Manual Analysis Tutorial 1.6 Ed01 Esp

ANLISIS MANUAL TUTORIAL
VERSIN 1.6
INTRODUCCIN
InfinicytTM es el software ms potente para la integracin de datos y el anlisis multidimensional de datos procedentes de citometra de flujo. Presenta un amplio rango de posibilidades en un nmero de dimensiones potencialmente infinito que incrementar la eficiencia en su laboratorio. Este tutorial le mostrar cmo realizar un anlisis sencillo utilizando InfinicytTM. InfinicytTM le permitir:

Fusionar diferentes archivos de datos de una o ms muestras, realizando un anlisis de mltiples archivos en un solo paso. Representar informacin integrada de un modo sencillo con las herramientas ms potentes de anlisis con N-colores, estadsticas e informes.
En las pginas siguientes podr ver el poder de esta herramienta de anlisis de un modo bastante sencillo. En este tutorial encontrar varios ejemplos de anlisis y los principales pasos de los que consta el anlisis de los archivos; tras su lectura, ser capaz de manejar InfinicytTM.
Figura 1
Fecha de publicacin: 19 diciembre 2011. Edicin 01
OBTENCIN DE ARCHIVOS DE DATOS DE MUESTRA

Visite www.infinicyt.com y haga clic en Support Tutorials and Videotutorials Tutorials o use el acceso rpido a los tutoriales (Tutorials) en el men inferior de la pgina de inicio.
Figura 2. Descarga de archivos de muestra desde el directorio
Descargue el Tutorial de Anlisis Manual (documento en PDF) y la carpeta con archivos de muestra (Sample Folder; 001 Tutorial), que contiene el archivo Tutorial.fcs. Este archivo FCS pertenece a una sangre perifrica patolgica marcada con los siguientes anticuerpos conjugados con fluorocromos: CD8+IgL-FITC, CD56+IgK-PE, CD5-PerCP-Cy5.5, CD19+TCRgd-PE-Cy7, CD3-APC, CD38-APC-H7, CD20+CD4-PB and CD45-PO (tubo de screening de patologas linfoides de 8 colores). Con estos marcadores seremos capaces de distinguir diferentes poblaciones, como leucocitos totales (CD45+), clulas T (CD3+\CD45+), clulas B (CD19+\CD45+) y clulas NK (CD56+\CD45+), adems de otras subpoblaciones que veremos a lo largo de este tutorial. En este archivo hay dos marcadores conjugados en el mismo fluorocromo para varias fluorescencias; esto slo es posible porque cada uno de estos marcadores es especfico para una poblacin diferente. Por ejemplo, CD8 es un marcador especfico para clulas T, mientras que IgL es un marcador para clulas B. Por tanto, al realizar el anlisis de la muestra es posible identificar la expresin de un marcador especfico de cada poblacin modificando visibilidad de las poblaciones.
Paso 1: ABRIR InfinicytTM

Una vez que est instalado, abrimos InfinicytTM haciendo doble-clic sobre el icono que aparece en el escritorio.
Paso 2: IR A LA OPCIN DE ANLISIS MANUAL

Manual Analysis
Al hacer clic sobre Anlisis Manual, se abrir una ventana de seleccin de archivo.
Figura 3. Pantalla principal de InfinicytTM (Infinicyt v1.6)
Escogemos el archivo Tutorial.fcs (desde la carpeta en que se haya guardado) y hacemos clic en Seleccionar.
Figura 4. Ventana de seleccin de archivos
Tambin podemos abrir directamente un archivo FCS con la opcin de Anlisis Manual arrastrando y soltando dicho archivo (Drag & Drop) desde la carpeta en que est guardado al icono de InfinicytTM que aparece en el escritorio.
CONSEJOS PARA EMPEZAR A ANALIZAR CON INFINICYT

Algunos diagramas de puntos (DotPlots) aparecern abiertos por defecto. Tambin se mostrarn la ventana de Anlisis Manual y el rbol de Poblaciones . Los datos aparecern como puntos grises en los diagramas de puntos.
Secciones en la ventana de Anlisis Manual:

La ventana de Anlisis Manual mostrada en la figura 5 incluye la Barra de Men de InfinicytTM. Podemos controlar todo el programa desde esta ventana ya que desde aqu podemos seleccionar las estadsticas, distintos grficos y diferentes vistas. El rbol de Poblaciones puede contener tantas categoras, leyendas y colores como necesitemos para clasificar las distintas poblaciones celulares. El diseo de un rbol de Poblaciones apropiado es muy importante para conseguir una buena clasificacin de nuestros eventos. El rbol de Poblaciones de la Figura 5 es el que aparece ligado al Perfil por defecto, pero el usuario puede personalizarlo por completo. Vase Anexo 1 para obtener ms informacin sobre el rbol de Poblaciones.
Figura 5. Ventana de Anlisis Manual por defecto
Si en algn momento, al hacer clic sobre alguna zona de la pantalla, los diagramas y la ventana de Anlisis desaparecen, slo hay que hacer clic sobre el botn de Anlisis Manual y los datos aparecern de nuevo en la pantalla. Tambin puede utilizarse el atajo de teclado Ctrl+A.
Si se comete un error al dibujar una regin o asignar una poblacin, se pueden deshacer los cambios de edicin en la barra de men de la ventana de Anlisis Manual, seleccionando Edit Undo (Ctrl+Z).
EDITAR UN RBOL DE POBLACIONES

Por defecto se muestran algunos diagramas de puntos y un rbol de Poblaciones ya creado. En este captulo aprenderemos cmo editar el rbol de Poblaciones.
Eliminar todas las poblaciones

Haciendo clic-derecho sobre cualquiera de las poblaciones existentes (sobre la etiqueta en color) en el rbol de Poblaciones, obtenemos el men de poblaciones. En este men encontramos la opcin Eliminar todas las poblaciones; si hacemos clic en esta opcin se eliminarn todas las poblaciones que estaban creadas.
Figura 6. rbol de Poblaciones por defecto
Si se eliminan las poblaciones por error, se pueden volver a visualizar en el rbol de Poblaciones seleccionando Edit Undo (Ctrl+Z).
Aadir y Editar una Poblacin

