UNIVERSIDAD AUTONOMA DE SINALOA

ESCUELA SUPERIOR DE AGRICULTURA DEL VALLE DEL FUERTE

DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGA, RAMA DE FITOPATOLOGA

NOTAS DEL CURSO DE:

BACTERIOLOGA Y VIROLOGA
PARASITOLOGIA 7mo. SEMESTRE ING. FIERRO CORRALES DAGOBERTO ING. MENA ADRIANO JORGE DANIEL Profesor

JUAN JOS ROS, SINALOA.

AGOSTO DE 2009

ii

UNIDAD I.- INTRODUCCIN. 1.1.- CONCEPTOS FITOPATOLGICOS. LA MICROBIOLOGA: Es un rea de la biologa que se encarga del estudio de los microorganismos en forma general. Esta ciencia empieza a desarrollarse a fines del siglo XVII, la razn de esto es que hasta esta fecha se cont con la ayuda de un instrumento ptico (microscopio) y adems que en esta poca prevaleca LA TEORA DE LA GENERACIN ESPONTNEA y otra razn es que se desconocan las tcnicas apropiadas para estudiar aspectos sobre estos microorganismos. LA FITOPATOLOGA: Es una ciencia de sntesis: toma datos y tcnicas de campos diversos como lo es la Agricultura, Microbiologa, Anatoma Vegetal y Ciencias del Suelo; sin embargo, la Fitopatologa es una ciencia aplicada que comprende el estudio de las enfermedades de las plantas y pretende dar soluciones prcticas para solucionar el problema. Las enfermedades de las plantas se pueden clasificar en varias formas, tomndose en cuenta diversos aspectos. Uno de los mtodos ms comunes de clasificacin es el tipo de agente y de esta manera se clasifican en: enfermedades infecciosas (todas aquellas provocadas por parsitos como: hongos, bacterias, virus, nemtodos, fitoplasmas, espiroplasmas, viroides, rikettsias, plantas parsitas, etc.) y enfermedades no infecciosas (provocadas por efectos del medio ambiente). FITOBACTERIOLOGA: Ciencia que se encarga del estudio de las bacterias que inducen enfermedades a los vegetales. QU SON LAS BACTERIAS?: Son microorganismos unicelulares procariontes, que carecen de clorofila y se reproducen principalmente por fisin binaria. Las bacterias fitopatgenas se definen como microorganismos unicelulares en forma de bastn, que carecen de clorofila, presentan pared celular y no tienen ncleo definido. La palabra BACTERIA proviene de las letras griegas: BACTERIE, que significa varita o bastn.

1.2.- HISTORIA DE LA FITOBACTERIOLOGA. Investigadores que hicieron aporte al campo de la Bacteriologa: ROBERTO HOOKE (1665): Fue el primero en observar protozoarios, utilizando lentes de 14 42 aumentos, analizando una gota de agua sucia, pero pas a ser pura observacin, ya que no describi y/o public nada. ANTON VAN LEEUWENHOECK (1675): Se interes en el pulido de lentes y fue el primero en construir un microscopio simple (200 aumentos), reconoci a las bacterias y a otros microorganismos, se entusiasm tanto con sus observaciones que escribi una serie de cartas a la REAL SOCIEDAD DE LONDRES, donde fue ignorado debido a la creencia en esa poca sobre LA TEORA DE LA GENERACIN ESPONTNEA. LUIS PASTEUR (1860): Experiment en un frasco con caldo nutritivo en su interior, el cual permita la entrada de aire libre pero filtrado, siendo con este experimento tan sencillo, lo que dio la pauta para refutar LA TEORA DE LA GENERACIN ESPONTNEA. Adems estudi la fermentacin, produccin de cido lctico va aerobiosis, estudia la enfermedad de la rabia en animales, ntrax del ganado, el clera y la produccin de vacunas y antispticos. Considerando todas las aportaciones de este investigador, se le considera como EL PADRE DE LA BACTERIOLOGA. En el ao de 1892 se le otorga el premio de la Soborna de Pars y en dicho reconocimiento menciona esta frase: El hombre debe de tener un mejor modo de vida, tiene que buscar la verdad, no tener dudas, tener determinacin an en condiciones adversas, preguntarse que he hecho para mi persona y que he hecho para mi pueblo. Vivan felices por todo lo que han hecho para la humanidad. ROBERTO KOCH (1876).- Trabajando en el laboratorio de PASTEUR, demuestra que el ntrax del ganado es ocasionado por una bacteria, al igual que la tuberculosis en humanos. Fue el primero en utilizar medios de cultivos de microorganismos en cultivos mixtos. Adems estableci los criterios para determinar la patogenicidad de microorganismos parsitos, a lo que actualmente conocemos como POSTULADOS DE KOCH. TOMS BURRIL (1880).- Investigador que relacion por primera vez a las bacterias como fitopatgenas, siendo la bacteria Micrococus amylovorus, hoy conocida como Erwinia amylovora, causante del tizn de fuego del peral y del manzano.

WAKER (1883).- Trabajando en el laboratorio de DE Bary, aisl y comprob la patogenicidad de Xanthomonas hyacinty la cual ocasiona la enfermedad del amarillamiento del jacinto. ARTHUR (1886).- Trabajando en Nueva York, comprueba y afirma los resultados de BURRIL y WAKER. QUAITE (1891).- Asistente de BURRIL, estudi la epidemiologa de Erwinia amylovora, adems de la distribucin o dispersin por medio de vectores. SAVASTANOI (1887).- Observ y describi las agallas de las ramas de olivo ocasionadas por Pseudomonas savastanoi. ERWIN F. SMITH (1887).- Estudia enfermedades de mucha importancia en Amrica Latina, como la marchitez de las cucurbitceas y la venacin negra de las crucferas. Dedic aproximadamente 40 aos al estudio de las bacterias fitopatgenas, por lo que en su honor, se le da el nombre al gnero Erwinia. 1.3.IMPORTANCIA FITOPATGENAS. Y DISTRIBUCIN DE LAS BACTERIAS

En la actualidad el hombre por obtener productos vegetales diversos que satisfagan sus necesidades de alimentacin, vestido y otras de menor importancia, se encuentran factores que disminuyen y en casos extremos aniquilan los rendimientos de los cultivos. Entre otros factores y en orden de importancia tenemos los insectos, ENFERMEDADES, malas hierbas y roedores. Las bacterias son importantes por varios puntos de vista: 1. 2. 3. 4. Son importantes en la ciencia de la biotecnologa. Son importantes en la ciencia de la geomicrobiologa. Son importantes en la gentica microbiana. Son importantes porque forman parte de los ciclos constructivos y destructivos.

1.- Importancia en la ciencia de la biotecnologa. Se utilizan bacterias fitopatgenas para la produccin y recombinacin de algunos productos, ejemplo: a. Escherichia coli: produce NDIGO (teir mezclilla). b. Clavibacter sp.: se utiliza para producir tomates secos, (CAMBELL) absorbe agua. c. Xanthomonas campestris: capaz de endulzar chiles sin caloras. d. Erwinia: la utiliza la Renault para filtrar los aceites (devoran impurezas). 5

e. Xanthomonas sp.: produce cervezas sin caloras (Alemania). f. Erwinia: destapa caos en (Francia). g. Pseudomonas: se utiliza para evitar que se encienda la lana. 2.- Importancia de las bacterias en la geomicrobiologa. Se han utilizado principalmente en Noruega, bacterias capaces de producir gas, tambin descomponen derivados del petrleo para su utilizacin en la industria, ejemplo: con la ayuda de las bacterias se disminuye el costo para la obtencin de vaselina. 3.- Utilidades de las bacterias en gentica microbiana. Se refiere al intercambio de genes o bien a las bacterias como portadoras de genes. Estos experimentos se iniciaron en Blgica y en la actualidad se usan en Suecia Y E.U. utilizando el gnero Agrobacterium y Bacillus para el intercambio o traspaso de genes. 4.- Debido a que forman parte de los ciclos constructivos y destructivos. Intervienen en los ciclos del Carbono, Nitrgeno y Azufre. En el ciclo del Carbono: algunos gneros de bacterias descomponen a los vegetales. En le ciclo del Nitrgeno: estn involucradas bacterias del gnero: Nitrobacter: descomponen el amoniaco a nitritos. Nitrosomonas: degradan los nitratos a nitritos. Las bacterias fitopatgenas juegan un papel muy importante en el ciclo destructivo de los vegetales debido a que ocasionan daos de suma importancia en la agricultura. De las 1800 especies de bacterias que se conocen, aproximadamente 200 se comportan como fitopatgenas, ejemplos: Pseudomonas solanacearum: ataca diversos cultivos de importancia en el mundo. En el ao de 1903 en Florida ocasion prdidas entre el 25-100% en el cultivo del tabaco. En Mxico en el ao de 1975 ocasion prdidas del 10-100% en el cultivo de la papa. En la isla de Java en el ao de 1978, caus el 25% de prdidas en el cultivo de cacahuate; en Chiapas se han abandonado plataneras por los daos ocasionados por esta bacteria. Erwinia amylovora: (Tizn de fuego del peral y manzano). Es una bacteria de mucha importancia en el mundo. En el ao de 1901 a 1904, se present una epifitia en el valle de San Joaqun, California, destruyendo aproximadamente 150,000 (95%) rboles de manzano y peral por lo que el cultivo se desplaz al Valle de Sacramento, California. 6

Agrobacterium tumefaciens: (Agallas de la corona). En 1963 en California, fue la enfermedad ms seria en 14 frutales de importancia. Para el ao de 1971 ocasion prdidas de 7 millones de dlares. Pseudomonas corrugata: Reportada en E.U. y recientemente un problema potencial para el cultivo de tomate y chile en el estado de Sinaloa. 1.4.- SINTOMATOLOGA BACTERIANA. Las funciones principales de los fitopatlogos son el diagnstico de las enfermedades de las plantas, la determinacin de su causa y el desarrollo de mtodos de control. Siendo una herramienta ms la sintomatologa inducida por las bacterias. Son muy pocas las especies de plantas cultivadas que no estn propensas al ataque de los agentes fitopatgenos; sin embargo, existen bacterias o especies que son compatibles a una sola especie de planta, aunque tambin existen especies de plantas que son susceptibles a ms de una especie de bacterias a la vez. Los sntomas pueden indicar la existencia de una enfermedad, pero ellos no son en s la enfermedad, estos son utilizados como guas para diagnosticar la naturaleza o causa de una enfermedad en particular. Entre las enfermedades bacterianas encontramos variados tipos de sntomas, los cuales son divididos en cuatro categoras: 1.- Cambios de color.- Alteraciones presentes en los plastidios, vacuolas o cloroplastos dando como consecuencia: Clorosis: retardamiento o disminucin de la clorofila por anormalidades en los cloroplastos. Amarillamiento. Disminucin de clorofila e incremento de carotenos y xantofilas. Antocianocencia: coloracin prpura como resultado del incremento del pigmento antocianina. 2.- desintegracin de tejidos: Son ocasionados por la accin enzimtica o toxinas que producen los patgenos sobre la pared del hospedante y/o afectando el protoplasma celular. Pudricin: reas muertas debido a la maceracin de tejidos con presencia de exudados bacterianos. Esta pudricin puede ser de consistencia seca o hmeda. Cancro: Necrosis restringida en los tejidos corticales de tallos y raz con crecimiento secundario, usualmente delimitado por tejido sano.

 Necrosis: reas donde las clulas sufren primeramente plasmlisis, colapso y la muerte. En ocasiones stas reas presentan una coloracin oscura o castaa debido a la produccin de melaninas. Tizn: Desintegracin rpida de los tejidos seguida por la muerte celular, esta puede ser parcial o total del hospedante (produccin de toxinas) tambin definida como lesiones de crecimiento indeterminado. Mancha: Necrosis localizada en cualquier parte de la planta. 3.- Desarrollo anormal del crecimiento: Ocasionado por alteraciones en las sustancias reguladoras del crecimiento ya sea aumentando o disminuyendo su concentracin. Agalla: desarrollo anormal donde las clulas daadas sufren el fenmeno de Hiperplasia (multiplicacin excesiva de las clulas) o Hipertrofia (aumento de tamao de las clulas). Fasciacin: proliferacin excesiva de brotes como consecuencia de la Hipoplasia (poca divisin celular), presentndose la planta como arrosetada. 4.- Daos al sistema vascular Marchitez: Flacidez o prdida de turgencia de la planta debido al taponamiento de los vasos que conforman este sistema, ya sea por estructuras del patgeno, sustancias que las bacterias producen o estructura del tejido vegetal. 1.5.- SEROLOGA Y PRODUCCIN DE ANTISUEROS. Los mtodos serolgicos, a juzgar por la cantidad de trabajos que se han realizado y los resultados que se han obtenido, son de un valor incalculable para la identificacin y diagnosis de rutina, as como un mtodo cuantitativo para el estudio de algunos microorganismos. Por lo anterior, es indispensable conocer las ventajas y limitaciones de la serologa. Con las tcnicas serolgicas se detectan microorganismos en bajas concentraciones en tejidos vegetales, pero para esto se requiere contar con el antisuero especfico y la obtencin de este es minuciosa y lleva tiempo. Si un animal de sangre caliente es infectado con un agente que causa enfermedad, como una bacteria o virus, en respuesta a la infeccin aparecen en su sangre protenas del grupo de las globulinas que se les llama anticuerpos. Se puede demostrar la presencia de anticuerpos en el suero de la sangre del animal inoculado, por la propiedad que tienen de combinarse IN VITRO, produciendo una reaccin visible con la bacteria o virus que caus la infeccin. Este acto de combinacin, que se puede demostrar de muchas maneras, constituye la base de las pruebas serolgicas. Un animal puede producir anticuerpos no solamente en respuesta a la infeccin con

un agente causante de enfermedad, sino tambin con una gran cantidad de materiales extraos, generalmente protenas y polisacridos. Cualquier sustancia que estimula la produccin de anticuerpos y que adems puede combinarse con ellos IN VITRO se denomina antgeno. Al suero que contiene anticuerpos se le llama antisuero, mientras que al suero proveniente de un animal al que nunca se le ha eyectado un material antignico se le nombra suero normal. Con el fin de producir antisueros especficos para una determinada bacteria, dicha especie de bacteria completamente purificada e inactivada se debe de inyectar a un animal, de preferencia a un conejo. Para obtener antisueros bien concentrados (ttulos altos), por lo general se emplean procedimientos que hayan sido exitosos en otras ocasiones. Despus de un tiempo prudencial, en el cual se considera (se detecta) que se ha formado la mayor cantidad posible de anticuerpos, se extrae la sangre del animal inmunizado y se separa la fraccin suero. Este antisuero es valorado seguidamente para determinar su ttulo. Para preparar un antisuero para una bacteria especfica se sigue el siguiente procedimiento: 1. Preparacin del antgeno: se prepara una suspensin bacteriana con concentracin aproximada de 3 x 109 clulas por mL, en solucin salina al 0.85% esterilizada y utilizando una cepa purificada en un cultivo de 48 hr de edad. Posteriormente, las bacterias se colocan en bao mara, a 60 C durante 2 horas para inactivarlas, aunque tambin se pueden matar con cloroformo, glutaraldehido o con otros mtodos. Para tener la certeza de que las bacterias murieron al ser expuestas a esta temperatura, se toma una muestra de la suspensin tratada y se siembra en una placa de medio artificial. 2. Inmunizacin del conejo: Para la inmunizacin se selecciona un conejo macho, joven, sano, de color blanco y se mantiene con alimento balanceado. Cuatro das antes de inyectarlo por primera vez y con un da de ayuno, se le extraen 10 mL de sangre para obtencin de suero normal; el suero normal se utiliza para pruebas de aglutinacin o de titulacin del antisuero. Para el sangrado del conejo, manualmente se le quita el pelo de una oreja hasta descubrir una vena; a esta vena, con una navaja de afeitar nueva y flameada, en la regin ms alejada de la cabeza se le practica una pequea herida longitudinal. La sangre se recoge con cuidado en un vaso de precipitado, tratando de que las gotas escurran por la pared interna del recipiente con el fin de que no golpeen y se rompan los glbulos rojos. Esta sangre obtenida se deja en reposo durante 1 hr, 20 min y despus, con una esptula se separa el cogulo de las paredes del vaso; despus de una noche de refrigeracin, por decantacin se obtiene el suero, que se debe de observar de color amarillo, ya que si se observa rojo, significa que se rompieron glbulos rojos y entonces es necesario centrifugar para clarificar el suero.

El suero obtenido se conserva en congelacin hasta el momento en que es utilizado. La inyeccin del antgeno en el cuerpo del conejo se realiza bajo un programa calendarizado, como se muestra en el cuadro siguiente:

Programa para la inmunizacin del conejo en contra de una bacteria especfica. Fecha ------------------A los 3 das A los 2 das A los 2 das A los 3 das A los 8 das A los 5 das Volumen del antgeno a inyectar 0.1 mL 0.2 mL 0.3 mL 0.5 mL 0.5 mL 1.0 mL 2.0 mL observaciones Intravenosa en la oreja Intravenosa en la oreja Intravenosa en la oreja Intravenosa en la oreja Msculo de la pata Msculo de la pata Msculo de la pata

Cuando se inyecta 1.0 mL en el msculo de la pata, el antgeno se puede mezclar con un coadyuvante (sustancia a base de aceite, ms compuestos con fuerte capacidad antignica, que puede ser de bacilos tuberculosos muertos o atenuados). PRUEBA DE AGLUTINAMIENTO O TTULO DEL ANTISUERO Los conejos, al igual que otros animales, producen anticuerpos en contra de sustancias o microorganismos extraos que penetran a su cuerpo. Para demostrar la presencia de anticuerpos en la sangre. Al conjugarse el antgeno con el anticuerpo se forman agregados de alto peso molecular que se precipitan y se agregan en el fondo de tubos de ensayo. Despus de tres das de la ltima inyeccin, al conejo se le extrae una pequea cantidad de sangre, como se describi anteriormente. De esta sangre se obtiene antisuero y se realiza la titulacin de la manera siguiente: Se preparan 10 tubos de ensayo con solucin salina al 0.85% (dos con 0.9 mL y el resto con 0.5 mL) y se esteriliza con presin y calor hmedo.

10

 A un tubo con 0.9 mL con solucin salina se le agrega 0.1 mL de antisuero, para que la dilucin quede 1:10. Despus de agitar perfectamente, de esta primera dilucin se toma 0.5 mL y se vacan en otro tubo de ensayo con 0.5 mL de solucin salina, para que quede una dilucin 1:20 en este segundo tubo y as se prosigue diluyendo hasta llegar al 1:2560. Del tubo con la ltima dilucin se desechan 0.5 mL para que todos los tubos queden con 0.5 mL de la mezcla. A cada tubo se le adicionan 0.5 mL de antgeno para aforar a 1.0 mL y se dejan en reposo en una gradilla. Nota: A otro tubo de ensayo con 0.9 mL de solucin salina biolgica, se le adiciona 0.1 mL del suero normal; se desechan 0.5 mL y despus se le adicionan 0.5 mL del antgeno. Este es el tubo que se utilizar como testigo. Algunas pruebas serolgicas son la aglutinacin, doble difusin en agar, inmunofluorescencia, ltex y ELISA. II. CARACTERSTICAS GENERALES DE LAS BACTERIAS FITOPATGENAS. 2.1.- MORFOLOGA 2.1.1.- Forma.- el cuerpo de la mayora de las especies de bacterias est constituido por una sola clula que puede variar su forma, de acuerdo con la especie: as pues, hay esfricas (cocos), elipsoidales (espirilos), bacilares (bacilos) y las de forma de coma; todas las fitopatgenas poseen su cuerpo en forma bacilar o bastn. Un grupo especial de microorganismos posee un cuerpo multicelular y filamentoso, como el de los hongos. 2.1.2.- Tamao.- el tamao de las clulas de las bacterias fitopatgenas vara de 0.6 a 4.5 micras de longitud por 0.5 a 1.0 micras de dimetro. 2.2.- ESTRUCTURA El examen microscpico de una clula bacteriana revela ciertas estructuras como: pared celular, cpsula, flagelos, pilis, membrana plasmtica, citoplasma y organelos o estructuras citoplasmticas. 2.2.1.- Pared celular.- Es la envoltura de las clulas procariticas, es una estructura que le confiere rigidez a la clula, le da forma y sirve de soporte a la presin interna, la cual generalmente es de 5 a 20 atmsferas; adems forma parte en la divisin celular y le da especialidad antignica para la identificacin. La pared celular representa el 20% del peso seco de la clula bacteriana y sus componentes qumicos son: aminas, aminocidos, cidos teitoicos, azcares y lpidos.

