Instituto de Cincias Biomdicas Abel Salazar Laboratrio de Biofsica Bioqumica Licenciatura em Bioqumica Ano Lectivo 2012/2013

Laboratrio de Biofsica/Bioqumica 2 ano da Licenciatura em Bioqumica, S2-2012-13 Fraccionamento Celular estuda da sedimentao em centrfuga preparativa Relatrio
Turma: 2 Grupo: Catarina Cruz Vaz Filipa Glucia Rodrigues Lemos Micaela Faria Freitas

1- Para cada um dos fraccionamentos efectuados, preencha a tabela seguinte relativa actividade especfica da gliceraldedo-3-fosfato desidrogenase no homogeneizado e nas diferentes fraces sub-celulares. (Modo de clculo em anexo). Actividade especfica/M.min-1 Fracc. II Fracc. III 180 86,7 10 79 16 86 66,6

F0 F1 F2 F3

Fracc. I 116,4 51,6 21,2 74,8

2- Para o Fraccionamento I calcule a actividade especfica relativa da enzima nas diferentes fraces sub-celulares. (Modo de clculo em anexo). Fraco F0 F1 F2 F3 Actividade Especfica Relativa 1,11 0,46 1,37

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3- Interprete
Atravs da anlise dos resultados obtidos podemos verificar que o somatrio da actividade especfica de F1, F2 e F3 no igual ao valor encontrado para a actividade especfica de F0, contudo so valores relativamente prximos (I F1+F2+F3=148 e F0=116; II F1+F2+F3=175 e F0=180; III F1+F2+F3=83 e F0=87), tendo em considerao a dificuldade em conseguir bons resultados num experimento desta categoria. A dificuldade deste tipo de procedimentos reside no facto das amostras com que se trabalha ao longo da experincia serem homogeneizados, podendo aquando da sua recolha, que uma fraco contenha mais tecido que em outra, da a necessidade de se fazer em duplicado e mesmo assim haverem diferenas significativas nos valores encontrados para a mesma fraco (fraco submetida ao mesmo fraccionamento). Esta pequena diferena tambm pode ser devida a erros experimentais, nomeadamente o facto de existir um intervalo de tempo curto entre a adio da amostra na cuvete, a leitura da absorvncia e a anotao da absorvncia ao longo do tempo no ser mecanizada mas sim manual. Nesta experincia, partiu-se de um homogeneizado inicial (F0), e a partir do fraccionamento desta obteve-se a fraco nuclear (F1), a fraco mitocondrial (F2) e a fraco ps-mitocondrial (F3). Para avaliar os fraccionamentos foram feitos estudos enzimticos para a gliceraldedo-3-fosfato desidrogenase, que se encontra no citosol. Seguidamente passamos anlise dos resultados obtidos para a actividade especfica relativa. No fraccionamento II as sedimentaes foram feitas a 8000 rpm em vez das 12000 rpm realizadas no fraccionamento I. Observando os resultados de actividade especfica relativa obtidos para estes dois fraccionamentos as principais diferenas esto no F1 e F0, o que indica que a mudana na velocidade de centrifugao teve grande influncia na distribuio da enzima por estas duas fraces. Quanto ao F3 aproximadamente igual nos dois fraccionamentos (I-1,37 e II-1,02). Se tivermos em considerao a percentagem de actividade obtida para estas fraces, no fraccionamento I e II, podemos verificar que no I a percentagem maior no F1 e no II
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maior no F2. Quanto ao F3, a percentagem aproximadamente a mesma (I-50,7 e II49,1). Tendo em considerao o fraccionamento III, no qual no se efectuou a primeira centrifugao, s se tendo obtido portanto a fraco F2 e F3, pode-se observar que a maior percentagem de actividade se encontra no F3, mas a maior percentagem de protena est no F2. No que toca actividade especfica relativa, esta vais ser maior na F3. Estes resultados demonstram que tanto a velocidade de centrifugao como a quantidade de centrifugaes influenciam a constituio da cada fraco. Em termos gerais, podemos verificar que o maior valor de actividade especfica relativa encontrado na fraco F3. Esta situao concordante com o esperado, uma vez que no presente trabalho prtico estamos a estudar a actividade do gliceraldedo3-fosfato que se encontra no citosol. Caso estivssemos a estudar, por exemplo a succinato desidrogenase, a maior actividade seria encontrada nas mitocndrias, ou seja, na fraco F2. Por ltimo, importante realar que todos os clculos efectuados da actividade tiveram como base o facto de o NADH ser um dos produtos da reaco catalisada pelo gliceraldedo-3-fosfato.