Ahora crearemos un nuevo rbol de Poblaciones. Hacemos clic-derecho sobre la poblacin gris denominada Eventos y seleccionamos Aadir poblacin.
Figura 7. Aadir una nueva poblacin
Asignar nombre y color a una poblacin:

Al seleccionar Aadir poblacin, aparecer un cuadro de dilogo: Escribimos el nombre Leucocitos en el cuadro Nombre, por ejemplo. Seleccionamos el color que deseamos asignar a la poblacin entre los colores disponibles (podemos encontrar colores adicionales en las pestaas Muestras, HSB y RGB). Podemos destacar la poblacin si queremos visualizar los puntos en un tamao mayor. En este caso, dejaremos esa opcin desactivada (Visualizacin normal).
Figura 8. Ventana Aadir Poblacin
Cuando hayamos terminado, hacemos clic en Aceptar y una nueva poblacin llamada Leucocitos aparecer en azul en el rbol de Poblaciones.
Figura 9. rbol de Poblaciones con una nueva poblacin aadida
Nota: Si creamos una etiqueta de poblacin por error, podemos eliminarla haciendo clicderecho sobre la poblacin en cuestin y seleccionando Eliminar seleccionado. Si queremos cambiar el nombre o el color de una determinada etiqueta, seleccionaremos Editar poblacin o haremos doble-clic sobre la etiqueta a modificar. Vase Manual de Usuario, captulo 3, ventana de Anlisis Manual, rbol de Poblaciones, para ms informacin.
Figura 10. Eliminar o editar poblaciones
Aadir y editar subpoblaciones

Crearemos ahora una nueva poblacin que depender de la poblacin Leucocitos. Hacemos clic-derecho sobre la poblacin de inters, en este caso, Leucocitos y seleccionamos Aadir poblacin.
Figura 11. Aadir Poblacin
Nombramos la nueva poblacin como Linfocitos. Escribimos el nombre de la etiqueta en el cuadro Nombre, elegiremos un color (por ejemplo, verde) y aceptamos.
Figura 12. Ventana Aadir Poblacin
Visualizar una subpoblacin

Para visualizar la nueva poblacin creada, hacemos clic en el smbolo izquierda de la etiqueta Leucocitos. situado a la
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Figura 13. Nueva poblacin creada
La poblacin Linfocitos aparecer subordinada a la poblacin Leucocitos.
Figura 14. Nueva poblacin creada (Linfocitos) subordinada a Leucocitos
Crear el resto de las poblaciones requeridas en este tutorial

Para crear las poblaciones solicitadas en este tutorial, seguiremos los pasos mostrados previamente; las poblaciones sern: Clulas T, Clulas B y Clulas NK, todas ellas dependientes de Linfocitos. Hacemos clic derecho en la etiqueta Linfocitos y seleccionamos Aadir poblacin; asignamos un nombre y un color a la nueva poblacin de clulas T y aceptamos. Repetimos los mismos pasos para crear las poblaciones de clulas B y NK dependientes de la poblacin Linfocitos.
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Figura 15. rbol de Poblaciones
Resumen
Hemos aprendido a configurar el rbol de Poblaciones, aadir y eliminar poblaciones y crear subpoblaciones. La forma en que creemos un rbol de Poblaciones nos permitir obtener porcentajes no slo de los eventos totales, sino tambin de la poblacin que nosotros consideremos que es nuestro 100% (importante para columna de % parcial).
CREAR DIAGRAMAS
Este paso en necesario para crear los grficos adecuados para llevar a cabo el anlisis.
Cerrar todos los diagramas

Por defecto, algunos de los diagramas se encuentran abiertos. Vamos a aprender a crear diagramas, por lo que primero cerraremos todos los grficos que aparecen por defecto. Existen dos formas de cerrar todos los diagramas: 1. Cerrando cada diagrama uno a uno en el botn de cierre del diagrama). (barra superior
2. Cerrando todos los diagramas al tiempo con la opcin Cerrar Todos los Diagramas disponible en Diagramas en la barra de men de la ventana de Anlisis Manual (atajo de teclado Ctrl+B)
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Figura 16. Cerrar diagrama
Crear nuevos diagramas

Si queremos crear un nuevo diagrama (vase Manual de Usuario, captulo 3, Barra de Men de la ventana de Anlisis Manual Diagramas), seleccionaremos Diagramas Nuevo Diagrama o usaremos el atajo de teclado Ctrl +D.
Figura 17. Crear Nuevo Diagrama
Seleccionar Diagrama de Puntos, elegir 2D y aceptar.
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Figura 18. Crear Nuevo Diagrama
Por defecto, el programa generar un diagrama de puntos mostrando FSC vs. SSC.
Figura 19. Diagrama de puntos 2D por defecto, representando FSC vs.SSC
En este tutorial necesitaremos las siguientes combinaciones de diagramas de puntos: FSC-A Linear\ SSC-A (ExpSSC LOW) * CD45 PO \ SSC-A (ExpSSC LOW) CD3 APC \ SSC-A (ExpSSC LOW) CD56 + IgK PE \ SSC-A (ExpSSC LOW) CD19 + TCRgd PE Cy7 \ SSC-A (ExpSSC LOW) CD20 + CD4 PB \ SSC-A (ExpSSC LOW) CD20 + CD4 PB \ CD8 + IgL FITC CD8 + IgL FITC \ CD56 + IgK PE
*ExpSSC LOW es la transformacin matemtica que se elige para expandir los valores en la parte inferior de la escala de SSC.
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Seleccionar los parmetros a mostrar