11

2.2.2.- Membrana citoplasmtica (MC).- Situada inmediatamente despus de la pared celular. Esta juega un papel importante en los procesos de biosntesis basndose en el nmero de enzimas que se encuentran en su nivel; en la excrecin de enzimas hidrolticas. Adems juegan un papel importantsimo en la respiracin y transferencia de sustancias. Es una estructura que esta formada por capas de protenas, lpidos y enzimas. Las bacterias Gram + tienen dos capas y las Gram tienen cuatro. 2.2.3.- Mesosomas.- Se encuentran en la membrana citoplasmtica y es un retculo que se encuentra entre la MC que limita el contenido citoplasmtico y aparecen como expansiones de la misma membrana. Estn relacionados directamente con el aparato nuclear de la clula bacteriana y se les atribuye que tienen funcin directa en la sntesis del septum transversal, o sea el que divide la clula al momento de la reproduccin asexual. 2.2.4.- Citoplasma. Est definido como un HIDROGEL COLOIDAL, es un fluido que contiene sustancias disueltas y partculas en suspensin como los ribosomas. El 80% del citoplasma corresponde a agua y el resto lo componen cidos nucleicos (AN), protenas, carbohidratos, lpidos, iones orgnicos, compuestos de bajo peso molecular y partculas diversas. En este fluido espeso ocurren muchas reacciones qumicas tales como la sntesis del material celular a partir de los nutrientes (anabolismo). El pH del citoplasma es de 7.0 y 7.5 (neutro). Adems de los ribosomas, el citoplasma contiene: el material nuclear (ncleo), sustancias de reserva (grnulos) y pequeos rganos especializados. 2.2.5.- Ribosomas.- Son partculas o pequeas granulaciones esfricas que se encuentran libres en el citoplasma o bien asociados a la parte interna de la MC. Los ribosomas estn compuestos aproximadamente en un 60% de ARN y un 40% de protenas. En los ribosomas se lleva a cabo la biosntesis de protenas. 2.2.6.- Granulaciones o sustancias de reserva del citoplasma.- Las bacterias pueden acumular materiales orgnicos e inorgnicos en el citoplasma y constituyen reserva de energa; cuando estas sustancias llegan a acumularse en una cantidad suficiente, forman lo que se llama granulaciones. Cada grupo o especie de bacteria sintetiza una sola categora de sustancias y sta puede ser: almidn, glucgeno, sustancias carbonatadas y Nitrgeno.

12

ESTRUCTURA FITOPATGENA

CELULAR

DE

UNA

BACTERIA

2.2.7.- Material nuclear (Nucleoide).- Las clulas procariticas (bacterias) no poseen una membrana que englobe al ncleo. El material nuclear ocupa la zona central de la clula y parece estar unido a los mesosomas. Este material nuclear llamado nucleoide esta formado por un nico cromosoma circular. Es el portador del material gentico (herencia). Como se mencion anteriormente el aparato nuclear tiene un solo cromosoma y este cuerpo cromosomtico tiene una estructura fibrilar que est constituida exclusivamente de ADN y, el mensajero del ADN es transmitido bajo formas de ARN mensajero, que luego va a transformarse en secuencias polipctidas que formarn las protenas de estructura o bien las enzimas. 2.2.8.- Plsmidos.- Son fragmentos extracromosomticos de ADN. Son portadores de la variacin gentica (resistencia). 2.2.9.- Elementos inconstantes en las bacterias.- Existen estructuras que solo estn presentes en ciertos grupos o especies de bacterias como lo son:

13

2.2.9.1.- Cpsula.- es un material mucilaginoso que rodea a la pared celular, protege a las clulas contra la desecacin (deshidratacin) y fagocitosis; tambin se cree que est involucrada con la patogenicidad, ya que algunos mutantes avirulentos carecen de este muclago; adems le da adherencia a la clula y sirve de reserva de carbohidratos 2.2.9.2.- Flagelos.- Son estructuras en forma filamentosa compuestas por protenas (flagelina) y 14 aminocidos (queratomicina del flagelo). Miden aproximadamente tres veces la longitud de la clula bacteriana. Su funcin es darle movimiento a la clula y funcionar como estructuras quimiorreceptoras. 2.2.9.3.- Pilis o fimbrias.- Son estructuras que se encuentran distribuidas en gran cantidad alrededor de la clula bacteriana. A diferencia de los flagelos, son cortas, quebradizas y contienen una protena que se llama pilina. Generalmente se encuentran con mayor frecuencia en las bacterias Gram y son ms raras en las Gram +. Se consideran de importancia en la fusin, al momento de la conjugacin bacteriana (paso de plsmidos a travs del pili de una clula a otra) y le da adherencia a la clula. III. FISIOLOGA BACTERIANA. 3.1.- NUTRICIN BACTERIANA. Una de las caractersticas que hace importante a las bacterias es su rpida reproduccin y por esto LA NUTRICIN BACTERIANA debe de estar completada con dos tipos de sustancias: Sustancias elementales.- Es decir, los materiales constitutivos de la clula, como son: C, N, O, H y en menor proporcin sustancias minerales y sustancias orgnicas (Ca, K, Mg y P). Estos constituyentes permiten a las clulas bacterianas elaborar sus propios alimentos. Para estudiar la nutricin de las bacterias es necesario analizar las necesidades elementales y energticas necesarias para su crecimiento, al igual que los factores fsicos y qumicos que la condicionan, ya que las bacterias se multiplican a partir de los alimentos o nutrientes presentes en los medios de cultivo. Las bacterias siempre tienen un nmero de necesidades comunes, como son las necesidades elementales (N, H2O, fuentes de energa) y otros que son capaces de utilizar ciertos elementos, requieren de sustancias orgnicas que son capaces de sintetizar, por ejemplo, los aminocidos, vitaminas, bases puricas y pirimdicas y stos son los que conocemos como FACTORES DE CRECIMIENTO. Entre los aminocidos estn: lisina, cido glutmico, arginina y el triptofano, mientras que en las vitaminas estn: riboflavina y el cido pantotnico.

14

Intervienen tambin en la nutricin y el crecimiento de los FACTORES FSICOS, los cuales pueden impedir, inhibir o bien acelerar la nutricin y dentro de estos factores tenemos: temperatura, pH y O2. Temperatura.- Ya que el proceso de desarrollo de las bacterias depende de reacciones qumicas y la velocidad con que se efectan estas reacciones es influida por la temperatura, el patrn de desarrollo bacteriano puede ser influido profundamente por esta condicin. La temperatura puede, en parte, determinar la velocidad de crecimiento y el grado total de desarrollo de los microorganismos. Las variaciones en la temperatura tambin pueden influir en los procesos metablicos y en la morfologa celular. Cada especie de bacterias crece a temperaturas que estn dentro de ciertos lmites. De acuerdo a las necesidades de temperatura para la nutricin y crecimiento las bacterias se pueden dividir en los siguientes grupos: Psicrfilas: Capaces de desarrollarse a 0 C o menos, aunque crecen mejor a temperaturas superiores, cercanas a 15 o 20 C. Mesfilas: Crecen mejor en lmites de temperatura que va de 25 a 40 C. Termfilas: Crecen mejor entre 45 y 60 C. Los lmites de desarrollo de algunas bacterias termfilas se extienden a la regin mesoflica. A estas especies se les conoce como termfilas facultativas o euritermfilas. Otras que pertenecen a las termfilas crecen mejor a temperaturas superiores a los 60 C y no se desarrollan a temperaturas que estn en la regin mesoflica. Estas especies se denominan termfilas verdaderas, termfilas obligatorias o estenotermfilas. La temperatura de incubacin que permite a las bacterias el desarrollo bacteriano en un perodo corto (12 a 24 hrs) se llama temperatura ptima de crecimiento. Aunque cabe sealar que la temperatura ptima de crecimiento as definida, puede no serlo para otras actividades celulares. Gases.- Los gases principales que afectan el desarrollo bacteriano, son el oxgeno y el dixido de carbono. Las bacterias presentan una respuesta amplia y variable al oxgeno libre, y sobre esta base se dividen en cuatro grupos: Aerobias: bacterias que se desarrollan en presencia de oxgeno libre. Anaerobias: bacterias que se desarrollan en ausencia de oxgeno libre. Anaerobias facultativas: bacterias que se desarrollan tanto en presencia como en ausencia de oxgeno libre. Microaerfilas: bacterias que crecen en presencia de pequesimas cantidades de oxgeno libre. pH.- En la mayor parte de las bacterias el pH ptimo de crecimiento est entre 6.5 y 7.5, aunque algunas bacterias pueden desarrollarse a pH extremo, en la mayor

15

parte de las especies los lmites mnimos y mximos corresponden a cualquier punto entre pH 4 y 9, en cuanto a necesidades de pH hay bacterias: Acidfilas: se desarrollan en pH cido (< 7). Basfilas: se desarrollan en pH alcalino (> 7.5). Neutrfilas: se desarrollan en pH neutro (7). IV.- PROCESOS FITOBACTERIAS. DE COMPATIBILIDAD E INFECCIN DE LAS

Los agentes cambiantes de enfermedad son muy cambiantes porque sus poblaciones genticamente no son estables ni uniformes, de ah que cultivos de plantas resistentes a una raza de un patgeno, con el tiempo llegan a perder su resistencia. La mayora de las plantas son resistentes al ataque de la mayora de los patgenos vegetales. En la naturaleza es muy frecuente que las plantas sean atacadas por parsitos y an as la mayora de stas permanecen sanas, o sea que los microorganismos no llegan a inducirles enfermedad; lo anterior indica que la resistencia es la regla o la generalidad y la enfermedad es la excepcin. An cuando muchos microorganismos potencialmente fitoparsitos llegan a estar en contacto con su hospedante, no le pueden inducir enfermedad, porque para que esto suceda debe de existir una relacin gentica, fisiolgica y especfica entre los dos, que le permita al patgeno ser aceptado por las clulas hospedantes. Lo anterior se da siempre y cuando las condiciones del ambiente favorezcan esa relacin. Las plantas influyen sobre los parsitos en forma fsica y qumica. Cuando en las hojas existe mucha cera y esta es de calidad, el agua de roco o de lluvia resbala impidiendo que se presente una pelcula de humedad que favorezca el establecimiento preintroductorio del parsito; lo anterior es un ejemplo de influencia fsica. La influencia qumica se da de muchas formas, como ejemplo se puede mencionar la produccin y exudado de sustancias (aminocidos, azcares, vitaminas, toxinas, etc.) ya sea por las races o partes areas de las plantas que favorecen o desfavorecen al microorganismo; en ocasiones estos exudados son txicos para algunos microorganismos y para otros no, otras veces inhiben la germinacin de estructuras de resistencia del parsito o actan como atrayentes o repelentes de los mismos. Las clulas bacterianas individuales son muy frgiles y estn desprotegidas, por lo tanto deben de encontrar con rapidez un ambiente propicio para su proliferacin y as evitar la muerte. Los requerimientos inmediatos son alta humedad relativa y un sustrato nutricional adecuado; aunque una nutricin mnima y alta humedad relativa con frecuencia son suficientes para establecer la infeccin, la temperatura ptima y la presencia de ciertos factores de crecimiento aumentan la velocidad de proliferacin. Los procesos de infeccin incluyen: Migracin de la bacteria desde el lugar de multiplicacin o sobrevivencia hasta el hospedante.

16

 Reconocimiento y contacto de la bacteria con su hospedante. Penetracin y establecimiento de la bacteria en los tejidos hospedantes. Ya que el patgeno se ha establecido en el hospedante, los procesos de infeccin terminan y a este momento se le considera como el tiempo en que se inicia la fase logartmica de la divisin celular. 4.1.- INOCULACIN. La inoculacin es el proceso mediante el cual entran en contacto, el patgeno (en este caso una especie de bacteria) con la planta hospedante. Las bacterias pueden migrar desde el sitio de hibernacin o desde su fuente de multiplicacin por medios propios o auxiliada por otros agentes como el agua, los insectos, el hombre, el viento, entre otros. Las bacterias en el suelo se pueden tener en contacto accidentalmente con las races como consecuencia del crecimiento radical, sin embargo el contacto se da ms bien como resultado de la locomocin del microorganismo en suelos microcapilares; la migracin no es un movimiento al azar, sino una respuesta a estmulos que se originan en el hospedante. Los flagelos, adems de proporcionar locomocin a las clulas bacterianas, capacitan al patgeno para recibir el estmulo y tomar contacto con su hospedante para causarle infeccin. Las bacterias fitopatgenas son capaces de seguir un gradiente de concentracin qumico. La atraccin de los patgenos es hacia sustancias o soluciones aminocidos, azcares, nucletidos y vitaminas. Los fluidos que emanan de aberturas naturales (gutacin) de las plantas presentan altos contenidos de aminocidos (arginina y metonina) y carbohidratos (ribosa, arabinosa, glucosa), por lo que ejercen fuerte atraccin hacia las clulas bacterianas. El reconocimiento es un requisito universal de sobrevivencia y se da entre los dos organismos participantes. En este caso particular el patgeno reconoce los estmulos o las sustancias y la topografa del hospedante. Segn Sequira, el reconocimiento es un evento temprano especfico que (induce) dispara una rpida respuesta en el hospedante, ya sea facilitando o impidiendo el crecimiento del patgeno. El reconocimiento se establece mediante superficie de dos organismos que se ponen en contacto (esto ltimo es la Teora de Molculas Complementaria), en la pared celular o en la membrana citoplasmtica de las clulas del hospedante pueden estar presentes protenas o glicoprotenas que se reconocen con los carbohidratos del patgeno. Esta complementariedad manda una seal que llega a los organelos de la clula hospedante y se da una respuesta (reacciones) que puede ser positiva (se acepta el patgeno y la enfermedad se desarrolla) o negativa (opuesta al patgeno y se disparan los mecanismos de defensa) y se forman barreras estructurales o barreras qumicas. 4.2.- PENETRACIN.

17

Para que las bacterias causen infeccin en plantas hospedantes susceptibles, se requiere que primero penetren a los tejidos y tomen contacto con las sustancias que ellas necesitan para su desarrollo y multiplicacin. En casos excepcionales, algunas bacterias no necesitan penetrar para llegar a causar indirectamente dao en plantas, esto es cuando el microorganismo se desarrolla y produce sustancias como desecho de su metabolismo cerca de rganos vegetales como la raz, dichas sustancias son absorbidas por las planta y entonces le pueden provocar toxicidad. Se requiere de una pelcula de agua sobre los rganos del vegetal para que las bacterias puedan nadar y llegar a los sitios especficos de penetracin. Esta humedad se proporciona por lluvia, roco, riego, liberacin natural de agua por las aberturas naturales de las plantas y por el escape de agua por heridas producidas por agentes extraos. Adems de la humedad, tambin el sustrato nutricional adecuado y una temperatura apropiada favorecen la penetracin de las bacterias. Las bacterias tienen que penetrar rpidamente en sus hospedantes por que al no tener capacidad de producir estructuras de resistencia, las clulas bacterianas se desecan con facilidad y en poco tiempo, en la superficie de los rganos de las plantas. Las bacterias no desarrollan rganos o estructuras especiales para romper las barreras estructurales de las plantas y as penetrar directamente, como lo hacen la mayora de los hongos, las plantas superiores parsitas de otras plantas y los nemtodos; tampoco producen sustancias que lleguen a desdoblar las ceras cuticulares y las cutinas presentes en la cutcula de las plantas. Por tales razones las bacterias utilizan las aberturas naturales que tienen las plantas y las heridas que se producen por diversos factores o agentes para introducirse en los tejidos hospedantes. 4.2.1.- PENETRACIN POR ABERTURAS NATURALES. Las plantas presentan una variedad de aberturas naturales para realizar algunas de sus funciones esenciales como es la transpiracin, intercambio de gases, eliminacin de exceso de agua o de sustancias nocivas, secrecin de nctar, entre otras. Estas aberturas son los estomas, que se localizan en las hojas, tallos, races y tubrculos en sustitucin de los estomas: axilas de hojas, pecolos, etc.; y los hidtodos, que estn presentes en los bordes o pices de las hojas o lbulos, o bien en las puntas de prolongaciones piliformes. Penetracin por estomas.- Los estomas son diminutas aberturas que se localizan en la epidermis de los rganos verdes de las plantas, regulan la transpiracin y el intercambio de gases con el ambiente. Al ser las hojas los rganos ms expuestos de las plantas, los estomas son orificios que las bacterias utilizan con frecuencia para penetrar a los tejidos vegetales, principalmente cuando se presentan lluvias o roco que elevan la humedad relativa del ambiente. La bacteria Pseudomonas syringae pv. tabaci (P. tabaci) que causa la enfermedad conocida como quemazn o fuego silvestre del tabaco y soya, penetra por estomas aunque tambin puede penetrar por hidtodos y por heridas producidas por insectos y otros agentes. 18

Otras bacterias que pueden penetrar por estomas son: Xanthomonas campestris pv. citri (X. citri), cncer bacteriano de los ctricos; P. syringae pv. phaseolicola (P. phaseolicola), tizn del halo del Frijol; X. campestris pv. phaseoli (X. phaseoli), tizn comn del Frijol; X. campestris pv. vesicatoria (X. vesicatoria), mancha bacteriana del tomate y chile, y muchas otras especies ms. Penetracin por lenticelas.- Las lenticelas son protuberancias visibles a simple vista, tienen una abertura en forma de lenteja y se localizan en la corteza de las plantas leosas para reemplazar a los estomas de la desaparecida epidermis. Las plantas utilizan las lenticelas para el intercambio de gases. Durante el desarrollo de las lenticelas en la corteza se producen grietas o fisuras que son invadidas por algunas bacterias, antes de presentarse la suberizacin, para as introducirse en los tejidos de las plantas. Aun cuando las siguientes bacterias y otras muchas pueden penetrar de otra forma, aprovechan las lenticelas para introducirse a tallo y tubrculos: P. syringae pv. tabaci (P. tabaci); Erwinia carotovora pv. carotovora (E. carotovora), pudriciones blandas de rganos carnosos; Erwinia carotovora pv. atroseptica (E. atroseptica), pudriciones blandas y pierna negra o pi negro de la papa; E. amylovora, tizn del fuego del peral y manzano. Penetracin por nectarios.- Los nectarios son rganos con abertura que secretan nctar y pueden ser florales o extraflorales. Algunas bacterias como Erwinia amylovora, P. syringae pv. syringae (P. syringae), cncer bacteriano y gomosis de rboles de fruto de hueso respectivamente, utilizan los nectarios para introducirse a las plantas y causar infeccin. Penetracin por hidtodos.- Los hidtodos son rganos secretores foliares que segregan soluciones acuosas muy diluidas. Se localizan en el pice de algunas vellosidades o de las nervaduras de las hojas. Por los hidtodos se realiza la gutacin. Por la maana cuando sale el sol, el agua expulsada por gutacin puede ser absorbida por los hidtodos y si en estas gotas de agua se han depositado algunas clulas bacterianas, tambin son introducidas a las plantas. Xanthomonas campestris pv. oryzae (X. oryzae), tizn bacteriano del arroz; y Xanthomonas campestris pv. campestris (X. campestris), pudricin negra de las crucferas, se introduce a las plantas por los hidtodos. Penetracin por la base de los pelos glandulares.- Los tricomas son proyecciones epidermales de diferente forma y funcin, uni o multicelulares, muy frgiles y que pueden secretar algunas sustancias o humedad, factores que favorecen la sobrevivencia de algunas bacterias durante condiciones secas. Clavibacter michiganense pv. michiganense, cancer bacteriano del tomate; y P. syringae pv. tomato (P. tomato), peca bacteriana del tomate, son favorecidas por las secreciones de tricomas y probablemente penetran por la base de los mismos. 4.2.2.- PENETRACIN POR HERIDAS. 19

Algunas bacterias dependen de heridas practicadas por diferentes agentes como el granizo, tormentas de polvo, lluvias, descargas elctricas, implementos agrcolas, desarrollo de races secundarias, insectos, etc., para poder penetrar a los tejidos hospedantes. Despus de que se practica una herida en la planta, sta se suberiza con rapidez; las bacterias deben de coincidir con la herida antes de que se realice la suberizacin para llegar a penetrar. Agrobacterium tumefaciens, agallas de la corona de muchas plantas, solo penetran por heridas y despus de que se presentan reacciones de acondicionamiento del tejido hospedante que favorecen a la bacteria, esto es normalmente despus de ocho horas de que se practica la herida.

