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Lipdios
CROMATOGRAFIA GASOSA
DETECTORES
Classificao
UNIVERSAIS:
Geram sinal para qualquer substncia eluida.
SELETIVOS:
Detectam apenas substncias com determinada propriedade fsico-qumica.
ESPECFICOS:
Detectam substncias que possuam determinado elemento ou grupo funcional em suas estruturas
FASES ESTACIONRIAS
FE Lquidas: Absoro
O fenmemo fsico-qumico responsvel pela interao analito + FE lquida a ABSORO
ABSORO
SILICONES (polisiloxanas) As FE mais empregadas em CG. Cobrem ampla faixa de polaridades e propriedades qumicas diversas.
R1 O Si R2
METODOS OFICIAIS AOCS - Official methods and recommended practices of the american oil chemists' society. Champaign, IL, 1996. AOAC - Official methods of analysis of the association of official analytical chemists. 40.ed. Washington, DC, 1995. IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry
Alguns lipdios so naturalmente volteis, mas a maioria deles precisa ser transformada em derivados com maior volatividade , convertendo-os em steres metlicos. A, ento estes steres metlicos de cidos graxos so colocados na coluna cromatogrfica gslquido e a coluna aquecida para volatizar os compostos presentes.
Os steres metlicos mais solveis no material da coluna se dissolvem, os menos solveis so carregados pela corrente de gs hlio e emergem primeiro na coluna.
Metilao (AOAC)
A preparao dos cidos graxos para a cromatografia gasosa feita atravs da transformao dos cidos graxos livres em steres metlicos.
Este mtodo baseado na esterificao dos cidos graxos com metanol, aps saponificao, usando como catalisador o trifluoreto de boro (BF3).
Aps a metilao, os steres metlicos devem ser conservados 4oC, at a sua anlise.
A anlise de cidos graxos conduzida de acordo com metodologia padro da AOCS por cromatografia gasosa O cromatgrafo deve ser equipado com uma coluna capilar de slica fundida (SP2340) (60m x 0.32mm x 0.25m). Recomenda-se a temperatura inicial da coluna cerca de 150C e a temperatura final de 200C, com programao de 1,3 a 2,0C/minuto . 1 L da amostra diluda, 2%, injetada na coluna. As temperaturas do injetor e do detector recomendadas so 250C e 280C, respectivamente e o fluxo de hidrognio da ordem de 2,5 mL/minuto. Estes steres so identificados por comparao com os tempos de reteno dos padres.
Consideraes
Os cidos graxos livres podem ser esterificados e os lipdios O-acil, como triacilgliceris, podem ser transesterificados por aquecimento com um grande excesso de metanol anidro e um reagente cido como catalisador.
CH2OOCR1 CHOOCR2 CH2OOCR3
Triglicerdeo
CH3OOC - R1
+
+ 3 CH3OH H+
Metanol
CH3OOC - R2 + CH3OOC- R3
steres Metlicos
Consideraes
Lipdios no-polares, como os steres de colesterol ou triglicrides no so solveis em reagentes composto predominantemente de metanol, e no ser transesterificados em um tempo razovel, a no ser que mais um solvente seja adicionado soluo. O benzeno j foi utilizado regularmente para este fim, mas devido sua toxicidade grande, aconselhvel a utilizao de alguns outros solventes como tolueno e tetrahidrofurano. Metanol contendo soluo cido aquosa normalmente recomendado para a preparao de steres metlicos de esfingolipdeos.