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ANEXOS
A) Determinao da concentrao proteica Na tabela 1 so apresentadas as leituras de absorvncia feitas pelos grupos 4, 2 e 3 a 595 nm. De salientar que para a determinao da recta de calibrao foram utilizados os valores determinados pelo grupo 2 para P1,P2,P3 e P4.
Tabela 1: Valores de absorvncia determinados a 595 nm para os tubos F0, F1, F2, F3, P1, P2, P3 e P4. Absorvncia Tubo F0 I (G4) F1 F2 F3 F0 II (G2) F1 F2 F3 F0 III (G3) F2 F3 P1 P2 P3 P4 B A 0,221 0,174 0,192 0,112 0,255 0,291 0,149 0,234 0,215 0,209 0,092 0,050 0,272 0,398 0,383 0,000 B 0,206 0,168 0,222 0,105 0,229 0,22 0,278 0,17 0,213 0,212 0,096 0,074 0,330 0,357 0,414 0,000 2,00E-03 6,000E-03 1,250E-02 2,500E-02 0,000 Concentrao BSA/mg.mL-1

Determinao da Concentrao de BSA em P1, P2, P3 e P4

ci vi cf vf ci vi cf vf

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Exemplo de clculo para P1:

cf

4 0,5 1000 2,00 10 3 mg / mL

0.450 0.400 0.350 0.300 Abs = 32[BSA] + 0,02 R = 0,9157

Absorvncia

0.250 0.200 0.150 0.100 0.050 0.000 0.00E+00 2.00E-03 4.00E-03 6.00E-03 8.00E-03 1.00E-02 1.20E-02 1.40E-02 [BSA]/mg.mL-1

Figura 1: Representao grfica da absorvncia em funo da concentrao de BSA.

Determinao da Concentrao proteica em F0, F1, F2 e F3 Recta de calibrao:

Abs 32[ BSA] 0,02 Abs 0,02 [ BSA] 32

Exemplo da concentrao proteica de F2 do grupo 3 Ensaio A

Abs 32[ BSA] 0,02 0,209 0,02 [ BSA] 5,9 10 3 mg / mL 32

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Tendo em considerao os dois factores de diluio aplicados, obtemos a seguinte concentrao:

[ BSA] (5,9 10 3 ) 3,9 101 mg / mL

1000 200 3 10

Tabela 2: Concentrao proteica das diferentes amostras em mg/mL. Tubo F0 I (G4) F1 F2 F3 F0 II (G2) F1 F2 F3 F0 III (G3) F2 F3 [Protena]A [Protena]B 4,2E+01 3,2E+01 3,6E+01 1,9E+01 4,9E+01 5,6E+01 2,7E+01 4,5E+01 4,1E+01 3,9E+01 1,5E+01 3,9E+01 3,1E+01 4,2E+01 1,8E+01 4,4E+01 4,2E+01 5,4E+01 3,1E+01 4,0E+01 4,0E+01 1,6E+01 Mdia 4,0E+01 3,1E+01 3,9E+01 1,8E+01 4,6E+01 4,9E+01 4,0E+01 3,8E+01 4,0E+01 4,0E+01 1,5E+01

2) Determinao da actividade de gliceraldedo-3-fosfato desidrogenase Aplicando a lei de Lambert-Beer:

A lc A c

Exemplo de clculo para a concentrao de NADH em F0 do G3 (fraccionamento III) 60 segundos Ensaio A

0,035 0,0063 5,6M

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Tabela 3: Concentrao de NADH em mol/L nos tubos F0, F1, F2 e F3 do grupo 4, fraccionamento I, ao longo de um minuto. Tubo t/min 0 0,17 0,33 0,50 0,67 0,83 1,0 F0 4,4444 5,3968 6,349 7,4603 8,4127 9,3651 10,159 F1 -0,7937 0,1587 0,7937 1,270 1,5873 1,7460 1,9048 F2 4,7619 5,0794 6,3492 5,3968 5,5556 5,7143 5,8730 F3 1,9048 2,3810 3,1746 3,9683 4,6032 4,9206 5,5556