Las Erwinias del grupo carotovora, pudriciones blandas, penetran por heridas, lo mismo que Clavibacter sepedonicum, pudricin anular de la papa; X. campestris pv. campestris (X. campestris), pudricin negra de las crucferas; P. syringae pv. syringae (P. syringae), cncer bacteriano y gomosis de rboles de fruto de hueso; y Clavibacter michiganense pv. michiganense, cancer bacteriano del tomate. Erwinia tracheiphila, marchitez bacteriana de las cucurbitceas; y Erwinia stewartii, marchitez bacteriana del maz; se introducen por las heridas practicadas por los insectos vectores como Acalymma vittata (escarabajo rayado de las cucurbitceas) y Diabrotica undecimpunctata (diabrtica) para la primer bacteria y Chaetocnema pulicularia (pulga saltona del maz) para la segunda. Rhizobium spp., la bacteria vive en simbiosis con las leguminosas, penetra a la raz a travs de las heridas que se practican cuando se estn desarrollando races secundarias. 4.3.- INVASIN, INFECCIN Y PATOGNESIS. 4.3.1.- INVASIN. Despus de que se ha presentado la penetracin en el hospedante, a las bacterias se les puede localizar intercelular, intravascular o intracelularmente. Los patgenos invaden a sus hospedantes de manera distinta y a diferentes niveles; las bacterias que invaden intercelularmente los tejidos, tambin se pueden desarrollar intracelularmente al disolver los constituyentes de la pared celular, mientras que las bacterias que ocasionan marchitamiento vascular (invasin del floema) tambin pueden invadir a los vasos del xilema. Muchas infecciones causadas por bacterias son locales, o sea que comprenden a una sola clula, a unas cuantas clulas o a una pequea zona de la planta y se mantienen localizadas durante toda la estacin de crecimiento, aunque a veces se pueden extender ligeramente y a un ritmo tambin lento. Otras infecciones se propagan ms o menos con cierta rapidez y se pueden extender a todo un rgano de la planta (flor, hoja, fruto, etc.) o incluso llegar a infectar a la planta completa. 20

4.3.2.- INFECCIN Y PATOGNESIS. Patogenicidad es la habilidad de un agente para generar una enfermedad; mientras que virulencia es el grado de patogenicidad que presenta el mismo agente. La infeccin se entiende como el establecimiento de la asociacin entre el patgeno y las clulas y tejidos de la planta hospedante. La infestacin es la introduccin del patgeno en el ambiente hospedante. La patognesis es el proceso de induccin de la enfermedad, o sea una serie de eventos que van desde la infeccin hasta el desarrollo del patgeno dentro de la planta y subsecuente produccin de sntomas; la patognesis trata del proceso de la enfermedad donde se estudian los mecanismos que utilizan la bacterias para causar infecciones y las reacciones fisiolgicas, bioqumicas y estructurales que una planta lleva a cabo en respuesta al dao que le causa un agente extrao. En primeros estados de la enfermedad es raro que las bacterias lleguen al interior de las clulas vivas, ya que primero tienen que atravesar las paredes celulares que funcionan como una barrera fsica; por esta razn las bacterias fitopatgenas primero son intercelulares y despus intracelulares. Aparentemente existen tipos especficos donde se une la bacteria con la planta; las bacterias aparentemente, reconocen estos sitios especficos para la unin, que se localizan en la pared celular (si los sitios especficos de reconocimiento llegaran a ser ocupados por cepas avirulentas de bacterias, despus las cepas virulentas ya no pueden establecerse y por lo tanto la infeccin tampoco se realiza). El nmero de clulas bacterianas que se requieren para que una infeccin se inicie es variable y depende de la especie de bacteria que se trate, por ejemplo, si se introduce una sola clula de Agrobacterium tumefaciens en una planta, se forma un pequeo tumorcito, pero si se introducen 100 clulas el tumor es mucho mayor; para que se desarrolle una infeccin sistemtica y se cause un dao severo en manzano por E. amylovora, se requieren de 150 a 200 clulas bacterianas, pero si el nmero es menor slo se producen daos localizados. Para penetrar las paredes celulares y causar infeccin las bacterias producen enzimas, toxinas, polisacridos y sustancias hormonales. Estas sustancias son las responsables directas de las alteraciones de los procesos fisiolgicos del hospedante y que resultan en la manifestacin de la enfermedad. Influyen en la germinacin de las semillas, interfieren en el desarrollo de la raz y en la absorcin de agua y nutrientes, en el transporte de agua y translocacin de alimentos, reducen la fotosntesis, alteran los procesos de reproduccin de las plantas, destruyen el material de reserva y alteran la integridad estructural de los tejidos. 4.3.2.1.- Enzimas.- Son sustancias (protenas) que catalizan las reacciones bioqumicas de las clulas vivas. La actividad enzimtica est asociada con la patogenicidad de los microorganismos. Las bacterias producen gran variedad de enzimas, tanto in vitro como in vivo y el establecimiento de la infeccin parece depender de la compatibilidad del hospedante con la bacteria, lo cual induce la produccin de enzimas por parte del patgeno. Aunque las cepas virulentas como avirulentas de bacterias tienen la capacidad de producir enzimas, la actividad 21

enzimtica de las primeras es mucho mayor. Se ha demostrado que las bacterias fitopatgenas pueden producir enzimas pectolticas, celulolticas, proteolticas y/o amilolticas. Enzimas pectolticas o pcticas.- La lmina media de las clulas de plantas est constituida por pectinas y sustancias relacionadas, adems la pared celular primaria de dichos tejidos tambin contiene porcentaje alto de estas sustancias. Existen especies de bacterias fitopatgenas (especies de Xanthomonas, Pseudomonas y Erwinia) que actan sobre las sustancias pcticas degradndolas; esto ocasiona desintegracin de tejidos que se manifiesta como pudricin blanda o acuosa. Las primeras clulas bacterianas que penetran a los tejidos se alimentan de azcares, sales y agua presentes en los espacios intercelulares; durante este proceso son producidas enzimas pectolticas que degradan la lmina media y la pared celular de clulas colindantes que se destruyen, plasmolizan y mueren sirviendo de alimento para las bacterias que as sucesivamente se siguen multiplicando; como resultado de esta actividad se presenta el aspecto hmedo y la prdida de turgencia de los rganos atacados. En los marchitamientos vasculares inducidos por bacterias se presentan varios elementos responsables del taponamiento y degradacin de los tejidos de conduccin. En estos casos las enzimas pectolticas ocasionan disociacin de los tejidos de conduccin o de las clulas que rodean estos tejidos y por lo tanto estn ntimamente involucradas con este tipo de enfermedades. Algunas especies de bacterias que producen enzimas pectolticas son: Erwinia carotovora, E. amylovora, E. stewartii, Pseudomonas syringae, P. solanacearum, Clavibacter michiganense y Xanthomonas campestris. Enzimas celulolticas o celulasas.- La celulosa es el principal componente y la base estructural de la pared celular de las plantas superiores. Las enzimas producidas por microorganismos llegan a hidrolizar la celulosa ocasionando ruptura de la pared celular y muerte de la clula. Se ha comprobado que P. solanacearum, C. michiganense, y algunas Erwinias y Xanthomonas llegan a producir este tipo de enzimas. Enzimas proteolticas o proteasas.- las protenas celulares son sustancias muy importantes puesto que catalizan todas las reacciones qumicas que se llevan a cavo en todas las clulas vivas, adems de que son componentes estructurales de las membranas de organelos celulares. Se ha comprobado que E. carotovora produce, adems de las enzimas ya mencionadas, proteasa que son las responsables de la degradacin de protenas y del mal olor de los rganos carnosos en descomposicin. Enzimas amilolticas o amilasas.- El almidn es un polisacrido de reserva presente en algunos rganos vegetales. La mayora de las especies de Xanthomonas tiene capacidad de producir amilasas para desdoblar el almidn y as poderlo utilizar en sus funciones metablicas. 4.3.2.2.- Toxinas.- son productos muy txicos secretados por organismos. Las fitotoxinas bacterianas son compuestos de bajo peso molecular (aunque no siempre) que afectan adversamente el metabolismo y funcin de la planta, ya sea hidrolizando 22

protenas, bloqueando sistemas enzimticos o siendo antagnico a algunos metabolitos esenciales, lo cual repercute en la muerte de clulas (pueden actuar directamente sobre el protoplasma o alterar el metabolismo del citoplasma o del ncleo); no son enzimas, ni hormonas o cido nucleico, ni afectan la integridad estructural de la pared celular; son mviles en la planta y activas en concentraciones muy bajas. Considerando el rango de hospedantes, existen dos tipos de toxinas: las toxinas de hospedantes especficos y las toxinas de amplio rango de hospedantes o de hospedantes no especficos. Toxinas de hospedantes especficos.- Compuestos txicos slo para el hospedante del patgeno que las produce. Al ser determinantes primarios de patogenicidad, la virulencia del patgeno vara de acuerdo a la capacidad que tiene para producir la toxina. El patgeno produce la toxina en el hospedante susceptible y los sntomas inducidos por sta son los caractersticos de la enfermedad. E. amylovora produce Amilovorina, la cual al ser inyectada slo llega a inducir marchitez y plasmlisis. Toxinas de hospedantes no especficos.- Son compuestos txicos para el hospedante de la bacteria y para otras plantas no hospedantes de la bacteria, aunque en algunos hospedantes la bacteria no produce la toxina. Son determinantes secundarios de patogenicidad, por lo que no provocan la totalidad de los sntomas que el patgeno llega a inducir en el hospedante, o sea que la toxina no influye en el establecimiento del patgeno, aunque induce algunos sntomas del sndrome total de la enfermedad. Se dividen en exotoxinas, son toxinas extracelulares o sea que son liberadas fuera de la pared celular de la bacteria, y en endotoxinas, son toxinas que se liberan de la clula bacteriana hasta que esta muere o es daada. Las toxinas de hospedantes no especficos pueden producir manchas clorticas, halos clorticos y marchitez. Algunos ejemplos de este tipo de toxinas son: Tabtoxina producida por P. tabaci (halo clortico); Faseolotoxina producida por P. phaseolicola (halo clortico); Tagetitoxina producida por P. tagetis (evita la formacin de cloroplastos); Siringomicina SR producida por P. syringae (cancro en rganos frutales y provoca tiro de municin an sin estar presente la bacteria). 4.3.2.3.- Polisacridos.- Los polisacridos son sustancias complejas o combinaciones orgnicas del tipo de la glucosa y que por hidrlisis dan glucosas; tambin se incluyen en este grupo los polialcoholes relacionados con la glucosa. Las clulas bacterianas producen polisacridos extracelulares que quedan libres o se acumulan alrededor de su pared formando su cpsula. Estos polisacridos aparentemente juegan un importante papel en la patogenicidad; algunas evidencias claras que respaldan lo anterior son ciertas cepas de E. amylovora (patgeno de tizn de fuego del peral y manzano) y de P. solanacearum (patgeno de marchitez o vaquita de la papa) encontradas por algunos investigadores, los cuales no presentan polisacridos extracelulares (cpsula) y son completamente avirulentas. Aparentemente los polisacridos son supresores de los mecanismos de defensa del hospedante, aunque tambin ocasionan daos fsicos al participar en el taponamiento 23

de tejidos de conduccin. E. amylovora produce un polisacrido que por si solo causa marchitamiento y plasmlisis de clulas del parnquima del xilema. Otras especies que producen polisacridos asociados con la patogenicidad son: Clavibacter sepedonicum (pudricin anular de la papa), C. insidiosum (marchitez de ramas de alfalfa), C. michiganense, P. solanacearum, X. phaseoli, entre otras. 4.3.2.4.- Reguladores de crecimiento.- Los reguladores de crecimiento (RC) son compuestos hormonales comunes que controlan el crecimiento de las plantas. Los ms importantes son las auxinas, las giberalinas y las citocininas, aunque el etileno y los inhibidores de crecimiento tambin realizan importantes funciones de control durante el desarrollo de una planta. Los RC actan a concentraciones muy bajas por lo que tambin variaciones pequeas de concentracin normal desencadenan anormalidades en el crecimiento de las plantas. Los microorganismos fitopatgenos pueden producir RC, sustancias que inhiben o estimulan la produccin de RC en la planta y sustancias que actan de manera similar a los RC. Con esto los patgenos inducen desequilibrios en el sistema hormonal de las plantas producindose crecimientos anormales como achaparramiento, crecimiento excesivo, arrocetado, deformacin de tallos, epinastia de hojas, defoliacin, inhibicin del desarrollo o crecimiento de yemas, etc. A).- Auxinas.- (cido indol actico AIA-).- Actan en la elongacin celular, diferenciacin celular, afectan la impermeabilidad de la membrana celular, aumentan la respiracin de los tejidos y promueven la sntesis de ARN mensajero y as la sntesis de enzimas y protenas estructurales. Los microorganismos patgenos pueden aumentar los niveles de AIA, aunque algunos los disminuyen. Pseudomonas solanacearum induce el aumento del 100% de AIA en plantas atacadas por lo que se afecta la permeabilidad de las membranas celulares y por consiguiente se aumenta la transpiracin y se presenta marchitamiento. Agrobacterium tumefaciens (agalla de la corona de muchas plantas) provoca un estmulo conocido como principio de induccin al tumor (PIT) que transforma a las clulas vegetales normales en tumorales; las clulas tumorales tienen alta cantidad de AIA y citocininas producidas por ellas mismas y por las clulas bacterianas. B).- Citocininas.- Son necesarias para la diferenciacin y crecimiento celular, promueven la inhibicin de la senescencia y dirigen el flujo de aminocidos y otros nutrientes por toda la planta. La actividad de las citocininas aumenta en las clulas de la agalla de la corona y la fascinacin o agalla foliar ocasionada por Clavibacter fascinas, en muchas plantas se debe parte de una citosina. Entre los efectos del etileno en las plantas se incluye la abscisin de las hojas, la epinastia y la maduracin de los frutos. Especies de los gneros de Pseudomonas, Xanthomonas y Erwinia producen etileno. Se ha comprobado que el contenido de etileno aumenta en plantas de pltano cuando son atacadas por P. solanacearum y esto se manifiesta en el amarillamiento prematuro de frutos. 4.4.- REPRODUCCIN. 24

Aunque en las bacterias se pueden dar procesos primitivos de reproduccin sexual (conjugacin e intercambio de material gentico entre clulas), realmente la nica forma de multiplicacin de estos organismos es asexualmente por fisin binaria o biparticin. Durante el proceso de divisin de la clula, primero se presenta crecimiento de la membrana citoplasmtica de las orillas hacia el centro para dividir el citoplasma en dos. Despus se produce la pared celular y finalmente se separan dos clulas hijas. Bajo condiciones favorables la multiplicacin es muy rpida y las divisiones se realizan cada 20 minutos; sin embargo la velocidad de reproduccin no es constante y con el paso del tiempo se va haciendo ms lenta, hasta que finalmente se detiene. Lo anterior se presenta porque disminuye el alimento, se acumulan entre las colonias desechos de la actividad metablica de las mismas clulas y porque se presentan otros factores limitantes. 4.5.- DISEMINACIN. La dispersin de las bacterias puede ser a distancias muy cortas, en donde se desplazan por si solas con la ayuda de sus flagelos, o a distancias mayores, para lo cual requieren la participacin de otros agentes como el agua de riego, lluvia, brisa, rocos, viento, el hombre, insectos, entre otros. La lluvia distribuye las bacterias de una planta a otra, de un rgano a otro, o del suelo a los rganos del vegetal con su efecto de salpique; el agua de riego o lluvia, tambin acarrea bacterias de un rea a otra a travs del suelo. Los insectos pueden llevar bacterias de unas plantas a otras incluso introducirlas en el vegetal; en algunos casos, las bacterias dependen de los insectos para sobrevivir y diseminarse. Se conocen 77 insectos que pueden transmitir bacterias. Algunos solo las transportan externamente, otros lo hacen internamente, mientras que en otros puede presentarse multiplicacin del patgeno en su interior, o incluso manifestarse cierta alteracin del insecto, como es el caso de la mosca Dacus oleae, que transmite a P. savastanoi (agalla del olivo) la cual le induce tumores en el tracto digestivo y vagina. E. tracheiphila y E. stewartii son diseminadas por el escarabajo rayado de las cucurbitceas (Acalyma vittata) y diabrticas (Diabrotica undecimpunctata), la primer bacteria y por la pulga saltona del maz ( Chaetocnema pulicularia), la segunda. Tambien E. amylovora se dispersa por las abejas que visitan las flores de las plantas enfermas. E. chrysanthemi cuando hay daos mecnicos en frutos de pia, ocasiona pudricin blanda; las hormigas son agentes importantes en la dispersin de esta bacteria. El hombre disemina todo tipo de patgenos a distancias variables y de muchas formas; disemina bacterias cuando manipula plantas enfermas y sanas, las transporta en tierra que arrastra en sus pies, herramientas e implementos agrcolas, las dispersa en semillas, plntulas de viveros, yemas, estacas, tubrculos, etc. El viento arrastra polvo y en ocasiones restos de plantas los cuales pueden transportar clulas de bacterias fitopatgenas para as dispersarlas en una regin. Otra forma de dispersin de las bacterias puede ser el polen. 4.6.- SUPERVIVENCIA.

25

Las bacterias fitopatgenas, con la excepcin de las especies de bacterias que atacan plantas perennes, permanecen parte de su vida en la planta como parsitas y parte en el suelo o restos vegetales como saprfitas. El suelo les proporciona proteccin y nutrientes cuando el hospedante est ausente; sin embargo muchas especies reducen sus poblaciones cuando se encuentran en estas condiciones. La mayora de las bacterias fitopatgenas no producen estructuras de resistencia, as es que sobreviven en los rganos afectados del vegetal o en forma libre o saprfitas, o cubiertas con un muclago natural que las protege de factores adversos, o en el interior de insectos. A las bacterias se les encuentra en una amplia variedad de sitios en la proximidad de sus hospedantes. Aunque estn cubiertas por la cpsula, no estn protegidas por una pared tan resistente como las de las esporas, por lo tanto son sensibles a los rayos actnicos (luminosos) del sol y para sobrevivir necesitan encontrar un ambiente propicio que incluya alta humedad (cercana al 100%), nutricin adecuada y temperatura entre 24 a 30 C. Las bacterias que infectan plantas perennes sobreviven en tiempos favorables en el interior de sus hospedantes. Las bacterias fitopatgenas en las plantas hospedantes se desarrollan como parsitos y en el suelo sobreviven como saprfitos. El suelo sirve como reservorio de bacterias, sin embargo la persistencia de las mismas en ellos depende de la velocidad a la que son descompuestos los rastrojos del cultivo en los que se encuentran. Algunas bacterias como E. amylovora incrementan su poblacin en sus hospedantes, pero en el suelo disminuye con rapidez por que han perdido capacidad de sobrevivencia en el suelo. X. phaseoli var. fuscans en el suelo su poblacin desaparece en cuatro semanas. Otras, como A. tumefaciens, que tambin incrementa su poblacin en la planta hospedante, al llegar al suelo, dicha poblacin tambin disminuye aunque en forma gradual y se ha determinado que llega a permanecer en el suelo hasta 40 aos en ausencia de las plantas que sean hospedantes. Las Erwinias y Pseudomonas causantes de pudriciones blandas, pueden incrementar su poblacin en el suelo. E. chrysanthemi no llega a sobrevivir por fuera de los tejidos de su hospedante ms de 14 das en condiciones tropicales, en cambio inverna en el tracto digestivo de las hormigas que la diseminan, dentro de las plantas y en el suelo. P. syringae pv. tomato (peca bacteriana del tomate) puede sobrevivir en ambientes calientes y secos como residente de las hojas hasta que se presenta humedad y temperatura que le favorezcan, entonces la poblacin bacteriana se multiplica y la infeccin se desarrolla. Algunas especies de Clavibacter pueden mantenerse vivas en semillas entre 8 a 24 aos. P. solanacearum sobrevive en el suelo en la superficie externa de tubrculos y en semillas de tabaco. X. vesicatoria sobrevive en el suelo y en la semilla.

26

V. DESCRIPCIN DE LOS PRINCIPALES GNEROS DE BACTERIAS FITOPATGENAS Y SUS ESPECIES DE IMPORTANCIA ECONMICA. La taxonoma de los organismos se basa principalmente en las caractersticas morfolgicas que presentan. En las bacterias es difcil utilizar este criterio porque presentan un tamao reducido, carecen de diferenciacin y existen muy pocos registros fsiles. La taxonoma de las bacterias se basa en datos morfolgicos y fisiolgicos, utilizando de preferencia estos ltimos. En el pasado las bacterias se clasificaban como plantas debido a que coinciden en algunos caracteres como el requerimiento de alimento en forma soluble y a la presencia de pared celular. Sin embargo en la actualidad, las bacterias estn clasificadas en un nuevo reino, el PROKARIOTAE (algunos le llaman MONERA), que incluye a los organismos que carecen de membrana nucleoplsmica. De Bergey (Bergey`s Manual of Determinative Bacteriology) aceptado por los especialistas en el ramo para la clasificacin de las bacterias. La separacin inicial de los taxones ms altos se basa en la morfologa y reaccin a la Tincin de Gram. Los grupos en los que se incluye a los procariontes fitopatgenos conocidos, primero se clasifican por una combinacin de caractersticas morfolgicas y fisiolgicas; con mayor nfasis en morfologa, requerimiento de oxgeno y utilizacin de carbohidratos para el nivel Gnero, mientras que la clasificacin a taxones ms bajos involucra caractersticas fisiolgicas y bioqumicas adicionales. Las bacterias en general estn clasificadas en 19 GRUPOS O PARTES, que a su vez incluyen familias, que es la Taxa ms alta en la DIVISIN III (bacterias) del REINO PROKARIOTAE. Las bacterias fitopatgenas estn incluidas en los grupos 7, 8, 17, y 19. Parte 7. Bacilos y cocos aerobios, Gram negativo. Familia Pseudomonadaceae Gnero Pseudomonas y Xanthomonas Familia Rhizobiaceae Gnero Rhizobium y Agrobacterium Parte 8. Bacilos anaerobias facultativas, Gram negativo Familia Enterobacteriaceae Gnero Erwinia Parte 15. Bacilos Gram positivo que producen endosporas. Familia Gnero Bacillus Parte 17. Actinomycetes y organismos relacionados, Gram positivo. Grupo Coryneforme de bacterias (Clavibacter, Streptomyces) Parte 19. Los micoplasmas (fitoplasmas) y gneros de afiliacin incierta y organismos semejantes a micoplasmas (Spiroplasma). No han sido clasificadas las

27

bacterias fastidiosas, habitantes vasculares, como la enfermedad de Pierce y la bacteria falsa del duraznero. Lista de nombres de las especies de bacterias que se han aprobado y fueron publicadas en 1980 en la octava edicin del manual de De Bergey.