Derivatizar as amostras
Esterificao
A amostra lipdica (at 50 mg) dissolvido em tolueno seco (1 mL) em um tubo de ensaio, adicionado 0,5 M metxido de sdio em metanol anidro (2 mL), e a soluo deve ser mantida a 50 C por 10 min. cido actico glacial (0,1 mL) ento adicionado, seguido de gua (5 mL). Os steres so extrado em hexano (2 x 5 mL), utilizando uma pipeta Pasteur para separar as camadas. A camada de hexano seca com sulfato de sdio anidro e filtrada, o solvente removido sob presso reduzida em um evaporador rotativo. "
DE
Coluna:5%DEGS-PS s/ Supelcoport 100/120 mesh; 6 x 1/8 TCOL: 200oC (isotrmico) Gs de Arraste: N2 20 ml.min1
Detector: FID Amostra: 0,5 mL de soluo em clorofrmio contendo 0,5 mg de cada ster
Fosfogliceris
Fosfatidilglicerol no fcil analisar. Ele tende a eluir perto cido fosfatdico em muitos sistemas cromatogrficos, mas geralmente podem ser resolvidos por cromatografia bidimensional em camada delgada.
Espectrometria de massa em condies de ionizao negativa parece ser bem adequada para determinao da composio de espcies moleculares. Do mesmo modo, os mtodos de espectrometria de massa moderna parece ser adequada para a anlise dos cidos complexos lipoamino.
Esfingolipdeos
O primeiro passo para a anlise de esfingolipdeos a hidrlise de uma ligao glicosdica ou ligaes de fosfato, bem como a ligao amida ao grupo acila graxos. Isso deve ser feito atravs de um processo em que a degradao mnima ou rearranjo das bases ocorra, como N-metilao. Muitos analistas afirmam que a catlise cida mais rpida. Posteriormente, as bases so melhor analisadas por cromatografia gasosa aps a derivatizao. cido graxo cido graxo
colina
Glicdio
Separao esquemtica de ceramidas por TLC em camadas de slica gel G, impregnado com arsenito de sdio a 2% (placa A) e borato de sdio a 2% (placa B), utilizando um sistema de solvente de clorofrmiometanol (95:5, v / v) para o desenvolvimento.
Abreviaes: na, cidos graxos normal; ha, hidrxi cidos graxos; db, base dihidroxi; tb, base trihidroxi; sat, saturado.
Separao dos teres por GC de uma frao contendo esfingosina e cidos graxos de cerebrosdeos. Apenas o componente cido graxo identificado.
Coluna de ao inoxidvel (50 cm x 2 mm de dimetro), enpacotada com 3% de OV-1Tm temperatura programada 175-350 C a 4 C / min com nitrognio como gs de arraste em uma vazo de 40 mL / min.
UV/VIS
Fluorescncia
ndice de Refrao
Eletroqumico
Condutividade
Separao de uma mistura padro de cidos graxos na forma de steres phenacyl por HPLC de fase reversa com deteco espectrofotomtrica em 254 nm. A coluna (900 x 6,4 mm) foi recheada com Bondapak C-18, e foi eluda com acetonitrila-gua na proporo 76:33 (por volume), inicialmente, alterado para s 74:26 "a", e 4:1 na alnea "b", e 97:3 a "c", a uma vazo de 2 mL / min.
CLAE
UV
IR
l = 210 nm
A deteco se realiza mediante UV na regio de 240 - 270 nm e se obtm a identificao do pico sobre a base do perodo de reteno.
cis, trans
Fosfolpdeos
Apparatus: HPLC system, light scattering detector (espalhamento de luz) (3m silica column (10 cm x 4.6 mm)
Detector, como o prprio nome indica, utiliza um spray que continuamente atomiza o eluente na coluna em pequenas gotculas. Essas gotculas evaporam-se, dispersando-se a luz que transmitida atravs das fibras, sendo detectadas por um fotomultiplicador que as processa eletronicamente e transmite a um computador .
Pureza de picos.
CLAE/EM
+HN
+H2N OH
+H2N O
+N O
NH3+
OH
+H3N H +H N O C20H41 C12H25 OH C42H82NO2 Exact Mass: 632.63 [Cer - H2O+H]+ C20H41 C12H25 HN +HO CH3 H3C N+ CH3 H2C CH2 O HO P O OH C5H15NO4P+ C47H96N2O6P+ Exact Mass: 815.70 Exact Mass: 184.07 OH +HO HN
+
Esfingomielina
24:0 SM