Repetiremos el paso para crear siete nuevos diagramas. Haciendo clic-derecho sobre las etiquetas de los ejes de cada grfico podemos ver todos los parmetros del archivo. Elegiremos as el parmetro apropiado para cada eje.
Figura 20. Parmetros, ejes X e Y
Ej.: Elegimos APC-A: CD3 en el eje X haciendo clic en el botn de seleccin del parmetro y el diagrama de puntos se actualizar. Seguimos los pasos y , y configuramos todos los diagramas de puntos que hemos mencionado.
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Figura 21. Cambio de parmetros
Nota: Si hacemos clic de nuevo en la etiqueta APC-A: CD3, podemos elegir la representacin Logarithmic (escala logartmica, si los datos ya estn compensados) o Logical (representacin lgica, que slo est disponible cuando aparecen valores negativos resultado de la aplicacin de la compensacin despus de la adquisicin en el citmetro).
Mosaico
Los diagramas pueden solaparse. Para resolver esta situacin, en la barra de men de la ventana de Anlisis Manual seleccionamos Diagramas Mosaico (Ctrl+T). El programa ordenar los grficos por toda la pantalla de anlisis aprovechando al mximo el espacio disponible. El usuario puede redimensionar los grficos a su eleccin, pero tambin, moverlos y reorganizarlos; para ello slo tiene que arrastrar el grfico con el ratn y reubicarlo.
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Figura 22. Mosaico (Ctrl+T)
Redimensionar diagramas
Al hacer clic una vez en la parte superior del diagrama CD45 vs. SSC, seleccionamos dicho grfico; al hacer clic dos veces, se muestra en modo pantalla completa. Cuando hacemos clic-derecho en el rea de trazado del grfico desplegamos su men contextual y podemos seleccionar Ventana Maximizar (Ctrl+Ms) para ampliar el tamao de la ventana. Para devolver el diagrama a su tamao original, seleccionaremos en ese mismo men Ventana Minimizar (Ctrl+Menos).
Figura 23. Maximizar y minimizar ventana
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Configuracin de Etiqueta/Escala
Esta opcin nos permite cambiar la configuracin de las etiquetas y escalas que se aparecen en los diagramas. Existen varias formas de mostrar esta opcin: haciendo doble-clic sobre la etiqueta del parmetro; haciendo clic-derecho sobre la etiqueta del parmetro y seleccionando Configuracin de Etiqueta/Escala; o abriendo el men contextual con clic-derecho sobre el rea del grfico y seleccionando Configuracin de Diagrama Configuracin de Etiqueta/Escala. Vase Manual de Usuario, captulo 2, Men contextual de Diagramas Configuracin de Diagramas Configuracin de Etiqueta/Escala para una informacin ms detallada sobre la configuracin de etiqueta y escala. A travs de esta ventana podemos configurar por completo nuestras etiquetas, siendo posible cambiar el tipo de fuente, el color, el tamao e incluso el texto en todos los diagramas.
ETIQUETA
Desde esta pestaa es posible cambiar la configuracin de las siguientes etiquetas:
Figura 24. Ventana de Configuracin de Etiqueta/Escala
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Etiquetas de diagramas: seleccionando esta opcin podemos cambiar la configuracin de las etiquetas presentes en el diagrama o diagramas seleccionados. Etiquetas de parmetros: podemos cambiar la configuracin de todas las etiquetas presentes en el archivo, pero tambin podemos elegir configurar slo las etiquetas de ciertos parmetros. Etiquetas de poblaciones: mediante esta opcin podemos modificar la etiqueta asociada a una poblacin en los Diagramas de Bandas por Poblacin (vase Manual de Usuario, captulo 3, Diagramas). Los cambios se aplicarn slo a los diagramas y no al rbol de Poblaciones, donde las etiquetas permanecern inalteradas, Otras etiquetas: mediante esta opcin podemos modificar las etiquetas de Densidad y de Diagramas de Cajas. Para estas etiquetas es posible configurar las siguientes opciones: Configuracin del texto Visualizacin de etiquetas: Podemos seleccionar qu elementos de la etiqueta queremos mostrar: marcador, fluorescencia y/o representacin; adems, el orden de visualizacin de marcador y fluorescencia puede invertirse. Etiqueta personalizable: Podemos personalizar el texto que queremos mostrar en una etiqueta. Configuracin del color Opciones de fuente
En todas estas opciones siempre es posible restaurar los valores por defecto haciendo clic en el botn Texto / Color / Fuente Defecto, que se encuentra en la parte inferior de la ventana.
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Paso 3: ANLISIS DE LA MUESTRA

Una vez que hemos creado los diferentes grficos con los parmetros de inters y el rbol de Poblaciones con sus correspondientes etiquetas y colores, comenzaremos el anlisis de la muestra. Empezaremos con la caracterizacin de la poblacin Leucocitos.
Dibujar regiones y asignar eventos a una poblacin

Dibujamos una regin con el ratn que rodee las clulas de inters en el diagrama de puntos 2D CD45 vs. SSC. La lnea marcada se cerrar automticamente cuando soltemos el ratn. Los eventos seleccionados aparecern por defecto en negro. Al hacer clic en la etiqueta de Leucocitos del rbol de Poblaciones, esto es, al asignar los eventos a una poblacin determinada, los eventos cambiarn de color
Figura 25. Cmo dibujar una regin y cmo caracterizar una poblacin
Nota: Si cometemos un error al dibujar una regin o al asignar una poblacin, podemos ir al comando Editar en la barra de men de la ventana de Anlisis Manual y seleccionar Deshacer Dibujar Regin o Deshacer Asignar Poblacin (Ctrl+Z), segn cual sea la ltima accin realizada.
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Figura 26. Deshacer la ltima accin realizada
Ocultar poblaciones
Si deseleccionamos la casilla VIS. (Visibilidad) correspondiente a la poblacin Eventos, slo estar visible la poblacin de Leucocitos en los grfico. Para mostrar de nuevo la poblacin Eventos slo tendremos que hacer clic de nuevo en la casilla VIS. de Eventos en el rbol de Poblaciones.
Figura 27. Ocultar una poblacin
Seleccin mediante regiones consecutivas