28

LISTA APROBADA DE BACTERIAS FITOPATGENAS GRUPO

Gram negativo, varillas y cocos

FAMILIA
Pseudomonadaceae

GNERO
Pseudomonas

ESPECIES
agarici, andropogonis, avenae, caricapapaya, caryophylli, cichorii, cissicola, gladioli, glumae, marginales, pseudoalcaligenes subs. cityrulli, rubrilineans, rubrisubalbicans, syringae, solanacearum, tolaasii, viridiflava albilineans, ampelina, axonopodis, campestris, fragaria. rhizogenes, rubi, tumefaciens amylovora, ananas, cancerogena, carnegieana, carotovora subs. carotovora, chrysantemi, cypripedii, carotovora subs atroseptica, dissolvens, herbicola, mallotivora, milletiae, nigrifluens, nimipressuralis, quercina, rhaponctici, rubrifaciens, salicis, stewartii, tracheiphila, uredovora. betae, beticola, fascinas, flaccumaciens, ilicis, insidiosum, michiganense, nebraskense, oortii, poinsettiae, sepedonicum. ipomeae, scabies. vaccinii citri

Xanthomonas Agrobacterium Erwinia

Gram negativo, varillas anaerbicas facultativas

Enterobactereaceae

Gram positivo, actinopmycetes y organismos relacionados Micoplasmas y gneros de afiliacin incierta

Ninguna

Clavibacter

Streptomycetaceae Nocardiaceae

Streptomyces Nocardia Spiroplasma

a.- Incluye muchos patovares previamente reconocidos como especies. Todas las otras especies no estn incluidas debido a descripciones inadecuadas. b.- Streptomyces scabies esta listado como especies incertae sedis (especies no reconocidas) La mayoria de las especies de Xanthomonas y Pseudomonas se degrad a patovares (pv), designacin intra especfica que no requiere fundamentos de soporte, aunque muchos patovares son especies legtimas. La mencionada lista contiene solo tres especies fitopatognicas de Pseudomonas fluorescentes, P. syringae Van Hall, P. cichorii (Swingle) Stapp y P. viridiflava (Burkholder) Dowson. Las otras Pseudomonas que aparecan en la sptima edicin del manual de Bergey, estn invalidadas debido a la carencia de fundamentos y se consideran patovares de P. syringae.

29

GNEROS DE BACTERIAS RELACIONADAS CON LAS PLANTAS 5.1.- GNERO Erwinia Las especies del gnero Erwinia en plantas inducen amplio rango de sntomas, como son: marchitamientos, tizones, cancros, muerte regresiva, manchas foliares, manchas de frutos, pudriciones blandas y decoloracin de tejidos de conduccin. Los miembros del gnero Erwinia son varillas rectas de 0.5 a 1.0 x 1.0 a 3.0 micras, se les encuentra como clulas simples, en pares u ocasionalmente en cadenas cortas; son Gram negativo (-), mtiles (con flagelacin pertrica, con excepcin de E. stewartii que es trica) y anaerobias facultativas, aunque el crecimiento anaerbico en algunas especies es dbil. La temperatura para el crecimiento ptimo es de 27 a 30 C, y el mximo est entre 32 a arriba de 40 C. Son fermentativas, oxidasa negativo y catalasa positivo; producen cido de fructuosa, galactosa, glucosa y sucrosa. Sus colonias son cremosas, amarillas o crema blanquecino. La taxonoma y nomenclatura de especies de este gnero se ha complicado por la heterogeneidad de la poblacin incluida en el taxn. Las Erwinias fitopatgenas se acomodan en tres grupos: Grupo HERBCOLA.- Producen un pigmento amarillo insoluble en agua y son patgenos oportunistas de plantas, animales u hombre o son epfitos no fitopatgenos. E. herbicola pv. herbicola E. herbicola pv. milletiae E. ananas py. ananas E. ananas pv. uredovora E. stewartii Grupo CAROTOVORA.- Comprende a las especies de Erwinia con intensa actividad pectoltica en plantas. E. carotovora pv. carotovora E. carotovora pv.atroseptica E. chrysanthemi Grupo AMYLOVORA.- Son bacterias sistemticas que pueden causar marchitamiento y necrosis seca de plantas, no forman enzimas pectolticas ni pigmentos amarillos. E. amylovora E. rhapontici E: mallotivora E. dissolvens E. salisis E. carnegieana E. cancerogena E. pulsifaciens E. tracheiphila E. cypripedii 30

E. quercina Carcter / Grupo Pigmento amarillo soluble en agua Licuefaccin de pectatos (enzimas pcticas) cido de lactosa Cuerpos biconvexos Simplasmata (agrupaciones en forma de salchicha) 5.2.- GNERO Pseudomonas

Herbicola + +

E. nigrifluens Amylovora -

Carotovora + + -

Las especies de este grupo ocasionan enfermedades que se manifiestan con sntomas como marchitamiento, tizones, estriados y manchas foliares, pudriciones, cancros y agallas. Las clulas del gnero Pseudomonas son varillas rectas o curvas que miden 0.5 a 1.0 x 1.5 a 4.0 micras. Son aerobias, oxidativas, Gram negativo y presentan uno o ms flagelos polares (montricas, y loftricas en su mayora). El nmero de especies de Pseudomonas fitopatgenas que anteriormente se manejaban (100) fueron reducidas a 23. Las especies de Pseudomonas se dividen en dos grupos: Pseudomonas fluorescentes (Stutzeri) Pseudomonas no fluorescentes 5.2.1.- Pseudomonas fluorescentes (a su vez se dividen en dos grupos) Fluorescentes Syringae Fluorescentes P. fluorescens P. marginales P. putida P. aeruginosa P. agarici P. carica papaya P. cichorii Syringae P. syringae P. toloasii P. viridiflava P. coronofaciens P. glycinea P. lachrymans P. mori P. morsorunorum P. phaseolicola P. tabaci P. tomato P. savastanoi

31

+ + + *Excepto P. tabaci y P. glycinea

+ ++*

L= Levana O= Oxidasa P= Pudricin en Papa A= D. de Arginina T= Hipersen. En Tabaco

5.2.2.- Pseudomonas no fluorescentes. Causan pudriciones, manchas foliares, nunca marchitez. P. cissicola P. gladioli P. cepacia P. avenae (alvoprecipitans) P. amygdali P. solanacearum* P. corrugata P. pseudoalcaligenes P. caryophylli P. rubrilineans P. woodsii P. andropogonis P. cattleyae

* Pseudomonas solanacearum no fluorescentes, pero algunos autores tampoco la incluyen en las no fluorescentes y la consideran como un grupo especial. Causa marchitez de plantas y segn su hospedante se clasifica en: Raza 1.- ataca papa, tomate, chile, cacahuate y tabaco. Raza 2.- ataca pltano. Raza 3.- ataca a papa, a veces tomate. Raza 4.- ataca hierba de pollo. Raza 5.- ataca mora.

Las dos ltimas se han encontrado recientemente en China y no se conoce gran cosa de ellas. Produce poli-beta-hidrolibutirato, es sistmica, en medio Kelman (CPG + cloruro de tretrazolio) las colonias pueden tener diferente coloracin; la bacteria al atacar el tetrazodio produce farzn (pigmento rojizo). Si toda la colonia se observa rojiza, la cepa es avirulenta, si la coloracin rojiza es en forma de caracol, la cepa es virulenta. No produce pudricin en papa, causa marchitez. Las colonias al crecer forman como un desplazamiento. 5.3.- GNERO Xanthomonas La mayora de las especies de Xanthomonas son patgenas de plantas. Actualmente se tienen cinco especies vlidas que causan diferentes enfermedades cuyos sntomas son: estras y manchas foliares, marchitamiento, pudricin blanda, cnceres y tizones. En la especie X. campestris se han acomodado 123 patovares.

32

Las Xanthomonas son de forma de varilla, Gram negativo, mtiles con un flagelo polar simple (tres a cinco veces ms largo que la clula bacteriana), producen un pigmento amarillo (excepto X. maniotis colonias blancas-) insoluble en agua, son oxidativas, nunca fermentativas; produce un polisacrido chicloso extracelular en medios a partir de glucosa. A veces las Erwinias se comportan igual; usualmente son de hospedantes especficos y muchas crecen lentamente en los medios artificiales. Las especies de Xanthomonas son: X. campestris. En esta se incluyen como patovares (pv.) el resto de las 200 especies X. ampelina X. axonopodis X. fragariae X. albilineans Para diferenciar a los cinco grupos (octavo manual de Bergey), el pigmento es muy especfico en anlisis espectroscpicos como lo son los polisacridos producidos por otras bacterias. 5.4.- GNERO Clavibacter Fue creado en 1896 para poder acomodar al bacilo de la difteria. Algunas especies de este gnero causan diversas enfermedades en las plantas cultivadas y pueden ser de mucha importancia econmica. Los sntomas que llegan a inducir son marchitamiento, cnceres, pudricin, manchas de frutos y fasciacin. Normalmente a cada especie se le encuentra asociada con un solo tipo de hospedante. Su morfologa es muy curiosa ya que en un mismo cultivo se pueden encontrar diversas formas como varillas irregulares que incluyen formas rectas, curvas, triangulares y en forma de mazo, cocos V o en empalizada /////. Las dimensiones de los bastones rectos son de 0.4 a 0.5 x 0.7 a 1.0 micras; normalmente son inmviles aunque algunas especies son mviles con uno o dos flagelos polares. Son Gram positivo. Las colonias pueden ser desde amarillo, crema oscuro o color rosado. En el octavo manual de Bergey se le denomina corineformes; son bacterias aerbicas, oxidativas, de crecimiento lento, poca y lenta produccin de cidos en medios con carbohidratos, todas son catalasa positivo, pero no todas oxidasa positivo, todas hidrolizan gelatina. Las especies de Clavibacter son: C. michiganense subsp. michiganense C. michiganense subsp. sepedonicum C. michiganense subsp. nebraskense C. michiganense subsp. insidiosum C. flaccumfaciens flaccumfaciens C. flaccumfaciens betae subsp. subsp.

33

C. fascians subsp. poinsettia C. rathayi C. tritici C. fascians

C. iranicum C. ilicis C. xyli

La especie C. fascians es la nica que produce fasciacin (muchas hojitas se aglomeran produciendo una especie de agalla en la raz crece superficialmente). 5.5.- GNERO Agrobacterium Este gnero de bacterias tiene muy pocas especies fitopatgenas, aunque algunas infecciones llegan a ser de mucha importancia, principalmente en plantas por las especies patgenas de Agrobacterium; induce proliferacin anormal de clulas (hiperplasia) que resultan en formacin de tumores o en produccin excesiva de races adventicias. Usualmente son habitantes del suelo y rizsfera. Los miembros de este grupo son aerobias obligadas, Gram negativo, tienen forma de varilla y miden de 0.6 a 1.0 x 1.5 a 3.0 micras y son mtiles con 1 a 6 flagelos pertricos (cuando tienen uno solo ste es ms lateral que polar). Las colonias son blancas, lisas y mucosas. En medios que contienen carbohidratos, producen gran cantidad de polisacridos extracelulares mucilaginosos. Las especies reconocidas de Agrobacterium son: A. radiobacter (saprfito) A. tumefaciens (tumores o agallas) A. rhizogenes (races secundarias) A. rubi. La literatura dice que es igual a tumefaciens. Agalla en frambuesa. A. tumefaciens produce la agalla de la corona de muchas plantas leosas, principalmente durazno, zarzamora, sauce, vid, mango, aguacate, frambuesa (en zarzamora y frambuesa puede causar agalla de tallo y a la especie algunos la llaman A. rubi). De A. tumefaciens se conocen tres biotipos: el primero puede atacar vid y frutales de hueso; el segundo se le encuentra en frutales de hueso y el tercero afecta vid. 5.6.- GNERO Streptomyces Son Gram positivo, de crecimiento lento. En medio artificial producen un tipo de micelio muy fino (el grosor es menor al de una clula bacteriana). La colonia crece hacia abajo, como que se enriza por lo que es difcil de levantar; el micelio areo es gris cenizo y con ramificaciones monopdicas con cadenas de esporas en espiral.

34

S. scabies, roa superficial de tubrculos y otras partes subterrneas de la papa, aunque tales infecciones no se han reportado que causen prdidas econmicas; nicamente daa el aspecto (calidad). S. cratirefer S. intermedius S. ipomoeae 5.7.- GNERO Bacillus Aunque normalmente no se reconocen como patgenos de plantas, se ha descubierto que algunas especies inducen enfermedades en vegetales. B. megaterium pv. cerealis induce la mancha blanca del arroz y B. circullans se ha encontrado que induce una enfermedad de plntulas de cultivo de tejidos de palma datilera. B. megaterium y B. cereus se han encontrado en vulos, semillas y tubrculos de papa, pero sin efectos perceptibles. Son Gram positivo o Gram variable y en los ltimos aos se ha comprobado que hay Gram negativo; en rebanadas de papa crecen hacia arriba y las colonias son arrugadas. Son aerobias, facultativas, pertricas, pudren tejidos, producen una endospora en la clula y producen una gran cantidad de antibiticos. Son problema en almacn. Los bacillus se dividen en tres grupos: Grupo I. Esporas ovales o cilndricas, centrales, subterminales o terminales. Clula con espora ligeramente hinchada o no hinchada del todo. Grupo II. Esporas ovales, raramente cilndricas, subterminales o terminales. Clula notablemente hinchada. Grupo III. Esporas esfricas, subterminales o terminales. Clulas hinchadas. 5.8.- Bdellovibrio bacteriovorus Devora bacterias. Son ms pequeas que las otras bacterias; se introducen entre la pared celular y la membrana celular, donde crecen para posteriormente pasar al protoplasma. Son Gram negativo. Mtiles (con un flagelo polar), oxidativas. 5.9.- MICROORGANISMOS AFINES A BACTERIAS. 5.9.1.- Organismos semejantes a Micoplasmas (Clase Mollicutes). Desde 1967 a la fecha se ha demostrado que 75 enfermedades de las plantas, que anteriormente se crean causadas por virus, son producidas por microorganismos 35 S. setoii S. tumuli S. viridogenes

con caractersticas morfolgicas semejantes a los micoplasmas, pero que difieren de stos en que no se han podido cultivar en medios artificiales. Los micoplasmas son organismos unicelulares procariticos que carecen de pared celular; sus clulas son pequeas, a veces ultramicroscpicas y tienen citoplasma, ribosomas y cordones de material nuclear. Miden de 175 a 200 nanmetros de dimetro durante su reproduccin. Su forma vara de cocoide a ligeramente ovoide a filamentosa. Se pueden reproducir por gemacin y por fisin binaria. No tienen flagelos, no producen esporas y son Gram negativos, son resistentes a la Penicilina, pero sensibles a Tetraciclina, Cloranfenicol y algunos a Eritromicina. Se les encuentra en la savia de algunos cuantos tubos cribosos del floema. Son transmitidos por chicharritas, aunque algunos tambin por otros insectos como Pslidos, periquitos, fulgridos y posiblemente fidos y caros. La clase Mollicutes tiene un orden, Mycoplasmatales, que se divide en tres familias: Mycoplasmataceae, Acholeplasmataceae y Spiroplasmataceae. La familia Mycoplasmataceae tiene un solo gnero, Micoplasma. ste requiere esterol para su crecimiento y es sensitivo a digitonina. La familia Acholeplasmataceae tambin tiene un solo gnero, Acholeplasma. No requiere esterol para su crecimiento y es resistente a la digitonina. Tambin la familia Spiroplasmataceae tiene un solo gnero, Spiroplasma. Los espiroplasmas son clulas pleomrficas de forma esfrica a ligeramente ovoide, con dimetro de 100 a 250 nanmetros o ms, hasta filamentos helicoidales ramificados que miden de 120 nm x 2 a 4 micras. A diferencia de los grupos anteriores, los espiroplasmas se pueden cultivar en medios nutritivos y dan colonias pequeas (0.2 mm) de forma de huevo frito. Son Gram positivo o Gram variable; los filamentos helicoidales son mviles, aunque carecen de flagelos, se desplazan mediante ondulaciones lentas del filamento. Requieren de esterol para desarrollarse. Son resistentes a penicilina y se inhiben con eritromicina, tetraciclina, neomicina y anfotericina. Algunas enfermedades causadas por Micoplasmas y Spiroplasma son: amarillamiento del ster que ataca a muchas hortalizas, plantas de ornato y malas hierbas; amarillamiento letal del cocotero; necrosis del floema del olmo; enfermedad X del duraznero; decaimiento del peral; enfermedad persistente de los ctricos ( S. citri); y achaparramiento del maz (espiroplasma). A los micoplasmas, espiroplasmas y rickettsias casi no se les ha dado atencin. Son importantes patgenos responsables de declinacin, enfermedades del tipo amarillamiento, virescencias, falta de crecimiento y otros desrdenes de proliferacin. A estos organismos se les localiza en los tejidos del floema y xilema y se transmiten por chicharritas, pslidos, injerto y cscuta. Son sensibles a los tratamientos con calor y tetraciclinas. Pocos se han cultivado y su identidad se ha basado en la especialidad del vector, rango de hospedantes y sntomas en el hospedante. 5.9.2.- Organismos semejantes a Rickettsias.

36

Las rickettsias son organismos procariticos, parsitos intracelulares obligados de clulas de organismos superiores. Son pleomrficos o tienen forma de cocos o bacilo, con pared celular normalmente ondulada, sin flagelos, Gram negativos y se multiplican solo en el interior de las clulas hospedantes. Tienen un tamao que va de 0.2 a 0.8 a 2.0 micras, aunque algunas llegan a alcanzar hasta 4.0 micras de longitud poco antes de dividirse. Se desarrollan mejor a 32 y 35 C. Desde 1972 se han observado algunas plantas con ciertas anormalidades y que en su interior se localizan organismos que se asemejan a rickettsias en la forma, tamao, posesin de una pared generalmente ondulada, ausencia de flagelos, 1 crecimiento intracelular y en DE la LOS incapacidad de crecer en medios nutritivos I. ASPECTOS GENERALES VIRUS...................................... artificiales. Estos organismos tienen como vectores a las chicharritas. Algunos se 1 a los localizan en los vasos xilmicos del hospedante, mientras que otros se limitan 1. INTRODUCCIN............................................................................... 1 elementos cribosos del floema. sntomas disminuyen cuando las plantas daadas 2. IMPORTANCIA DE LOSLos VIRUS...................................................... 2 se tratan con penicilina, clorhidrato de tetraciclina u ................................. oxitetraciclina. 3. FORMA Y ESTRUCTURA QUMICA VIRAL 3 4. SNTOMAS CAUSADOS POR VIRUS FITOPATGENOS ............ Algunas enfermedades en donde se involucran a estos patgenos son: Pierce de la de la alfalfa, enfermedad falsa del duraznero, enanismo de la 6 soca de II vid, enanismo TRANSMISIN DE VIRUS .............................................................. la caa de azcar, enverdecimiento de los ctricos y el chamusco foliar del almendro. 6 NDICE 1. TRANSMISIN MECANICA ........................................................... 7 2. TRANSMISIN POR INJERTO......................................................... 7 3. BIOTRANSMISORES ....................................................................... UNIDAD PAG 7 3.1. INSECTOS ........................................................................................ 7 3.1.1 AFIDOS ............................................................................................. 9 3.1.2 MOSCA BLANCA (MB).................................................................... 10 3.1.3 CHICHARRITAS ............................................................................... 10 3.1.4 COLEPTEROS ................................................................................ 10 3.1.5 TRIPS ................................................................................................ 11 3.2. CAROS ........................................................................................... 11 3.3. NEMTODOS ................................................................................... 12 3.4. HONGOS ........................................................................................... 12 4. TRANSMISIN POR SEMILLA ....................................................... III RELACIONES VIRUS PLANTA ................................................... 1. PENETRACIN ................................................................................ 2. INFECCIN Y SNTESIS VIRAL .................................................... 3. TRANSLOCACIN ........................................................................... IV IDENTIFICACIN DE VIRUS ......................................................... 1. ASPECTOS GENERALES ................................................................ 2. COMPROBAR LA NATURALEZA INFECCIOSA DE LA ENFERMEDAD................................................................................. 3. DETERMINAR TAMAO Y FORMA DE LA PARTICULA ........... 4. PROPIEDADES FSICAS DEL VIRUS ............................................. 5. MECANISMOS DE TRANSMISIN... 6. RANGO DE HOSPEDANTES............................................................ 14 14 14 15 16 16 17 17 17 18 18

37

7. SEROLOGA ........................................................................................ 7.1. BASES DE LA SEROLOGA ............................................................ 7.2. PRODUCCIN DE ANTISUEROS ................................................... 7.3. REACCIONES SEROLGICAS ....................................................... 7.4. ELISA ................................................................................................ 8. NOMENCLATURA Y CLASIFICACIN .......................................... 8.1. NOMENCLATURA ........................................................................... 8.2. CLASIFICACIN .............................................................................. V CONTROL DE ENFERMEDADES VIRALES ................................... 1. ELIMINACIN DE EVASIN DE FUENTES DE INCULO ......... 1.2. 1.3. 1.4. 1.5. 1.6. 1.7. 1.8. SANEAMIENTO ............................................................................... EVITAR TRASLAPE DE CULTIVOS .............................................. SELECCIN DEL SITIO DE SIEMBRA .......................................... HIGIENE DEL CULTIVO ................................................................. SELECCIN DE LA POCA DE SIEMBRA .................................... USO DE SEMILLA SANA ................................................................ RBOLES DE VIVEROS SANOS ....................................................