Tabela 4: Concentrao de NADH em mol/L nos tubos F0, F1, F2 e F3 do grupo 1 (fraccionamento II) ao longo de 1 minuto. Tubo F0 t/min 0 0,17 0,33 0,50 0,67 0,83 A 24,2857 26,3492 21,2698 30,7937 32,2222 33,4921 B 22,6984 23,9683 25,2381 26,5079 27,3016 28,2540 A 18,0952 18,2540 18,2540 18,4127 18,5714 18,5714 F1 B 16,9841 17,1429 17,1429 17,1429 17,3016 17,3016 A 17,1429 17,7778 18,4127 19,0476 19,5238 20,1587 F2 B 19,3651 20,1587 20,6349 21,4286 22,2222 23,0159 A 19,3651 20,0000 20,7937 21,4286 22,0635 22,8571 F3 B 18,2540 19,2063 20,0000 20,4762 21,2698 22,0635

Tabela 5: Concentrao de NADH em mol/L nos tubos F0, F2 e F3 do grupo 3 (fraccionamento III) ao longo de 1 minuto. Tubo F0 t/min 0 0,17 0,33 0,50 0,67 0,83 1 A 0 1,269841 B 0 0,31746 A 0 -0,79365 F2 B 0 0,47619 0,15873 0,15873 0,31746 A 0 0,47619 F3 B 0 0,47619

1,904762 0,952381 -0,79365 3,174603 1,746032 -0,47619 4,126984 2,063492 -0,15873 4,761905 2,539683 0,15873

1,269841 0,952381 1,904762 1,428571 2,539683 2,063492

0,634921 3,015873 2,539683

5,555556 3,015873 -0,31746 0,793651 3,492063 3,015873

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De salientar que os algarismos significativos no esto de acordo com as regras de acerto de algarismos significativos. O nosso grupo optou por no acertar os algarismos de modo a evitar uma maior propagao de erros. Para esta parte do tratamento de dados usaram-se os resultados do grupo 1, fraccionamento II, em vez dos do grupo 2 uma vez que estes apresentavam um erro. Desta forma, apesar do erro induzido por esta troca, era mais sensato usar os valores do grupo 1.

Representaes grficas da concentrao de NADH em funo do tempo Grupo 4 (Fraccionamento I):

12.00 10.00 8.00 [NADH]/mol.dm-3 6.00 4.00 2.00 0.00 0 -2.00 F0 0.2 0.4 0.6 Tempo/min F1 F2 F3 [NADH]= 2,58t - 0,340 R = 0,904 0.8 1 1.2 [NADH]= 1,06t + 4,834 R = 0,986 [NADH]= 5,82t + 4,461 R = 0,998

[NADH] = 3,74t + 1,916 R = 0,989

Figura 2: Representao grfica da concentrao de NADH em funo do tempo (grupo 4)

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Grupo 1 (fraccionamento II):

40.00 35.00 30.00 [NADH]F0A = 11,3t + 24,51 [NADH]F1A = 0,6t + 18,11[NADH]F1B = 0,4t + 17,02 R = 0,852 R = 0,989 R = 0,942 [NADH]F0B = 6,7t + 22,87 R = 0,992

[NADH]/mol.dm-3

25.00 20.00 15.00 10.00 5.00 0.00 0 0.1 F0A 0.2 F0B 0.3 F1A 0.4 F1B F2A 0.5 F2B 0.6 F3A 0.7 F3B 0.8 0.9 Tempo/min [NADH]F2A = 3,6t + 17,18 [NADH]F3A = 4,2t + 19,35 R = 0,998 R = 0,998 [NADH]F2B = 4,3t + 19,33 R = 0,995 [NADH]F3B = 4,4t + 18,37 R = 0,993

Figura 3: Representao grfica da concentrao de NADH em funo do tempo (grupo 1)

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Grupo 3 (fraccionamento III):