InfinicytTM nos permite dibujar regiones consecutivas en diferentes grficos para definir mejor una poblacin. La primera poblacin que vamos a seleccionar de este modo son las clulas T. Para ello, dibujaremos una nueva regin en el diagrama 2D FSC vs. SSC en la zona de linfocitos.
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Figura 28. Regin en linfocitos (FSC vs. SSC)
Para definir mejor la poblacin de linfocitos, hacemos otra regin en el diagrama 2D CD45 vs. SSC.
Figura 29. Regin en linfocitos (CD45 vs. SSC)
Con los linfocitos seleccionados en el resto de los grficos, dibujamos otra regin en el diagrama 2D CD3: APC vs. SSC.
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Figura 30. Regin en clulas T (CD3 vs. SSC)
En este punto, slo los eventos incluidos en las tres regiones que hemos dibujado estn seleccionados. Asignamos estos eventos a la poblacin de Clulas T haciendo clic sobre la etiqueta correspondiente en el rbol de Poblaciones.
Figura 31. Clulas T seleccionadas
Despus de seleccionar la poblacin de Clulas T, aprenderemos cmo analizar las subpoblaciones correspondientes dado que, como mencionamos con anterioridad, los marcadores especficos para dichas subpoblaciones estn combinados con otros marcadores conjugados con el mismo fluorocromo. Para ello, necesitaremos los siguientes diagramas: CD20 + CD4 PB \ CD8 + IgL FITC CD19 + TCRgd PE Cy7 \ SSC-A (ExpSSC LOW) Tambin necesitaremos aadir al rbol de Poblaciones las siguientes cinco subpoblaciones que dependern de la poblacin Clulas T:
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Figura 32. Subpoblaciones de clulas T en el rbol de Poblaciones
Antes de continuar con el anlisis, dejaremos slo visible la poblacin de Clulas T (slo tendremos esa poblacin seleccionada en la casilla VIS. del rbol de Poblaciones). Posteriormente, realizaremos las siguientes regiones consecutivas con objeto de definir las subpoblaciones de Clulas T:
Figura 33. Regiones consecutivas para definir las subpoblaciones de clulas T
Una vez que hemos seleccionado la poblacin Clulas T CD4-/CD8-, el siguiente paso es analizar las Clulas T TCRgd. Dejaremos slo visible la poblacin Clulas T CD4-/CD8-, haremos dos regiones consecutivas en CD19+TCRgd/SSC y CD3/SSC, como se muestra en la siguiente figura, y asignaremos a la poblacin correspondiente:
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Figura 34. Regiones consecutivas para definir la subpoblacin de clulas T TCRgd
Notas: Si dibujamos una regin que no es vlida por algn motivo, podemos corregirla. Haciendo clic dentro de la regin (antes de asignar la poblacin), dicha regin quedar seleccionada y podemos tanto moverla a travs del grfico como cambiar su tamao. Podemos deshacer la ltima accin realizada con Ctrl+Z o rehacer con Ctrl+Y. Continuamos con el anlisis pero antes de clasificar otra poblacin, ocultaremos las poblaciones de Clulas T y Eventos para facilitar el anlisis. Tras ello, repetiremos los pasos previos para definir la poblacin de Clulas B, pero en este caso dibujando regiones en los siguientes diagramas de puntos 2D: FSC/SSC, CD45/SSC, CD19+TCR /SSC y CD20+CD4/SSC.
Figura 35. Regiones consecutivas para definir la poblacin de clulas B
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Del mismo modo que hemos trabajado con las subpoblaciones de Clulas T, vamos a aprender a analizar las subpoblaciones de Clulas B. Dejaremos slo visible la poblacin de Clulas B y usaremos el siguiente diagrama para seleccionar las subpoblaciones: CD8 + IgL FITC vs. CD56 + Ig K PE Aadiremos al rbol de Poblaciones las siguientes subpoblaciones dependientes de Clulas B: Kappa y Lambda.
Figura 36.rbol de Poblaciones mostrando las subpoblaciones de clulas B
Definiremos ambas subpoblaciones, Kappa y Lambda, dibujando dos regiones en CD8 + IgL vs. CD56 + IgK.
Figura 37. Clulas B Kappa y Lambda
Realizaremos la misma operacin para definir la poblacin de Clulas NK (CD3- y CD56+).
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Resumen del anlisis de la muestra

Tras definir todas las poblaciones, deberamos tener una pantalla de anlisis como la siguiente:
Figura 38. Pantalla de anlisis
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Paso 4: ESTADSTICAS
En este punto, la muestra debera estar ya analizada. Por tanto, ahora nos centraremos en la ventana de Anlisis Manual antes de crear el Informe.
Informacin estadstica en el rbol de Poblaciones