18 19 19 20 20 22 22 23 25 25 26 26 26 26 27 27 27 27 28 28 29 29 29 29 29 30 30 30 31 31 31

2. CONTROL QUMICO DE VECTORES ............................................. 3. CONTROL FSICO ............................................................................... 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.6. 4. 5. . 5.1. 5.2. 5.3. 5.4. CONCEPTOS Y PRINCIPIOS GENERALES ................................... TIPOS DE RESISTENCIA................................................................. FUENTES DE RESISTENCIA .......................................................... VARIACIN PATOGNICA DE LOS VIRUS ................................. BARRERAS BIOLGICAS ............................................................... SUPERFICIES REFLEJANTES ......................................................... FRANJAS AMARILLAS ................................................................... CUBIERTAS DE PLSTICO ............................................................ ACEITES ........................................................................................... TERMOTERAPIA ............................................................................. PROTECCIN CRUZADA ............................................................... RESISTENCIA ..................................................................................

38

UNIDAD 1 ASPECTOS GENERALES DE LOS VIRUS

39

Unidad 1. ASPECTOS GENERALES DE LOS VIRUS 1.- INTRODUCCIN. La virologa es una ciencia microbiolgica que estudia a los virus. Los virus son agentes infecciosos causantes de enfermedades de diversos organismos vivos. La palabra virus es de origen latino y significa pus o veneno. Los virus son partculas compuestas por cido nucleico (AN) y protena, de tamao submicroscpico, son parsitos obligados que solo se multiplican en el interior de las clulas del hospedante. Los virus no son clulas ni estn constituidos por ellas, pero se propagan al obligar a la clula vegetal a que los multiplique utilizando su propia energa y maquinaria biosinttica. A consecuencia de lo anterior el metabolismo de las clulas vegetales se altera a tal grado que las plantas se enferman. Los virus no matan a las plantas directamente mediante toxinas ni enzimas. En cambio desvan el metabolismo y se generan substancias extraas y se alteran diversas funciones vitales que inducen el desarrollo de sntomas, que pueden variar desde simples cambios de color hasta necrosis severa o muerte sbita de la planta. En otros el efecto es casi imperceptible como en el caso de los hospedantes asintomticos. 2.- IMPORTANCIA DE LOS VIRUS. Los virus son importantes porque: 1. Causan enfermedades en el hombre (sida, cncer, poliomielitis, rabia, gripe y hepatitis viral, etc), animales domsticos y silvestres. 2. Afectan a otros microorganismos (bacterifagos, micovirus) por lo que contribuyen al equilibrio microbiano de la naturaleza. 3. Causan enfermedades de plantas. Se han caracterizado ms de 1000 virus, de los cuales ms de 500 son patgenos de plantas. Al alterar el funcionamiento

40

normal de la planta llegan a provocar prdidas hasta de 100%. Los daos no son nicamente en la cantidad sino en la calidad de la produccin; por ejemplo frutos deformes y manchados pierden valor comercial. Prcticamente cualquier planta puede ser atacada por virus y es comn encontrar a mas de dos virus afectando al mismo tiempo a la misma planta. Algunos como el virus Mosaico del Tabaco tiene un rango de hospedantes muy amplio; puede atacar ms de 300 especies de plantas herbceas y leosas distribuidas en 50 gneros. A consecuencia de las enfermedades virales (o virosis) se derivan tambin una serie de gastos adicionales para lograr el control: aplicaciones de insecticidas contra vectores, cubiertas de agribn, trampas amarillas, etc. 3. FORMA Y ESTRUCTURA DE LA PARTCULA VIRAL. A diferencia de otros patgenos de las plantas, los virus no estn constituidos por clulas. Adems de estar entre los patgenos mas pequeos, los virus tambin se constituyen uno de los grupos mas simples. Estn formados por partculas (solo visibles al microscopio electrnico de transmisin) que miden menos de 2000 nanmetros (nm +); estn formados por una cadena simple o doble de ARN o ADN, cubiertas por una cpsula de protena. Mediante el microscopio electrnico de transmisin se ha determinando que los virus presentan las siguientes formas: 1. Varilla rgida. Virus Mosaico del Tabaco (VMT) 2. Varilla flexible. Virus Y de la papa (VYP) 3. Isomtrica (polidrica). Virus Mosaico del Pepino (VMP) 4. Bacilo. Virus Amarillamiento Necrtico de la Lechuga (VANL) El cido nucleico (genoma) es responsable de la infeccin y la cubierta de protena le sirve de proteccin y tambin funciona en el reconocimiento del hospedante. El cido nucleico (ARN en la mayora de los virus; ADN en los geminivirus y caulimovirus) porta la informacin gentica necesaria para la 41

replicacin del virus. Tanto el ADN como el ARN pueden ser de cadena simple o de doble cadena. La cpsula protica (cpside) esta compuesta por subunidades (CAPSMEROS). A la partcula completa (cido mas protena se le denomina virin. El cido nucleico se ubica en la parte central de la partcula. En el caso de virus de varilla el ARN esta organizado como una hlice larga. El tamao de los virus isomtricos vara de 17-70 nanmetros (nm1) de dimetro; los baciliformes alcanzan 300 nm de longitud x 95 nm de ancho; los de varilla rgida miden 114-215 nm de largos por23 nm de ancho; las dimensiones de los virus de varilla flexible alcanzan hasta 2000 nm de longitud por 10 nm de ancho. La cantidad relativa de AN y protena, vara segn el virus; las partculas de los isomtricos contienen entre 15-45% de cido, mientras que los de varilla contienen aproximadamente 5%. Adems de la protena y del AN algunos virus contienen otros constituyentes qumicos tales como algunos cationes, poliaminas y enzimas; tambin contienen agua, que puede alcanzar hasta 50% del peso del virus. + Un nanmetro (=1 milimicra) = 0.000 000 001 m; o 0.000 001 mm; o 0.001 micras 4. SNTOMAS CAUSADOS POR VIRUS FITOPATGENOS Sin negar la importancia de los sntomas para identificar enfermedades virales, el diagnstico de estas en base a los sntomas, es con frecuencia de baja precisin. Los sntomas son tiles para el diagnstico preliminar y solo en el caso de enfermedades muy conocidas se puede afirmar con total certeza que el agente causal de tal o cual enfermedad es determinado virus. Lo anterior se debe a que: Sntomas similares pueden ser producidos por diferentes virus. El mismo virus puede producir un amplio rango de sntomas, dependiendo de la variante del propio virus, del ambiente y genotipo del hospedante.

42

Otros patgenos o factores abiticos tambin producen sntomas similares. La falta de sntomas no necesariamente significa que la planta no est infectada. Puede suceder simplemente que la infeccin est latente. En general los sntomas inducidos por virus se pueden agrupar en tres grandes

categoras: cambios de coloracin, malformaciones y sntomas diversos. 4.1. Cambios en la coloracin. Se observan en hojas, flores, frutos y races. 4.1.1. Hojas. Clorosis. El color verde se debilita progresivamente. Amarillamiento. Clorosis y aparecen pigmentos amarillos. Albinismo (bleaching). Tejidos de color blanco. Enrojecimiento. Debido a la formacin anormal de antocianinas. Obscurecimiento. Debido a la sntesis de color caf oscuro, semejantes a las melaninas. Necrosis. Las clulas se colapsan y se tornan de color oscuro. A veces hay tonalidades bronceadas (bronceamiento). Mosaico. reas irregulares de color verde plido, alternadas con zonas de amarillentas o clorticas; el lmite entre estas dos tonalidades generalmente est determinado por las nervaduras. Moteado. reas decoloradas mas o menos redondeadas, con el borde difuso. Lesiones locales. reas clorticas o necrticas de forma variable. Miden mm. Manchas anulares. Manchas redondeadas o de borde irregular, que presentan patrones de lneas en forma de anillos o huella digital. Pueden ser necrticas. Estras. Lesiones alargadas, paralelas a lo largo de las nervaduras (gramneas). con el borde bien definido Amarillamiento de nervaduras. Nervaduras de color amarillo o verde plido.

43

Aclaramiento de nervaduras. Nervaduras translcidas. Necrosis de nervaduras. Necrosis por muerte del sistema vascular. 4.1.2. Flores. Virescencia. Enverdecimiento general de los ptalos. "Breaking". Pecas, estras o sectores de colores anormales en los ptalos (variegado). Cambios de color. (Intensificacin, debilitamiento o cambio de pigmentos). 4.1.3. Frutos. Todo el fruto puede cambiar de tamao y color. Puede haber moteado, manchas angulares. 4.1.4. Races. Puede haber necrosis. 4.2. Malformacin. Se observan en hojas, flores, frutos y races. 4.2.1. Hojas. Distorsin. Hay encurvamientos, rizamientos, Epinastia. Curvamiento del ngulo del pecolo de las hojas hacia abajo "Angostamiento". Reduccin en la superficie de la lmina de la hoja; las venas permanecen casi normales. Reduccin de tamao. Todas o solo parte del follaje. Engrosamiento. Parte o toda la lmina foliar; de las nervaduras.

44

Enaciones. Crecimiento de la lmina foliar hacia la superficie adaxial de la lamina de la hoja, resultando en el curvamiento de las hojas hacia el dorso. 4.2.2. Flores. Varios tipos de distorsin. Fillodia. Partes de la flor se desarrollan con apariencia de hojas. 4.2.3. Frutos. Deformacin y forma irregular. Tumores Semillas abortivas. 4.2.4. Tallos. Distorsin Acortamiento de entrenudos. 4.2.5. Races. Decaimiento y muerte regresiva Tumores. Deformacin o agallas 4.3. Otros sntomas. Marchitez. Flacidez de parte del follaje o de toda la planta. Defoliacin. Cada prematura de las hojas o sbito desprendimiento de estas. Alteracin en la cantidad de flores Floracin prematura o retardada Sabor anormal de frutos. Frutos desabridos. Secreciones anormales. Gomosis

45

Concavidades en la madera Engrosamiento de yemas Incompatibilidad en el injerto. Los injertos no prenden o no desarrollan 4.4. Factores causantes de sntomas semejantes a los inducidos por los virus Anormalidades genticas Deficiencias nutrimentales Dao por herbicidas Dao por insectos o caros Dao por poluantes o pesticidas Otros fitopatgenos Los sntomas causados por estos ltimos agentes no son de naturaleza infecciosa; es decir, que no se transmiten mediante injerto. Adems, al paso de los das la recuperacin puede ser comn. Agentes infecciosos tambin pueden causar sntomas similares a los ya descritos: por ejemplo el tizn tardo llega a ser confundido con el virus de la marchites manchada, por productores y tcnicos inexpertos. El uso de los sntomas para la diagnosis de campo es una gua valiosa pero imprecisa, sobre todo para los tcnicos no familiarizados con las enfermedades comunes en un cultivo en una regin determinada. An el especialista debe ser humilde antes de poder afirmar que un virus particular est involucrado en determinada enfermedad. Lo anterior no significa que cada vez que detectemos sntomas presuntamente virales, se tendr que acudir a un experto. Dependiendo de la experiencia del investigador y de los antecedentes del problema, los diagnsticos de campo pueden ser relativamente precisos. El patrn de dispersin de la enfermedad puede dar indicios

46

del virus o grupo de virus que se trate. Por ejemplo en el caso de geminivirus en tomate, los sntomas mas notables son de enchinamiento y reduccin en el crecimiento; su presencia en la regin est relacionada con las poblaciones de mosca blanca y generalmente al inicio de las epidemias se aprecia un gradiente en dnde las plantas de las orillas son las primeras en ser infectadas, especialmente si hay maleza cercana en los drenes. En base a lo anterior en sentido estricto, solo se puede afirmar que tenemos problemas de virosis, cuyos sntomas coinciden con los descritos para geminivirus, pero en ningn momento podemos decir con precisin de que geminivirus se trata; tampoco podemos negar que posiblemente haya plantas infectadas por otros virus. El apoyo del laboratorio puede ser indispensable para determinar con certeza a los patgenos involucrados, sobre todo cuando se presentan sntomas que antes no se haban observado en el cultivo en la regin. Unidad 2. TRANSMISIN DE VIRUS Dada su condicin como parsitos obligados los virus no se pueden desarrollar en materia orgnica muerta; requieren del albergue en tejido vivo, ya sea en estado de reposo o de multiplicacin activa. El Virus Mosaico del Tabaco (VMT) constituye una de las pocas excepciones, ya que puede sobrevivir en restos de tejidos infectados que quedan en el campo despus de la cosecha, de tal manera que estos materiales sirven como fuente de inculo primario en el siguiente ciclo. Los virus requieren pasar constantemente de un hospedante infectado a otro sano, para poder sobrevivir en cualquier regin. Los virus no penetran a las plantas de manera directa, ni salen de estas por sus propios medios. La dispersin no es activa; es pasiva y se da mediante los siguientes mecanismos:

47

1. Transmisin mecnica. Este fenmeno sucede comnmente en el campo o en los invernaderos, mediante el rozamiento natural entre plantas (VMT), pero principalmente a travs de las heridas causadas por las prcticas de cultivo, tales como: podas, desbrotes, acomodo de guas, cosecha, etc. Afortunadamente la mayora de los virus no se dispersan eficientemente de esta manera. Sin embargo hay que valorar la enorme importancia de las prcticas causantes de heridas en cultivos sujetos a manipuleo frecuente (hortalizas), o en aquellos casos en que por necesidad hay que causar heridas (particin de tubrculos en papa o podas en frutales). Por otra parte, la transmisin mecnica artificial es uno de los aspectos a estudiar para la identificacin de virus. Este aspecto se ver en el captulo correspondiente. 2. Transmisin por injerto. En la prctica agrcola este factor es de gran importancia especialmente en el caso de rboles frutales. El sitio de unin del injerto con el patrn permite el contacto de la savia infectiva con la savia de plantas sanas. Todos los virus se pueden transmitir potencialmente por injerto, propiedad que se utiliza a nivel experimental para determinar la naturaleza infecciosa de las enfermedades. 3. Biotransmisores. Se aplica este trmino a cualquier agente vivo (excluyendo semilla y polen) capaz de portar o transmitir un virus fitopatgeno de una planta enferma a una planta sana. En sentido estricto la palabra vector no es sinnimo de biotransmisor, aunque en el lenguaje comn se usan de manera indistinta. Siendo ms comn el primer trmino. El ser vector implica que el virus es ingerido y se halla en contacto ntimo con el

48

transmisor. Un ejemplo til de vector es el del mosco Anopheles, que transmite al protozoario causante del paludismo; el microorganismo ingerido se multiplica y sufre transformaciones en el interior del cuerpo del insecto, antes de poder ser transmitido. En muchos casos de biotransmisores de virus, el patgeno si se multiplica en el insecto pero hay abundantes excepciones en las que no sucede as. Entre los biotransmisores de virus fitopatgenos se hallan los insectos, caros, nemtodos y hongos.

3.1. Insectos Segn Harris (1981) los insectos constituyen el grupo ms importante; de las 391 especies de animales vectores de virus en plantas, 94% son artrpodos y 6% son nemtodos; del total de artrpodos vectores, el 99% son insectos; el 70% de los insectos capaces de transmitir virus son hompteros. En general, durante la transmisin por insectos se pueden distinguir tres fases: Perodo de adquisicin. Es el tiempo mnimo que requiere el insecto para adquirir el virus. Perodo de ltencia. Tiempo transcurrido desde que el insecto adquiere el virus hasta que es capaz de transmitirlo. Perodo de inoculacin. Tiempo mnimo requerido por el insecto para poder trasmitir el virus adquirido, una vez que empieza a alimentarse de una planta sana. Hay otro trmino importante denominado perodo de retencin, que se refiere al tiempo durante el cual el insecto permanece infectivo. Los principales grupos de insectos vectores de virus son: fidos, mosca blanca. trips. chicharritas y colepteros.

49

3. 1. 1. Afidos. Existen ms de 190 especies de fidos vectores de virus. Entre los gneros ms comunes se encuentran: Aphis, Myzus, Brevicoryne, Macrosiphum, Rophalosiphum, Toxoptera, etc. Se han reportado ms de 160 virus trasmitidos por fidos. La mayora de los virus transmitidos por fidos son de forma polidrica o de varilla flexible. Cuyo sntomas ms notable es el de mosaico, aunque algunos tambin inducen amarillamientos. Los virus raras veces son transmitidos transovarialmente (a travs del huevo); as, los fidos recin eclosionados casi siempre estn libres del virus. La transmisin por fidos pueden ser de tres tipos; No persistente (circulativa) que es la ms comn, o persistente (circulativa). Hay una tercera categora que incluye a virus que presentan caractersticas intermedias entre las dos anteriores (cuadro 1). Cuadro 1. Caractersticas diferenciales de los virus transmitidos por fidos. No persistentes El virus se adquiere durante piquetes superficiales de prueba; es portando en el estilete y retenido en el mismo por menos de una hora y usualmente no es ingerido El insecto puede adquirir al virus en segundos a pocos minutos. No hay un perodo latente y el virus puede ser transmitido de inmediato despus de adquirirse Semipersistentes El virus es ingerido, y se ocupan de varios minutos a 1-2 horas de alimentacin para que se adquiera Persistentes El virus es ingerido, pasa a los ductos alimenticios y hemolinfa. Invade las glndulas salivales. Tarda en adquirirse de 30 minutos a varias horas. Hay un perodo de latencia antes de que el fido pueda transmitirlo. La transmisin es eficiente en funcin de la cantidad de virus ingerido. El virus persiste en el vector durante toda su vida y a menudo se multiplica en este. Rango estrecho de hospedantes

No hay perodo de latencia en el vector. Para transmitirlo en una planta sana se tarda de varios minutos a pocas horas

Los virus generalmente tienen amplio rango de hospedantes Se transmiten Se transmiten difcilmente No se transmiten por frotis

50

mecnicamente mediante frotado de savia Ejemplos: Virus Mosaico comn del Frijol, Y de la papa, jaspeado del Tabaco, Mosaico del pepino y, Mosaico de la Sanda.

por frotis de savia Ejemplos: Virus Tristeza de los Ctricos, Amarillamiento de la Remolacha y Amarillamiento del Trbol.

de savia Ejemplo: Virus Mosaico del Maz, Enrollamiento de la papa, Amarillamiento Necrtico de la Lechuga y Enanismo estriado del Trigo.

Los fidos presentan formas pteras y aladas; estas ltimas son las ms importantes como vectores dada su alta movilidad. Son insectos partenogenticos y vivparos que pasan por cinco estadios ninfales. Algunos son especficos a uno o pocos hospedantes, pero muchas especies son polfagas, En ausencia del hospedantes cultivable los fidos sobreviven en maleza ubicada dentro del lote (arvenses) o en los montes o drenes cercanos (maleza ruderal) Con frecuencia la maleza que alberga a los fidos, es tambin susceptibles y funcionan como fuentes de inculo primario; a veces estas plantas infectadas son asintomticas. Otra posibilidad comn es que el fido adquiera al virus durante el trayecto hacia el cultivo, a partir de plantas infectadas de las que se alimente. Al llegar a los lotes de cultivo los fidos se alimentan de los brotes ms tiernos. Hay que distinguir dos cosas importantes relacionadas con la transmisin no persistente. Por un lado sealar que no todos los fidos colonizan al hospedante, pero esto no es obstculo para que los virus no persistentes sean transmitidos. Es comn que antes de fijar su estilete de manera definitiva, realice piquetes de prueba ("tientas"), que le permitirn decidir si la planta escogida le conviene como hospedante. Este comportamiento es de mucha importancia epidemiolgica ya que bastan estas tientas realizadas en segundos, para que pueda adquirir el virus o para depositarlo en las plantas sanas. El otro factor se refiere a que no se debe visualizar a los fidos vectores de virus bajo la misma ptica de los insectos plaga. Tericamente basta con que una planta sea picada con un solo fido infectivo para transmitir al virus; por lo anterior no podemos 51

hablar de umbrales de control para el control qumico de fidos vectores. Este tipo de transmisin no persistente se facilita porque algunos virus se hallan muy concentrados en las clulas del parnquima, y durante la tienta se adhieren fcilmente al estilete. Una vez que la planta es infectada los sntomas aparecen pocos das despus, estas se presentan inicialmente en forma aislada, pero despus se generaliza la epidemia. El control de enfermedades virales de transmisin no persistente es difcil de lograr mediante aplicaciones de insecticidas. Antes de que el insecto alado muera por el efecto del insecticida, puede potencialmente (bajo la excitacin nerviosa derivada del txico) picar otras plantas sanas cercanas, de tal manera que la transmisin no se evita.