7.00 6.00 5.00 [NADH]/mol.dm-3 4.00 3.00 2.00 1.00 0.00 0 -1.00 -2.00 F0 A F0 B Tempo/min F2 A F2 B F3 A F3 B 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 [NADH]F0(A) = 5,54t + 0,198 R = 0,991 [NADH]F0(B) = 3,13t - 0,045 R = 0,988 [NADH]F2(B) = 0,80t - 0,102 R = 0,880 [NADH]F3(A) = 3,6t + 0,011 R = 0,994 [NADH]F3(B) = 3,06x - 0,034 R = 0,998

Figura 3: Representao grfica da concentrao de NADH em funo do tempo (grupo 3)

Os declives das rectas permitem-nos obter a actividade em mol.min-1. Assim, temos:

Tabela 6: Valores de actividade obtidos atravs das representaes grficas.

Actividade (mol.min-1)
Fraccionamento (Grupo) I (G4) II (G2) III (G3) F0 A 5,82 11,3 5,54 B 6,7 3,13 A 2,58 0,6 F1 B 0,4 A 1,06 3,6 F2 B 4,3 0,8 A 3,74 4,2 3,6 F3 B 4,4 3,06

Todavia necessrio ter em considerao a diluio de 20 vezes. Assim, temos:

a real a 20

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Exemplo de clculo para F0A do grupo 3 (fraccionamento III):

a real 5,54 20 110,8 mol. min 1

Tabela 7: Valores de actividade tendo em considerao a diluio efectuada.

Actividade (mol.min-1)
Fraccionamento (Grupo) I (G4) II (G2) III (G3) F0 A 116,4 226 110,8 B 134 62,6 A 51.6 12 F1 B 8 A 21,2 72 F2 B 86 16 A 74,8 84 72 F3 B 88 61,2

Actividade total:

actividade total a( F1) a( F 2) a( F 3)

Exemplo de clculo para o Grupo 4:

a total 51,6 21,2 74,8 147,6 mol. min 1

Tabela 8: Valores de actividade total dos grupos 4, 1 e 3. Actividade total/mol.min-1 147,6 175 82,6

G4 G1 G3

% de Actividade numa dada fraco

% Actividade actividade na fraco 100 actividade total

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Exemplo de clculo para F1 do grupo 4 (fraccionamento I):

% Actividade 35,0%

51,6 100 147,6

Tabela 9: Valores de % de actividade de F1, F2 e F3 dos diversos tipos de fraccionamento. % de actividade F1 F2 35,0 5,7 14,4 45,1 19,4

F0 I (G4) II (G1) III (G3) -

F3 50,7 49,1 80,6

% de protena

% protena

m protena ( F1 ou F 2 ou F 3) m protena total( F1 F 2 F 3)

100

m protena c protena V
Nota: para os casos em que foram feitos ensaios em duplicado fez-se primeiro a mdia das concentraes de cada fraco. Exemplo de clculo da massa de protena para F1 do grupo 4:

m protena c protena V (3,1 101 ) 0,75 24 mg

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Tabela 10: Valores de massa de protena em F0, F1, F2 e F3 para os diversos tipos de fraccionamentos. Massa de Protena/mg F0 I (G4) F1 F2 F3 F0 II (G2) F1 F2 F3 F0 III (G3) F2 F3 5,0E+02 2,4E+01 2,3E+01 2,8E+01 5,8E+02 3,7E+01 2,4E+01 5,7E+01 5,1E+02 4,0E+01 2,6E+01

Exemplo de clculo da % de protena para F1 do grupo 4:

% protena

m protena ( F1) m protena ( F1 F 2 F 3)

100

24 100 31,6% 24 23 28

Tabela 11: % de protena em F1, F2 e F3 dos diversos tipos de fraccionamento.

% de protena F0 I (G4) II (G2) III (G3) F1 31,6 31,2 F2 31,3 20,5 60,2 F3 37,1 48,3 39,8

Actividade especfica
Actividade especfica % Actividade na fraco % protena na fraco

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Exemplo de clculo para F1 do grupo 4:

Actividade especfica 1,11

35 31,6

Tabela 12: Actividade especfica de F1, F2 e F3 dos diversos tipos de fraccionamento. Actividade especfica relativa F1 F2 1,11 0,46 0,18 2,20 0,32

I (G4) II (G2) III (G3)

F0 -

F3 1,37 1,02 2,03

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