El rbol de Poblaciones aporta informacin estadstica sobre las poblaciones analizadas, tales como el nmero de eventos dentro de cada poblacin, % total, % parcial, % visibilidad y Comentarios (vase Anexo 1 de este tutorial).
Figura 39. Ventana de Anlisis Manual tras el anlisis
En la ventana de Anlisis Manual hay diferentes columnas con informacin sobre las poblaciones: Poblacin: Muestra las poblaciones creadas con el color y la etiqueta seleccionadas por el usuario. Eventos: Muestra el nmero de eventos que pertenecen a cada poblacin. En nuestro ejemplo (Figura 39), tenemos 30.000 eventos totales y de ellos, 10574 corresponden a la poblacin Linfocitos. % Visibilidad: En esta columna se indica el porcentaje relativo de las poblaciones visualizadas en un momento concreto del anlisis, siendo el 100% el total de las poblaciones mostradas.En nuestro ejemplo, si deseleccionamos la poblacin Eventos, sta tendr una visibilidad del 0.0% mientras que Leucocitos tendr un % de visibilidad del 100%; de este porcentaje, el 43.84% corresponder a la poblacin Linfocitos mientras que el 56.16% corresponder a Otros Leucocitos (es decir, a eventos seleccionados como
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Leucocitos pero no asignados an a ninguna poblacin concreta; ej. neutrfilos, eosinfilos). Es importante recordar que el % Visibilidad est relacionado slo con los eventos visibles en un momento determinado (i.e., marcados en la casilla VIS.) y no con el % total de eventos.
Figura 40. Columna % Visibilidad
% Parcial: En esta columna se indica el porcentaje de eventos atribuidos a una poblacin en relacin con el nmero total de eventos de la poblacin considerada jerrquicamente superior en el diseo de nuestro rbol de Poblaciones. Por ejemplo, Linfocitos es la poblacin jerrquicamente superior a la que se subordinan las poblaciones Clulas T, Clulas B y Clulas NK; la suma de los % parciales de dichas poblaciones ser el 100%.
Figura 41. Columna % Parcial
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% Total: Esta columna muestra el porcentaje que representa cada poblacin en relacin con el nmero total de eventos incluidos en el archivo de datos.
Figura 42. Columna % Total
El formato en que se muestran las estadsticas en relacin con el separador decimal, separador en archivos CSV y nmero de decimales es configurable. Para ello, iremos a la barra de men de la ventana de Anlisis Manual y seleccionaremos: Estadsticas Configuracin Formato, donde podremos configurar las opciones mencionadas. El nuevo formato se aplicar a todos los valores que se muestran tanto en las columnas de la ventana de Anlisis Manual como las que aparecen en el Informe (vase Manual de Usuario, captulo 2, Perfil).
Figura 43. Configuracin de las estadsticas
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Comentarios: Podemos aadir comentarios acerca de los parmetros de una determinada poblacin. Para ello, haremos clic sobre la etiqueta correspondiente de la columna Comentarios y aparecer la ventana de Comentarios donde podremos escribir las anotaciones pertinentes. Cuando se aadan comentarios, aparecer un smbolo de informacin en la etiqueta de la poblacin correspondiente. Estos comentarios quedarn guardados y se mostrarn cada vez que hagamos clic sobre la etiqueta; adems, estn disponibles para incluirse en el Informe.
Figura 44. Comentarios
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Paso 5: INFORME
El Informe es un elemento esencial en el anlisis que forma parte del Perfil. Una vez que se ha completado el anlisis, es posible disear un resumen personalizado de toda la informacin que puede imprimirse y guardarse. El informe del anlisis se actualizar cada vez que se cargue un nuevo archivo con el mismo Perfil. InfinicytTM facilita al usuario la posibilidad de editar un informe de forma sencilla, incluyendo diferentes elementos como grficos, cuadros de estadsticas, texto, imgenes y otros elementos que el usuario quiera aadir.
Crear un informe
Para iniciar la edicin del informe seleccionaremos Archivo Informe en la barra de men de la ventana de Anlisis Manual y se abrir la hoja del informe.
Figura 45. Apertura de la hoja de informe
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Este es un ejemplo de informe final:
Figura 46. Ejemplo de un informe final
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Los principales componentes que pueden aadirse y configurarse en la hoja del informe son los siguientes: 1.- Imgenes, dibujos o logos 2.- Texto 3.- Datos de la muestra o del paciente 4.- rbol de Poblaciones con estadsticas 5.- Diagramas 6.- Fecha 7.- Compass
Eliminar Componente
Haciendo clic-derecho sobre los componentes del informe y seleccionando Eliminar Componente, podemos eliminarlos uno a uno. Si eliminamos los componentes que aparecen en el informe por defecto, podremos crear nuevos componentes para disear nuestro propio modelo de informe.
Figura 47. Eliminar Componente
Aadir Componente
Haciendo clic-derecho en el rea libre de la Hoja de Informe y seleccionando Aadir Componente, podemos aadir tantos componentes como queramos.
Figura 48.Aadir Componente
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Aadir Componente Imagen Haciendo clic-derecho en el rea libre de la Hoja de Informe y seleccionando Elegir un Componente Imagen, podremos seleccionar una imagen o un logo desde nuestro ordenador.
Figura 49. Aadir Componente Imagen
Aadir Componente Texto Haciendo clic-derecho en el rea libre de la Hoja de Informe y seleccionando Elegir un Componente Texto, podemos aadir un texto personalizado, cambiando la fuente, el color y el alineamiento a nuestra eleccin.
Figura 50. Aadir Componente Texto
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Aadir Componente Datos Para aadir un componente Datos, haremos clic-derecho en el rea libre de la Hoja de Informe y seleccionaremos Elegir un Componente Datos. Esta opcin nos permitir aadir informacin sobre la muestra y/o paciente. Aparecern una serie de campos por defecto; para configurar nuestro Informe podemos aadir nuevos campos (disendolos nosotros mismos con el botn Aadir que se encuentra en la parte inferior de la ventana con el botn o importndolos desde el fichero FCS, como veremos ms adelante) o eliminar campos (con el botn ).
Figura 51. Ventana de datos
Aadir informacin FCS: Tambin es posible incluir informacin que se encuentra almacenada en los archivos FCS. Para ello, seleccionaremos la opcin Aadir informacin FCS en la ventana de Datos y se abrir otra ventana con la informacin interna del archivo FCS. Marcaremos las casillas correspondientes a los parmetros que queremos incluir en la caja de datos y aceptaremos.
Figura 52. Ventana de Configuracin
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Podemos configurar un campo con informacin interna incluida en el fichero FCS, como por ejemplo el nombre del paciente, fecha de adquisicin, nombre del instrumental, etc. Al abrir otro fichero empleando este mismo Perfil, la informacin se actualizar automticamente con los datos del nuevo archivo.
Aadir Componente rbol de Poblaciones Haciendo clic-derecho en el rea libre del informe y seleccionando Aadir Componente rbol de Poblaciones, obtendremos la lista de poblaciones localizadas en el rbol de Poblaciones.
Figura 53. Seleccionar poblacin
Haciendo doble-clic sobre la tabla de poblaciones que se ha creado, se abrir un men. Esta ventana nos permitir seleccionar tanto la poblacin como los parmetros que queremos mostrar en el informe; en este caso mostraremos slo las poblaciones con eventos (Seleccionar solo poblaciones con eventos).
Figura 54. Men pop-up del Componente Poblacin
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Haciendo clic en el smbolo de una poblacin podemos seleccionar los parmetros estadsticos de dicha poblacin que queremos mostrar en el informe.
Figura 55. Seleccin de poblaciones y parmetros
Seleccionar Informacin Estadstica La informacin estadstica de los parmetros que queremos que sea mostrada en el componente Poblacin del informe puede seleccionarse en el campo Columnas.
Figura 56. Seleccionar informacin estadstica de los parmetros
Una vez seleccionadas las poblaciones, los archivos (slo para archivos fusionados o calculados) y las estadsticas, pulsamos Aceptar.
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Aadir Componente Diagrama Seleccionamos Aadir Componente Diagrama.
Figura 57. Seleccionar Diagrama
Al seleccionar esta opcin, se abrir una ventana de configuracin de Diagramas para poder editarlos. El ejemplo que realizaremos en este tutorial es el siguiente: Diagrama de Puntos 2D con CD3 en el eje Y y CD19+TCR en el eje X, como se describe en el siguiente apartado.
Figura 58. Ventana de Configuracin de Diagrama
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Editar Diagramas en el Informe 1. Seleccionamos el tipo de grfico que deseamos insertar en el informe. En este caso, seleccionaremos un Diagrama de Puntos 2D.
Figura 59. Seleccin de tipo de diagrama
2. Despus seleccionamos los parmetros que queremos representar en los ejes del grfico.
Figura 60. Seleccin de los parmetros de los ejes
3. Configuramos las opciones de etiqueta y escala.
Figura 61. Configuracin de Etiqueta/Escala
4. Configuramos las opciones de visualizacin.
Figura 62. Configuracin de la visualizacin de la poblacin
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Aadir Componente Compass Seleccionamos Aadir Componente Compass.
Figura 63. Seleccionar Compass
Al seleccionar esta opcin, se abrir una ventana de configuracin del diagrama.
Figura 64. Ventana de Configuracin de Diagrama Compass
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Disponemos de varias opciones de configuracin: 1. Seleccionamos la poblacin que queremos comparar con nuestra base de datos.
Figura 65. Seleccionar Poblacin a comparar
2. En caso de estar trabajando con un archivo fusionado (vase tutorial Fusin de Archivos), podremos seleccionar los archivos que queremos mostrar en el diagrama mediante la opcin Mostrar archivo.
Figura 66. Seleccionar Mostrar archivo
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3. Configuramos las opciones de etiqueta y escala.
Figura 67. Seleccionar Mostrar archivo
4. Podemos imprimir las Comparativas (diagramas comparativos) correspondientes, todos (Todas las Comparativas) o solo los relevantes (Comparativas Relevantes). Estos diagramas no se previsualizarn en el Informe, pero s aparecern al imprimirlo o al exportarlo a cualquiera de los formatos disponibles.
Figura 68. Seleccionar Imprimir Comparativas
Nota: La opcin Aadir Componente Compass slo estar disponible si tenemos abierta la herramienta Compass en Anlisis Manual. En caso contrario, obtendremos el siguiente aviso:
Figura 69. Aviso Compass est cerrado
Para ms informacin, vase tutorial Compass.
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Guardar y cerrar el informe