3. 1. 2. Mosca blanca (MB) Transmiten virus cuyos sntomas generalmente son de amarillamiento, enrollamiento ("enchinamiento") y a veces mosaicos. Estas enfermedades se presentan generalmente en zonas tropicales y subtropicales. Las especies mas importantes son: Bemisia tabaci, Trialeurodes vaporariorum. Transmiten principalmente geminivirus (partcula formada por dos virus polidricos unidos). La transmisin es de tipo persistente (excepto en el Virus de la Vena Amarillo del Pepino). El virus alcanza la hemolinfa. El perodo de adquisicin es de 1-2 das y el de latencia de 4-20 horas. La mosca permanece infectiva hasta por 35 das o ms. El virus puede ser adquirido por las ninfas, persiste durante la "pupacin" y es inmediatamente transmisible por el adulto recin emergido. No hay evidencia de que el virus pase al huevo. Las moscas se alimentan del floema, prefieren tejidos jvenes o

52

en el envs de las hojas. Al ser arrastradas por el viento llegan a diseminar virus a grandes distancias. Son atradas por la luz azul y colores amarillos. La mayora de los virus transmitidos por mosca no se transmiten por frotis. Ejemplos de virus transmitidos por MB son: Virus Mosaico Dorado del Frjol, Virus del Enrollamiento de la Hoja de la Calabaza y el Virus del Enchinamiento del Tomate. 3. 1. 3. Chicharritas 1. Las especies ms comunes como vectores de virus pertenecen a gneros como: Empoasca, Dalbulus, Circullifer, Macrosteles, Agallia y otros. Son insectos de hbitos picador-chupador. 2. Transmisten virus asociados al floema, tejido del cual se alimentan. 3. Estos virus no se transmisten mecnicamente por frtis (excepto El Virus Enanismo Amarillo de la Papa) 4. La transmisin es generalmente del tipo persistente (circulativa). El perodo de adquisicin es de 30 minutos o ms. Hay un perodo de latencia en el vector. El perodo de inoculacin es de varias horas. 5. El virus es retenido por el insecto durante toda su vida (excepto en el Virus tungro del arroz). El virus pasa del intestino a la hemolinfa y se multiplican en el vector (excepto el Virus curly top de la remolacha). En algunos casos hay transmisin transovarial del virus, es decir que los huevecillos quedan infectados y la progenie puede ser infectiva. 6. Hay una alta especificidad virus-vector y los virus tienen un limitado rango de hospedante. 7. Los sntomas mas comunes son amarillamiento sntomas de distorsin y proliferacin anormal de hojas y yemas ("escoba de bruja"). 8. Ejemplos de virus transmitidos por chicharras son: Curly Top del Tomate, Rayado Fino del Maz, Mosaico Estriado de la Cebada, y Estriado del Maz. 3. 1. 4. Colepteros

53

1. Las especies ms comunes de estos vectores en Mxico son Acalymma spp.y Diabrotica spp. 2. Perodo de adquisicin de aproximadamente 5 minutos. 3. El insecto permanece infectivo por al menos un da despus de que se alimenta de una planta enferma 4. Los virus se transmiten fcilmente mecnicamente. 5. Ejemplos de virus transmitidos por colepteros son: Virus Mosaico de la Calabaza, Virus Mosaico Rugoso del Frijol, Virus Mosaico de la Berenjena y el Virus del Mosaico del Rbano. 3. 1. 5. Trips 1. Los trips son insectos de hbito raspador-chupador que usualmente se alimentan de tejido joven. Las especies reportadas como vectores son Frankiniella occidentalis, F. fusca, F. schultzei,Thrips tabaci, T. setosus, T. palmi y Scirtothrips dorsalis. 2. Transmiten a virus pertenecientes al grupo de los ToSpoVirus (tmino derivado de Tomato Spotted Wilt Virus. Este grupo se distribuye en casi todo el mundo y ataca mas de 500 hospedantes, ubicados en mas de 50 familias, que incluyen hortalizas de gran importancia. 3. Del grupo de los Tospovirus, l ms importante es el Virus de la Marchitez Manchada del Tomate (VMMT o TSWV.) 4. Los' insectos adquieren el virus solamente durante los estados ninfales. Las larvas infectadas pueden transmitir al virus; los adultos infectados lo pueden transmitir durante toda su vida. Bastan 15 minutos de alimentacin para que el trips adquiera el virus. Entre mayor sea el perodo de adquisicin, habr mayor eficiencia en la transmisin. La savia ingerida pasa al intestino y los virus atraviesa la pared intestinal, y alcanzan la hemolinfa. El virus alcanza las glndulas salivales y es depositado junto con

54

la saliva cuando el insecto se alimenta de plantas sanas, efectuando la transmisin. 5. Aparentemente bastan pocos minutos para que el virus pueda ser inoculado por los insectos en las plantas susceptibles. Evidencias recientes indican que los trips tambin realizan "piquetes de prueba" de manera similar a los fidos y que durante estos puede ocurrir una transmisin exitosa, ya que depositan el virus en clulas que pueden sobrevivir al dao fsico del insecto, permitiendo la multiplicacin del mismo. 6. Existen evidencias que el virus se logra multiplicar en el cuerpo del vector y que el ciclo de vida de este se puede acortar considerablemente por el efecto del virus. 3. 2. caros De la clase arcnida, los erifidos son los vectores de virus ms importantes, pero algunos tetranichidos tambin los pueden transmitir. Los caros son artrpodos de hbito chupador. Se conocen al menos seis virus transmitidos por caros y en todos los caos la transmisin es de tipo persistente, el virus persiste tambin durante la muda. No existe transmisin transovrica. Algunos vectores son; Eriohystulipae, que transmite al Virus Estriado del Trigo y E. ficus, vector del Virus del Mosaico del Higo. 3. 3. Nemtodos. Se conocen al menos 12 virus transmitidos por nemtodos y todos los vectores se ubican en el Orden Dorylaimida y cuyos gneros son: Xiphinema, Longidorus y Trichodorus. La mayora de los virus transmitidos por nemtodos se transmiten tambin mecnicamente, son especficos al hospedante y el virus es desechado durante la muda del nemtodo vector. El perodo de adquisicin es de 48 hrs. La transmisin de virus por nemtodos no es de tipo persistente, ni existe evidencia de que estos se multipliquen en el vector. En cierta manera el mecanismo de

55

transmisin es similar al tipo no persistente de los fidos, ya que entra por el estilete junto con el alimento y se adhiere a la pared del esfago. Cuando el nemtodo se aleja y pica otra planta el virus es inyectado junto con la saliva, la cual despega al virus del estilete y este es inyectado en la planta sana. El patrn de dispersin de estas enfermedades es en manchones, lo cual es tpico del patrn de dispersin del vector. En nepovirus la transmisin por semilla es ms importante a largas distancias. En base al tipo de partcula viral transmitida, los patgenos se clasifican en: Nepovirus. Son virus polidricos que tambin se transmiten por semilla y polen. Ejemplos de vectores son: Xiphinema index y X. americana que transmiten al Virus de la Hoja de Abanico de la Vid y el Virus de la Mancha Anular del Tabaco, respectivamente. ste nemtodo es muy longevo en ausencia de hospedante y el virus dura hasta 8 meses en el nemtodo. Longidorus sp. Transmite al Virus del Anillo Negro del Tomate. Netuvirus. Tambin llamados Tobravirus. Incluyen virus en forma de varilla. Un ejemplo es Trichodorus sp que transmite al Virus Sonajero del Tabaco. 3. 4. Hongos. Se conocen cinco especies de hongos vectores, todos ellos son ficomycetes. Forman zoosporas en esporangios. Las zoosporas tienen cierta autonoma de movimiento gracias a los flagelos. El hongo adquiere al virus al atacar a una planta enferma por este ltimo. La reproduccin del hongo da origen a esporangios y zoosporas infectadas por partculas de virus. Las zoosporas se desplazan por el agua, al infectar races de plantas sanas tambin inoculan al virus. Ejemplos son: Cuadro 2. Hongos vectores de virus y virus transmitidos.

56

Hongo fitopatgeno Olpidium brassicae Synchytrium endobioticum Spongospera subterranea Polymixa graminis Pythium ultimum 4. Transmisin por Semilla

Virus transmitido Vistus Vrice de la Lechuga Virus x de la Papa Virus Mop Top de la Papa Virus Mosaico del Trigo Virus Falso Enrollamiento del Chcharo

En 1982 se conocan 230 virus fitopatgenos, de los cuales al menos 62 pueden ser transmitidos por semilla en cuando menos uno de sus hospedantes. El porcentaje de semilla infectada depende del virus y de la variante del mismo, as como de la variedad del hospedante y de la etapa de su desarrollo al momento de la infeccin viral. La transmisin por semilla constituye uno de los factores ms importantes en el desarrollo epidmico de algunos virus. Las semillas infectadas dan origen a plntulas que representan una fuente de inculo inicial temprana, que adems se halla uniformemente distribuido. Las plntulas infectadas constituyen reservorios a partir de los cuales ocurre la dispersin secundaria del virus, lo cual sucede por transmisin mecnica o mediante vectores. En el campo es raro que ocurran incidencias del 100% de plantas infectadas y adems no todas las semillas de una planta resultan infectadas. En consecuencia, la proporcin de plantas con semillas infectadas generalmente es baja en la mayora de los virus; una de las excepciones quiz sea el Virus Mosaico Comn del Frjol. Sin embargo bastan incidencias muy bajas de semilla infectada para que se inicien epidemias severas. Por ejemplo en California se determin que basta con que 0.1% de la semilla tenga al virus del Mosaico de la Lechuga para que las prdidas sean cuantiosas. El papel del inculo portado en la semilla es mayor cuando el virus no tiene muchos hospedantes alternativos. La transmisin por semilla tiene tambin mucha importancia de la dispersin de virus de un pas o continente a otro; en este caso puede ser el medio mediante el cual se introduce al patgeno por vez primera a

57

una nueva regin. Debe tambin visualizarse su papel como sitio de supervivencia de los virus. La mayora de los virus que se transmiten por semilla se ubican en su interior, generalmente en el embrin. La infeccin de la semilla va precedida de infecciones en la planta antes de la floracin. Virus tales como el VMT constituyen casos especiales, ya que el virus puede ir en el embrin y en la testa de la semilla. El VMT puede ser eliminado fcilmente de la testa con substancias qumicas, no as del interior de la semilla. Hay varias hiptesis que intentan explicar la ausencia de la transmisin por semilla. Se supone que aunque algunos virus alcancen la semilla en desarrollo, estos sean inactivados por substancias inhibidoras de la propia planta. En otros casos el aborto de flores podra evitar la transmisin. En algunos casos ciertos virus se transmiten por semilla solo en algunos hospedantes; la eficiencia de transmisin (% de semilla afectada) es tambin variable segn la especie y variedad. Las plantas infectadas pueden tambin producir polen infectado, el cual al fertilizar flores de plantas sanas transmite tambin el virus. Este fenmeno aumenta tambin la proporcin de semillas infectadas. En otros casos el virus induce esterilidad en el polen. Son diversos los factores que determinan la proporcin de semillas infectadas o inclusive el xito de la propia transmisin. As, infecciones antes de la floracin o durante floracin, contribuyen a que el virus alcance el embrin. La temperatura es determinante, pues por ejemplo, en el Virus Mosaico Sureo del Frjol, hay una transmisin de 95% cuando la temperatura es de 16-20C; sin embargo la transmisin es de solo 55% a 28-30C. En otros casos algunos virus se transmiten por semilla solo en algunos hospedantes. As por ejemplo el Virus Mosaico Amarillo del Frjol se transmite por semilla en lupino, pero no en frjol. Las diferencias en la proporcin de semilla infectadas tambin se expresan segn el cultivar. As, al estudiar la transmisin del

58

VMCF en 51 cultivares de frjol, la transmisin vari desde 1-75%. Esta variacin tambin es distinta segn la planta individual de la misma variedad; por ejemplo en lechuga de misma variedad, la transmisin de semillas contaminadas vari de 0.214.2% plantas. Es obvio que la propia extirpe o variante del virus tambin difiere en su capacidad de transmisin; tal es el caso del Virus Mosaico Estriado de la Cebada, cuya transmisin por semilla vari del 0-53%. Un caso aparte es el de la transmisin de virus mediante partes vegetativas. En este caso todos los virus de determinado cultivo pueden ser transmitidos de manera vegetativa, aunque no todas las partes vegetativas de la misma planta puedan estar contaminadas. En cultivos ornamentales y comestibles como la papa y el camote, es de enorme importancia la utilizacin de semilla libre de virus. Unidad 3. RELACIONES VIRUS-PLANTA Las plantas mantienen una relacin ntima con sus parsitos virales y salvo pocas excepciones los virus generalmente estn en el interior de las clulas vivas, ya sea en etapa de multiplicacin o en reposo. Esta relacin parastica inicia cuando el virus ingresa a tejido sano. 1. Penetracin. Los virus son parsitos de heridas frescas y requieren de estas para introducirse a la planta mecnicamente ya que son capaces de introducirse en el hospedante por s solos. Puede suceder que el virus ya est en la semilla, pero en plantas sanas las partculas iniciales son inoculadas mecnicamente mediante prcticas de cultivo, injerto y mediante el roce entre plantas. En el caso de la transmisin por polen, tambin ocurren heridas mecnicas, durante la germinacin de este grano y la formacin posterior del tubo polnico. Los vectores tambin causan

59

heridas con su aparato bucal (artrpodos o nemtodos) durante su alimentacin en la que se adquiere o se inocula el virus. 2. Infeccin y sntesis viral. La infeccin viral en funcin de la sntesis de nuevas partculas. La sntesis de nuevas partculas se da a costa de las substancias del propio hospedante. El fenmeno de la replicacin y de la induccin de la enfermedad es complejo, pero haciendo una simplificacin se puede escribir de la siguiente manera: 1. Una vez que las partculas han penetrado (inmersas en la savia infectiva) y hacen Contacto estrecho con el citoplasma de la planta sana, la partcula viral pierde la cpside protica. El cido nucleico (AN) libre es el responsable de la infeccin y de los sntomas, al interferir con el metabolismo normal de la planta. Los fragmentos de la cpside quedan libres en la clula y aparentemente son incorporados en las reacciones metablicas de la clula infectada. 2. La partcula de AN viaja al ncleo y logra inducir a la clula para que sintetice enzimas ARN-polimeras y ARN-sintetazas. 3. En presencia del ARN viral que sirve como molde, se sintetizan nuevas partculas virales. El ARN original que sirve de molde para producir una copia que acta como una especie de "negativo"I que sirve para que se produzcan mltiples copias exactamente iguales al molde original. 4. Tan pronto como se sintetizan las nuevas partculas virales, a partir de las propias clulas del hospedante (bajo las ordenes del ARN viral) se sintetizan tambin cada una de las cpsides correspondientes. 5. El proceso anterior se completa en aproximadamente 10 hrs. Al final los nuevos virus quedan formados a imagen y semejanza de las partculas originales y se comportaran de manera similar al padre original; a menos que ocurra alguna alteracin (mutacin) durante la sntesis y ensamblaje de las molculas del AN o de la cpside.

60

El proceso antes descrito ha sido determinado en el VMT, uno de los virus ms estudiados. En plantas susceptibles es posible hallar hasta 10 millones de virus por cada clula. Hay que enfatizar que los virus no poseen un sistema metablico propio y que todas las actividades se efectan a costa de consumir las substancias de la planta y de alterar las funciones de la planta. El virus utiliza los ribosomas y el ARN de la planta. La planta deja de sintetizar algunas substancias y las sintetiza en mayor o menor grado. Otro evento comn es la sntesis de protenas extraas y de nuevas substancias. La concentraciones de algunas substancias son tambin alteradas, incluyendo la de algunas hormonas. Todas estas anomalas en el funcionamiento de la planta constituyen el proceso de enfermedad (patognesis), que desemboca en la el desarrollo de los sntomas en cada hospedante. Cabe agregar que una vez formadas las nuevas partculas en algunos virus se ha observado que forman agregados de partculas virales conocidos como inclusiones, cuya forma y tamao es variable, as como su localizacin en el interior de la clula. 3. Translocacin. Los virus tienen que desplazarse de las clulas inicialmente infectadas a las clulas sanas vecinas o an desplazarse a distancias de varios cm o metros (rboles) para poder generalizar la infeccin en la planta atacada. El desplazamiento entre 15 clulas vecinas se da va de los plasmodesmos. Los plasmodesmos son proyecciones del citoplasma que conectan una clula con otra y que permiten el transporte intercelular, lo que tambin permite el flujo de los virus en suspensin acuosa. Se ha estimado que este mecanismo de transporte es demasiado lento ya que los virus se desplazan 8-10 clulas por da. El desplazamiento ms rpido y a grandes distancias (entre rganos) a travs de los tubos cribosos del floema; se menciona que pueden desplazarse hasta 15 cm en tan solo 6 minutos. Del floema los virus pueden invadir nuevas clulas tambin va plasmodesmos. El transporte por el floema ocurre

61

en sentido descendente y por lo tanto los virus se desplazan inicialmente a la raz y posteriormente invaden otros rganos de las plantas Unidad 4. IDENTIFICACION DE VIRUS 1. Aspectos generales. La identificacin completa de enfermedades virales en base a sntomas conlleva un alto riesgo de equivocacin, y ms en el caso de personal no entrenado, que no conoce ni siquiera el desarrollo normal de un cultivo particular en una regin. Tambin se mencion que las virosis pueden ser confundidas fcilmente con problemas de tipo nutrimental, fitotoxicidad por plaguicidas u otros patgenos; en este ltimo caso la confusin se puede dar principalmente con enfermedades causadas por fitoplasmas (mycoplasmas). Sin embargo, la observacin de sntomas a nivel de campo nos da una idea de la posible causa y diseminacin de las enfermedades virales. La identificacin puede ser con fines de diagnstico ante problemas prcticos concretos y en este caso los resultados deben ser rpidos y oportunos. Diagnsticos errneos conducen invariablemente a la toma de decisiones equivocadas en cuanto al manejo de la enfermedad. Por ejemplo al confundir a una virosis con un problema nutrimental puede conducir a gastar en fertilizantes innecesarios; la confusin con enfermedades fungosas puede inducir al productor a aplicar infructuosamente en fungicidas. Es comn que algunos tcnicos bajo el supuesto de que hay que prevenir contra mycoplasmas, aplican antibiticos en cultivos que solamente son afectados por virosis. Sin embargo hay que reconocer que los fitopatlogos experimentados en determinados cultivos, con certeza relativa diagnostican enfermedades virales en base a los sntomas y revisin de literatura; inclusive ese diagnstico llega incluso a nivel de

62

especie con cierta precisin. Sin embargo en estos casos hay que contar con informacin sobre los virus previamente detectados en la regin. Desde el punto de vista prctico no siempre es posible acudir a un laboratorio para que se determinen los virus presentes en una plantacin. De hecho una vez, familiarizados con la sintomatologa, no hay necesidad de acudir a tcnicos mas experimentados. La sintomatologa sigue siendo la herramienta ms importante en el campo para identificar virosis, con todas las limitaciones que este mtodo tiene. Sin embargo no hay que despreciar la utilidad del trabajo de laboratorio, sobre todo cuando se trata de sntomas no observados con anterioridad en una regin. En una investigacin formal, las fases a seguir para identificar a el o los agentes causales de una virosis desconocida son los siguientes: 2. Comprobar la naturaleza infecciosa de la enfermedad. Antes que nada debe de determinarse que la enfermedad se puede transmitir de una planta enferma a una sana, ya que solo las enfermedades de naturaleza bitica son infecciosas. Este aspecto se prueba haciendo injertos de brotes de plantas enfermas en plantas sanas cultivadas en invernadero. Es obvio que el invernadero deber estar protegido para evitar el acceso de vectores. 3. Determinar tamao y forma de la partcula. Este factor se determina realizando observaciones en el microscopio electrnico de transmisin. Se observa la forma de la partcula y se miden sus dimensiones. Recuerde que las formas de los virus son en su mayora de tipo poliedro (esfricas o isomtricas), de varilla flexible y varilla recta. Muchos virus forman inclusiones y estas se pueden observar al microscopio biolgico compuesto, para lo cual se hacen preparaciones de tiras epidermales sobre un portaobjetos. Las inclusiones son agregados de partculas y su presencia sirve

63

solamente como indicador de la presencia de algunos virus; existen inclusiones amorfas, piramidales, etc. Cabe aclarar que estas tcnicas requieren de mucho entrenamiento, especialmente la de microscopa electrnica, pues no cualquier persona lo puede hacer eficientemente. Se requiere previamente purificar al virus al menos parcialmente, lo cual a veces no es sencillo, pues el uso de solventes u otras substancias pueden destruir al virus. Para purificar virus se requiere de centrfugas y ultracentrfugas, que solo se encuentran en los centros de investigacin ms importantes del pas. De hecho este proceso es realizado por especialistas. 4. Propiedades fsicas del virus. Son varias las propiedades que se han utilizado y entre las ms importantes se hallan: Punto de inactivacin trmica (PIT). Se refiere a la temperatura requerida para identificar virus en la savia cruda recin extrada del tejido infectado, con el auxilio de una solucin amortiguadora. Esta savia se coloca en tubos, que se colocan en bao Mara por perodos de exposicin de 10 minutos; se evalan temperaturas que varan de 30 a 1000 C. Los tubos se retiran de inmediato del agua caliente y se pasan a agua con hielo. Enseguida se inocula savia de cada tubo por separado en plantas indicadoras, que den origen a lesiones locales. El PIT ser aquella temperatura ms baja en la cual los sntomas ya no se produzcan despus de inocular las plantas indicadoras. Longevidad "in vitro". Se refiere al tiempo durante el cual el virus permanece infectivo en la savia cruda expuesta al ambiente de laboratorio (20-22C). Se extrae la savia y se en tubos de ensayo (como en el PIT) y se le agrega 0.01% de estreptomycina

64

(para evitar contaminacin bacteriana). Se extrae savia a los 1, 3, 6, 9, 12. 15, 30, 60, 90 y 150 das (segn sea necesario), que se usa para inocular a plantas diferenciales que den lesiones locales. La longevidad in vitro se determina considerando la ltima fecha de extraccin en la cual se obtiene an desarrollo de sntomas en las plantas inoculadas. Si por ejemplo se tuvieron sntomas a los 6 das, pero no a los 9, se repite el ensayo evaluando perodos intermedios entre 6 y nueve das. Punto final de dilucin (PFD). Es la ms alta dilucin de la savia en la cual el virus an es capaz de causar infeccin. Se maceran 10 g de tejido en solucin buffer y a partir de esta se inoculan plantas indicadoras que den reaccin local, con diluciones de 10-1 a 10-9 El punto final de dilucin ser aquel que corresponda a la ms alta dilucin en la que an fue posible reproducir sntomas en las indicadoras inoculadas. 5. Mecanismos de transmisin. Desde un principio debe intentarse la transmisin mecnica ya que este aspecto permite hacer diversos estudios y da una idea del posible grupo de virus al que pertenece el patgeno en estudio. Independientemente de que se transmita o no de manera mecnica el agente infeccioso, se debe probar la transmisin por insectos y de ser necesario, la posible transmisin por hongos, nemtodos y otros agentes sospechosos de actuar como vector. 6. Rango de hospedantes Se prueba la susceptibilidad de hospedantes de distintas especies pertenecientes a la misma familia y a otras distintas a las que pertenece el hospedante principal. En el caso de virus que se transmiten mecnicamente, el virus se inocula mediante frotis; si no se transmite de esta manera, se procede a evaluar la transmisin por insecto, o a

65

hacer transmisin por injerto. Esta fase del estudio requiere de un amplio conocimiento de la biologa de los vectores y de las tcnicas de cra, ya que se requiere tener colonias limpias de virus y de un manejo cuidadoso para evitar contaminaciones.

