a:
25 x 106 x C x A1 A2 x m x P

Donde los smbolos tienen el mismo significado indicado en el numeral 8.1.1. 8.1.3 Caf verde descafeinado, caf tostado y descafeinado, extracto de caf seco descafeinado y extracto de caf lquido descafeinado. El contenido de cafena de la muestra expresada en gramos por 100 g de material seco es igual a:
5 x 10 x C x A1 A2 x m x P

Donde los smbolos tienen el mismo significado indicado en el numeral 8.1.1. 8.1.4 Resultados Se toma como resultado el promedio aritmtico de los valores obtenidos, dado que el requisito para repetibilidad es satisfecho. 8.2 REPETIBILIDAD

La diferencia entre los valores obtenidos en las determinaciones llevadas a cabo simultneamente o en rpida sucesin, sobre la misma muestra, en un laboratorio con el mismo analista, no exceder el valor dado en la Tabla. 8.3 REPRODUCIBILIDAD

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones llevadas a cabo en dos laboratorios diferentes, sobre la misma muestra, no exceder el valor dado en la Tabla.

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Tabla. Repetibilidad y reproducibilidad Muestra Gramos de caf verde Contenido de g cafena/100 g de caf alrededor de 2 alrededor de 1 descafeinada < 0,1 alrededor de 2 alrededor de 1 descafeinada < 0,1 alrededor de 4 alrededor de 2 descafeinada < 0,3 Repetibilidad* g cafena/100 g de caf 0,12 0,08 < 0,01 0,10 0,04 < 0,01 0,17 0,12 < 0,01 Reproducibilidad* g de cafena/100 g de caf 0,38 0,31 0,01 0,32 0,19 0,01 0,39 0,20 0,01

Gramos de caf tostado

Caf soluble

En estos valores de repetibilidad y reproducibilidad son crticos sus diferencias a 95 % del nivel de probabilidad.

10.

DOCUMENTO DE REFERENCIA

INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Coffee. Determination of Caffeine Content (Reference Method) ISO 1983 6p. (International Standard ISO 4052).

10