Seleccionando el men Archivo, en la parte superior izquierda de la ventana del Informe, podemos Imprimir el informe, o Exportar a XML / Imagen / PDF. Para una informacin ms detallada sobre la exportacin en XML, vase Manual de Usuario, captulo 7, Exportar Archivo.
Figura 64. Guardar e Imprimir el Informe
Si cerramos el informe (Archivo Salir), la ventana de Anlisis Manual aparece de nuevo. La configuracin del informe se guarda como parte del Perfil. La informacin incluida se actualiza automticamente si hacemos modificaciones en el Anlisis Manual o bien con los nuevos datos si abrimos otro fichero diferente con el mismo Perfil. Podemos encontrar informacin ms detallada sobre el Informe en el Manual de Usuario, captulo 3.
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Paso 6: GUARDAR PERFIL

En funcin del tipo de estudio que estemos llevando a cabo, puede ser de utilidad trabajar siempre con la misma configuracin de rbol de Poblaciones, Diagramas, etc. Cuando guardamos un Perfil estamos guardamos las opciones definidas para nuestro anlisis: rbol de Poblaciones Tipo de Grficos Configuracin de los parmetros estadsticos Informe Imagen de Referencia Estrategia de Anlisis Etc.
Para guardar el Perfil, en la barra de men de la ventana de Anlisis Manual seleccionaremos Perfil Guardar Perfil. Elegiremos un nombre y una carpeta para salvar el Perfil y aceptamos. El nuevo Perfil se guardar en formato .inp (Perfil InfinicytTM).
Figura 65. Guardar Perfil
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Paso 7: SALVAR ARCHIVO ANALIZADO

Utilizamos esta opcin cuando queremos guardar el anlisis de un fichero. Para guardar un archivo analizados, en la barra de men de la ventana de Anlisis Manual seleccionaremos Archivo Guardar Archivo Analizado. El programa abrir una ventana donde podremos elegir el nombre del archivo analizado y el directorio donde queremos salvarlo. El formato de estos ficheros es formato .cyt. El archivo de datos originales permanecer en la misma carpeta de origen porque el archivo .cyt no afecta al archivo original. Un archivo .cyt incluir el anlisis de las poblaciones con los colores correspondientes, diagramas, estadsticas, informe y toda la informacin incluida en el Perfil durante el anlisis del archivo.
Figura 66. Guardar Archivo Analizado
Cuando guardamos un archivo analizado, tenemos la posibilidad de crear archivos annimos. Para ello, hacemos clic en la casilla correspondiente (Annimo) y se activar el botn Configuracin; seleccionando esta opcin podemos configurar los parmetros que queremos eliminar cuando guardemos el archivo annimo. El archivo se guardar excluyendo toda la informacin relativa a la identificacin del mismo.
Figura 67. Anonimizar Archivos
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INFORMACIN ADICIONAL ANEXO 1: Componentes de la ventana de Anlisis