7. Serologa. Todas las tcnicas anteriores forman parte del protocolo formal para identificar virus desconocidos en una regin. Sin embargo, en los diagnsticos de rutina su uso es cada da menor, ya que otras tcnicas mas rpidas y eficaces, como la serologa presentan amplias ventajas (y algunas desventajas). La serologa constituye una de las herramientas ms importantes en estudios tales como: -Diagnsticos rpidos y precisos -Estudios epidemiolgicos -Relaciones entre virus y entre sus variantes 8. Bases de la serologa. La tcnica se fundamenta en el conocimiento que se tiene sobre la reaccin (produccin de anticuerpos) que ocurre en los animales de sangre caliente cuando son invadidos por un agente extrao (antgeno; en este caso el virus). Los antgenos son molculas o partculas constituidas por polisacridos y/o protenas de elevado peso molecular, ajenas al animal inoculado. De hecho un proceso similar ocurre diariamente en la naturaleza cuando los animales sealados se defienden del ataque de microorganismos potencialmente patgenos. En contraparte los anticuerpos son macromolculas producidas por el animal inoculado natural o

66

artificial mente. Las reacciones antgeno anticuerpo se caracterizan por ser relativamente especficas. As un antgeno "A" dar origen a un anticuerpo "A" y un antgeno "B" inducir la sntesis de un anticuerpo "B"; pero ni "A" dar origen a "B" y viceversa; tampoco "A" ni "B" producirn anticuerpos C, D...ni N. Los anticuerpos son protenas del tipo de las gamaglobulinas especficas. Los anticuerpos funcionan como un sistema de defensa especfica contra el antgeno que indujo su formacin. Partculas de nucleoprotenas, tales como los virus, funcionan como antgenos; en este caso, la cpside (cubierta de protena) determina el tipo de antgeno, (segn el arreglo de sus aminocidos) que ser producido. Este fenmeno que ocurre de manera natural tambin puede ser inducido inoculando animales con virus conocidos, con el fin de aprovechar los anticuerpos producidos en estudios de identificacin y diagnstico de virus. La produccin controlada de antisueros (anticuerpos presentes en SL suero sanguneo) se lleva al cabo en algunos centros de investigacin y en los ltimos aos constituye un prspero negocio de algunos laboratorios que se encargan de producir los a nivel comercial. Ejemplos de estas compaas internacionales son Agdia y Sanofi. 9. Produccin de antisueros. Aunque en si la produccin de antisueros no es una tara complicada, para lograr una alta calidad si se requiere de personal altamente capacitado. En trminos generales el proceso consiste en inocular plantas susceptibles con el virus especfico. Posteriormente el tejido infectado se macera y se somete a proceso de extraccin con solventes, agentes de precipitacin y otras substancias, auxilindose tambin con el uso de centrfugas y ultracentrfugas hasta obtener al virus con la mayor pureza posible. El virus purificado se inyecta mediante un programa calendarizado en algn animal de sangre caliente, tales como conejos de Nueva Zelanda, caballos, borregos u

67

otros. El virus tiene que combinarse con substancias coadyuvantes antes de inyectarse, para que el virus sea liberado lentamente y no cause un shock en el animal. Despus de cierto nmero de inyecciones y 5-10 das despus de la ltima, se puede hacer un sangrado previo para checar la concentracin de los anticuerpos en la sangre del animal. Una vez determinada la concentracin ptima, el animal se puede sangrar parcialmente o se sacrifica (aplicando antes un anticoagulante), tratando de obtener la mayor cantidad de sangre posible. Se deja la sangre en reposo y una vez que esta se coagula, se separa el suero que contendr los anticuerpos (antisuero), el cual se guarda congelado (-15 a - 25 C) en pequeas ampolletas cerradas hermticamente, previa incorporacin de un microbicida. Este antisuero esta listo para su uso, previa dilucin del mismo a las concentraciones adecuadas. 10. Reacciones serolgicas. Es posible aprovechar la capacidad de los anticuerpos para reconocer y

acoplarse con el antgeno especfico que indujo su formacin con fines de identificacin de virus. Es decir si tenemos una muestra de una planta infectada con un virus "X" desconocido, podemos utilizar nuestro banco de antisueros para tratar de identificar al patgeno en estudio. Si al hacer reaccionar por separado cada antisuero disponible, y entre nuestros antisueros est un antgeno "X", habr un reconocimiento y una reaccin entre antgeno "X" y los antisueros conteniendo al anticuerpo "X" , pero no con los antisueros "Y", o "Z"; estos ltimos daran reaccin positiva solo en el caso de que en la muestra hubiera los antgenos (virus) especficos correspondientes. Existen diversidad de tcnicas disponibles, cada una con ventajas y desventajas, entre las ms usuales: Doble Difusin en Agar, Latex, Elisa, Dot Blot, etc. La tcnica doble difusin ya se explic con anterioridad. Aqu se explicar solamente la tcnica ELlSA, la cual es la ms usada en la mayora de los laboratorios.

68

11. ELlSA. Las tcnicas serolgicas convencionales (aglutinacin, doble difusin en agar) tenan numerosos inconvenientes, tales como una baja sensibilidad, o el efecto de la forma la forma de la partcula, presencia de inhibidores de la reaccin presentes en la savia. Estas desventajas quedaron superadas con la tcnica ELlSA, la cual revolucion la serologa. Esta tcnica desarrollada inicialmente en patologa clnica e inmunologa, fue adaptada en 1976 para utilizarse en la deteccin de virus fitopatgenos. Desde entonces ha sido una de las tcnicas ms utilizadas, junto con las tcnicas moleculares como PCR, que fueron desarrolladas poster. El trmino ELlSA se deriva de "EnzymeLynked-I,mmuno-Sorbent-Assay" que puede traducirse como "Ensayo de inmunoabsorbencia con enzimas conjugadas". La ELlSA es ampliamente usada en investigacin por su alta sensibilidad y especificidad, por su carcter prctico y verstil en su metodologa, lo que permite trabajar gran cantidad de muestras con pequeas cantidades de tejido vegetal. Es posible detectar virus an en plantas con sntomas muy tenues o asintomticas y permite cuantificar concentraciones del virus. Tambin permite detectar virus en semillas e incluso en insectos vectores. Tambin se pueden detectar hongos y bacterias con ELlSA. El mtodo ELlSA consiste bsicamente de cuatro fases principales: 1. La adsorcin de un antisuero especfico a la pared de un pozo de plstico (fig. A). 2. Se agrega un extracto de la planta infestada. Las partculas virales se adhieren a los anticuerpos portadas en el antisuero, que previamente se adhiri a las paredes del pozo (fig. B). 3. De nuevo se agrega el antisuero usado inicialmente, pero conjugado previamente con una enzima (por ejemplo la fosfatasa alcalina). Este conjugado se adhiere al virus (fig. C), de tal forma que este queda atrapado

69

entre el conjugado y el anticuerpo agregado inicialmente (se forma un "sandwich" con el virus en medio). 4. Se agrega un substrato sobre la cual pueda actuar la enzima conjugada (Fig. D). Al combinarse la enzima con el substrato se registra un cambio de coloracin a simple vista, cuya intensidad ser proporcional a la concentracin. Cabe sealar que entre cada paso el pozo se lava con una solucin especial que contiene detergente y se desecha el lavado, de tal manera que si la muestra de savia no tena al virus correspondiente al antisuero utilizado, en el primer lavado (despus del punto 1) los anticuerpos no atraparn ninguna partcula viral (dada su especificidad). Si esto ocurre el conjugado (enzima-anticuerpo) tampoco se pegar y ser eliminado por el segundo lavado. Despus al agregar el substrato, este no ser afectado porque la enzima ya fue eliminada. En consecuencia no habr cambio de coloracin. Esta tcnica descrita es la que se usa con mayor frecuencia y se conoce como "ELlSA Sandwich doble anticuerpo". Existen variantes de ELlSA, que se usan en situaciones especiales. Es claro que la tcnica es fcil de llevar al cabo, pero para que su utilizacin sea confiable se requiere de experiencia, ya que pequeos detalles a veces son la diferencia entre un diagnstico adecuado y uno errtico. La tcnica se facilita con el uso de equipo apropiado y en algunos laboratorios bien equipados el procedimiento es semiautomtico. Las placas con los pozos se pueden "leer" en un espectrofotmetro especial, para cuantificar la concentracin del virus. Un aspecto muy importante es la cantidad de antisueros que se tengan disponibles y la calidad de los mismos. Algunas compaas como Agdia y Sanofi son proveedores de equipo, reactivos y antisueros de alta calidad. Cabe mencionar que desde la dcada pasada inici el desarrollo de las tcnicas moleculares, las cuales hoy en da han alcanzado un alto desarrollo y su avance es vertiginoso. Tcnicas como la de Reaccin de la Polimerasa en Cadena (Polymerase Chain Reaction = PCR), tienen una sensibilidad mucho mayor que ELlSA, de tal

70

manera que muestras registradas como sanas mediante EllSA (porque el virus est poco concentrado) en realidad si estn infectadas. Estas nuevas tcnicas tienen una gran importancia en la deteccin de virus en frutales, semillas, etc. Su utilidad prctica es grande en diversos casos: por ejemplo en la certificacin de sanidad de semilla, material propagativo, etc. Tcnicas moleculares. En este caso se usan tcnicas mas sofisticadas, que requieren de equipo especial, que por su alto costo solo se tiene en aquellos laboratorios mas avanzados en la investigacin en virolgica. Las tcnicas moleculares incluyen diversos aspectos del anlisis bioqumico de los virus, entre ellas el anlisis del genoma vira!. Ejemplos de estas son la Reaccin de la Polimerasa en Cadena tambin llamada PCR, o la Hibridacin de cidos Nuclicos. Se caracterizan porque son muy sensibles y ms precisas que otras tcnicas. Regularmente estas pruebas se ejecutan, en casos especiales de diagnstico o con fines ms especficos. Sin embargo, en la medida que los reactivos y el equipo utilizado sea mas barato y cuando exista personas mas capacitado, estas tcnicas aparentemente se volvern tan rutinarias como ELISA. 7. Nomenclatura y clasificacin 7. 1. Nomenclatura. A travs del tiempo se han seguido varios sistemas de nomenclatura de virus incluyendo el uso de sistemas binomiales, el cual se encuentra solamente en la literatura antigua. Actualmente el nombre particular de cada virus se adopta en base a los sntomas los mas caractersticos de la enfermedad (a juicio del descubridor del patgeno), en hospedante en el que se observ por vez primera al virus. As por ejemplo, el Virus Mosaico del Pepino lleva este nombre porque fue descubierto en pepino y uno de los sntomas principales es el mosaico.

71

En virologa es comn el uso de siglas para designar de manera abreviada a los virus, lo cual resulta prctico. As se utiliza VMP para el Virus Mosaico del Pepino, VMT para el Virus Mosaico del Tabaco o VMAT para el Virus Mancha Anular del Tabaco. Es necesario aclarar que estas abreviaturas se usan de manera uniforme por la mayora de los investigadores, con el fin de facilitar la comunicacin oral o escrita. Es pertinente sealar que en el idioma ingls tambin se usan abreviaturas, aunque estas no sean las mismas que en espaol; en lugar del VMP se usa CMV(Cucumber Mosaic Virus) y en lugar del VMT la abreviatura es TMV (Tobaco Mosaic Virus). En esta poca de globalizacin es muy comn el uso de las siglas en ingls para referirse a los virus y algunos investigadores latinos hasta se olvidaron de las siglas en espaol, para referirse a talo cual virus; por ejemplo todo mundo habla de TSWV (Tomato Spotted Wilt Virus), en lugar de VMMT para referirse al Virus de la Marchitez Manchada del Tomate. Este fenmeno no es deseable desde el punto de vista idiomtico o nacionalista, pero que a veces facilita la comunicacin. Resulta evidente que el sistema de nomenclatura en uso resulta inapropiado, ya que los sntomas pueden variar incluso en el mismo hospedante y con el mismo virus. Los sntomas tambin pueden ser diferentes de acuerdo a la variante del virus y por el efecto del ambiente. Sin embargo el uso del sistema binmial, tan til en hongos y bacterias, no es aceptado por los virlogos, entre otras razones porque no se acepta que los virus son seres vivos, en sentido estricto. A finales de los aos 60 algunos virologo desarrollaron, adems del nombre comn, un sistema de criptogramas que no es muy utilizado por los fitopatlogos en la prctica. Con fines ilustrativos a continuacin se anota el criptograma especfico que corresponde al VMT: R/1: 2/5: E/E: S/O En el criptograma anterior el significado de cada componente es: R/1= La R significa que el virus est compuesto por ARM; el nmero 1 indica que la cadena del ARN es de una sola banda.

72

2/5= El 2 representa el peso molecular del cido nucleico, expresado en millones. El 5 representa la proporcin (%) de ARN que posee la partcula. E/E= Se representa aqu la forma de la partcula que recubre al ARN (envoltura / elohagada o varilla). S/O= Describe el tipo de hospedante (en este caso plantas de semilla o angiosperma). El 0 (cero) indica el tipo de vector que en este caso no existe). 7.2. Clasificacin. Hasta 1985 (Walkey, 1985) los virus de las plantas se hallaban clasificados en 27 grupos de los cuales se estructuraron en base a las propiedades fsicas, qumicas y biolgicas; es decir segn la forma de la partcula, tipo de cido nucleico (ARN o ADN), nmero de cadenas o bandas de cido (1 o 2 bandas) en las partculas de cada virus, as como el mecanismo de transmisin conocido. Caractersticas principales de los grupos de virus fitopatgenos.
Transmisin Tamao de partcula Grupo ARN 1 Cadena 1. Polidricos Luteovirus Enanismo clortico Maz Sobemovirus Necrosis del Tabaco Tombushvirus Tymovirus Comovirus Dianthovirus Nepovirus Mosaico Ena. Chicharo Mosaico de la Alfalfa Bromovirus Cucumovirus Llarvirus Rango de hospedantes

Semilla

Mecnica

Vector

25 30 28 26-28 30 28-30 24 31-34 28 30 18-58x28 26 28 26-35

A,E E E A A E E A E A E A A +

+ + + + + + + + + + + +

A p CH sp Co Ho Co Co p Ne A p A np Co, Ne A np T

+ + + +

73

Moteado Velvet 30 del Tabaco 2. Varillas 180-215 y 16114x22 Tobravirus 300x18 Tobamovirus 100-150x13 Potexvirus 470-580x13 Carlabirus 620-7200x13 Potyvirus 680-900x11 Closterovirus 600-2000x10 3. Envueltos Rhadovirus 160-380x5095 Tospovirusa 85 ARN 2 cadenas Phytoreovirus 70 (polidricos) Fijivirus 70 (polidricos) ADN 1 cadena Geminivirus 18-20 (polidricos) ADN 2 cadenas Caulimovirus 50 (polidricos)

E + A A E E, A E A, E A A + + +

Co

+ + + + +

Ne, Co A- np A- np A- sp A p, Ch p T p Ch p Ch p Ch p Ch p, Mbp A np

+ -

E A, E E -

*Cuadro elaborado en base a informacin de Wakley, 1985. Rango amplio (A) o estrecho (E) de hospedantes. Vectores: A= afidos, Ch = Chicharras, Co = Colepteros, Ho = hongos, Mb = Mosca Blanca, Ne = Nemtodos, T = Trips. Tipo de transmisin: p = persistente, np = no persistente, y sp = semipersistente. *Los Rhabdovirus son de forma baliforme y los tospovirus de forma polidrica; ambos estn recubiertos por una capa de lpidos * Espacios en blanco significa que no se tuvo informacin disponible. *Geminivirus estn compuestos por dos partculas unidas. Cuadro. Algunos ejemplos de virus importantes en Mxico.
Grupo Luteovirus Nepovirus Sobemovirus Mosaico de la alfalfa Cucumovirus Tobamovirus Potexvirus Potyvirus Closterovirus Tospovirus Geminivirus Virus Enrollamiento de la Hoja de la Papa Mancha Anular del Tabaco Mosaico Sureo del Frijol Mosaico de la Alfalfa Mosaico del Pepino Mosaico del Tabaco, Mosaico del Tomate X de la papa Y de la papa, Mosaico Comn del Frijol, Mancha anular de la Papaya, Mosaico de la Sanda, Jaspeado del Tabaco Tristeza de los Ctricos Marchitez Manchada del Tomate Chino del Tomate, Mosaico dorado del Frjol, Enrrollamiento de

74

la Hoja de la Calabaza.

Unidad 5 CONTROL DE ENFERMEDADES VIRALES Desde el punto de vista prctico el principal objetivob de la virologa es obtener control de las enfermedades causadas por estos agentes. Para lograr lo anterior es necesario: a) La identificacin de los agentes involucrados b) Tener conocimientos bsicos sobre la epidemiologa del patgeno: fuentes de inculo primario y secundario, transmisin mecnica, y por semilla, vectores y tipo de transmisin, etc. A diferencia de hongos y bacterias, los virus no pueden ser controlados con substancias qumicas especficas. Una vez que el virus ha infectado a una planta resulta sumamente difcil su eliminacin. Sin embargo existen diversas medidas preventivas que permiten evitar disminuir la incidencia de plantas enfermas. Generalmente se requiere de mas de una medida de control, que aplicada de manera integrada con otras prcticas, permiten lograr un manejo de la enfermedad. Entre las medidas ms importantes se hallan: 1. Eliminacin o evasin de fuentes de inculo. El inculo (partculas de virus) se puede hallar en diversos lugares (fuentes de inculo), tales como plantas de maleza o de cultivo, semillas y en insectos vectores. El virus puede estar activo o latente. La fuente de inculo primario se refiere a aquellos lugares u organismos en los que se albergan los virus que causan las primeras infecciones de la temporada en el cultivo. Las plantas infectadas con el inculo primario multiplican al virus y as se constituyen en fuentes de inculo secundario. La eliminacin del inculo primario se puede lograr mediante:

75

1.1 Eliminacin de hospedantes alternativos. La mayora de los virus atacan a otros hospedantes distintos al principal, tales como maleza o plantas silvestres que desarrollan dentro o fuera del terreno de cultivo. Estos pueden actuar como reservreos de inculo y entre, mas cerca se hallen, la influencia puede ser mayor del cultivo. la dispersin del virus de estas fuentes de inculo se da principalmente mediante insectos vectores. Por lo anterior la eliminacin de maleza dentro y por las orillas del lote, as como en drenes o canales cercanos deber hacerse varios das antes de establecer el cultivo. Con este fin se pueden usar herbicidas o medios mecnicos y manuales. 1.2.Saneamiento. Comprende el arranque o destruccin en su sirio, de las primeras plantas que resulten infectadas. Es una prctica til en las primeras etapas de desarrollo del cultivo y/o de las epidemias; es decir cuando existan pocas plantas enfermas. Es importante que antes de hacer el saneamiento se efecte una aplicacin fuerte (de productos de accin rpida) contra los insectos, ya que si no se hace, los insectos presentes en las plantas enfermas volarn a las sanas, aumentando la gravedad del problema. El saneamiento tambin debe incluir a las plantas mostrencas (voluntarias) que crecen fuera del ciclo de cultivo. En ocasiones resulta difcil confirmar visualmente (en base a sntomas) la ausencia de virus en una planta, ya que los sntomas podran estar enmascarados. Este factor es de especial inters en rboles frutales, ya que la deteccin oportuna de plantas enfermas asintomticas permitira su erradicacin oportuna y/o al menos evitar su uso de los materiales a usa en propagacin se puede hacer uso de las tcnicas serolgicas como ELISA o de mtodos moleculares como la Reaccin de la Polimerasa en Cadena (PCR).

76

1.3. Evitar traslape de cultivos. Se pretende romper el ciclo; es decir, evitar la continuidad de la enfermedad en el espacio y en el tiempo. Este principio se puede aplicar evitando siembras secuenciadas de especies de ciclo corto en el mismo terreno. Por ejemplo, es comn que en suelos con acolchado se arranquen plantas viejas de calabaza (a veces con incidencias superiores a 50% de virsis) y se siembra de nuevo sin arar el terreno. Al destruir las plantas viejas, los insectos se albergan en el suelo, en maleza o en cultivos vecinos. Una vez establecido el nuevo cultivo, epidemia desarrolla en forma temprana a partir de abundantes fuentes de inculo primario. 1.4. Seleccin del sitio de siembra. Se debe evitar el establecimiento de cultivos nuevos en lotes cercanos o colindantes a plantaciones viejas. Los vectores prefieren generalmente las plantas nuevas, por lo que tienden a emigrar de los plantos en senescencia. Se debe rastrear dichos lotes abandonados antes d establecer un nuevo cultivo, e inclusive de debe valorar una posible aplicacin previa de insecticidas "fuertes" antes del rastreo, sobre todo se va a establecer una plantacin de la misma especie a la del lote abandonado de vecinos. La seleccin del sitio de siembra es tambin de gran importancia en la produccin de semilla certificada, ya que se debe evitar esta prctica en valles altamente contaminados con virus. Por ejemplo la semilla de papa es producida por algunos productores en regiones aisladas de Chihuahua y Jalisco, con xito relativo. 1.5. Higiene del cultivo. Para evitar la introduccin y dispersin del inculo a un lote o invernadero, se pueden tomar diversa medidas tales como evitar el manipuleo excesivo de las plntulas por los obreros, evitar en lo posible entrada de fumadores en los

77

invernaderos de tomate y chile. Tambin se recomienda la desinfeccin de herramientas y de las manos de los obreros, con la idea de prevenir la dispersin de virus como el VMT, de manera mecnica. Entre los productores de sanda es muy comn el acomodo de guas, y el descole. Se ha demostrado que estas prcticas incrementan significativamente la dispersin mecnica de virus. Se recomienda la desinfeccin de manos y herramientas con agua con cloro. Una situacin similar se da en los cultivos de tomate bajo estacado, ya que los desbrotes o las podas, conllevan a la transmisin de virus y bacterias. Conviene valorar este factor de riesgo antes de iniciar esta prctica y hacer lo posible por disminuir al mximo el problema mediante la desinfeccin de herramientas (cuchillas y tijeras). 1.6. Seleccin de la poca de siembra. Este factor esta muy ligado a la fluctuacin poblacional de vectores en cualquier regin. El conocimiento del comportamiento de las poblaciones de vectores ms importante permite tomar algunas decisiones tendientes a disminuir los riesgos de epidemias devastadoras. As es posible escoger la poca de siembra ms favorable o al menos estar prevenido si se escoge una poca ms riesgosa. Por ejemplo, aunque el tomate se puede establecer en el Valle del Fuerte, a partir de septiembre, las compaas que siembran tomate para uso industrial, prefieren sembrar hasta en noviembre con la idea de evadir en lo posible las poblaciones de mosca blanca (como plaga y como vectores de geminivirus) y de trips (nicos vectores del Virus de la Marchitez Manchada del Tomate). Los productores que siembran muy temprano tienen el riesgo de prdidas totales por lo que tienen que gastar mas en insecticidas y a veces estas son infructuosas. 1.7. Uso de semilla sana.

78

En algunas enfermedades virales, e uso de semilla sana es uno de los aspectos ms importantes, sobre todo cuando no existen otras fuentes importantes de inculo primario. Un ejemplo comn es el del Virus del Mosaico Comn del Frijol (VMCF). Aunque el VMCF puede albergarse en algunas leguminosas silvestres, la transmisin por semilla llega a ser la fuente de inculo ms importante. Otro ejemplo ilustrativo es el del Virus Mosaico de la Lechuga, ya que en California se determin que mediante el uso de semilla sana se pueden incrementar los rendimientos hasta en 30%. El uso de semilla vegetativa libre de virus es de especial inters en papa (tubrculos) y en ornamentales (esquejes, bulbos). 1.8. rboles de vivero sanos. La sanidad de los arboles de vivero no solamente debe de efectuarse en base a la apariencia libre de sntomas de la planta. En cultivos como ctricos es conveniente analizar la sanidad de las plantas de vivero antes de su establecimiento en el campo. Esto se puede hacer mediante ELlSA o PCR. 2. Control qumico de vectores. Se han obtenido resultados satisfactorios en el control de vectores areos transmisores de virus en la forma persistente, tales como los transmitidos por mosca blanca, chicharritas y trips. En estos casos los insecticidas matan al insecto 27 antes de que logre transmitir al virus. Recurdese que en estos casos tanto el perodo de adquisicin como el de inoculacin es relativamente lento y que adems se requiere de un perodo de incubacin en el vector, de tal manera que la muerte del insecto en alguna de estas fases, rompe la transmisin. Sin embargo cuando las poblaciones de estos insectos son demasiado altas y las fuentes de inculo muy abundantes, el control de estas virosis no es eficiente, an con los insecticidas ms potentes. Este fenmeno se puede ilustrar en varias regiones de Mxico con el problema de la mosca blanca, insecto que adquiri resistencia a prcticamente todos los insecticidas comnmente

79

empleados. Por lo anterior el uso de nuevos productos eficientes contra mosca blanca, (como el Confidor), deber ser muy cuidadoso. En contraste, el uso de insecticidas contra virus transmitidos de manera no persistente ha tenido resultados errticos e infructuosos, sobre todo cuando se quiere depender de este nico mtodo para abatir las virsis. En el caso de la mayora de los virus transmitidos por fidos, tanto la adquisicin como la inoculacin del virus se pueden efectuar en cuestin de segundos y no se requiere de un perodo de incubacin. El uso de insecticidas (an los mas fulminantes) no maten al insecto de inmediato; La excitacin nerviosa inducida por el txico altera su comportamiento, tornndose temporalmente ms activos de tal forma que tienden a hacer mas "piquetes de prueba". En consecuencia el nmero de plantas visitadas puede aumentar y la incidencia se llega a incrementar substancialmente. A lo anterior hay que agregar que muchas de las especies de fidos tambin han desarrollado resistencia a numerosos insecticidas. En cultivos de bajo valor econmico no puede ni pensarse en este mtodo. En pases como Inglaterra, se cuenta con sistemas de pronstico de enfermedades virales, mediante un esquema de manejo integrado, en cultivos de remolacha, cebada y papa. El control de vectores es tcnicamente posible mediante la aplicacin de insecticidas granulados de lenta liberacin. Tal es el caso del Tmik. El control de virus transmitidos por nemtodos y hongos es tambin factible mediante la oportuna aplicacin de nematicidas o fungicidas. Sin embargo en Mxico no existe experiencia con estos patosistemas, que solamente ocurre en ciertos cultivos y en condiciones muy especficas, segn se ha reportado en otros pases. 3. Control Fsico. 3.1. Barreras biolgicas. Consisten generalmente del establecimiento de hileras de plantas no susceptibles en las orillas o alrededor de las plantaciones, buscando romper el mecanismo de

80

transmisin, sobre todo en el caso de virus no persistentes. Se pretende que el fido visite las plantas de la barrera antes de alimentarse de las plantas cultivables. Se seala que los fidos tienen la costumbre de picar cualquier especie sobre la que aterricen, con el fin de probar (tientas) una posible fuente de alimento. Se supone que en estos ensayos de alimentacin el estilete presuntamente contaminado con partculas virales, es limpiado al efectuar estos piquetes, posteriormente al emigrar el insecto al cultivo, ya va libre de virus no persistentes. En la regin se usan principalmente barreras de maz o de zacate Sudn, alrededor de lotes de hortalizas. Estas barreras se deben establecer con suficiente anticipacin para que lograr una mayor efectividad. Existe la opcin de aplicar insecticidas residuales en las plantas de la barrera, para que los vectores mueran ah. La eficiencia de esta tcnica es limitada bajo una alta presin de vectores. En Veracruz se han evaluado las barreras de plantas de jamaica para limpiar estiletes de fidos, en un intento de controlar al Virus de la Mancha Anular de la Papaya, con xito limitado. 3.2. Superficies reflejantes. Algunos materiales que reflejan la luz solar se han usado tambin para ahuyentar insectos vectores. Por ejemplo se ha observado que los plsticos (usados en acolchado) de color gris o plateado son repelentes de trips y de fidos. Se obtiene proteccin durante las primeras etapas del cultivo, pero una vez que el follaje cubre la cama, la capacidad reflejante disminuye considerablemente. Algunos productores usan tambin tiras de papel aluminio con este propsito; en este caso las tiras se cuelgan de las estacas de las espalderas. 3.3. Franjas amarillas. En la regin se generaliz el uso de pancartas, botes y franjas de plstico de color amarillo; especialmente estas ltimas. En estas se atrapan altas cantidades de

81

insectos vectores ya que este color atrae a diversos insectos, especialmente fidos y moscas blancas, que quedan atrapados en el pegamento depositado previamente sobre estas trampas. Una variante es el uso de franjas de color azul, el cual es preferido por los trips. 3.4. Cubiertas de plstico. Incluye el uso de lminas de polietileno transparente con perforaciones ("plsticos multiperforados") y el agribn. En esta regin se utilizan generalmente en tomate, y cucurbitceas. La idea es evitar el acceso de los insectos a las plantas en etapas tempranas de desarrollo, por lo que estas lminas de deben de colocar antes de la emergencia o inmediatamente despus del trasplante. Las cubiertas se retiran generalmente 30-45 das despus, con el fin de que la planta complete su desarrollo normalmente. 3.5. Aceites. El uso de derivados del petrleo para el control de virosis transmitidas por fidos o mosca blanca, fue comn en aos pasados. Se pretende que la fina pelcula de aceite depositada sobre el follaje sirva como "filtro limpiador" del estilete contaminado por el virus. En otras palabras, cuando un fido se alimenta de una planta enferma las partculas virales son atrapadas por el aceite al extraer el estilete; o cuando un fido con el estilete contaminado llaga a alimentarse de una planta sana tratada, el virus es desprendido por el aceite, antes de que el estilete ingrese en el tejido sano. La eficiencia de esta tcnica ha sido de moderada a baja, ya que se requiere de una buena cobertura de la superficie de la planta, lo cual no es siempre fcil de lograr con los equipos convencionales de aspersin. Se reporta que en Israel se ha logrado una buena eficiencia mediante el uso de aceites aplicados a alta presin. Otro inconveniente es el riesgo potencial de fitotoxicidad de los aceites.

82

3.6. Termoterapia. El material vegetativo (generalmente en estado de reposo; semillas, bulbos ,esquejes, tubrculos) se puede tratar con aire o agua caliente, siendo mas comn esto ltimo. Para lograr el xito es necesario conocer la susceptibilidad del virus al calor, as como la de la planta u rgano a tratar. Generalmente se usa en material vegetativo de alto valor econmico o biolgico. La termoterapia se puede utilizar en combinacin con tcnicas de cultivo de tejidos. Entre los virus ms fciles de eliminar se encuentran los Virus X, Y y del enrollamiento de la Papa; por el contrario uno de los ms difciles es el VMT que es termoestable an a 900 C. 4. Proteccin cruzada. Este mtodo de control se basa en un principio anlogo al de inmunizacin de animales de sangre caliente mediante el uso de vacunas. Las plantas de inters se inoculan deliberadamente con cepas .dbiles o atenuadas artificialmente, antes de que estas resulten infectadas por el patgeno en el campo. Se pretende estimular los mecanismos de defensa de la plantas (proceso anlogo a la induccin de anticuerpos en humanos) de tal forma que al llegar el patgeno silvestre se encuentra con los posibles sitios de infeccin ocupados. Esta tcnica se utiliz en los aos 70, contra el VMT en tomate. Cepas silvestres del virus se trataron con cido nitroso para obtener mutantes debilitados, que posteriormente se inoculaban en tomate. Con esta tcnica se logr incrementar la produccin en 15% en algunos invernaderos de Europa. Ya no se utiliz esta tcnica, una vez que se obtuvieron variedades resistentes al VMT.

83

En Brasil tambin se obtuvieron buenos resultados con esta tcnica, pero contra el Virus Tristeza de los Ctricos. En Hawaii se utiliza exitosamente la proteccin cruzada contra el Virus de la Mancha Anular de la Papaya. Desafortunadamente, en Mxico se evaluaron algunas de estas cepas debilitadas procedentes de EUA, pero no se obtuvo control de la virosis del papayo. La proteccin cruzada es un mtodo riesgoso, ya que a partir de las cepas virales alteradas se pueden originar nuevas variantes an ms agresivos que el virus silvestre. Es una opcin conveniente en ausencia de otros mtodos de control. 5. Resistencia gentica. 5.1. Conceptos y principios generales. El control gentico consiste en la utilizacin de variedades resistentes o tolerantes a virus. Este mtodo se basa en el hecho de que en cualquier poblacin de plantas existe variabilidad gentica; es decir que en el caso particular de un determinado virus una especie de plantas puede tener variedades o clones que son resistentes o inmunes al patgeno; igualmente habr individuos altamente susceptibles o medianamente susceptibles. Susceptibilidad. Una planta susceptible es aquella que permite fcilmente la infeccin y la multiplicacin del virus. Es lo opuesto a resistente. Alta susceptibilidad y baja resistencia son sinnimos. Inmunidad. Son plantas que no llegan a ser infectadas. Se consideran aqu a las plantas que no son hospedantes de determinado virus. De hecho la mayora de las plantas son inmunes a la mayora de los virus. La inmunidad es la regla, la susceptibilidad es la excepcin. Resistencia. Es aquella que es capaz de retardar o suprimir la multiplicacin de un virus, o de retardar el desarrollo de los sntomas de la enfermedad. Es lo opuesto a susceptible. Se han reconocido varios tipos de mecanismos de resistencia a virus, que pueden agruparse en: a) resistencia a la infeccin; b)

84

resistencia a la multiplicacin; c) resistencia al movimiento del virus en la planta. En el caso de la resistencia a la infeccin se ignoran muchas cosas, pero se puede deber a diversos factores. Algunos de ellos es la presencia de cutcula gruesa y setas o pilosidad abundante que interfiera con la alimentacin de los vectores. Algunos materiales resistentes limitan la multiplicacin de virus a pesar de ser infectados, tal y como ocurre en algunos cultivares de tabaco con VMT o de pepino con VMP. Resulta obvio suponer que algunas substancias de las plantas tienen propiedades inhibidoras de la multiplicacin. En cambio algunos materiales resistentes al Virus Y de la Papa, el movimiento del virus se retarda significativamente, lo cual posiblemente se deba a la accin de ciertas protenas involucradas en la translocacin de virus. Tolerancia. La planta es susceptible al virus, pero los sntomas desarrollan lentamente o son moderados. La concentracin del virus y su movimiento en la planta es similar al de las plantas susceptibles. Tolerancia no es sinnimo de resistencia. Hipersensibilidad. Es un caso extremo de alta resistencia. Una vez que el virus se introduce a la planta, el tejido inoculado muere y el virus generalmente no se dispersa en la planta. El resultado puede ser una lesin local necrtica o la muerte completa por un shock de la planta. En el primer caso se puede usar este mecanismo para obtener variedades resistentes. 5. 2. Tipos de resistencia. Resistencia vertical. Tipo de resistencia que se debe generalmente a uno o pocos pares de genes. Tiene la desventaja de que con frecuencia la resistencia es rota por alguna nueva variante del virus. La ventaja es que este tipo de resistencia es ms fcil de incorporar en las plantas y de manejar durante el proceso de mejoramiento. El nivel de

85

resistencia puede ser del 100% Y el ambiente no determina generalmente a este tipo de resistencia. Tambin se le denomina resistencia monognica.

Resistencia horizontal. Es controlada generalmente por muchos pares de genes que trabajan de manera coordinada. La ventaja es que esta resistencia es ms estable, ya que no es generalmente afectada por las variantes. Es ms difcil de incorporar y de manejar durante el proceso de obtencin de variedades. El nivel de resistencia es variable y puede ser afectado por las condiciones ambientales. 5. 3. Fuentes de resistencia. La primer gran tara en cualquier programa de mejoramiento clsico es identificar germoplasma que posea un alto nivel de resistencia al patgeno. A veces este factor se encuentra en variedades comerciales en uso ya usadas con anterioridad. Esta resistencia tambin se puede aprovechar para integrarla a un material que tiene resistencia a otros patgenos. Cuando la resistencia es conferida por un par de genes el proceso se hace ms simple. A veces hay que probar muchas variedades conocidas y lneas en desarrollo para poder detectar alguna resistencia. Con frecuencia los materiales resistentes no presentan buenas caractersticas agronmicas y hay necesidad de cruzarlos con materiales susceptibles que si los posean, para poder obtener la variedad deseada. Lo ms deseable es contar con genotipos resistentes con diferentes caractersticas agronmicas aceptables, que se ajusten a las necesidades de los productores. A veces sucede que en una variedad susceptible de buenas caractersticas agronmicas se detectan una o pocas plantas que pueden seleccionarse o mejorarse para lograr un material resistente. Puede suceder que no se detecta resistencia en

86

ninguna variedad comercial y entonces se tienen que buscar fuentes de resistencia en materiales silvestres de la misma especie o de especies del mismo gnero. El proceso de obtencin de variedades resistentes no es fcil. Es una tara laboriosa que requiere de una alta preparacin terica y prctica. La cruza de materiales silvestres con cultivados puede dar origen individuos no frtiles, pero con el auxilio de tcnicas de cultivo de tejidos se pueden lograr resultados satisfactorios. Mediante procedimientos de biologa molecular de pueden extraer genes de una especie resistente e insertarse en otra especie, lo que en condiciones normales sera imposible, por la incompatibilidad entre especies. Este tipo de tcnicas empieza a utilizarse con xito, pero an se sabe poco de los riesgos de estas plantas transgnicas. Una vez obtenida la variedad resistente puede suceder que presente caractersticas agronmicas indeseables, por lo que es necesario hacer retrocruzas para incorporar los factores deseados. Siempre es deseable incorporar resistencia a otros patgenos importantes, ya que una variedad resistente a determinado virus puede ser de poco valor si es susceptible a otro virus o patgeno importante. El control de patgenos y plagas mediante variedades resistentes tiene la ventaja de que es l ms econmico, contribuye a disminuir la contaminacin y es fcil de utilizar. El desarrollo de variedades resistentes es an ms importante cuando no existen otros mtodos eficientes y econmicos de control. Entre los inconvenientes se mencionan el largo tiempo requerido para desarrollar las variedades resistentes, mismas que adems debern poseer caractersticas agronmicas aceptables, caracterstica que resulta especialmente importante en el caso de productos hortcolas. Para obtener una variedad resistente mediante los mtodos tradicionales se puede tardar 8 o ms aos, tiempo que se puede acortar notablemente mediante el uso de los nuevos mtodos de mejoramiento, en los que se hace uso de la biologa molecular y del cultivo de tejidos. El costo de las variedades resistentes es alto durante el proceso de obtencin, pero en el caso de productos de grano bsico, es siempre la mejor opcin, pues resulta antieconmico el uso de otros mtodos.

87

5. 4. Variacin patognica de los virus. Sin embargo el principal inconveniente de este mtodo, es que con frecuencia la resistencia de las variedades es "rota" por el desarrollo de cepas llamadas variantes del virus, que llegan a afectar severamente a genotipos de plantas que normalmente no eran atacadas por las variantes comunes conocidas. Esto se debe a que as como entre las plantas existe variabilidad gentica, en los virus tambin ocurre, ya que pequeos cambios en las cadenas de cido nucleico pueden bastar para que surja una nueva variante que sea capaz de vencer la resistencia de las variedades. La existencia de variantes virales complica el proceso de mejoramiento y la durabilidad misma de la resistencia. Puede suceder que la resistencia a un virus en una regin es rota en un tiempo ms corto que el requerido para desarrollar la propia variedad. Una variedad resistente en una regin puede no serio en otras en las que se presentes diferentes variantes del mismo virus (en variedades con resistencia vertical) o en donde las condiciones ambientales sean distintas (en variedades con resistencia horizontal). Una de las grandes desventajas de la agricultura moderna ha sido que en muchos casos los programas de mejoramiento gentico se enfocaron a la obtencin de variedades de alto rendimiento y calidad alimenticia o de aspecto agradable al consumidor. Esto provoc el descuido en lo relativo a la resistencia a plagas y patgenos, ya que la mayora de estos genotipos rendidores o de alta calidad comercial, con frecuencia son demasiado susceptibles a diversos patgenos. En cursos posteriores se profundizar ms sobre este tema.

88