INFORMACIN DE LA VENTANA DE ANLISIS
En el rbol de Poblaciones hay varias columnas que muestran la siguiente informacin:
Eventos: Informacin sobre el nmero de eventos incluidos en cada grupo o poblacin. % Total: Informacin sobre el porcentaje que representa cada grupo en relacin con el nmero total de eventos incluidos en el archivo de datos. % Parcial: Informacin sobre el porcentaje de eventos atribuidos a una poblacin dada en relacin con el nmero total de eventos de la poblacin considerada jerrquicamente superior a dicha poblacin. % Visibilidad: Informacin sobre el porcentaje de cierta poblacin en relacin con el nmero de eventos visualizados en un momento concreto del anlisis. Recordemos que podemos marcar la casilla VIS. o no para visualizar o no una determinada poblacin; por tanto, la columna % Visibilidad depender siempre de la visibilidad de las poblaciones. Comentarios: En esta columna podemos escribir comentarios sobre una determinada poblacin; stos aparecern en el informe.
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Revisin: Desde esta columna podemos revisar el anlisis de cada poblacin haciendo clic en el icono lupa que aparece junto a la poblacin que queremos revisar. Haciendo clic-derecho sobre cualquiera de estas columnas podemos seleccionar qu columnas queremos visualizar u ocultar en la ventana de Anlisis Manual.
ESTADSTICAS DE LOS PARMETROS

Haciendo clic en el componente Estadsticas de la barra de men, aparecer un men con tres opciones:
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Opciones Estadsticas:
1. Mostrar Estadsticas: Al hacer clic sobre este componente, se mostrarn las estadsticas de los parmetros en el rbol de Poblaciones.
2. Exportar Estadsticas: Esta opcin nos permite exportar las estadsticas en formato hoja de clculo (.csv). Al seleccionar Exportar Estadsticas se abrir una nueva ventana que nos permitir configurar la exportacin; trabaja del mismo modo que el componente Poblacin del informe (vase pgina 36 de este tutorial).
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Si desplegamos el men de la parte superior de la ventana, podremos seleccionar varias opciones, entre ellas Seleccionar solo poblaciones con eventos; con esta opcin seleccionaremos slo las poblaciones que ya han sido analizadas para exportar sus estadsticas.
Es posible seleccionar los parmetros estadsticos que queremos exportar; las opciones a seleccionar estn enumeradas en el campo Columnas: Eventos, % Total, % Parcial, Media, SD, Moda, CV, etc.
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Tambin es posible guardar la configuracin de las estadsticas exportadas; asignamos un nombre a la nueva configuracin y guardamos.
Al hacer clic en , aparece una ventana de dilogo en el que podremos nombrar el archivo (que se guarda en formato .csv) y elegir el directorio donde se salvarn las estadsticas exportadas.
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3. Configurar Estadsticas: Esta opcin nos permitir configurar las estadsticas que se muestran, tanto las funciones que aparecen en el rbol de Poblaciones como el formato de las mismas. Cuando seleccionamos esta opcin en la ventana de Configuracin, se abrir un cuadro de dilogo en el que podemos seleccionar dichas opciones.
Cada columna muestra las estadsticas de cada parmetro para cada poblacin. Las columnas pueden abrirse o cerrarse para ver los datos seleccionados; para ello, haremos clic sobre la etiqueta del parmetro de la columna para abrir y clic para cerrar.
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Para visualizar las estadsticas de todos los parmetros al mismo tiempo, podemos hacer clic-derecho sobre cualquier etiqueta de parmetro para mostrar el men contextual y seleccionar Expandir Estadsticas; si queremos cerrar todas las estadsticas seleccionaremos Colapsar Estadsticas.
Comentarios
Para escribir comentarios sobre los parmetros, haremos clic sobre la etiqueta Comentarios correspondiente. Estos comentarios se podrn incluir en el informe.
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ANEXO 2: GUARDAR Y APLICAR ESTRATEGIAS

GUARDAR ESTRATEGIAS
Una vez que hayamos analizado nuestras poblaciones, podemos guardar la estrategia que hemos empleado para dibujar las regiones. Para ello, seleccionaremos Perfil Guardar Estrategia de Anlisis en la barra de men de la ventana de Anlisis Manual.
Se abrir un cuadro de dilogo para que asignemos un nombre a nuestra estrategia.
Esta nueva Estrategia de Anlisis quedar guardada en el Perfil actual. Para revisar la estrategia, seleccionaremos Perfil Configuracin en la barra de men de la ventana de Anlisis Manual. Se abrir una ventana con las opciones de Configuracin. Si seleccionamos Regiones y Estrategias podremos revisar las estrategias de anlisis guardadas.
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Tambin es posible guardar una secuencia de las regiones dibujadas antes de asignar los eventos a una poblacin. Para ello, dibujaremos la regin que deseamos salvar y antes de asignar los eventos, seleccionamos Perfil Guardar Estrategia de Anlisis Regiones.
Tambin en este caso pueden revisarse en Perfil Configuracin Regiones y estrategias.
APLICAR ESTRATEGIAS
Para aplicar una estrategia de anlisis previamente guardada, abriremos el archivo al queremos aplicar la estrategia y seleccionamos Perfil Cargar Estrategia de Anlisis en la barra de men de la ventana de Anlisis Manual. Aparecer una ventana en la que podemos seleccionar la estrategia guardada que queremos aplicar.
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La estrategia de anlisis seleccionada se aplicar al nuevo archivo no analizado.
Podemos comprobar que las regiones aplicadas sean correctas haciendo clic en la lupa que aparece junto a cada poblacin. Aparecern destacadas las regiones empleadas para seleccionar la poblacin en los diagramas correspondientes y estas regiones pueden modificarse si se considera necesario.
Coincidencia de Parmetros
InfinicytTM slo aplica las Estrategias de Anlisis guardadas si los parmetros de ambos archivos son coincidentes, lo que implica que los parmetros de ambos archivos no slo tienen que ser los mismos, sino que deben estar escritos de la misma forma.
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Si las etiquetas no estn escritas exactamente igual, InfinicytTM nos sugerir opciones para hacer coincidir los parmetros. En nuestro ejemplo, los parmetros que aparecen en el archivo 1, donde se ha creado la estrategia, son los siguientes:
Los parmetros que aparecen en el archivo 2, en el cual vamos a aplicar la estrategia guardada, son los siguientes:
Si nos fijamos en ambos listados, hay varios parmetros que no estn escritos exactamente de la misma forma en los dos archivos (aqu marcados con un rectngulo azul). Al aplicar la estrategia sobre el archivo 2, el programa nos mostrar un cuadro para comprobar la concordancia de parmetros.
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Si aceptamos las concordancias propuestas, InfinicytTM las guardar y construir un diccionario con todas las concordancias aprobadas. Es posible visualizar los grupos previamente creados al cargar la Estrategia de Anlisis seleccionando Perfil Configuracin Grupos Previos.
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Al aceptar, se aplicar al nuevo archivo el anlisis de la poblacin (regiones) correspondiente a la Estrategia de Anlisis guardada. Si las regiones no se ajustan correctamente, podemos hacer clic sobre la regin y reajustarla.
Revisin de la Estrategia de Anlisis

Cuando aplicamos una Estrategia de Anlisis a un nuevo archivo, siempre podemos revisar las poblaciones que han sido seleccionadas mediante regiones. Por ejemplo, en este caso revisaremos la poblacin Leucocitos. Si hacemos clic en la lupa que hay en la Columna Revisin, se mostrar toda la informacin relacionada con la poblacin a revisar.
Revisin de la regin: Hacemos clic en la regin correspondiente para modificarla.
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Informacin de la Estrategia de Anlisis: La informacin relacionada con las regiones que ya estn diseadas se muestra en la parte inferior del rbol de Poblaciones en la ventana de Anlisis Manual.
En esa parte de la ventana, podemos visualizar informacin sobre dnde y cmo se han realizado las regiones para la seleccin de poblaciones: Este smbolo indica regiones positivas (en este caso, dentro de Leucocitos); significa que la regin para Leucocitos es positiva porque se han asignado eventos a esta regin. Este smbolo indica regiones positivas (en este caso, dentro de Leucocitos); significa que algunos eventos previamente asignados a Leucocitos han sido asignados posteriormente a otras poblaciones (clulas B, clulas T y clulas NK).
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Manual Analysis Tutorial 1.6 Ed01 Esp

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ANLISIS MANUAL TUTORIAL

Fecha de publicacin: 19 diciembre 2011. Edicin 01

OBTENCIN DE ARCHIVOS DE DATOS DE MUESTRA

Figura 2. Descarga de archivos de muestra desde el directorio

Fecha de publicacin: 19 diciembre 2011. Edicin 01

Paso 1: ABRIR InfinicytTM

Paso 2: IR A LA OPCIN DE ANLISIS MANUAL

Figura 3. Pantalla principal de InfinicytTM (Infinicyt v1.6)

Figura 4. Ventana de seleccin de archivos

Fecha de publicacin: 19 diciembre 2011. Edicin 01

CONSEJOS PARA EMPEZAR A ANALIZAR CON INFINICYT

Secciones en la ventana de Anlisis Manual:

Figura 5. Ventana de Anlisis Manual por defecto

Fecha de publicacin: 19 diciembre 2011. Edicin 01

Fecha de publicacin: 19 diciembre 2011. Edicin 01

EDITAR UN RBOL DE POBLACIONES

Eliminar todas las poblaciones

Figura 6. rbol de Poblaciones por defecto

Aadir y Editar una Poblacin

Fecha de publicacin: 19 diciembre 2011. Edicin 01

Figura 7. Aadir una nueva poblacin

Asignar nombre y color a una poblacin:

Figura 8. Ventana Aadir Poblacin

Fecha de publicacin: 19 diciembre 2011. Edicin 01

Figura 9. rbol de Poblaciones con una nueva poblacin aadida

Figura 10. Eliminar o editar poblaciones

Fecha de publicacin: 19 diciembre 2011. Edicin 01

Aadir y editar subpoblaciones

Figura 11. Aadir Poblacin

Figura 12. Ventana Aadir Poblacin

Visualizar una subpoblacin

Fecha de publicacin: 19 diciembre 2011. Edicin 01

Figura 13. Nueva poblacin creada

La poblacin Linfocitos aparecer subordinada a la poblacin Leucocitos.

Figura 14. Nueva poblacin creada (Linfocitos) subordinada a Leucocitos

Crear el resto de las poblaciones requeridas en este tutorial

Fecha de publicacin: 19 diciembre 2011. Edicin 01

Figura 15. rbol de Poblaciones

Cerrar todos los diagramas

Fecha de publicacin: 19 diciembre 2011. Edicin 01

Figura 16. Cerrar diagrama

Crear nuevos diagramas

Figura 17. Crear Nuevo Diagrama

Seleccionar Diagrama de Puntos, elegir 2D y aceptar.

Fecha de publicacin: 19 diciembre 2011. Edicin 01

Figura 18. Crear Nuevo Diagrama

Figura 19. Diagrama de puntos 2D por defecto, representando FSC vs.SSC

Fecha de publicacin: 19 diciembre 2011. Edicin 01

Seleccionar los parmetros a mostrar

Figura 20. Parmetros, ejes X e Y

Fecha de publicacin: 19 diciembre 2011. Edicin 01

Figura 21. Cambio de parmetros

Fecha de publicacin: 19 diciembre 2011. Edicin 01

Figura 22. Mosaico (Ctrl+T)

Figura 23. Maximizar y minimizar ventana

Fecha de publicacin: 19 diciembre 2011. Edicin 01

Figura 24. Ventana de Configuracin de Etiqueta/Escala

Fecha de publicacin: 19 diciembre 2011. Edicin 01

Fecha de publicacin: 19 diciembre 2011. Edicin 01

Paso 3: ANLISIS DE LA MUESTRA

Dibujar regiones y asignar eventos a una poblacin

Fecha de publicacin: 19 diciembre 2011. Edicin 01

Figura 26. Deshacer la ltima accin realizada

Figura 27. Ocultar una poblacin